Préparation des échantillons et électrophorèse

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1 SOP-Proteomics URBO Western-blot NuPAGE. Contributed by: F. Silvestre, V. Gillardin 04 June 2009 Préparation des échantillons et électrophorèse Nous allons utiliser le Novex NuPAGE Bis-Tris Electrophoresis System (Invitrogen). Ce système simplifie les électrophorèses, stabilise les gels et augmente la qualité des résultats. Les échantillons ont préalablement été homogénéisés dans un tampon DLA (urée 7M, thiourée 2M, CHAPS 4%, Tris 30mM ph 8.5) ou resuspendus après précipitation dans du DLA. Après centrifugation 10 min à x g, les concentrations en protéines sont mesurées sur les surnagents par la méthode de Bradford ou Pierce 660nm (concentration minimale de 1,66 µg/µl). - Placer le volume d échantillon nécessaire dans 3 tubes eppendorf 0,5 ml afin d avoir un total de 20 µg de protéines. Ajouter du tampon DLA (ou du Tris-50mM ph 7) afin d obtenir un volume total de 12 µl. - ATTENTION : tous les produits doivent être à température ambiante. - Ajouter le tampon de charge NuPage LDS (lithium salt of dodecyl sulfate) sample (classiquement, on utilisait du Laemmli : 2% SDS, 65mM Tris, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoéthanol, 0,002% bleu de bromophénol, ph 6.8) afin d obtenir une dilution du tampon de 4X (ex : 4µL dans 12 µl). Le volume final doit être le même pour tous les échantillons. - Ajouter du DTT 0,5 M (77 mg dans 1 ml d eau MQ ; FW 154,25) à raison de 10% du volume de l échantillon (1,6µL dans 16 µl). - Vortexer ; Spin afin de concentrer l échantillon - Incuber pendant 5 min à 70 C - Préparer le tampon d électrophorèse : 800 ml de MOPS [3-(N-morpholino) propane sulfonic acid] SDS dilué 20X (40 ml ml d eau). - Prélever 200mL de MOPS et y ajouter 500 µl d antioxydants (NuPage antioxidant). - Déballer les gels NuPAGE Novex Bis-Tris précoulés (running gel à ph 7.0 au lieu de 8.7) et les rincer de tampon MOPS+antioxydants à l aide d une pipette pasteur. Placer les gels dans la cuve, puits vers l intérieur. Attention de décoller l étiquette blanche en bas (mettre un ghost si on ne fait migrer qu un seul gel). Clipser la sécurité.

2 - Mettre les 200 ml de MOPS+antioxydants entre les deux gels et 500 ml de MOPS à l extérieur des gels. Garder 100 ml de MOPS pour ajouter après chargement des puits. - Centrifuger les échantillons 5 min à rpm. - Grâce à une pipette Hamilton, charger tout l échantillon dans les puits. Laisser les puits aux extrémités vides. Mettre 5 µl de marqueurs de poids moléculaires dans un des puits. - Ajouter les 100 ml de MOPS restants dans la cuve extérieure. - Lancer la migration à 200 V constants (55 min au total ou un peu plus). Transfert des protéines : - Préparer le tampon de transfert NuPage transfer buffer dans un cylindre gradué de 500 ml : 20 ml de transfer buffer concentré 20X dans 360 ml d eau MQ ; 400 µl d antioxydants ; 40 ml de méthanol. (Classiquement, on utilisait le tampon de transfert Towbin : 25mM Tris, 192mM glycine, SDS 0,1%, 20% v/v méthanol, ph 8.3). Remarques : ajouter le méthanol en dernier, il ne se conserve pas dans la solution ; le SDS améliore le transfert mais peut diminuer l accrochage des protéines sur les membranes ; le méthanol améliore l accrochage des protéines sur les membranes. Utiliser l unité TE 77 PWR en semi-sec. - Arrêter l électrophorèse quand le front de migration est au bout du gel. - Démouler le gel en marquant un côté si nécessaire. Enlever le stacking gel et le front de migration (marque en «L»). - Rincer l anode et la cathode de l unité de transfert avec de l eau distillée. - Mesurer le gel et calculer sa superficie (normalement 8x6 cm). - Couper 6 morceaux de papier blot à la même taille que le gel. - Saturer le papier blot dans le tampon de transfert. - Préparer une feuille en plastique transparent (type photocopieuse) avec un trou au centre aux dimensions du gel. La placer sur la section de transfert. - Disposer 3 papiers blot sur l électrode, parfaitement alignés et sans bulle d air. - Couper une membrane de nitrocellulose (0,45µm pour les protéines de poids moyen ou 0,2 µm pour les petites protéines) à la même taille que le gel. Mettre des gants en nitrile pour toucher la membrane!!! - Tremper la membrane dans de l eau MQ.

3 - Equilibrer la membrane 5 min dans le tampon de transfert. - Mettre la membrane sur les 3 papiers blots, bord contre bord. - Equilibrer le gel dans le tampon de transfert pendant 15 secondes. - Placer le gel sur la membrane le plus rapidement possible. S assurer qu il n y a pas de bulle d air. Toujours la membrane du côté de l anode (+)! - Recouvrir avec 3 papiers blot. - Refermer la cathode (couvercle) et régler l ampérage à 0,8 ma/cm² de membrane. Ne pas fixer le voltage! Régler le timer sur 2 h maximum. Start. - Noter l évolution de l ampérage et du voltage: o T0 : o T1 : o T2 fin : - Quand le blot est terminé, retirer délicatement les papiers blot et le gel. Révélation de toutes les protéines par Blot FastStain The Chemicon BLOT-FastStain is a unique proprietary system for the reversible staining of proteins after transfer to nitrocellulose or PVDF membranes. The staining procedure takes 10 minutes. BLOT-FastStain detects only proteins (BLOT- FastStain does not stain nucleic acids) and leaves the background absolutely untouched and brilliant white leading to exceptional band visibility. The lower detection limit of BLOT-FastStain is 0.5 ng/band (BSA). The staining color is indigo blue. Le but de cette étape est de verifier si la charge totale en proteines sur les membranes est reproductible d un blot à l autre. - Placer de l eau MQ à 4 C - Diluer 10X le fixateur ( ml) - Incuber la membrane avec le fixateur 2-3 min en remuant délicatement - Diluer le développeur 7X ( ml) et incuber la membrane 1 min en remuant délicatement - Placer la membrane dans un frigo, dans le noir, SANS la remuer jusqu à l apparition des bandes (environ 30 min) - Rincer la membrane dans de l eau MQ à 4 C afin de faire disparaître le bruit de fond - Scanner la membrane - Laver la membrane dans de l eau MQ à C pendant environ 10 min en éclairant intensivement jusqu à disparition des bandes - Laver 2 X 10 min dans de l eau MQ.

4 Western-blot - Mettre la membrane dans la solution de blocage. Marquer un côté ou un bord de la membrane. On peut également colorer le gel au bleu afin d évaluer l efficacité du transfert des protéines. - Préparer 1L de tampon TBS (tris buffer saline) : 10mM Tris-HCl ; 150mM NaCl ; ph 7.5. Garder 100mL et ajouter du Tween 0,5 ml/l aux 900 ml restants (tampon TBST). Préparer 50mL de solution de blocage TBST + 5% de BSA (agent bloquant). - bloquer la membrane1h minimum à température ambiante ou toute la nuit à 4 dans TBST + 5% d agent bloquant. Jour 2 - Préparer 100mL de solution d anticorps TBST + 2% d agent bloquant - Lavages : 2 x 10 min dans TBST. - Anticorps 1 : voir annexe ; incuber pendant 1 h (ou 2 h) dans TBST + 2% d agent bloquant + anticorps dilué. La membrane doit tout le temps être recouverte de solution! - Rincer rapidement la membrane 2X dans TBST - Laver 2 x 10 min dans TBST - Anticorps 2 : voir annexe ; incuber pendant 1 h dans TBST + 2% d agent bloquant + anticorps dilué - Rincer rapidement la membrane 2X dans TBST - Laver 2 x 5 min et 1 x 30 min dans TBST - Rincer rapidement 3X dans TBS (sans Tween!!!) - ATTENTION!! Les temps d incubation et de lavage, ainsi que les dilutions des anticorps doivent être ajustés en fonction de chaque expérience.

5 Révélation par chémiluminescence ECL - Mélanger les 2 réactifs ECL 1 :1. Utiliser des pipettes très propres. (15mL/membrane) - Laisser la membrane 1 min dans cette solution. - Mettre la membrane entre 2 transparents pour éviter de mouiller le film. - La mettre dans une cassette - Aller en chambre noire - Allumer la lampe rouge et le témoin - Mettre la solution de fixateur et de révélateur (et d eau) dans les 3 bassines - Eteindre - Mettre un demi-film ECL Amersham sur la membrane bien à plat et sans bouger. Fermer la cassette. Bien garder le film au sec. - Laisser de 30sec à 10min. - Révélateur le temps nécessaire - Eau - Fixateur 3min - Rincer à l eau - Faire sécher - Allumer quand le film est bien fixé et quand les autres films sont remis dans la boîte - Récupérer les solutions - Scanner et analyser les bandes avec le logiciel Total Lab. Annexes Anticorps 1 : Mouse anti-hsp70 Bioreagent (MA3-006) dilution 1 :1000 Rabbit anti-alpha Actinin antibody (ab11007) Rabbit anti-cps1 antibody - Liver Mitochondrial Marker (ab3682) Anticorps 2 : ECL anti mouse Ig-HRP dilution 1 :2000 Goat anti-rabbit IgG secondary antibody HRP - H&L (ab6721)