Contribution «K» à l effet biologique des rayonnements ionisants
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- Michel Roux
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1 Université Paris VI École Doctorale : La Physique de la Particule au Solide ; Modèles & Expériences présentée par Mr Arnaud BOISSIÈRE 08 septembre 2004 Thèse réalisée dans les laboratoires d accueil : Équipe Mécanismes Physiques de Létalité et Mutagenèse (MPLM) GPS, UPMC Paris 6 : A. Chetioui Directrice de Thèse Laboratoire de Radiobiologie et Oncologie (LRO) DSV/DRR, CEA Fontenay-aux-Roses : L. Sabatier
2 Plan de l exposé - Introduction - Contexte & Objectifs - Méthodes expérimentales - Résultats 1. Survie cellulaire 2. Aberrations chromosomiques 3. Contribution «K» à la létalitl talité des rayonnements γ - Conclusions et perspectives
3 - Introduction - Contexte & Objectifs - Méthodes expérimentales - Résultats 1. Survie cellulaire 2. Aberrations chromosomiques 3. Contribution «K» à la létalitl talité des rayonnements γ - Conclusions et perspectives
4 Introduction 1 Chronologie des événements après irradiation Mort cellulaire incorrecte réparation correcte Instabilité à long terme Mutations Formation de remaniements Survie Carcinogenèse Transformation cellulaire
5 Introduction 2 Interaction rayonnement-matière Dommages primaires physiques et biologiques dans des cellules de mammifères irradiées sous faible TEL (1Gy, rayons γ) [H. Nikjoo et al. (I.J.R.B, 1998)] Rayonnement : faible TEL Traces dans le noyau 1000 Ionisations dans le noyau Ionisations dans l ADN 1500 Excitations dans l ADN 1500 Dommages de bases 10 4 Cassures simple-brin d ADN csb 850 Cassures double-brin d ADN cdb 40 Aberrations chromosomiques 0,3 Dicentriques 0,1 Lésions létales 0,3 % Inactivation cellulaire 30%
6 Introduction 3 - Quels sont les événements critiques à l origine des effets biologiques des rayonnements ionisants? - Rôle des événements d ionisation en couche interne (I.C.I) dans la mort cellulaire (rayons X, rayons γ et e - rapides)? - Rôle des événements de cœur dans l induction d aberrations chromosomiques et d instabilité génomique?
7 - Introduction - Contexte & Objectifs - Méthodes expérimentales - Résultats 1. Survie cellulaire 2. Aberrations chromosomiques 3. Contribution «K» à la létalitl talité des rayonnements γ - Conclusions et perspectives
8 Contexte 1.1 Premier modèle d événements physiques critiques (Goodhead et al.) Mort cellulaire attribuée à l action sur l ADN des grappes d ionisation (clusters) en fin de trace des électrons secondaires N lét = ε lét x N cluster
9 Contexte 1.2 Mise en évidence de désaccords entre le modèle et l expérience - Rayonnements électromagnétiques : - Ions : EBR (E) / EBR (278 ev) K c ~290eV Energie des photons (ev) EBR théoriques (m-d de traces) EBR théoriques (m-d de traces et locaux) Points expérimentaux Noumber of lethal events ( cell -1. Gy -1 ) 10-1 calculs : He U Kr Fe Ar Ne F expérience : He U Kr Fe Ar Ne F LET(keV / µm) Rappel : EBR : efficacité biologique relative ; rapport des doses de 2 rayonnements pour induire le même effet proportionnel au nombre d événement létaux. TEL : transfert d énergie linéique ; de/dx (kev/µm).
10 Contexte 2.1 Modèle d événements de cœur (MPLM et LRO) Ionisation en couche externe : Ionisation en couche interne : Plus de 99% des événements Complexe ~500 fois moins probable mais dégage ~30 fois plus d énergie
11 Contexte 2.2 Comparaison des sections efficaces expérimentales d inactivation cellulaire par ions et des prédictions du modèle d évènements de coeur inactivation cross sections (µm2) mammifère H levure bactérie [Kraft, Adv.Space Re., 1987] [Chetioui et al., IJRB, 1994] He 1 MeV/u V = V (C, N, O) K TEL = de/dx (kev/µm) - comportement en «crochet» - décroissance à haut TEL (paradoxe?) Fe Ar Ar F Ar Ar Kr U Ni Xe Xe U+Pb Pb Xe Kr TEL = dε/dx (kev/µm) U mammifère levure bactérie H H H Ne Ne Ne He He He F F Fe Ar F Fe Ar Fe Ar Kr TEL = dε/dx (kev/µm) Kr Kr U U U H He F Ne Ar Fe Kr U
12 Contexte 2.3 Comparaison des EBRexpérimentales d inactivation cellulairepar rayonnement électromagnétique et des prédictions du modèle d événements de cœur. 3 K c --- EBR des rayonnements X ultra-mous prédites par le modèle «K» (trait plein) en cellules V79 EBR (E) / EBR (278 ev) 2 1. EBR des rayonnements X ultra-mous et expérimentales (point noirs) en cellules V Energie des photons (ev) Accroissement abrupt d un facteur 2 de l EBR au seuil K du carbone augmentation d un facteur 2 du nombre d I.C.I des atomes de l ADN
13 Contexte 2.4 Schéma proposé pour l induction de cassures complexes de l ADN par événements de cœur Événements de cœur sur l ADN conjuguent interaction physique la plus intense et site le plus «stratégique» de la cellule K Electron Auger Electron secondaire Ils sont donc proposés comme vecteurs d effets biologiques ADN ~2nm
14 Contexte 3 Derniers résultats en faveur du modèle «K» (en cellules V79 sous rayons X ultra-mous) 1000 nombres moyens / Gy cassures double brin ionisations K sur l'adn hydraté événements létaux aberrations (dic + anneaux) 0, Energie (ev) - Événements «K» = événements physiques responsables des effets biologiques des rayons X ultra-mous
15 - Introduction - Contexte & Objectifs - Méthodes expérimentales - Résultats 1. Survie cellulaire 2. Aberrations chromosomiques 3. Contribution «K» à la létalitl talité des rayonnements γ - Conclusions et perspectives
16 Objectifs - Corrélation mort cellulaire - événements «K» pour d autres types cellulaires? - survie de cellules humaines (B3) à des irradiations X ultra-mous (et ions) - Corrélation translocations (aberrations impliquées dans le cancer) - événements «K»? - cellules B3 irradiées en X ultra-mous - Étude quantitative de la contribution «K» à la létalité des rayonnements rencontrés dans la pratique : e - rapides et γ.
17 - Introduction - Contexte & Objectifs - Méthodes expérimentales - Résultats 1. Survie cellulaire 2. Aberrations chromosomiques 3. Contribution «K» à la létalitl talité des rayonnements γ - Conclusions et perspectives
18 Méthodes Physiques 1 Événements «K» sondés par les rayons X ultra-mous (utilisation du rayonnement synchrotron) - Utilisation de la propriété unique de ces rayons d interagir avec la matière biologique presque exclusivement par ICI Énergies des X ultra-mous P 250 ev 350 ev 810 ev 230 ev 330 ev Ionisations en couche externe I.C.E 70% 26% 6% Ionisations «K» (I.C.I) Nombre d événements «K» /Gy 115 ev 110 ev C,P 60 ev 250 ev C, N, O, P 500 ev 30% 74% 94% ev 250 ev Test décisif du rôle des événements de cœur - ajuster l énergie X fixer l énergie des électrons émis - sélection d un seuil K d un atome cibler 1 atome donné : variation nb ICI /ADN - Choix d énergies X assurant l isoatténuation dans la cellule
19 Méthodes Physiques 2 Choix des énergies de rayons X ultra-mous isoatténuées Noyau L(P) K(C) K(O) D / Do 0.5 Absorption ev 340 ev épaisseur (µm ) Energie des photons (ev). Même profil de dose dans la cellule. Possibilité de comparer les effets entre énergies
20 Méthodes Physiques 3 Dispositif d extraction du faisceau d X 150 nm N4Si3 0.9 µm Mylar Détecteurs alignés avec les cellules CI / PD Faisceau Synchrotron (SU7) Y X Z Ultravide -7 P=10 torr 4 mm Monocouche Pompe Ionique Pompe Ionique Pompe Turbo moléculaire de cellules B3 (cellules humaines) - Impératif physique : minimum d épaisseurs interposées entre le faisceau et la cible - Impératif biologique : irradiation à l air et à pression atmosphérique
21 Méthodes Physiques 4 Techniques physiques - Caractérisation du faisceau : - Dosimétrie : - mesure des harmoniques par mesure d absorption de matériaux calibrés en épaisseur - Étalonnage en efficacité de détecteur de rayons X ultra-mous (photodiode) par référence à un détecteur absolu (chambre d ionisation) - Détermination très précise des épaisseurs - des matériaux interposées dans le faisceau - des 200 supports cellulaires (5 points par support) - des divers compartiments cellulaires eux-mêmes méthodes nucléaire d analyse Van de Graaf (GPS) microscopie confocale (MRC Harwell)
22 Méthodes Biologiques 1 Tests et études préliminaires : - culture des cellules en monocouche sur mylar - cycle cellulaire : 24h - protocoles d irradiation :. mises au point pour la culture et l analyse. cellules en phase G o /G 1. récolte des cellules sur mylar Étude de la survie cellulaire classique -à11j (>50 cellules survivantes par colonies) Étude des aberrations chromosomiques : - Caryotype 24h après l irradiation - Hybridation in situ : télomères et mfish
23 Méthodes Biologiques 2 Les cellules B3 Cellules humaines provenant de sous-clônes de cellules du carcinome de la vessie (E.J Blader) Caryotype témoin (non irradié) : 3 translocations clonales Caryotype établi par méthode mfish t(10;22) t(11;20) t(15;18)
24 - Introduction - Contexte & Objectifs - Méthodes expérimentales - Résultats 1. Survie cellulaire 2. Aberrations chromosomiques 3. Contribution «K» à la létalitl talité des rayonnements γ - Conclusions et perspectives
25 Résultats 1.1 Survie cellulaire en rayonnement gamma Cs 0,67Gy/min -1 Fraction de survie (%) 1 0,1 rappel modèle L-Q : S(D) = e -α.d+βd² 0,01 0,001 survie γ ajustement exponentiel Dose (Gy) α 0,23/Gy β 0,062/Gy² D 1/10 (γ) = 4,6 Gy B3 plus radiosensibles que V79 (D 1/10 ~7Gy)
26 Résultats 1.2 Cellules B3 Survie cellulaire en ions lourds Cellules V79 (rappel) 10 Ions Ar 95 MeV/u (HE) ajustement linéaire Survie (%) 1 0,1 0,01 0,0E+00 1,0E+06 2,0E+06 3,0E+06 4,0E+06 5,0E+06 6,0E+06 Fluence (ions/cm²) σ 253keV/µm = 36µm² 10 1 Ions Ar 13,6 MeV/u (SME) ajustement linéaire Survie (%) 0,1 0,01 0,001 0,E+00 5,E+06 1,E+07 2,E+07 2,E+07 3,E+07 Fluence (ions/cm²) σ 1325keV/µm = 27µm² - σ(b3) ~ σ(v79) - σ(b3) en accord avec le comportement en crochet des V79
27 Résultats 1.3 Survie cellulaire en rayonnement X ultra-mous (250eV et 350eV) 1 Survie corrigée (%) 0,1 0,01 350eV 250eV ajustement exponentiel (350eV) ajustement exponentiel (250eV) barres d erreur importantes : - transport des cellules - double couche 0, Dose entrée (Gy) EBR(250eV)γ ~ 3 et EBR(350eV)γ ~ 9 EBR(350/250) = 3±0,9 On retrouve pour des cellules humaines la corrélation événement «K» - événement létaux mise en évidence pour les V79 Cette corrélation traduit très vraisemblablement une relation de causalité
28 - Introduction - Contexte & Objectifs - Méthodes expérimentales - Résultats 1. Survie cellulaire 2. Aberrations chromosomiques 3. Contribution «K» à la létalitl talité des rayonnements γ - Conclusions et perspectives
29 Résultats 2.1 Translocations induites par rayons X ultra-mous à 250 ev et 350 ev Rapport d EBR d induction de translocations entre ces deux énergies : 14 EBR(350/250) ~1,8 fréquence de translocations par métaphase ev 350 ev ajustement linéaire (350 ev) ajustement linéaire (250 ev) dose d'entrée dans la cellule (Gy) grandes barres d erreur liées - témoin instable - statistique très faible - Possible efficacité accrue d induction de translocations pour le rayonnement à 350 ev (~ x1,8) malgré des barres d erreur importantes. - Le rapport d induction 350/250 pour les V79 était de 2,8±1
30 Résultats 2.2 Aberrations d échange complexes (plus de 2 cassures dans plus de 2 chromosomes) induites par rayons X ultra-mous à 250 ev et 350 ev fréquence de translocations complexes par métaphase ev 350 ev ajustement linéaire (350 ev) ajustement linéaire (250 ev) dose d'entrée dans la cellule (Gy) Aucun échange complexe dans les témoins non irradiés EBR(350/250eV) ~ 3,3 - Capacité des X ultra-mous à induire des échanges complexes déjà observée par Griffin et al. (2003). - Mise en évidence d une sur-efficacité du rayonnement à 350 ev / 250 ev tout à fait nouvelle pour ce type d aberrations.
31 Résultats 2.3 Aberrations chromosomiques complexes impliquant plus de 3 chromosomes induites par rayons X ultra-mous à 250 ev et 350 ev
32 Résultats 2.3 Aberrations chromosomiques complexes impliquant plus de 3 chromosomes induites par rayons X ultra-mous à 250 ev et 350 ev 7 fréquence de traslocations complexes p métaphase (> 3 chromosomes impliqué ev 350 ev ajustement linéaire (350 ev) ajustement linéaire (250 ev) ajustement polynomial (350 ev) dose d'entrée dans la cellule (Gy) - EBR(350eV/250eV) ~4 : grande sur-efficacité du rayonnement à 350 ev - Accroissement de la complexité avec la dose. - Complexité plus importante à 350 ev / 250 ev
33 Résultats 2.4 Discussion - Une aberration complexe peut-elle être engendrée par 1 événement «K» unique?. possible au vu de la quasi-linéarité à basse dose - Sur-efficacité d induction à 350eV/250eV :. corrélation avec les événements «K» sur l ADN, - Complexité des aberrations accrue à 350 ev / 250 ev :. lésions plus complexes? réparation plus difficile aberrations plus complexes?
34 - Introduction - Contexte & Objectifs - Méthodes expérimentales - Résultats 1. Survie cellulaire 2. Aberrations chromosomiques 3. Contribution «K» à la létalitl talité des rayonnements γ - Conclusions et perspectives
35 Résultats 3.1 Contribution des événements «K» à l inactivation cellulaire pour les rayonnements usuels de bas TEL (cas des cellules V79). Étapes du calcul : - Simulation Monte Carlo des événements dans la trace de rayonnements de bas TEL (e - rapides de 100 kev) - Détermination du rendement d événements de cœur créés par ce rayonnement-type sur l ADN (cellules V79) en partant de l interaction e - 100keV / molécule H 2 O. - Extraction du rendement en événements létaux théorique (η lét.k ), et comparaison avec le rendement en événements létaux expérimental (η lét.exp ). Le rapport de ces 2 η lét correspond à la contribution «K»
36 Résultats 3.2 Principe du calcul - η létal.exp est extrait de la dose correspondant à 1/10 de survie, D 1/10 ln(p survie=1/10 ) 2,3 0.9 ηlét. exp η = 0, 28 létal.exp 7,2 EBR e - 100keV D 1/10 ( 60 Co) S = ηlét e EBRRay. = D D D 1/10 1/10 60 ( Co) ( Ray.) - Le nombre moyen d événements létaux par gray provenant d événements «K» sur l ADN est : η i létal. K K lét E i i = η < ε ( ) > ηk i i ε lét < (E) > : nombre d événements de coeur par gray pour l espèce i considérée : efficacité létale moyenne relative aux événements de cœur de l espèce i On aura donc pour la contribution «K» à la létalité : CK = i η K i < ε 0,29 i lét ( E) >
37 Résultats 3.3 ηk i Calcul du nombre d événements «K» sur l ADN - Évaluation du nombre moyen N K d événements «K» crées par 1Gy d e - 100keV / l eau. déduction de η K, nombre d événements «K» sur l ADN par Gy absorbé, en corrigeant des nombres d atomes en présence et de leurs capacités relatives à être ionisés en couche interne. - Pour un noyau de cellule V79 (M=289pg), 1Gy d e - 100keV N e électrons de 100keV absorbé par le noyau (N e =18,1). η K C O P [ nc σ K ( E) + no σ K ( E) + np 4 σ L ( E) + n = Ne NK < O N σ H 2 0 K N σ N K ( E) + n Na σ Na K ( E)] > - Deux codes Monte Carlo TILDA et TRACELE ont été utilisé : code TILDA N K 8 code TILDA η K 8,1 TRACELE 9,4 TRACELE 9,5
38 Résultats 3.5 i ε lét < (E) > Efficacité moyenne attribuée à un événement de cœur ε K i ε Ki calculée en s appuyant sur les valeurs expérimentales en rayons X mous et moyennée sur l ensemble des valeurs possibles des énergies des e - secondaires. Type d ionisation (i) E A : Energie des électrons Auger (ev) Energie médiane des électrons secondaires (ev) i ε lét < (E) > couche K de C ,0% couche K de N ,4% couche K de O ,7% couche L de P ,1%
39 Résultats 3.6 Contribution «K» à la létalité des rayonnements de bas TEL code TILDA (e - rapides 100 kev) TRACELE (e - rapides 100 kev) PARTRACK (photons de 1 MeV) η létal.k 0,18 0,21 0,24 η létal.exp (V79) 0,28 0,28 0,33 La contribution des événements «K» à l inactivation cellulaire des rayonnements de bas TEL (e - rapides et γ) pour la lignée cellulaire V79 est donc : < >= 75% CK ± 25%
40 - Introduction - Contexte & Objectifs - Méthodes expérimentales - Résultats 1. Survie cellulaire 2. Aberrations chromosomiques 3. Contribution «K» à la létalitl talité des rayonnements γ - Conclusions et perspectives
41 Conclusions - Reproduction des résultats établis auparavant en cellules de mammifères avec des cellules humaines B3 en X mous et en ions. - sections efficaces d inactivation cellulaire en ions lourds en accord avec les «crochets» des sections efficaces d ionisation «K». - forte «sur-efficacité» biologique pour l inactivation cellulaire et la production d aberrations d échanges à 350 ev par rapport à 250 ev en rayonnement X ultra-mous, reproduisant l accroissement d événements «K» sur l ADN. - Les événements de cœur sur l ADN apparaissent comme responsables des effets biologiques des X ultra-mous. - Contribution des événements «K» à l inactivation cellulaire induite par les rayonnements utilisés en radiothérapie et impliqués dans les risques radiologiques (e - rapides et γ) 75±25%
42 Perspectives - Étude de la contribution des événements «K» à l induction d aberrations chromosomiques d échange par rayonnement γ et e - rapides - Recherche d un rôle éventuel des événements de cœur dans l induction des aberrations retardées. - Détermination des mécanismes mis en jeu : - étude de la complexité des cassures doubles brin induites par les événements «K» ainsi que leur réparabilité. - étude de la fragmentation moléculaire de l ADN induite par les ionisations en couche interne. - Contribution à l élaboration de protocoles thérapeutiques : - calcul des EBR des ions lourds - prédiction des effets d atomes lourds photo-ionisés au seuil K incorporés dans les cellules tumorales. - prédiction des effets d émetteurs Auger incorporés dans les cellules tumorales.
43 Plan de l exposé - Introduction - Problématique & Objectifs - Méthodes expérimentales - Résultats 1. Survie cellulaire 2. Aberrations chromosomiques 3. Contribution «K» à la létalitl talité des rayonnements γ - Conclusions et perspectives
44 Merci ;-b Àmon Papa
45 Si tu peux voir détruit l'ouvrage de ta vie Et sans dire un seul mot te mettre à rebâtir Ou perdre d'un seul coup le gain de cent parties Sans un geste et sans un soupir ; Si tu peux être amant sans être fou d'amour, Si tu peux être fort sans cesser d'être tendre Et te sentant haï, sans haïr à ton tour, Pourtant lutter et te défendre ; Si tu sais méditer, observer et connaître Sans jamais devenir sceptique ou destructeur ; Rêver sans laisser ton rêve être ton maître, Penser sans n'être qu'un penseur ; Si tu peux être dur sans jamais être rage, Si tu peux être brave sans jamais être imprudent, Si tu sais être bon, si tu sais être sage Sans être moral ni pédant ; Si tu peux supporter d'entendre tes paroles Travesties par des gueux pour exciter des sots, Et d'entendre mentir sur toi leur bouches folles Sans mentir toi-même d'un seul mot ; Si tu peux rester digne en étant populaire, Si tu peux rester peuple en conseillant les rois Et si tu peux aimer tous tes amis en frère Sans qu'aucun d'eux ne soit tout pour toi ; Si tu peux rencontrer Triomphe après Défaite Et recevoir ces deux menteurs d'un même front, Si tu peux conserver ton courage et ta tête Quand tous les autres les perdront, Alors les Rois, les Dieux, la Chance et la Victoire Seront à tout jamais tes esclaves soumis Et, ce qui est mieux que les Rois et la Gloire, Tu seras un Homme, mon fils. R. Kipling
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