+ Méthodes d analyses des molécules organiques P /2017 S.IMBART

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1 + Méthodes d analyses des molécules organiques P /2017 S.IMBART 1

2 + Sommaire 2! I les acides aminés! II les protéines! III les glucides! IV les lipides! V - spectrophotométrie

3 + I Les acides aminés 3 A Electrophorèse = Séparation en fonction de leur charge: 3 étapes:! Dépôt de l échantillon (gel ou acétate de cellulose)! Migration dans un champs électrique! Révélation (par coloration à la ninhydrine) Peu utilisée

4 + I Les acides aminés 4 B - Les méthodes chromatographiques 1 - Définition: séparation des constituants qui se distribuent différemment dans 2 phases non miscibles. une phase est mobile: liquide ou gaz une phase est stationnaire: colonne, papier, gel

5 + I Les acides aminés 5 B - Les méthodes chromatographiques 2 - Echange d ions - Séparation en fonction du phi - Chromatographie sur colonne contenant une résine échangeuses de cations (ou anions)

6 + I Les acides aminés 6 B - Les méthodes chromatographiques 2 - Echange d ions - les colonnes

7 + I Les acides aminés 7 B - Les méthodes chromatographiques 2 - Echange d ions! L'élution consiste à déplacer l'ion fixé par un autre, de densité de charge et de concentration plus élevée on utilise de petits ions fortement chargés : Cl -, HO -, Na +, H +...! Les résines polyosidiques chargées de type Sephadex : utilisés pour la séparation de macromolécules ionisées : protéines, acides nucléiques... La matrice polyosidique (composée de cellulose ou de dextranes) porte les groupements chargés suivants :

8 + I Les acides aminés 8 B - Les méthodes chromatographiques 2 - Echange d ions -autres types de résine

9 + I Les acides amines 9 B - Les méthodes chromatographiques 3 - La chromatographie de partage (1)! Partage entre une phase hydrophile (couche mince, stationnaire) et hydrophobe (solvant organique, mobile)! Dépôt de la solution sur la couche mince! Incorporation de la couche mince dans un récipient contenant le solvant! Migration par capillarité du solvant sur la couche mince "Méthode peu utilisée car pas assez spécifique

10 + I Les acides amines 10 B - Les méthodes chromatographiques 3 - La chromatographie de partage (2) Sens de Migration du solvant

11 + I Les acides amines B - Les méthodes chromatographiques 4 Chromatographie en phase gazeuse (CPG)! AA sont rendus volatils par modification chimique de leur fonction polaire (méthylation)! Séparer par passage à travers une colonne capillaire dont l intérieur est recouvert d un film liquide (phase stationnaire)! Chauffage de la colonne ( C)! Entrainé par un gaz vecteur (phase mobile)! Différence de solubilité des aa vis-à-vis du film! Dosage d un aa de l ordre du picomole (10-12 )

12 + I Les acides amines 12 B - Les méthodes chromatographiques CPG 12

13 + I Les acides amines 13! Les méthodes chromatographiques 5 Chromatographie liquide haute performance (HPLC)! Méthode la plus récente! Séparation des aa en fonction de leur hydrophobicité! Détecte de l ordre du picomole(10-12 ) 13

14 + I Les acides amines 14 B - Les méthodes chromatographiques HPLC Echantillons 14

15 + Appareil d HPLC 15

16 + I Les acides amines 16 C - Le spectre d absorption # AA ont une absorbance pour des Rayonnements UV < 230nm # La liaison peptidique absorbe à 210 nm # Détection et quantification des protéines et aa vers 210 nm = peu spécifique # Détection à 280nm des protéines

17 + II Les protéines 17 A - Composition en Aminoacide! Hydrolyse:! enzymatique, elle n est pas totale! Acide par HCl 6N à 105 C, sous vide, 24h (0.5-1%)! Dosage du Trp, Gln et Asn par une autre méthode! Détermination de la séquence = Structure primaire

18 + II Les protéines 18 B - La solubilisation des protéines # Purification! Centrifugation de l extrait à une force ionique faible - Surnageant : protéines solubles - Culot : protéines non solubles, on passe au palier suivant, c est-à-dire une force ionique plus élevée! Protéines intégrales de membrane: détergent

19 + II Les protéines 19 C - Détermination quantitative # Dosage (quantitatif et qualitatif)! Méthode de Bradford (ou Lowry)! Activité catalytique (enzyme)! Stimulation d un phénomène biologique (croissance, mouvement cellulaire )! Interaction avec un récepteur (hormone ou facteur de croissance) # Kjeldahl # Méthode destructive, dosage de la fonction NH 2 des protéines

20 + II Les protéines 20 D - Purification des protéines 1 - Chromatographie d échange d ions 2 Chromatographie d exclusion! Leur conformation! En fonction de leur taille

21 + II Les protéines 21 D - Purification des protéines 3 - Chromatographie d affinité! Phase stationnaire inerte porteuse de groupes capables d interagir spécifiquement et de façon réversible avec une protéine au sein du mélange! La liaison ligand-protéine est rompue (gradient ph, force ionique ) : élution de la protéine d intérêt! Ligands # Anticorps spécifiques ou récepteur de la protéine # Antigène ou ligand spécifique d 1 AC à purifier # Lectine, interagit avec les chaînes polysaccharidiques de glycoprotéines

22 + II Les protéines 22 E - Electrophorèse SDS-PAGE # Séparation des molécules dans un champs électrique en condition dénaturante (SDS) en fonction de leur taille PM

23 + III Les Glucides 23! Purification # déprotéinisation # délipidation par les solvants organiques # dialyse pour éliminer les substances minérales.! Vérification de la pureté # Sur cendres pour les minéraux # Dosage de l azote total pour les protéines # Absorption dans l UV à 260 nm pour les acides nucléiques.

24 + III Les Glucides 24! Fractionnement # Electrophorèse capillaire # Chromatographie! Identification et dosage # Méthodes physiques : polarimétrie, réfractométrie (industrie sucrière) # Méthodes chimiques : Oxydation des oses

25 + III Les Glucides 25 # Oxydation des oses! Fonction aldéhydique ou cétonique est capable d être oxydée : réducteurs! Aldoses et cétoses vont réduire les sels métalliques en solution basique Glucose! Détection des sucres dans un mélange par la liqueur de Fehling

26 + III Les Glucides 26 # Oxydation des oses! Exemple : Sucre réducteur + 2Cu HO - R-C O H Sucre oxydé + Cu 2 O + 3 H 2 O (Précipité rouge) O R-C O -

27 + III Les Glucides 27 # Réaction à l iode! L amidon (non réducteur) # l amylose donne une coloration bleu foncé # l amylopectine donne une coloration rouge violacée.! Le glycogène # Brun acajou

28 + III Les Glucides 28 Diiode I 2 28

29 + III Les Glucides 29 # Chromatographie! Sur papier! CCM! HPLC # Méthode enzymatique! Glucose-oxydase! Hexokinase! Glucokinase

30 + IV Les Lipides 30! Extraction # A partir de lipides biologiques, tissus # Extraction par un mélange chloroforme/ méthanol! Fractionnement des lipides totaux # Par chromatographie sur gel de silice! Lipides neutres (mono-di-triacylglycérol, cholestérol)! Glycosphingolipides! Phospholipides

31 + IV Les Lipides 31! Fractionnement des lipides neutres # Par chromatographie sur CCM Esters de cholestérol Triacylglycérol (TG) Cholestérol libre (C) Diacylglycérol (DAG) Sens de migration Monoacylglycérol (MAG) Dépôt

32 + IV Les Lipides 32! Fractionnement des lipides totaux # Par chromatographie sur CCM Chaque dimension est due à un solvant différent Abréviations. PC, PS, PA, PG, PE : phosphatidyl choline, sérine, acide, glycérol, éthanolamine ; MGDG, DGDG :monogalactosyl, digaltactosyl diglycéride ; LN : lipides neutres ; n.d. : lipide non déterminé

33 + IV Les Lipides 33! Autres méthodes d identification # HPLC # Spectrométrie de masse! Méthode physique d analyse! Détecte et identifie des molécules par leur masse isotopique

34 + V La spectrophotométrie 34! Mesure la concentration d une substance chimique (en solution)! Transition des électrons de valence à la périphérie de l atome, ceux impliqués dans les liaisons! UV: 190 à 400nm, Visible: nm! Densité optique (DO) exprimé en absorbance (Abs)! Loi de Beer-Lambert Abs = l c! = Coefficient d extinction molaire en L.mol -1.cm -1! l = longueur du trajet optique! c = concentration en mol.l -1

35 + V La spectrophotométrie 35

36 + V La spectrophotométrie 36! La lumière émise (énergie) est absorbée par les molécules à doser, les électrons vont se délocaliser à un niveau d énergie supérieure, qui va ensuite retourner à son état fondamental en émettant à nouveau de la lumière dans l UV ou le visible! Groupement chromophore ayant des doubles liaisons Bleu de Coomassie

37 + V La spectrophotométrie 37! Transmittance = I/I 0! Absorbance = Log 10 (1/T)! D où Abs = Log 10 (I 0 /I) avec I 0 >I I 0 I Cuve

38 + V La spectrophotométrie 38! Gamme d étalonnage Abs Domaine de linéarité C correcte C fausse Concentration

39 + V La spectrophotométrie 39 $ Application $ Dosage $ Suivie d une réaction enzymatique $ Spectrophotométrie Infra-rouge (λ> 800nm) $ Mesure des liaisons $ Spectrophotométrie par fluorescence $ Mesure d ultratrace (10-18 M)