Free Testosterone II. Gen. ELISA

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1 Fiche technique Free Testosterone II. Gen. ELISA Test immuno-enzymatique à but de diagnostic in-vitro pour le dosage quantitatif de la testostérone libre dans le sérum ou plasma humains. DM C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. BUT DU TEST Test immuno-enzymatique à but de diagnostic in-vitro pour le dosage quantitatif de la testostérone libre dans le sérum ou plasma humains. Le kit Testostérone libre II. Gen est un test ELISA de seconde génération. 2. SOMMAIRE ET INTRODUCTION La testostérone est un stéroïde C19 de la famille des androgènes. Chez les hommes, elle est produite principalement dans les cellules de Leydig des testicules, et seulement une petite partie est produite par le cortex surrénal. De façon générale, les hommes adultes ont un taux de testostérone plasmatique 10 à 20 fois supérieur à celui des femmes. Dans la circulation, la majeure partie de la testostérone est liée aux protéines de plasma, comme à la sex homone binding globuline (SHBG 60-80%), l albumine et la cortisol binding globulin. La testostérone est responsable du développement des caractéristiques sexuelles masculines secondaires et ses dosages aident à évaluer les états hypogonadaux. Chez les femmes, on retrouve des taux élevés en testostérone dans les cas d hirsutisme et de virilisation, d ovaires polykystiques, de tumeurs ovariennes, de tumeurs surrénales et d hyperplasie surrénale. Chez les hommes, de fortes valeurs en testostérone sont associées aux maladies de l unité hypothalamique pituitaire, aux tumeurs testiculaires, à une hyperplasie surrénalienne congénitale et au cancer de la prostate. Des concentrations faibles en testostérone peuvent être trouvées chez des patients atteints des maladies suivantes: hypopituitarisme, syndrome de Klinefelter, féminisation testiculaire, orchidectomie et cryptorchidisme, déficiences enzymatiques et quelques maladies autoimmunes. Seulement environ 1-2% de la testostérone totale circule librement. Même si cela reste en cours d investigation, la plupart des biologistes acceptent le dosage de la testostérone libre en tant que mesure de la fraction biologiquement active. Les dosages de la testostérone libre sont recommandés pour obtenir une valeur indépendante des protéines de liaison, celles-ci pouvant influencer fortement la concentration totale en testostérone. 3. PRINCIPE DU TEST Le test immuno-enzymatique sur phase solide (ELISA) est basé sur le principe de compétition. La quantité inconnue d antigènes présents dans l échantillon et une quantité fixe d antigènes conjugués à une enzyme entrent en compétition pour les sites de fixation des anticorps coatés dans les puits. Après incubation, les puits sont lavés pour arrêter la réaction de compétition. L intensité de la couleur développée suivant la réaction substrat est inversement proportionnelle à la quantité d antigène présente dans l échantillon. Les résultats des échantillons peuvent être déterminés directement à partir de la courbe étalon. 4. PRECAUTIONS D EMPLOI 1. Seulement prévu au diagnostic in-vitro et à l usage professionnel. 2. Lire les instructions complètement et avec attention avant de commencer le test. Utiliser la version valide de la fiche technique incluse dans le kit. S assurer que tout a été bien compris. 3. Dans le cas de dommages importants de l emballage du kit, veuillez contacter IBL ou votre fournisseur sous forme écrite, une semaine au plus tard après avoir reçu le kit. N utilisez pas les composants abîmés pour un test, mettez-les de côté et en sécurité pour les besoins éventuels liés à la plainte. 4. Suivez le numéro du lot et la date de péremption. Ne pas mélanger les réactifs de différents lots. Ne pas utiliser de réactifs périmés. 5. Suivre les bonnes pratiques de laboratoire et les directives de sécurité. Porter des blouses de laboratoire, gants en latex à usage unique et lunettes de protection si nécessaire. 6. Les réactifs de ce kit contiennent du matériel dangereux pouvant irriter les yeux et la peau. Consulter le MATERIEL FOURNI et les étiquettes pour les détails. Les Fiches de Données de Sécurité pour ce produit sont disponibles sur le site internet IBL ou sur demande particulière à IBL. 7. Les réactifs chimiques préparés ou utilisés doivent être traités comme matériel dangereux en accord avec les directives et règlements nationaux de sécurité pour tout matériel à risque. 8. Le personnel de nettoyage doit être formé par des professionnels en ce qui concerne les risques potentiels et la manipulation des produits. Version 04/2015 (01) 1 / 6

3 9. Quelques réactifs contiennent de l acide de sodium (NaN 3 ) comme conservateurs. Laver abondamment à grande eau en cas de contact avec les yeux ou la peau. NaN 3 peut réagir avec le plomb et le cuivre pour former des acides de métal explosifs. L élimination de ces réactifs doit se faire avec une grande quantité d eau afin d éviter ce problème. 10. Tous les réactifs de ce kit contenant des sérums ou plasma humains ont été testés et confirmés négatifs à anti-hiv I/II, HbsAg et anti-hcv. Tous les réactifs doivent être considérés comme potentiellement contaminants et utilisés en tant que tel. 5. STOCKAGE ET STABILITE Le kit est envoyé à température ambiante et doit être stocké entre 2 C et 8 C. À conserver à l abri de la chaleur ou de la lumière directe. Le stockage et la stabilité des échantillons et réactifs préparés sont indiqués dans les chapitres correspondants. Les barrettes de la microplaque sont stables jusqu à la date de péremption du kit en étant stockées entre 2 C et 8 C dans le sachet déjà ouvert, mais hermétiquement refermé. 6. COLLECTE ET STOCKAGE DES ECHANTILLONS Sérum, Plasma Observer les précautions habituelles de prises de sang. Il est important de préserver l intégrité chimique d un échantillon sanguin, de sa collecte jusqu à son analyse. Ne pas utiliser d échantillons fortement hémolysés, ictériques ou lipémiques. Les échantillons d apparence turbide doivent être centrifugés avant analyse pour éliminer toute particule gênante. La signification clinique du dosage de la testostérone libre peut être invalide si le patient a été traité avec des stéroïdes ou de la cortisone naturelle ou synthétique.. Stockage: 2-8 C -20 C (Aliquots) Stabilité: 48 heures > 1 mois 7. MATERIEL FOURNI Quantité Symbole Composant 1 x 12x8 MTP 1 x 15 ml ENZCONJ 1 x 6 x 1.0 ml CAL A-F 1 x 1.0 ml CONTROL 1 1 x 1.0 ml CONTROL 2 1 x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP 1 x 50 ml WASHBUF CONC À conserver à l abri de la chaleur ou de la lumière directe. Eviter tout cycles de congélation / décongélation répétés. Envoyer les échantillons sous forme congelée. Avant le pipetage, l échantillon congelé doit être amené lentement à température ambiante et mélangé doucement. Ne pas décongeler les échantillons dans un bain-marie à 37 C. Microplaque Barrettes sécables. Recouvert de anticorps de chèvre anti-testostérone (monoclonal). Conjugué Enzymatique Prêt(e) à l emploi. Contient: Testostérone conjuguée à HRP. Étalon A-F 0; 0.2; 1.0; 4.0; 20; 100 pg/ml Prêt(e) à l emploi. Contient: Testostérone, Sérum humain, stabilisateurs. Contrôle 1 Prêt(e) à l emploi. Contient: Testostérone, Sérum humain, stabilisateurs. Concentrations / gammes acceptables sur les étiquettes ou sur le certificat CQ. Contrôle 2 Prêt(e) à l emploi. Contient: Testostérone, Sérum humain, stabilisateurs. Concentrations / gammes acceptables sur les étiquettes ou sur le certificat CQ. Solution Substrat TMB Prêt(e) à l emploi. Contient: TMB, Tampon, stabilisateurs. Solution d Arrêt TMB Prêt(e) à l emploi M H 2SO 4. Tampon de Lavage Concentré (10x) Contient: 160g/L NaCl; 10g/L Tween 20; 0.2M tampon phosphate. Version 04/2015 (01) 2 / 6

4 8. MATERIEL NECESSITE MAIS NON FOURNI 1. Pipettes (Multipette Eppendorf ou matériel similaire, CV < 3 %) Volumes: 20; 50; 100; 1000 µl 2. Vortex 3. Micropipette à 8-canaux avec réservoirs pour réactifs 4. Bouteille pour lavage, système automatique ou semi-automatique pour le lavage de microplaque 5. Incubateur, 37 C 6. Lecteur de microplaque capable de lire l absorbance à 450 nm (longueur d onde de référence nm) 7. Eau bidistillée ou désionisée 8. Papier absorbant, embouts de pipette et chronomètre 9. NOTES POUR LA PROCEDURE 1. Toute manipulation impropre des échantillons ou modification de la procédure du test peut influencer les résultats. Les volumes indiqués pour pipeter, les temps d incubation, températures et étapes de prétraitement doivent être strictement suivis selon les instructions. N utiliser que des pipettes et appareils calibrés. 2. Une fois que le test a commencé, toutes les étapes doivent être suivies sans interruption. S assurer que les réactifs, matériels et appareils nécessaires soient prêts au moment approprié. Amener tous les réactifs et échantillons à température ambiante (18-25 C) et mélanger doucement en tournant chaque flacon de réactif liquide et d échantillon avant emploi. Mélanger les réactifs sans former de mousse. 3. Eviter toute contamination des réactifs, pipettes et puits/tubes. Utiliser des nouveaux embouts de pipette en plastique pour chaque réactif, étalon ou échantillon. Ne pas interchanger les bouchons. Toujours refermer les flacons non utilisés. Ne pas réutiliser les puits/tubes ou réactifs. 4. Il est recommandé de doser les échantillons en double pour pouvoir identifier d éventuelles erreurs de pipetage. 5. Utiliser un schéma de pipetage pour vérifier la répartition appropriée de la plaque. 6. Le temps d incubation affecte les résultats. Tous les puits doivent être manipulés dans le même ordre et au même intervalle de temps. Il est recommandé d utiliser une micropipette à 8-cannaux pour pipeter une même solution dans tous les puits. 7. Le lavage de la microplaque est important. Des puits mal lavés provoqueront des résultats erronés. Il est recommandé d utiliser une pipette multicanaux ou un système de lavage de microplaque automatique. Ne pas laisser sécher les puits entre les incubations. Ne pas gratter les puits coatés pendant le rinçage ou l aspiration. Rincer et ajouter les réactifs avec précaution. Lors du rinçage, vérifier que tous les puits soient régulièrement remplis avec le tampon de lavage, et qu aucun reste ne soit ensuite visible. 8. L humidité affecte les puits/tubes coatés. Ne pas ouvrir le sachet avant que celui-ci n ait atteint la température ambiante. Les puits/tubes inutilisés doivent être rangés immédiatement dans le sachet refermé avec le dessiccateur. Version 04/2015 (01) 3 / 6

5 10. PREPARATIONS PREALABLES AU TEST Le contenu du kit pour 96 dosages peut être divisé en 3 analyses différentes. Les volumes indiqués ci-dessous sont pour un test avec toutes les barrettes (96 dosages). Préparation des composants lyophilisés ou concentrés Diluer / dissoudre Composant Diluant Relation Remarques Stockage Stabilité 50 ml WASHBUF CONC jusqu à 500 ml eau bidist. 1:10 Dissoudre les cristaux à C. 2-8 C 30 jours Dilution des Echantillons Prétraitement des échantillons: aucun Les échantillons dont la concentration dépasse 100 pg/ ml ne doivent pas être dilués. Toute dilution déplacera l équilibre entre la testostérone libre et les protéines sériques Préparation des étalons Avant l'utilisation, homogénéiser les étalons pendant 5 min. sur agitateur rotatif. Les étalons sont prêts à utiliser et ont les concentrations suivantes en testostérone: Etalon A B C D E F pg/ml Après la première utilisation les contrôles restent stables pendant encore 6 mois s ils sont conservés à 2 C et 8 C. 11. PROCEDURE DU TEST 1. Pipeter 20 µl de chaque Etalon, Contrôle et échantillon dans les puits respectifs de la microplaque. 2. Pipeter 100 µl de Conjugué Enzymatique dans chaque puits. 3. Bien mélanger pendant 10 secondes. 4. Incuber 1 h à 37 C. 5. Laver la plaque 3 x avec 300 µl de tampon de lavage dilué. Egoutter l excès de solution en retournant la plaque et en la tappant sur du papier absorbant. Note iimportante: Pendant chaque pas de lessive, secouez doucement la plaque depuis 5 secondes. Laveur automatique: Si vous utilisez un équipement automatisé, lavez les puits au moins 5 fois 6. Pipeter 100 µl de solution substrat TMB dans chaque puits. 7. Incuber 15 min à C à l obscurité (sans feuille adhésive). 8. Arrêter la réaction substrat en ajoutant 100 µl de solution d arrêt TMB dans chaque puits. Agiter la plaque rapidement. La couleur vire du bleu au jaune. 9. Mesurer la densité optique avec un photomètre à 450 nm (longueur d onde de référence: nm) dans les 5 min suivant l ajout de la solution d arrêt. 12. CONTROLE QUALITE Les résultats des tests ne sont valides que si les tests ont été effectués suivant les instructions. De plus, l'utilisateur doit respecter les règles des Bonnes pratiques de laboratoire (BPL) ou d'autres standards / lois applicables. L'utilisateur et/ou le laboratoire doit disposer d'un système validé pour obtenir des diagnostics selon les BLP. Tous les contrôles de kit doivent être compris dans les limites autorisées indiquées sur les étiquettes et dans le certificat de contrôle qualité. Si ces critères ne sont pas remplis, le test est non valide et doit être répété. Chaque laboratoire doit utiliser des échantillons connus comme contrôle supplémentaire. Il est recommandé de participer aux programmes de contrôle qualité appropriés. En cas de résultats présentant un écart, vérifier les origines techniques éventuelles : dates de péremption des réactifs (préparés), conditions de stockage, pipettes, appareils, conditions d incubation et méthodes de lavage. Version 04/2015 (01) 4 / 6

6 13. CALCUL DES RESULTATS Les densités optiques (DO) des étalons (axe y, linéaire) sont reportées en fonction de leurs concentrations (axe x, logarithmique) soit sur papier graphique semi-logarithmique soit en utilisant une méthode automatisée. Une bonne analyse est obtenue avec les méthodes cubic spline, Logistics 4 Paramètres ou Logit-Log. Pour le calcul de la courbe étalon, appliquer chaque signal des étalons (une valeur apparemment fausse d un double dosage peut ne pas être prise en compte et peut être remplacée par une valeur plus plausible). La concentration des échantillons peut être lue à partir de la courbe étalon. Conversion: Testostérone (pg/ml) x 3.47 = pmol/l Courbe Etalon Typique (Exemple. Ne pas utiliser pour vos calculs!) Étalon Testostérone DO moyenne DO/DO max (%) (pg/ml) A B C D E F VALEURS ATTENDUES Les résultats ne peuvent pas être l unique raison de conséquences thérapeutiques. Ils doivent être corrélés à d autres observations cliniques et tests diagnostiques. Des sujets apparemment sains ont montré les valeurs suivantes: Testostérone libre n sérum Moyenne [pg/ml] Gamme [pg/ml] Hommes (âge) Femmes (âge) < ND > < ND ND ND ND 2.85 > ND 1.56 Il est recommandé que chaque laboratoire établisse ses propres valeurs normales. 15. LIMITES DE LA PROCEDURE La collecte et stockage des échantillons a une influence significative sur les résultats du test. Voir le paragraphe COLLECTE ET STOCKAGE DES ECHANTILLONS pour plus de détails. Pour les réactivités croisées, voir PERFORMANCE. Version 04/2015 (01) 5 / 6

7 16. PERFORMANCE Spécificité Analytique (Réactivité Croisée) Sensibilité Analytique (Limite de Détection) Précision Substance Réactivité Croisée (%) DHT Androstènedione β-Estradiol α-Ethinylestradiol Norgestrel pg/ml Signal moyen (Etalon zéro) - 2SD Réactivité croisée d autres substances testées < % Intra-Essai Inter-Essai n = 20 Moyenne 8.9 % n = 10 Moyenne 12.4 % 17. LITTERATURE DE REFERENCE DU PRODUIT 1. Andersen, O. M. (2003): Essential Role of the Apolipoprotein E Receptor 2 in Sperm Development. In Journal of Biological Chemistry 278 (26), pp , checked on 10/03/ Fritz, K. S.; McKean, A. J.; Nelson, J. C.; Wilcox, R. B. (2008): Analog based free testosterone test results linked to total testosterone concentrations, not free testosterone concentrations. In Clin Chem 54 (3), pp Nieschlag, E. (2005): Entwicklungsstand der hormonellen männlichen Kontrazeption. In Deutsches Ärzteblatt Selby, C. (1990): Sex hormone binding globulin: origin, function and clinical significance. In Ann. Clin. Biochem 27 (Pt 6), pp Swerdloff, R. S.; Wang, C. (2008): Free testosterone measurement by the analog displacement direct assay: old concerns and new evidence. In Clin Chem 54 (3), pp Vermeulen, A.; Stoïca, T.; Verdonck, L. (1971): The apparent free testosterone concentration, an index of androgenicity. In J. Clin. Endocrinol. Metab 33 (5), pp Wheeler, M. J. (1995): The determination of bio available testosterone. In Ann. Clin. Biochem 32 (Pt 4), pp Winters, S. J.; Kelley, D. E.; Goodpaster, B. (1998): The analog free testosterone assay: are the results in men clinically useful? In Clin. Chem 44 (10), pp Version 04/2015 (01) 6 / 6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /