Qualité des Analyses en Microbiologie : le rôle clé du Vétérinaire traitant et de son équipe

Transcription

1 Qualité des Analyses en Microbiologie : le rôle clé du Vétérinaire traitant et de son équipe Les progrès récents en biologie médicale sont attribuables, bien sûr, au développement de nouvelles technologies, mais aussi à l accréditation devenue obligatoire pour tous les Laboratoires de Biologie Médicale (humaine). L accréditation permet non seulement la comparaison de méthodes, de valeurs et donc une meilleure interprétation des résultats, par l obtention de données comparables entre les patients, mais surtout la standardisation des pratiques analytiques et pré-analytiques, améliorant ainsi la fiabilité des résultats. Il est nécessaire de souligner que, pour les humains, les prélèvements sont généralement réalisés dans les laboratoires de proximité, par des professionnels de l analyse médicale qui sont euxmêmes, individuellement accrédités, c est-à-dire formés aux bonnes pratiques des conditions préanalytiques notamment. Nous ne sommes pas prélevés par notre médecin traitant. Pour les animaux, les prélèvements sont réalisés par le vétérinaire, qui est «polyspécialiste». De ce fait, les normes d accréditation des laboratoires humains et vétérinaires sont différentes : l une englobe le pré-analytique (le laboratoire est responsable du pré-analytique Norme ISO 15189), l autre non : le laboratoire, lorsqu il est accrédité, l est à partir de la réception de l échantillon (Norme ISO 17025). Pourtant, la qualité de l échantillon de départ est essentielle à la fiabilité du résultat. Un tube mal rempli ou mal conservé donnera un résultat faussé. Nous allons nous concentrer, pendant cet atelier, sur les analyses de microbiologie, mais cette réflexion concerne tous les domaines de la biologie. COMMENT BIEN REALISER UN PRELEVEMENT? a. Urinaire Le recueil des urines : doit être le plus «propre» possible. La cystocenthèse est le mode de recueil à privilégier. Si cela n est pas possible, le sondage urinaire reste un choix acceptable. Dans la mesure du possible, il vaut mieux éviter la miction spontanée et ne pas oublier, dans ce cas, l élimination du 1 er jet. Penser à recueillir des urines ayant séjourné au moins 3 heures dans la vessie, la concentration en bactéries y étant bien plus importante. Attention à ne pas contaminer l urine lors du transfert dans le tube de transport. Quel choix de tube? Dans tous les cas, utiliser un pot stérile à usage unique. Le tube borate : il conserve les bactéries pendant l acheminement et évite leur multiplication. Ainsi l analyse est le reflet «réel» de la flore urinaire. MAIS il doit être rempli jusqu au trait (4mL minimum), sinon il produit l effet inverse sur les bactéries. De plus, il modifie certains cristaux (urates).

2 Le tube sec : il conserve les cristaux mais permet la poursuite de la multiplication bactérienne s il voyage à température ambiante. En effet, Les bactéries, à température ambiante se multiplient une fois toutes les 45 minutes! On comprend facilement un risque de résultat non représentatif lorsque les urines attendent 24 ou 48h à température ambiante avant l analyse bactériologique. TUBE BORATE TUBE SEC A URINE Pot à Percussion (PAS POUR LE TRANSPORT) L intérêt de faire un Eswab/écouvillon est faible car on compte les colonies/ml d urine. A retenir : si possible envoyer un tube Borate rempli + un tube sec à température ambiante. Sinon utiliser un tube sec mais transporté à +4 C. Lors de l utilisation du pot à percussion pour transférer l urine dans les tubes sous vide, toujours commencer par le tube sec. b. Ecouvillonnage Pour les recherches de bactéries aérobies/ anaérobies/ levures. Utiliser un milieu de transport adapté : Eswab versus écouvillon gélosé Ecouvillon = coton-tige avec un embout tampon en cellulose. i. faible quantité de matériel pouvant être recueillie (il faut au moins 10 6 bactéries/ écouvillon pour qu elles soient visibles en coloration de Gram) ii. les bactéries meurent rapidement sur le coton (dessèchement, oxydation et substances toxiques dans le coton). On transporte l écouvillon dans un milieu de culture (pour la survie), charbonné (neutralisation des substances toxiques) iii. Milieu AMIES charbonné permet également de maintenir les bactéries anaérobies à distance de l air Eswab (Copan) = écouvillon avec une pointe en nylon floqué : i. Importante absorption hydraulique (plus grande quantité de bactéries recueillies) ii. Meilleur détachement des microorganismes au laboratoire pour réaliser l analyse iii. Milieu AMIES liquide pour la survie des bactéries imbibe l embout et permet la protection et la survie des anaérobies

3 iv. Flexibilité de transport : conservation des prélèvements entre 4 et 25 C pendant 48 à 72h Eswab de bactériologie Ecouvillon Amies gélosé Pour les oreilles, penser à nettoyer le pavillon auriculaire au sérum physiologique avant de procéder à l écouvillonnage. c. Hémoculture/liquide biologique/biopsie La réalisation d hémocultures nécessite tout d abord une asepsie parfaite du site de ponction veineuse. Le sang est normalement stérile mais c est un excellent milieu de culture : une contamination par des bactéries cutanées risque de donner un résultat faussement positif. De plus, la quantité de bactéries/ml de sang est très faible. Le volume sanguin à prélever doit être important (bouteilles pédiatriques : 2 à 10 ml de sang à répartir entre flacon anaérobie et aérobie), afin de maximiser les chances de détection. Les hémocultures doivent impérativement voyager à température ambiante. BOUTEILLES HEMOCULTURE Les liquides de ponction doivent être transportés à +4 C en tube sec (attention : les bactéries n aiment pas l EDTA qu on utilise pour les cytologies) ou tremper (généreusement) un eswab dans le liquide de ponction.

4 Cas particulier du Liquide Cérébro-Spinal : il doit être examiné dans les heures (idéalement dans l heure) qui suivent la ponction. Cette analyse est donc peu accessible au vétérinaire praticien dans l ensemble. Heureusement, les méningites bactériennes sont rarissimes chez le chien et le chat. Les biopsies sont traitées au laboratoire comme les hémocultures. Attention à la déshydratation du prélèvement : utiliser un tube stérile remplit de sérum physiologique stérile ou placer la biopsie dans l Amies liquide de l Eswab. d. Selles Les selles contiennent un grand nombre de micro-organismes. Pour obtenir un résultat significatif, il faut un volume de selles significatif (une clémentine ou 5g), transporté dans un pot stérile, à +4 C. A température ambiante, une acidification a lieu qui est néfaste pour la survie de la plupart des entéropathogènes. e. Mycologie Plusieurs milieux de cultures sont ensemencés au laboratoire, prévoir une quantité suffisante de poils, transportés en tube stérile ou dans une enveloppe propre, à température ambiante. f. PCR Il est indispensable de connaître la biologie de l agent pathogène dont on cherche à prouver la présence, afin de le chercher «au bon moment et au bon endroit». Si c est un micro-organisme contenu dans les cellules sanguines, envoyer du sang complet (EDTA) par exemple et non du plasma. Si on recherche un germe qui transite par voie hématogène mais va ensuite se nicher dans un organe, la probabilité d en détecter la présence dans le sang n est élevée que pendant la phase de bactériémie (ex : Borrelia). Autre exemple : La présence de Mycoplasma spp sur un écouvillon génital chienne est normale dans le vagin caudal, mais anormale au niveau du col et du vagin crânial. Pour éviter le développement de micro-organismes qui vont «polluer» la recherche d ADN ou d ARN, il est nécessaire d utiliser des Eswab dont le milieu de transport est un conservateur enrichi en antibiotiques. Les germes sont tués mais les acides nucléiques sont protégés. Lorsqu on envoie un échantillon biologique natif (sang, urine, et surtout selles), la norme NFU recommande le transport à +4 C afin de ralentir les dégradations liées à l activité enzymatique résiduelle. Les tissus étant riches en protéases et nucléases (DNAses et RNAses). Les tissus peuvent être congelés pour un examen ultérieur. Eswab PCR

5 COMMENT BIEN ACHEMINER MON PRELEVEMENT? LA question à se poser : mon échantillon voyage-t-il «natif» ou dans un milieu de transport? Si l échantillon est conditionné dans un milieu de transport spécifique il doit alors être transporté «à température ambiante». En revanche, l échantillon natif doit être transporté à +4 C pour éviter la dégradation ou la prolifération bactérienne. Faire son prélèvement et envoyer le plus vite possible (éviter le vendredi soir, veille de WE prolongé pour une hémoculture). Les échantillons vétérinaires sont soumis à la norme NF UN3373 pour le transport de matériel biologique infectieux : il est interdit depuis le 1 er juillet 2007 de faire voyager de ce type d échantillons par la poste! La règlementation impose un triple emballage (tube + protection + sachet) ou le transport par un coursier accrédité UN3373 (dans ce cas tube + sachet). L expéditeur (c est-à-dire vous) est responsable de son prélèvement jusqu à l arrivée au laboratoire. SACHET +20 C SACHET +4 C SACHET -20 C SACHET HISTOLOGIE POURQUOI EST-IL INDISPENSABLE DE NOTER LES COMMEMORATIFS SUR VOTRE FEUILLE DE DEMANDE D EXAMEN? Règle numéro 1 : identifier les prélèvements. Il est tout à fait aisé de cultiver des bactéries et même de les identifier. La difficulté pour le laboratoire est de faire une interprétation technique des résultats afin que ceux-ci soient cohérents avec le rôle réel de l agent dans le tableau clinique du patient. C est pourquoi il est indispensable de donner le plus de commémoratifs possible sur l ordonnance qui accompagne le prélèvement :

6 Urines : mode de recueil. Un germe trouvé en faible quantité dans une urine par cystocenthèse a une réelle signification clinique, tandis que dans une miction spontanée, on admet sa présence en tant que «contaminant» Plaie : localiser précisément le lieu de la plaie (un germe fécal dans une plaie cutanée sur les membres postérieurs ou sur la tête ne sera pas considéré de la même manière) et le type de plaie (profonde ou superficielle, suppurative ou non, traumatique, chronique, etc ) Traitements antérieurs, nombre de récidives, traitement en cours Tableau clinique, suspicion clinique COMMENT INTERPRETER MON RESULTAT? J ai reçu un résultat négatif en bactériologie ou en mycologie : o Soit il y a eu un problème pré-analytique et les germes sont morts (mauvaise température de conservation, écouvillon sec, délai d acheminement trop long ) o Mon animal était sous traitement, même peu efficace in vivo, un traitement antibiotique peut inhiber totalement la pousse in vitro o La pathologie responsable des symptômes de mon patient n est pas infectieuse. Elle est peut-être inflammatoire (aseptique), allergique (typiquement les otites chroniques des chiens atopiques), dysimmunitaire (lupus, pemphigus ) J ai reçu un résultat négatif en PCR : o Le pathogène n est pas présent, au moment où j ai fait le prélèvement, dans l échantillon que j ai choisi o Le pathogène est en quantité inférieure au seuil de détection dans mon échantillon J ai reçu un résultat «flore polymorphe» ou «germe de contamination» : o Le prélèvement a été contaminé lors de sa réalisation par un ou plusieurs germe(s) de la flore locale. Leur présence dans l échantillon n a pas de signification clinique. o Un résultat «flore polymorphe» indique que plus de 4 germes différents ont poussé sur les géloses. Il est hautement improbable qu autant de germes soient impliqués dans le tableau clinique. Par ailleurs, il n est pas possible techniquement de séparer les colonies pour les identifier individuellement J ai reçu un résultat positif o Selon les commémoratifs notés sur l ordonnance, le laboratoire interprète la présence du germe comme «responsable potentiellement des signes cliniques observés» o Je dois toujours me référer à mon tableau clinique et à la façon dont j ai réalisé mon prélèvement pour mettre en place le traitement le plus adapté Conclusion : Les différentes étapes pré-analytiques sont fondamentales pour l obtention de résultats fiables et utilisables en clinique, notamment en microbiologie. Votre laboratoire a besoin de vous pour être performant dans le traitement de vos échantillons et vous rendre le meilleur service possible, ainsi qu à vos patients.