CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE

Transcription

1 CYTOGENETIQUE MOLECULAIRE I)Introduction Le caryotype est l'examen génétique le plus prescrit, car il permet une analyse globale du génome. Il permet de détecter 15% des anomalies. Mais il possède un faible niveau de résolution : - caryotype classique : 400 bandes = 10 Mb / bande - caryotype haute résolution : 850 bandes = 5 Mb / bande (chromosome «étiré») Il met en évidence des anomalies de nombre, et de structure de taille suffisante. Limites : - impossibilité de caractériser finement un remaniement visible (résolution) - les remaniements cryptiques ne sont pas visibles - impossible à réaliser en l'absence de mitose La cytogénétique moléculaire permet d'augmenter ce niveau de résolution : 1 bande = 10 7 pb (rappel : génome = pb, 1 gène = pb). II)La cytogénétique moléculaire 1 ) Champs d'application : - prénatal, foetopathologie - post natal, anapath, hématologie... 2 ) Principe : Basé sur la capacité de l'adn à se dénaturer et se renaturer : hybridation nécéssitant : - une sonde et son système de marquage - un système de révélation - un système de capture (microscope à fluorescence) 3 ) Sondes utilisées : ADN (la plus utilisée) : - génome total: CGH - chromosome entier : peinture spécifique (obtenue par hybrides somatiques ou microdissection) - locus : fragment d'adn cloné, oligonucléotides ARN : ribosondes protéiques III)Technique 1 ) Préparation de la sonde : Digestion enzymatique de l'adn à cloner (humain) et de l'adn vecteur (souvent circulaire : ouverture ; contient un gène de résistance à un antibiotique) Ligation du fragment d'adn humain dans l'adn du vecteur (insertion) Transfert du vecteur + insert dans une cellule hôte et mise en culture Obtention de clones (colonies isolées : dans le milieu de culture se trouve l'antibiotique dont 1

2 le vecteur possède le gène de résistance, ainsi seules les cellules possédant le vecteur sont sélectionnées.) Extraction de l'adn Vérification (profil de restriction) Marquage Tests de validation Les cellules hôtes peuvent être : hybride somatique : (chromosome humain / mammifère, taille : 1 chromosome) YAC (levure, kb) BAC- PAC ( kb), cosmide (30 45 kb), phage (10 20 kb), plasmide (< 10 kb) (bactéries) Les banques informatiques répertorient différentes sondes spécifiques. En pratique, les laboratoires récupèrent des colonies de cellules avec vecteur et insert : culture sur milieu avec antibiotique de sélection = isolation, amplification dans un milieu de culture, lyse cellulaire et extraction de l'adn (technique de phénol-chloroforme), précipitation (isopropanol), dosage de l'adn sur gel d'agarose pour vérification. De nos jours une méthode plus simple est employée, permettant d'éviter la culture, le «rolling circle» : utilisation d'un bactériophage phi29, mis dans le milieu de culture, contenant une enzyme qui dénature vecteur et insert, permettant l'hybridation d'exanucléotides, donc l'amplification de l'adn ; l'enzyme resépare ensuite le brin néosynthétisé, permettant une amplification continue par synthèse des anciens et nouveaux brins (1 à 10 ng d'adn sont ainsi amplifiés en 10 µg). 2 ) Marquage de la sonde Il consiste en l'incorporation dans l'adn d'une molécule visualisable : un dntp (désoxyribonucléotide) marqué par un haptène = marquage indirect, ou par un fluorochrome = marquage direct. Il existe différentes techniques : nick-translation : destruction d'un brin par une DNAseI (exonucléase), puis néosynthèse par une ADNpolymérase I incorporant des nucléotides marqués random-priming : dénaturation de l'adn par la chaleur, puis ancrage d'amorces (hexanucléotides) à partir desquels il y a élongation par l'enzyme de Klenow (polymérase I) avec nucléotides marqués PCR : dénaturation de l'adn par la chaleur, puis ancrage d'amorces et élongation par une Taq polymérase avec nucléotides marqués On effectue ensuite un contrôle sur gel d'agarose. Pour information : nick translation : intérêt : qualité de la sonde (500 pb) limite : nécessite beaucoup d'adn à marquer random priming : intérêt : peu d'adn nécéssaire, rapide limite : nombreux petits fragments (moins «propre») PCR : intérêt : peu d'adn nécessaire limite : fragments de taille limitée, incorporation difficile pour l'enzyme Si la dénaturation (chaleur + formamide) est trop courte, l'hybridation risque d'être mauvaise. En revanche si elle est trop longue, l'adn risque d'être détruit... 2

3 3 ) Hybridation La sonde est resuspendue en tampon d' hybridation (formamide), dénaturée (chaleur), mise en compétition avec l'adn cot1 (spécifique des séquences répétées, il empêche les hybridations non spécifiques), hybridée sur lamelle avec rubber cement (colle, évite le déssèchement) dans une chambre humide à 37 C quelques heures à jours (en général 24 h). 4 ) Lavages Ils permettent l'élimination des fragments de sonde marqués non hybridés spécifiquement sur les chromosomes. On utilise la chaleur en condition de salinité connue. 5 ) Révélation, amplification Cette étape n'est nécessaire que si l'on utilise pour marqueur un haptène, lié à la sonde. Celui-ci peut être : la digoxigénine : on ajoute des anticorps anti-digoxigénine marqués permettant l'obtention d'un signal, que l'on peut amplifier (Ac anti Ac anti-digoxigénine etc) La biotine : on ajoute de l'avidine marquée, et l'on peut amplifier (Ac contenant de la biotine...) Haptène : intérêt : incorporation facile (bon marquage), amplification possible limites : bruits de fond (les Ac gènent la lecture), temps de révélation plus long Fluorochrome : intérêt : révélation plus rapide, signal plus propre limites : marquage plus difficile, signal moins intense 6 ) Lecture On utilise la fluorescence, c'est-à-dire l'émission de lumière sous l'influence d'une irradiation. Dans le microscope à épifluorescence on effectue une excitation à une longueur d'onde donnée, la sonde la reçoit et réémet à une longueur d'onde plus longue. Un filtre d'arrêt permet de ne laisser passer que la longueur d'onde émise spécifique de la longueur d'onde absorbée. ex: fluorescéine λ excitation = 495 nm (bleu-vert), λ émission = 525 nm (vert). On peut visualiser les spectres d'absorption et émission. 7 ) Sur quoi hybrider? sur chromosome métaphasique après culture : lymphocytes surtout, mais aussi moëlle ou fibroblastes, possiblement tous les tissus qui prolifèrent sur noyaux : amniocytes (diagnostic prénatal), lymphocytes, cellules buccales... sur coupe histologique IV) La FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) : étude ciblée du génome Elle consiste en la dénaturation (dans des conditions contrôlées) d'une sonde et en son hybridation sur ADN simple brin. 3

4 1 ) Les sondes utilisées sonde de peinture (constituée en réalité d'un ensemble de petites sondes, chacune spécifique d'une région), elle est : soit totale : marquant un chromosome entier soit partielle : marquant une partie de chromosome On peut observer des translocations réciproques, des remaniements... sonde spécifique : locus spécifique centromériques (ADN satellite α), aspécifiques ou spécifiques d'un chromosome (attention, certains ont des structures proches, ex : 13 / 21, 14 / 22) télomériques aspécifiques (marquant tous les télomères car ils possèdent des séquences communes de répétition) subtélomériques : permettent l'étude d'un, plusieurs ou tous les chromosomes. Ces régions sont riches en gènes, 6% des retards mentaux idiopatiques ont des remaniements cryptiques (< 5 Mb, invisibles au caryotype...) à ce niveau (trisomies, monosomies des régions subtélomériques). La lecture se fait par marquage de l'ensemble des chromosomes par un contre colorant, le DAPI, puis ajout de la sonde et d'une sonde témoin : on vérifie que la région étudiée est présente, et au bon endroit. On peut observer des microdélétions. 2 ) La FISH sur noyaux interphasiques Elle ne nécessite pas de mise en culture, et peut être pratiquée sur tout type cellulaire : elle est rapide et peu invasive. Elle est utilisée lorsque le diagnostic doit être vite posé (par exemple dans le cas d'une ambiguité sexuelle à la naissance, on réalise un sexage sur prélèvement sanguin en 24 h). Elle peut être effectuée : sur tissu : - coupe en paraffine (délicat, nécéssite un déparaffinage préalable) - coupe sur tissu congelé - empreinte à partir de tissu congelé en prénatal : - amniocytes non cultivés - sang du cordon L'aneuvysion est un test prénatal qui dépiste les principales aneuploidies (13, 18, 21, X et Y) grâce à des sondes spécifiques, très rapidement (24 à 48 h) ; cependant on effectuera secondairement un caryotype (l'aneuvysion ne donne qu'un dépistage partiel). Mais la FISH a une limite, l'étude est non globale : on ne trouve que les anomalies que l'on recherche... V)Les méthodes d'étude globale du génome 1 ) M-FISH et SKY: le «caryotype en couleurs» L'analyse du génome repose sur la combinaison, spécifique pour chaque chromosome, de fluorochromes (5 couleurs initiales). Il existe deux types de lecture. a) multi-fish: jeu de filtres 4

5 On réalise une capture séquentielle des couleurs émises avec différents filtres, puis les images sont superposées. Elle permet l'identifications de marqueurs. Un marqueur est un fragment de chromosome isolé, visible, dont il est impossible de déterminer l'origine (souvent il s'agit du chromosome 15). b) SKY (Spectral Karyotype) : spectromètre L'image est capturée par un spectromètre à interférences ; le logiciel calcule le spectre en chaque point lumineux et en déduit la composition des fluorochromes. Intérêt : analyse globale - étude des caryotypes complexes (surtout en hématologie) - identification d'un marqueur même en mosaique Limites : - ne détecte pas les anomalies intrachromosomiques - ne précise pas finement la localisation de l'anomalie chromosomique - niveau de résolution: 2 3 Mb - n'est pas accessible à toutes les équipes (cher) 2 ) CGH (Comparative Genomic Hybridization) Elle consiste en une cohybridation sur métaphase normale d'un ADN à tester (vert) et d'un ADN témoin (rouge), en quantité égale. L'hybridation est compétitive entre les deux ADN pour les mêmes loci. Un logiciel analyse le ratio rouge / vert. Résultat : une couleur jaune correspond à un ratio de 1 (hybridation en même quantité des deux ADN) ; une couleur verte indique un gain dans l'adn à tester, une couleur rouge une perte (délétion). Intérêt : analyse globale confirme une suspicion d'anomalie chromosomique sur bande : déséquilibres 5 10 Mb permet la caractérisation de l'anomalie (délétion, duplication...) permet de voir des duplications intercalaires (autres que télomériques) et terminales Limites : niveau de résolution faible pas de mise en évidence des anomalies en mosaique technique délicate (reproductibilité) et chère ne détecte pas les anomalies équilibrées 3 ) CGH arrays: la plus utilisée Même principe, les fragments d'adn fixés à la surface de la puce sont appelés sondes et les séquences nucléiques contenues dans l'échantillon à analyser sont appelées cibles (ADN patient / à tester). On analyse ensuite les rapports de fluorescence et on effectue une analyse informatisée du ratio (exprimé en log2) en chaque point. Elle permet la détection de nouveaux remaniements, la définition de nouveaux syndromes. Les différentes sondes (fragments d'adn spottés sur lame) : BAC, cosmides... produits de PCR oligonucléotides Les différentes puces : pangénomiques : les différents fragments d'adn couvrent à l'ensemble du génome spécifiques d'une région (télomères...) thématiques (cancer...) Les étapes : choix des clones, culture, organisation, préparation pour spottage 5

6 amplification, spottage hybridation, révélation scanner, analyse des résultats, vérification Intérêt : détection d'anomalies subtélomériques détection de microremaniements recherche de locus morbide correspondant à une pathologie donnée clonage des points de cassure mise en évidence de remaniements complexes Limites : la résolution est fonction de la taille et de la distance entre deux sondes (6 kb 1 Mb) mauvaise mise en évidence du mosaicisme (< 50%) pas de détection des remaniements équilibrés mise en évidence de polymorphismes (régions dupliquéesou délétées chez des individus normaux) : pose le problème de la signification de l'anomalie détectée et de sa responsabilité dans la pathologie. cher 6