851, 852 et 853 Lundi 26 mai D.S. n 7 BIOLOGIE. Exploitation de documents. Durée 3 h

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1 851, 852 et 853 Lundi 26 mai 2014 D.S. n 7 BIOLOGIE Exploitation de documents Durée 3 h Quelques aspects des conversions énergétiques dans la mitochondrie. Le sujet comporte trois parties indépendantes, toutes trois à traiter. Dans chaque partie, un questionnement guide l exploitation des documents. Il sera tenu compte de la qualité de l expression, de la concision et du soin apporté à la présentation. Page 1 sur 7

2 Partie I : la chaîne respiratoire et son rendement (durée conseillée 1 h) Afin d identifier les molécules impliquées dans la chaîne respiratoire mitochondriale, des scientifiques utilisent un spectrophotomètre, qui fait passer une lumière très intense à travers l échantillon étudié, puis à travers un prisme qui décompose le spectre du rouge au bleu. Si des molécules de l échantillon absorbent la lumière à des longueurs d onde particulières, des bandes sombres interrompent le spectre de couleurs obtenu. Des études menées sur des mitochondries de différents tissus et dans différentes conditions expérimentales ont permis de conclure que le spectre d absorption est dû à trois composants que l on nommera cytochromes a, b, c. Le document ci-contre représente les bandes d absorption de ces cytochromes a, b et c. L étude spectrophotométrique est ensuite réalisée dans différentes conditions expérimentales. 1. On compare les bandes d absorption des cytochromes en présence et en l absence de dioxygène. Le résultat obtenu est présenté ci-contre. Analyser et interpréter les résultats en précisant si c est la forme réduite (riche en électrons) ou oxydée (pauvre en électrons) qui absorbe la lumière dans certaines longueurs d onde. 2. Si l on introduit du cyanure (KCN) dans le milieu, on obtient les résultats présentés ci-contre. Analyser ces résultats pour formuler une hypothèse sur l action du cyanure. 3. L ajout d uréthane (inhibiteur du transport d électrons) donne les résultats (D). En utilisant un cytochrome c extrait par réhydratation de levures en poudre, les résultats (E) sont obtenus. A partir de l analyse de ces résultats, déduire l ordre dans lequel les trois cytochromes transportent les électrons dans la chaîne respiratoire mitochondriale. 4. On fournit les potentiels redox de quelques couples oxydo-réducteurs : Ces données sont-elles cohérentes avec votre proposition précédente? Présenter sous la forme d un schéma le trajet des électrons dans la chaîne respiratoire mitochondriale. [D après Wilson J., Hunt T., «Biologie moléculaire de la cellule, livre d exercices» Flammarion- Médecine Sciences Ed., 1995]. Couples oxydo-réducteurs (Ox, Red) E (ox, red) en volts O 2 / H 2 O 0,82 Cyt a 3 (Cu 2+ /Cu + ) 0,30 Cyt a (Fe 3+ /Fe 2+ ) 0,29 Cyt c (Fe 3+ /Fe 2+ ) 0,25 Cyt c 1 (Fe 3+ /Fe 2+ ) 0,22 Cyt b (Fe 3+ /Fe 2+ ) 0,04 Q / QH2-0,02 FAD / FADH 2-0,22 NAD + / NADH, H + - 0,32 Page 2 sur 7

3 5. Trois expériences successives sont réalisées sur la même suspension mitochondriale, préparée au temps 0. En a, b, c différentes substances sont ajoutées au milieu. a. Addition de 90 µmol d ADP et d un excès de -hydroxybutyrate. N.B. : Le -hydroxybutyrate est oxydé par une déshydrogénase à NAD + dans les mitochondries. b. Addition de 90 µmol d ADP, d un excès de succinate et de roténone. N.B. : Le succinate est oxydé par une déshydrogénase à FAD dans les mitochondries. La roténone inhibe le transfert d électrons en provenance du NADH. c. Addition de 90 µmol d ADP, d antimycine, et d un excès du mélange ascorbate + TMPD. N.B. : Le TMPD (tétraméthyl-p-phénylènediamine) est un transporteur d électrons réduit par l ascorbate et qui transfère ses électrons directement au cytochrome c. L antimycine inhibe le transfert d électrons provenant du FADH 2. La consommation d O 2 consécutive à chaque ajout de substances est indiquée à côté de la portion de graphique correspondante ( O 2 ). N.B. : dans toute l expérience, du Pi est présent dans le milieu. Document 2. Mesure de la concentration de l O 2 au cours du temps, à l aide d une électrode de Clark, dans un milieu adéquat contenant une suspension de mitochondries. [D après sujet de CAPES externe de SVT, 2004] Calculer le nombre de molécules d ATP produites par molécule d O 2 consommée pour chacune des expériences et proposer une explication aux différences constatées. Page 3 sur 7

4 Partie II : conversions énergétiques et synthèse d ATP 1. Afin de préciser le lien entre la consommation d O 2 par la respiration cellulaire et la synthèse d ATP, on réalise trois expériences indépendantes (A, B et C) avec trois suspensions mitochondriales identiques. On ajoute successivement les substances indiquées sur les graphiques. [D après sujet de CAPES externe de SVT, 2004] Document 3. Mesure de la concentration en O 2 du milieu d incubation des mitochondries au cours du temps à l aide d une électrode de Clark. ADP : adénosine diphosphate. FCCP : substance protonophore (= agent découplant ; le dinitrophénol DNP a le même effet). Oligomycine : inhibiteur de l ATP synthase. Indiquer l effet de l ajout du FCCP sur la consommation d O 2 par les mitochondries. Proposer une explication. Montrer que l on peut proposer, à partir de l ensemble de ces résultats, que la synthèse d ATP à partir d ADP utilise un gradient de protons. 2. Des vésicules submitochondriales (face matricielle vers l extérieur) sont incubées dans une solution à ph=4 afin d acidifier leur contenu. Elles sont ensuite transférées dans un milieu alcalin en présence d ADP et de phosphate (HPO 4 ) radioactif. On mesure la production d ATP. L expérience est reconduite en faisant varier le ph du milieu alcalin. Document 4. Production d ATP en fonction du ph du milieu. La production d ATP en fonction du ph alcalin utilisé est représentée sur le graphique ci-contre. [in : WILSON J., HUNT T. «Biologie moléculaire de la cellule : exercices», Flammarion Médecine-Sciences Ed., 1995]. Analyser ces résultats pour préciser la relation entre gradient protonique et synthèse d ATP. Page 4 sur 7

5 Partie III : particularités fonctionnelles des mitochondries du tissu adipeux brun Le tissu adipeux brun, ou graisse brune, est bien différent du tissu adipeux blanc qui stocke les lipides pour constituer un réservoir d énergie pour l organisme. Surtout abondante chez les Mammifères hibernants (comme la marmotte), la graisse brune est néanmoins présente dans l'espèce humaine, principalement au début de la vie, alors que les mécanismes de la thermorégulation ne sont pas encore pleinement fonctionnels. Chez le fœtus et le nouveau-né, elle se répartit dans la région interscapulaire, autour des gros vaisseaux (aisselles, cou), autour des reins et du cœur. Les adipocytes bruns ont un noyau central et un cytoplasme rempli de nombreuses petites vacuoles lipidiques et de très nombreuses mitochondries (qui confèrent sa couleur brune au tissu). 1. L oxydation d un acide gras, l acide palmitique, se fait dans les mitochondries, après transformation en palmitoylcoenzyme A puis en acétyl-coenzyme A suivant la réaction : Palmitoyl-CoA +7 FAD +7 NAD + +7 CoA+ 7 H 2 O 8 acétyl-coa + 7 FADH NADH, H + L acétyl-coenzyme A est ensuite entièrement dégradé lors du cycle de Krebs, avec production de 2 CO 2, un GTP, 3 NADH, H + et 1 FADH 2. 1a. Calculez la quantité de dioxygène consommée lors de l oxydation complète d une mole d acide palmitique en dioxyde de carbone et eau. 1b. Calculez la quantité totale d énergie libre standard récupérable lors de cette oxydation. On rappelle pour cela les potentiels d oxydoréduction standard à ph 7 des couples rédox suivants : FAD/FADH 2 E 0 = V (2 électrons transférés) NAD + /NADH, H + E 0 = V (2 électrons transférés) O 2 / H 2 O E 0 = V (2électrons transférés) Le Faraday vaut coulombs ou Joules/ volt. 2. On mesure la quantité de chaleur dégagée et la consommation de dioxygène qui accompagnent la dégradation de l acide palmitique en dioxyde de carbone et eau. On en déduit la quantité de chaleur dégagée par mole de dioxygène consommé : - dans les cellules du foie : 146 kj/mol - dans les cellules du tissu adipeux brun : 430 kj/mol 2a. Comparer la quantité d énergie libre de la réaction d oxydation à la quantité de chaleur libérée dans le foie d une part, dans le tissu adipeux brun d autre part. 2b. Comparer ensuite les conversions énergétiques réalisées dans les mitochondries de ces tissus. 3. On cherche à comprendre les particularités fonctionnelles des mitochondries du tissu adipeux brun, en comparant certaines de leurs caractéristiques avec celles des mitochondries du foie (document 5), et en étudiant l évolution de la conductance (perméabilité) aux protons de leur membrane interne en fonction de la force proton motrice (document 6). Page 5 sur 7

6 Document 5. Comparaison quantitative des complexes protéiques et des activités des mitochondries du tissu adipeux brun et du tissu hépatique, rapportés à la masse des protéines totales. Ces paramètres sont exprimés indépendamment les uns des autres, en unités arbitraires. TAB signifie tissu adipeux brun. A : complexes de la chaîne respiratoire B : ATP synthase C : activité respiratoire D : synthèse d ATP Document 6. Etude de la conductance aux protons de la membrane mitochondriale interne dans le foie ( ) et dans le tissu adipeux brun ( ), en fonction de la force protomotrice (ou gradient électrochimique de protons). Analyser les résultats obtenus. Proposer une interprétation des différences relevées au 2 (questions 2a/2b). 4. On a mis en évidence, dans la membrane interne des mitochondries du tissu adipeux brun, des protéines appelées UCP1 (uncoupling protein 1). Cette protéine appartient à la grande famille des transporteurs mitochondriaux. On connaît d autres protéines de séquence proche, telles qu UCP2, présente dans les mitochondries de nombreux tissus, ou UCP3, présente seulement dans les mitochondries des cellules musculaires. D autre part, on a mis en évidence que l ajout d acides gras dans une suspension de mitochondries extraites du tissu adipeux brun augmentait la production de chaleur. Document 7. Effet de l acide palmitique sur le taux respiratoire de mitochondries isolées. On utilise ici des mitochondries issues de levures «transformées» génétiquement, exprimant selon le cas le gène UCP1, UCP2 ou UCP3. Leur membrane interne contient donc des protéines résultant de l expression de l un de ces trois gènes. Page 6 sur 7

7 Augmentation de la respiration (nmol «O». min -1. mg -1 ) Ces mitochondries sont extraites, puis placées au temps 0 dans un milieu contenant du dioxygène, des substrats respiratoires, mais ne contenant pas d acides gras. On ajoute au cours de chaque expérience de l acide palmitique, en quantité variable. Le taux respiratoire mesuré de ces mitochondries est représenté sur le graphique ci-contre en fonction de la quantité d acide palmitique ajouté (en unités arbitraires). mitochondries avec UCP1 ; mitochondries avec UCP2 ; mitochondries avec UCP3 ; mitochondries «témoin». Quantité d acide palmitique ajouté (U.A.) [D après : Eduardo Rial, Mar González-Barroso, Christophe Fleury, Sira Iturrizaga, Daniel Sanchis, Jesús Jiménez-Jiménez, Daniel Ricquier, Marc Goubern and Frédéric Bouillaud, «Retinoids activate proton transport by the uncoupling proteins UCP1 and UCP2», The EMBO Journal (1999) 18, ]. A partir de l exploitation de ces résultats expérimentaux, montrer quel est le rôle d UCP1. 5. On étudie le taux d expression des ARNm de diverses UCP dans diverses situations physiologiques ou pathologiques et dans divers tissus (Document 8). Document 8. Modifications des niveaux d expression des ARN messagers des diverses UCP dans diverses situations physiologiques ou pathologiques. [Ricquier D. Bouillaud F. «Les protéines découplantes mitochondriales» Médecine-Sciences 1998 ; 14 : ] Analyser les données fournies et les mettre en relation avec les observations précédemment effectuées. Page 7 sur 7