TABLE DES MATIERES OBJECTIFS 1 PARTIE I : INTRODUCTION 2

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1 TABLE DES MATIERES OBJECTIFS 1 PARTIE I : INTRODUCTION 2 CHAPITRE 1 LE FACTEUR TISSULAIRE ET LES SERINES PROTEASES DE LA COAGULATION 3 Avant-propos 4 1. Le facteur tissulaire La dénomination Les données génétiques Gène Chromosome ARN messager ADN complémentaire Le peptide signal La structure de la protéine Le poids moléculaire Le facteur tissulaire sous sa forme complète Le domaine extracellulaire La queue intracytoplasmique Le facteur tissulaire alternativement épissé L expression du facteur tissulaire Le facteur tissulaire dans le tissu interstitiel Le facteur tissulaire dans le sang Les sérines protéases d intérêt Introduction Structure générale des sérines protéases d intérêt Synthèse générale Le facteur VII(a) La dénomination Gène Chromosome La structure de la protéine La concentration sanguine 16 I

2 Le complexe facteur tissulaire facteur VIIa Le facteur X(a) L historique La dénomination Gène Chromosome ARN messager ADN complémentaire La structure de la protéine La concentration sanguine L activation du facteur X La thrombine L historique La dénomination Gène Chromosome ARN messager ADN complémentaire La structure de la protéine La prothrombine L activation de la prothrombine D-Phe-Pro-Arg-chloromethylketon (PPACK) La coagulation Introduction La voie extrinsèque de la coagulation Les complexes Le complexe tenase extrinsèque Le complexe prothrombinase 27 CHAPITRE 2 LES RECEPTEURS AUX SERINES PROTEASES D INTERET Introduction Protease-activated receptor-1 (PAR-1) La dénomination Gène Chromosome ARN messager ADN complémentaire La structure du récepteur Le mécanisme d activation du récepteur 32 II

3 2.6. L expression du récepteur Protease-activated receptor-2 (PAR-2) La dénomination Gène Chromosome ARN messager ADN complémentaire La structure du récepteur L activation du récepteur L expression du récepteur Protéases et peptides activateurs des récepteurs PAR Introduction Les protéases activant le récepteur PAR Les protéases activant le récepteur PAR Remarques sur les agonistes et activateurs des récepteurs PAR Les peptides agonistes Le tableau récapitulatif La transmission du signal La relation entre la concentration en ligand et la réponse cellulaire La signalisation induite par PAR La voie Gα o La voie Gα La voie Gα I/ Les sous-unités βγ La signalisation induite par PAR La terminaison du signal Introduction Protease-activated receptor La phosphorylation du récepteur L internalisation du récepteur L internalisation constitutive du récepteur Protease-activated receptor Réponses fonctionnelles à l activation des récepteurs PAR Introduction Protease-activated receptor-1 52 III

4 L agrégation plaquettaire La barrière endothéliale et l inflammation La croissance cellulaire et la division Le système nerveux Le système cardiovasculaire Protease-activated receptor La barrière endothéliale et l inflammation Le système nerveux Le système cardiovasculaire Le tractus intestinal Le tractus respiratoire 55 CHAPITRE 3 LA SIGNALISATION CALCIUM Introduction et bref historique Les composants cellulaires participant à la signalisation calcium Les réserves de Ca Les éléments participant à la sécrétion du Ca 2+ intracellulaire Description générale L inositol trisphosphate 1,4,5 (IP 3 ) Le récepteur InsP 3 R Les canaux d entrée du Ca 2+ extracellulaire Les composants de terminaison du signal Ca Le "Ca 2+ signaling toolkit" Les mécanismes de la signalisation Ca L augmentation élémentaire du Ca 2+ intracellulaire Les événements nécessaires au démarrage du signal Ca Les vagues de Ca Les oscillations de Ca La fin de la signalisation Les effets induits par un signal Ca Les senseurs au Ca Quelques exemples de processus induits par le calcium 76 IV

5 PARTIE II : MATERIELS ET METHODES La culture cellulaire Le matériel La culture des cellules endothéliales La culture des cellules de la lignée SaOS La culture des cellules de la lignée U La mesure du temps de coagulation Les mesures du [Ca 2+ ] i Le matériel Principe et instrumentation Les sondes fluorescentes Le principe L instrumentation La mesure du [Ca 2+ ] i dans les HUVEC stimulées par les sérines protéases La mesure du [Ca 2+ ] i dans les HUVEC stimulées par du plasma en coagulation La mesure du [Ca 2+ ] i dans les cellules SaOS-2 stimulées par les sérines protéases La mesure de la sécrétion des cytokines par ELISA L immunohistochimie La transcription inverse (RT) et la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) Le matériel L extraction de l ARN total La transcription inverse (RT) La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) La PCR quantitative La mesure de survie cellulaire La mesure d apoptose La mesure de prolifération cellulaire Les statistiques 92 V

6 PARTIE III : RESULTATS 93 I. REPONSES DES CELLULES ENDOTHELIALES SOUMISES A DES CONDITIONS DE COAGULATION Introduction Stimulation des HUVEC par le complexe TF FVIIa Stimulation des HUVEC par le facteur Xa Caractérisation du signal Délai de réponse Activité catalytique de facteur Xa dans la signalisation Effet du complexe TF-FVIIa sur la signalisation induite par le facteur Xa Stimulation des HUVEC par la thrombine Induction de signaux calciques distincts par le facteur Xa et la thrombine Distinction des mobilisations de calcium intracellulaire Récepteur engagé dans la signalisation induite par le facteur Xa Signalisation induite par la génération in situ des sérines protéases facteur Xa et thrombine Mesure du temps de coagulation du plasma appauvri en plaquettes par le facteur tissulaire humain recombinant Activation in situ du facteur X Activation in situ de la thrombine Sécrétions de cytokines induites par le facteur Xa et la thrombine Réponses des cellules endothéliales traitées avec du plasma en coagulation 118 II. EFFETS DE SERINES PROTEASES SUR UNE LIGNEE CELLULAIRE D OSTEOSARCOMES (SA-OS-2) Introduction Signal calcium induit par la thrombine Caractérisation du signal La signalisation calcium induite par la thrombine fait intervenir le récepteur PAR Rôle du site actif de la thrombine dans la signalisation Activation unique et irréversible de PAR-1 par la thrombine 127 VI

7 2.5. Temps de recouvrement du récepteur PAR Expression du facteur tissulaire dans les cellules de la lignée SaOS Signalisation calcium induite par le complexe facteur tissulaire facteur VIIa Caractérisation du signal La signalisation induite par le complexe facteur tissulaire facteur VIIa passe par le récepteur PAR Signalisation calcium induite par le facteur Xa Caractérisation du signal Rôle du site actif du facteur Xa Récepteurs intervenant dans la signalisation induite par le facteur Xa Effet du complexe TF-FVIIa sur la signalisation induite par le facteur Xa Addition des effets du facteur Xa et de la thrombine Effets des sérines protéases d intérêt sur l apoptose cellulaire La thrombine et le facteur Xa augmentent la survie des SaOS-2 par l intermédiaire du récepteur PAR L augmentation de la survie passe par une diminution de l apoptose L augmentation de la survie cellulaire par la thrombine est maximale à 10nM Les sites actifs de la thrombine et du facteur Xa sont requis pour diminuer l apoptose En présence du facteur VIIa ou du complexe facteur tissulaire humain recombinant facteur VIIa, le facteur Xa ne diminue plus l apoptose cellulaire La diminution de l apoptose suite à l activation de PAR-1 passe par l activation de la voie MAP kinase ERK/MEK 1/ Le lien entre PAR-1 et la voie des MAP kinases ERK/MEK 1/2 est réalisé par la phosphatidylinositol-3 kinase 153 PARTIE IV : DISCUSSION 156 I. DE LA SIGNALISATION INDUITE PAR LA THROMBINE De la forme du signal Du récepteur en jeu 159 VII

8 3. Des ostéoblastes et des cellules endothéliales De l amplitude de la réponse De l étude de la dérivée première de la pente De l activation de la prothrombine En résumé 167 II. DE L ANALYSE DU SIGNAL INDUIT PAR LE FACTEUR XA DANS DEUX LIGNEES CELLULAIRES De la description du signal De la suspension des cellules endothéliales versus leur adhérence De l amplitude de la réponse Du délai de réponse De l activation de PAR-2 par le facteur Xa 175 III. DE LA SIGNALISATION INDUITE PAR LE FACTEUR VIIA ET LE COMPLEXE QU IL FORME AVEC LE FACTEUR TISSULAIRE De l expression du facteur tissulaire par les cellules de la lignée SaOS De la signalisation calcium induite par le complexe facteur tissulaire facteur VIIa Du rôle du complexe facteur tissulaire facteur VIIa dans la qualité de la signalisation induite par le facteur Xa 180 IV. DE L APOPTOSE DES OSTEOSARCOMES De PAR-1, de l apoptose et des voies de signalisation De l apoptose dans les ostéoblastes De la prolifération cellulaire et de PAR De la signification physiologique de l apoptose 186 CONCLUSION 187 ABREVIATIONS 189 REFERENCES 192 ANNEXES 223 THESE ANNEXE 272 VIII