2b. La conjugaison est un phénomène très répandu chez les bactéries, mais pas chez les eucaryotes. Pourquoi? (1pt)

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1 Semestrielle Biologie 2OS (95 ) 2BIos-2 8 juin 2010 B. Emery Génétique moléculaire - Biotechnologie COPAD Aucun document autorisé (ni personnel, ni fourni). Calculatrice non programmable personnelle autorisée. En annexe, se trouve le tableau du code génétique. Les réponses doivent figurer sur l énoncé. Si vous manquez de place, continuez au verso. Ecrivez très lisiblement et dans un français correct (2pt bonus). 1. En comparant l ADN mitochondrial (ADNmt) de nombreux individus humains, les chercheurs ont déterminé que l ensemble des êtres humains modernes, sont les descendants d une petite population vivant en Afrique, il y a environ 150'000 ans. Donnez au moins 2 propriétés différentes entre l ADNmt et l ADN nucléaire. Soyez précis. (2pt) P.ex : L ADNmt est beaucoup plus petit que l ADNn. L ADNmt est circulaire alors que l ADNn est formé de chromosomes linéaires. L ADNmt est présent en multiple copies (polyploïdie) tandis que l ADNn est présent à 1 (haploïde) ou 2 copies (diploïde). 1pt par élément correct et complet. 2a. Expliquez ce qu est le phénomène de conjugaison (en biologie). (2pt) Il s agit d un processus cellulaire durant lequel une bactérie F + (0,5pt) transfert (0,5pt) une copie (0,5pt) d un fragment d ADN vers une bactérie F - (0,5pt). 2b. La conjugaison est un phénomène très répandu chez les bactéries, mais pas chez les eucaryotes. Pourquoi? (1pt) Pour générer une grande variation génétique, les eucaryotes pratiquent la méiose et la fécondation («transfert vertical»). Ces processus mélangent les génomes de 2 individus pour en créer un nouveau. Les bactéries ne disposant pas de ces processus, elles pratiquent la conjugaison («transfert horizontal»). Page 1/8

2 3. La levure S. cerevisiae (un champignon unicellulaire) peut utiliser plusieurs molécules comme sources d énergie pour fabriquer l ATP nécessaire à son métabolisme. De préférence, elle utilise le glucose, toutefois, lorsqu il n est plus disponible, elle peut utiliser de nombreuses autres sources en synthétisant les enzymes nécessaires à partir de ses gènes. Toutefois, fabriquer en permanence ces autres enzymes lui couterait cher en énergie et par conséquent la production de ses enzymes est régulée. L utilisation du galactose comme source d énergie nécessite plusieurs enzymes codées par différents gènes. Le système de régulation est complexe et implique les gènes GAL3, GAL4 et GAL80. La protéine Gal4p (codé par le gène GAL4) est un activateur de la transcription. La protéine Gal80p est un répresseur, qui se lie à Gal4p en absence de galactose, l empêchant ainsi d agir. Cependant, lorsque le galactose est présent dans la cellule, la protéine Gal3p se lie à la protéine Gal80p, neutralisant ainsi ce répresseur (et donc libérant la protéine Gal4p de l emprise de Gal80p). De plus, tout ce système est sous le contrôle du glucose. Ainsi en sa présence aucun gène impliqué dans l utilisation du galactose n est exprimé. Le gène GAL2 code pour une protéine membranaire permettant au galactose d entrer dans la cellule. Ce gène est régulé par le système précédemment décrit. Nous disposons de deux souches mutantes. La première, nommée Z, possède une mutation dans le gène GAL80, empêchant la protéine pour laquelle il code, de se lier à Gal3p. La seconde, nommée W, possède une mutation dans le gène GAL2. La protéine résultante est dépourvue de séquence «signal». Nous effectuons l expérience suivante : Dans une boite de pétri contenant du galactose, on étale les 2 souches mutantes ainsi que la souche sauvage (nommée S et qui ne possède aucune mutation). On a également ajouté dans cette boite une substance transparente, qui une fois entrée dans la cellule (grâce à la protéine Gal2p) devient bleu (après avoir été coupée par des enzymes dégradant le galactose). Cette substance permet donc de voir si les levures expriment les enzymes permettant l utilisation du galactose. Puis on place un disque de papier filtre sur lequel on place une solution de glucose. Hachurez sur cette représentation de la boîte, les zones où les levures vont se développer. Coloriez entièrement (ou surlignez) les zones où ces cellules expriment les enzymes permettant l utilisation du Galactose comme source d énergie. Délimitez clairement les zones hachurées et les zones coloriées. (6pt) Souche «W» Souche «Z» Glucose Souche «S» Page 2/8

3 4. Voici les cartes de restrictions (= positions des sites reconnus par les enzymes de restriction) correspondant à la même portion de chromosome mais de 3 individus différents, obtenus après séquençage (donc tous les nucléotides sont connus). A B HindIII C HindIII Ces fragments d ADN ont été stocké (en grande quantité) dans des tubes afin d effectuer des recherches. Malheureusement, les étiquettes permettant de différencier ces tubes se sont décollées. Sans utiliser le séquençage (car trop long), décrivez le plus précisément possible (en utilisant les mots scientifiques adéquats) une méthode permettant de retrouver quel ADN contient chaque tube. Indiquez le résultat obtenu après chaque étape. (6pt) Il suffit de prélever un peu d ADN de chaque tube (respectivement) et de les digérer (couper) par les enzymes de restriction HindIII et. (2pt) Dans l échantillon correspondant à l individu A, nous devrions obtenir des fragments d ADN mesurant (respectivement) pb. Pour le B : Pour le C : (1pt) Il faut ensuite séparer ces fragments par électrophorèse. Cette technique consiste à placer les échantillons dans un gel séparateur (selon la taille des fragments) et de les faire migrer (se déplacer) grâce à un champ électrique. L ADN étant chargé négativement, il va se déplacer vers le pôle positif et les petits fragments se déplaceront plus rapidement. (2pt). Dessin de l électrophorèse. (1pt) A B C 1100 pb 1000 pb 800 pb 700 pb 400 pb 300 pb Page 3/8

4 5. La recherche scientifique utilise de nombreux animaux génétiquement modifiés (OGM) comme modèles pour observer le fonctionnement de certains gènes humains. Dans le court texte annexé en fin d épreuve, une souris a été génétiquement modifiée pour exprimer le gène humain FOXP2 (au lieu de la version naturellement présente dans la souris), dans le but d étudier l effet de ce gène dans le développement du langage. La création de cette souris est une des premières étapes de l étude. a) A partir de vos connaissances sur le génie génétique, proposez un argument ayant pu motiver les chercheurs à utiliser un modèle murin (= une souris) pour leur étude sur la génétique du langage plutôt qu un modèle humain ou d un autre primate (= un singe)? Indice : Il y a de nombreuses raisons possibles. (1pt) Il est plus facile et plus rapide d obtenir des souris transgéniques que des primates transgéniques. Surtout qu il est légalement interdit de modifier génétiquement un humain pour des recherches scientifiques. De plus, les souris se reproduisent plus rapidement et coûtent moins cher à entretenir. b) Le produit du gène FOXP2 est un facteur de transcription. Expliquez brièvement le fonctionnement d un facteur de transcription. (1pt) Les facteurs de transcriptions sont des protéines qui régulent (activent ou répriment) l expression des gènes. Ainsi, ils déterminent les gènes qui doivent être transcrits en ARNm de ceux qui ne doivent pas l être. La cellule n utilise donc pas tous ses gènes en même temps. c) Quelles sont les différences observées par les chercheurs entre les souris «normales» (possédant la version murine de FOXP2) et les souris «transgéniques»? La réponse se trouve dans le texte annexé. (2pt) «des modifications de leurs vocalisations ultrasoniques, des changements de comportement exploratoire ainsi que des variations de la concentration cérébrale de dopamine.» (1pt) «une plasticité synaptique plus élevée et une arborisation dendritique plus longue au niveau des neurones épineux moyens des ganglions de la base.» (1pt) d) Citez (et donnez un court exemple concret) d une autre application (que la recherche scientifique) du génie génétique. (2pt) 1pt pour la citation et 1 pt pour l exemple. P.ex : La création de protéines recombinantes pour la fabrication de médicaments (insuline humaine) ou de lessives (protéases, etc.) par des bactéries. La création de plantes génétiquement modifiées pour l agriculture (maïs résistant aux insectes, riz doré enrichi en vitamine A, etc) ou l assainissement des sols contaminés par des polluants (arbelette absorbant l Arsenic). Page 4/8

5 d) Pour réaliser cette souris transgénique, il a fallu «remplacer» le gène murin par sa version humaine. Décrivez, en plusieurs étapes clés, la procédure que vous auriez suivie pour créer une telle souris transgénique. Vous disposez du matériel suivant : des cellules humaines (dont tout le génome est séquencé), des cellules souches embryonnaires murines (dont tout le génome est séquencé), la séquence des gènes FOXP2 murin et humain, tout le matériel habituel du génie génétique (donc de tout ce que nous avons vu en cours). Soyez précis et utilisez le vocabulaire scientifique adéquat. Si nécessaire, n hésitez pas à continuer vos explications au verso. (8pt) Il y a de nombreuses variantes possibles. En voici une. 1. Il faut isoler l ORF du gène FOXP2 humain (le meilleur moyen c est de faire une PCR sur une extraction d ADN humain, mais nous ne l avons pas étudié. (Avec les moyens que nous avons vus en classe, cela consiste à utiliser les bonnes enzymes de restriction et une électrophorèse, et beaucoup de chance ou de patience). (1pt) 2. Il faut placer le gène de FOXP2 murin dans un vecteur plasmidique (contenant un gène marqueur aisément sélectionnable) ou éventuellement viral, à l aide (de la PCR), d enzymes de restriction, de l électrophorèse, et de l enzyme ligase. La construction plasmidique peut être amplifiée dans une bactérie (après transformation). (1pt) 3. Il faut remplacer l ORF de FOXP2 m par celui de FOXP2 h précédemment obtenus. Nous utilisons les enzymes de restriction, l électrophorèse et l enzyme ligase. (1pt) 4. On insère également un gène marqueur entre l ORF et le terminateur. L idéal serait d utiliser un gène marqueur que l on pourrait enlever par la suite (par exemple avec un système Cre-Lox). La construction peut être amplifiée dans une bactérie (après transformation). (1pt) La construction obtenue à ce point doit ressembler à cela : Vecteur Promoteur FOXP2 m ORF FOXP2 h Gène Marqueur Terminateur FOXP2 m Vecteur 4. Il faut introduire l ADN créé dans les cellules souches murines, par transformation (après linéarisation du vecteur plasmidique) ou transduction (si vecteur viral utilisé). L ADN devrait se recombiner avec le chromosome murin et remplacer l un des allèles chromosomiques de FOXP2 m par notre construction. Les cellules transformées sont facilement sélectionnables avec le gène marqueur. On vérifie cependant que tout s est bien passé grâce à un Southern blot ou un séquençage. Le gène marqueur peut alors être enlevé, si un système prévu à cet effet a été introduit. Il est possible d obtenir déjà à ce stade des CS homozygotes, mais cela n est pas souhaitable. (2pt) 5. On introduit les CS modifiées dans un embryon de souris et on obtient des bébés qui sont hérérozygotes FOXP2 m /FOXP2 h (que l on espère viables). (1pt) Page 5/8

6 6. On croise les souris hétérozygotes pour obtenir des souris homozygotes FOXP2 h (que l on espère viables). On identifie ces souris par Southern blot ou séquençage. On peut alors les reproduire entre elles et les étudier. (1pt) Détails de l attribution des points : (0,5pt pour l élément, 0,5pt pour l explication) - Isoler l ORF de FOXP2 h - Isoler le gène de FOXP2 m - Remplacer l ORF FOXP2 m par l ORF FOXP2 h : 1pt - Ajouter un gène marqueur - Transformer les CS avec la construction - Vérifier la construction - Introduire les CS dans un embryon pour créer une souris transgénique entière - Obtenir des souris homozygotes FOXP2 h Les 5 premiers points font appel aux techniques que nous avons vues, le 6 ème est une question de bon sens, les 2 derniers sont plus difficiles à trouver car nous ne les avons jamais étudiés ensemble. Page 6/8

7 6. Il existe 3 principales techniques pour introduire de l ADN dans une plante, afin de créer un OGM : la biolistique (transfert direct dans la cellule à l aide d un «canon à ADN»), la transformation de protoplastes (phénomène de transformation induit par un choc électrique ou un agent chimique sur des cellules privées de paroi cellulosique) et le transfert par A. tumefaciens recombinée. Cette dernière méthode, très proche du phénomène de conjugaison bactérienne, est la plus efficace, mais ne fonctionne pas sur tous les végétaux. a) Depuis le début de l agriculture (il y a plus de 10'000 ans), les humains n ont cessé de sélectionner les «meilleurs» spécimens de plantes pour améliorer le rendement. Décrivez brièvement deux avantages du génie génétique sur la sélection artificielle menée par les agriculteurs. (2pt) Il ne faut que quelques mois à quelques années pour obtenir un OGM, tandis qu il faut beaucoup plus de temps pour obtenir une nouvelle variante par sélection artificielle. Le génie génétique permet de fabriquer des organismes qui ne pourraient pas être obtenus par sélection artificielle (transfert de gènes bactériens vers des eucaryotes p.ex). Le génie génétique est plus précis que la sélection artificielle : il est possible de ne transférer qu un seul gène et on sait lequel on transfert. b) La méthode de transformation des végétaux par A. tumefaciens repose sur un transfert d ADN entre une bactérie et une cellule végétale. C est un phénomène proche de la conjugaison bactérienne. Cependant, seule A. tumefaciens a développé un tel système, tandis que de nombreuses espèces de bactéries effectuent la conjugaison. Expliquez quelle est la principale difficulté à surmonter pour un transfert de gènes entre bactéries et végétaux. (2pt) Procaryote et eucaryote n utilisent pas du tout le même système d expression des gènes. Transférer un ADN d une bactérie à une plante est «relativement» facile, mais pour que cet ADN soit utilisé (transcrit puis traduit) par la plante, il y a ici une difficulté très importante qui justifie qu une seule espèce de bactéries est parvenue à développer un tel système. Pour preuve, aucun virus connu à ce jour ne peut infecter à la fois les procaryotes et les eucaryotes. c) Lors de la fabrication d un OGM, il est très fréquent de transférer, en plus des autres gènes d intérêt, un gène de résistance à un antibiotique. Pourtant, les antibiotiques ne sont pas utilisés dans l agriculture. Quel est donc l intérêt de transférer un tel gène dans un végétal? Expliquez la raison d un tel transfert (2pt). Un gène de résistance à un antibiotique permet de sélectionner très facilement les cellules ayant reçu ce gène par rapport aux cellules ne l ayant pas reçu. Ainsi, il n est pas nécessaire de séquencer toutes les cellules utilisées pendant la transformation, mais simplement d utiliser un antibiotique pour tuer les cellules qui n ont pas reçu l ADN et ne garder que les autres. Total des points : / 37 (+ 2 Bonus) Note : ( / 32) x 4,5 + 1,5 = Page 7/8

8 Grille d évaluation semestrielle biologie 2OS Note : ( /32) x 4,5 +1,5 = B. Emery COPAD Juin 2010 Nom : Groupe : Q1-Q Q1) 2 propriétés correctes et complètes (1pt par propriété) Q2a) Bact. F+ (0,5) transfert (0,5) copie ADN (0,5) vers bact. F- (0,5) Q2b) Les eucaryotes utilisent plutôt Méiose + Fécondation. Total des points : /5 Q Souche W (zone de croissance 1pt ; zone de coloration 1pt) Souche Z (zone de croissance 1pt ; zone de coloration 1pt) Souche S (zone de croissance 1pt ; zone de coloration 1pt) Total des points : /6 Q Digestion par (1pt) et par HindIII (1pt) Electrophorèse avec explication (2pt) Résultats digestion (1pt) et électrophorèse (1pt) Total des points : /6 Q5a d a) 1 argument correct (1pt) + b) Explication Facteurs transcriptions (1pt) c) extrait 1 (1pt) + extrait 2 (1pt) d) Application (1pt) + exemple concret (1pt) Total des points : /6 Q5e Isoler ORF hum (1pt) + Gène murin (1pt) Remplacer ORF mur par ORF hum (1pt) + Ajouter marqueur (1pt) Transformer CS (1pt) + Vérification (1pt) Créer souris (1pt) + homozygote (1pt) Total des points : /8 Q a) 2 arguments corrects et complets (1pt par argument) b) Explication système expression différent procaryote-eucaryote c) Explication avantage d une gène marqueur Total des points : /6 Bonus Rédaction lisible et dans un français correct Total des points : /2 Page 8/8