Recherche de β2-transferrine dans les liquides d écoulement

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1 Recherche de β2-transferrine dans les liquides d écoulement 23 Octobre 2013 Lionel BEY Département Diagnostic SEBIA

2 Brèches ostéoméningées Rupture de la continuité ostéo-dure-mérienne Provoque un écoulement du LCR dans les cavités nasales (Rhinorrhée) ou auriculaires (Otorrhée) Apparition d une brèche: Dans la plupart des cas, traumatisme crânien (complication des 2% des traumatismes crâniens), mais aussi suite à une chirurgie intra crânienne, malformations congénitales, tumeurs, ostéomyélite Cessent parfois spontanément au bout de quelques semaines. Persistance pendant 3-4 semaines réparation chirurgicale (arrêt de la fuite dans 90 % des cas)

3 Brèches ostéoméningées Les brèches ostéoméningées exposent à des infections du système nerveux central (notamment des méningites, des abcès intracrâniens ) et aussi à des troubles dus à la diminution de pression du LCR. Une brèche peut passer inaperçue; une méningite peut se déclarer des années après un choc Risque cumulé de méningite = 85 % à 10 ans L enjeu du diagnostic est la prévention d une infection du SNC

4 Marqueurs diagnostiques, outils et techniques Liquorrhée claire, abondante diagnostic positif évident Imagerie (scanner, IRM) pour localiser la brèche Ecoulement peu abondant ou intermittent Examens biologiques sont nécessaires pour confirmer la brèche: Taux de protides et de glucides Peu spécifique et peu sensible Dosage B-Trace (néphélémétrie) β2 transferrine par électrophorèse (suivie par IF ou immunoblotting)

5 Marqueurs diagnostiques, outils et techniques

6 Marqueurs diagnostiques, outils et techniques

7 Β2-Transferrine (transferrine désialylée) Nom Liquides biologiqies Détection Transferrine désialylée β2 transferrine 0-sialo TRF LCR Perilymphe Humeur aqueuse Sérum Présente chez les sujets sains Absente chez les non buveurs Présente chez les consommateur excessives de l alcool La β2-transferrine est un marqueur spécifique de la présence du LCR dans les liquides d écoulement

8 Isoformes de la Transferinne Acide sialique Chaîne carbohydrate Chaîne peptidique Hexasialo Transferrine Pentasialo Transferrine pi = 5.2 Tetrasialo Transferrine pi = 5.4 Trf désialylée Trisialo Transferrine pi = sialo Transferrine pi = 5.7 Monosialo Transferrine pi = sialo Transferrine pi = 5.9

9 Hydragel B2 Transferrine Principe du test Séparation électrophorétique des différents isoformes de la transferrine Immunofixation avec un anti-trf marqué à la peroxydase L utilisation AS-PER : amplification du signal et détection de la fraction 2 transferrine jusqu a une concentration de 80 a 100 μg/l Il est recommandé d analyser le sérum en parallèle (pour permettre l interprétation des échantillons contaminées par le sang)

10 Principe du test LCR Hydragel B2 Transferrine Sérum Formes sialylées 2 transferrine (forme asialylée) Formes sialylées 0-sialo (Forme asialylée) Si contamination sanguine Liquide d écoulement

11 6 pistes par gel (10 gels dans le coffret) 2 à 4 patients /gel Antisérum Anti-TRF (vendu séparément) Deux modes d analyse: Hydragel B2 Transferrine Mode 1: 2 patients / gel Liquide d écoulement vs Sérum + contrôles Interprétation est possible même dans le cas de contamination du liquide d écoulement par le sang Mode 2: 4 patients / gel Liquide d écoulement uniquement + contrôles Patient 1, liquide d écoulement 1 Patient 1, liquide d écoulement 2 Patient 1, sérum 2 Patient 2, liquide d écoulement 3 Patient 2, liquide d écoulement 3 Patient 3, liquide d écoulement 4 Patient 2, sérum 4 Patient 4, liquide d écoulement 5 Sérum de contrôle normal (contrôle -) 5 Sérum de contrôle normal (contrôle -) 6 LCR (contrôle +) 6 LCR (contrôle +) Il est recommandé d analyser en parallèle l échantillon de liquide d écoulement et le sérum du patient (mode 1).

12 Hydragel B2 Transferrine : Comment interpréter les résultats? 1 - Analyse qualitative (visuelle) suffisante la plupart du temps 2 - Analyse quantitative par lecture densitométrique si nécessaire L analyse quantitative permet de déterminer la proportion de la fraction 0-sialo par rapport a la fraction 2-sialo dans le liquide d écoulement

13 Hydragel B2 Transferrine : Comment interpréter les résultats? Fraction la plus cathodique correspond à la fraction β2 Trf (0-sialo): 5 sialo 4 sialo 3 sialo 2 sialo 0 sialo = B2 Trf

14 Résultats Fractions 2-sialo sialo 14.4 R = 0-sialo / 2-sialo = 1.49 Échantillon de liquide d écoulement négatif Échantillon de LCR (= contrôle positif)

15 Résultats Fractions 2-sialo sialo 16.0 R = 0-sialo / 2-sialo = 1.18 Fractions 2-sialo sialo 14.4 R = 0-sialo / 2-sialo = 1.49 Echantillon de liquide d écoulement non contaminé; Positif Échantillon de LCR (= contrôle positif)

16 Résultats Fractions 2-sialo sialo 5.1 R = 0-sialo / 2-sialo = 1.28 Fractions 2-sialo sialo 14.4 R = 0-sialo / 2-sialo = 1.49 Echantillon de liquide d écoulement positif contaminé par du plasma Échantillon de LCR (= contrôle positif)

17 Résultats Le ratio 0/2 sialo du liquide d écoulement > au ratio 0/2 sialo du sérum Echantillon positif (une partie de 0-sialo provient du LCR)

18 Résultats Contrôle ß2 TRANSFERRIN(E) = contrôle de migration (optionnel; un échantillon de LCR peut être utilisé )

19 Hydragel B2 Transferrine Technique non invasive, facile à réaliser Technique sensible ( µg/l) - possibilité de travailler avec des échantillons non concentrés, de faible volume Possibilité de travailler avec des échantillons contaminées par du sang (problème fréquent) grâce à la comparaison quantitative des rapports 0-sialo/2-sialo du liquide d écoulement et du sérum

20 Avantages Hautes sensibilité et spécificité β2 transferrine est présente presque exclusivement dans le LCR et dans l humeur aqueuse; Un anticorps marqué à la peroxydase amplifie la sensibilité (seuil de détection : µg/l). Facilité d analyse Systèmes automatiques d électrophorèse (HYDRASYS; HYDRASYS 2 SCAN)

21 Facilité d inteprétation Avantages Analyse qualitative (visuelle) suffisante la plupart du temps; En cas de doute: analyse quantitative optionnelle des gels avec HYRYS /HYDRASYS 2 SCAN / GELSCAN (ratio 0/2 sialo) Pour les échantillons contaminées par le sang: possibilité d analyser le sérum du patient en parallèle (comparaison des ratios 0/2 sialo)

22 Références HYDRAGEL 6 2 TRANSFERRINE Réf gels / coffret 20 patients / coffret (si le sérum est analysé en parallèle) 40 patients / coffret (si analyse des liquides d écoulement uniquement) Antisérum Anti-transferrine PER (60 ml) Réf Normal Control Serum (5 x 1 ml) Réf ß2 TRANSFERRIN(E) CONTROL (optionnel) (1 ml) Réf. 4769

23 Hydragel B2 Transferrine : modification de la technique: En 2013: Remplacement du TTF3 (risque tératogène) dans la solution de révélation par le mélange TTF1/TTF2 Changement des conditions de stockage: - TTF3: température ambiante ou réfrigérateur - TTF1 et TTF2: réfrigérateur Changement dans la préparation de la solution de révélation: - Avant: 2 ml de solvant TTF3, 50 µl de TTF3, 2 µl d eau oxygénée à 30% - Maintenant: 2 ml de solvant TTF1/TTF2, 50 µl de TTF1, 50 µl de TTF2, 2 µl d eau oxygénée à 30% Rajout d une étape supplémentaire de lavage (après l incubation avec l antisérum) Une mise à jour est nécessaire (version pour Hydrasys; version 2.20 pour Hydrasys 2)

24 Hydragel B2 Transferrine : modification de la technique: TTF3 TTF1/TTF2 La couleur change mais pas le principe de l interprétation ni la performance du test!

25 Merci de votre attention!