En vue de l'obtention du

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1 THÈSE En vue de l'obtention du DOCTORAT DE L UNIVERSITÉ DE TOULOUSE Délivré par l'université Toulouse III - Paul Sabatier Discipline ou spécialité : Physiopathogie Cellulaire, Moléculaire et Intégrée Présentée et soutenue par JAILLARD Tristan Le 15 Juillet 2009 Titre : Les espèces actives de l'oxygène: nouveaux acteurs de la signalisation hypothalamique de l'insuline nécessaire au contrôle de la prise alimentaire JURY Pr. Louis CASTEILLA, Président Dr. Béatrice MORIO, Rapporteur Pr. Christophe MAGNAN, Rapporteur Dr. Tarik ISSAD, Examinateur Dr. Anne DEVIN, Examinatrice Pr. Anne LORSIGNOL, Directrice de thèse Ecole doctorale : Biologie - Santé - Biotechnologies TOULOUSE III Unité de recherche : UMR 5241 Directeur(s) de Thèse : Pr. Anne LORSIGNOL Rapporteurs : Dr. Béatrice MORIO, Pr. Christophe MAGNAN

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3 Voici 4 années qui s achèvent, à mon goût de façon trop brutale, malgré la longue épreuve que représente la rédaction de la thèse Une fois la thèse écrite, l oral préparé, on a hâte d en finir, et puis quand c est fini, une véritable tristesse et nostalgie sont au rendez-vous! Je pense que cette contradiction vient du fait que l on se rend compte tout à coup qu on est en train de perdre les liens affectifs que l on a tissés tout au long de cette expérience Bien sûr que les liens les plus forts persistent en dehors du laboratoire mais les plus faibles ont également leur importance et leur absence soudaine amplifie le vide ressentit! Alors c est tout naturellement que je ressens le besoin de présenter à chacun mes sentiments et émotions. Sûrement trop émotif, je n ai pas réussi à le faire lors de ma soutenance de thèse, je vais donc ma rattraper en le faisant par écrit, c est plus facile! Je tiens à remercier tout d abord les membres du jury d avoir accepté d évaluer mon travail de thèse et de s être déplacé sur Toulouse. Je vous ai trouvé très sympathique, Béatrice et Christophe, et j ai eu le plaisir de vous revoir lors de la thèse d Anne-Laure. Merci Anne (Devin) d être encore une fois intervenue au cours de ma thèse, j ai vraiment apprécié d interagir avec toi en cette fin de thèse, ton aide fût précieuse et d un grand secours! Enfin Louis! Un grand merci de m avoir fait l honneur de présider mon jury de thèse. Je crois avoir trouvé en vous mon maître à penser. Nous sommes sur la même longueur d onde et j aurais vraiment eu beaucoup de plaisir à travailler, discuter avec vous, les meilleures discussions étant bien sûr celles du soir autour d un p tit verre de calva!!! Cette première expérience professionnelle qu est la thèse est difficile car on apprend à être autonome à différents points de vue mais finalement, en comparaison avec la vraie vie du monde adulte professionnel, on est assez privilégié puisqu un «papa» ou une «maman» est toujours là! Anne, tu m auras permis de m exprimer librement et de mener ma tambouille comme bon me semblait, tout en assurant le rôle de garde fou ainsi que les arrières en cas de casse! Je sors de cette expérience fort d une autonomie aussi bien d un point de vue technique, conceptuelle, que dans la gestion de personnes, en ça je te remercie! Dans ce contexte d encadrement, je vous remercie aussi Luc, pour tout le temps que vous avez passé à m aider, aussi bien à réfléchir qu à maniper (je tiens à le souligner!). Et puis, personnellement, je vous apprécie bien tous les deux, je me suis attaché à vous, et je serai content de garder contact. Corinne, merci beaucoup pour avoir toujours répondu présente lorsque j avais mille questions techniques et théoriques, souvent en fin de journée Et puis «Morandini» dans ta jeunesse, on s en souviendra (cf Seix 2005)! Merci aussi Alex pour les nombreuses heures passées à faire des expériences de respi (nocturnes ), de western et j en passe, et pour tes conseils avisés! Merci Michel R. pour votre précieuse aide dans l analyse des manip de respi, qui nous a souvent permis de rectifier le tire! Maryse, Oh Maryse! Tu as été pour moi une véritable maman à mon entrée dans le laboratoire! Pas à pas, tu m as appris les techniques qui ont été nécessaires à la mise en place de ma thèse. Tu as largement contribué à la réflexion et l avancé du sujet, dans l ombre, mais de façon tout à fait juste et pertinente! Et puis, au-delà du travail, nous avons passé de très agréables moments à discuter et partager nos façons de penser que nous avons en commun, Maryse tu resteras gravé dans mon cœur. On ne peut pas parler de Maryse sans parler bien sûr de Pascalou! Sans toi, Pascalou, ma thèse aurait été autre! C est possible que nous ayons battu le record du nombre de souris

4 utilisées pour une thèse, qu en penses-tu? J ai vraiment beaucoup apprécié travailler avec toi, ta bonne humeur, mais aussi ton sale caractère! Sans oublier les nombreuses oies que tu perdais régulièrement et tes lunettes aussi etc! Enfin, Pascalou quoi! Merci. De Pascalou on en vient à Mama! American classe s! Hye hye! Bon ben là, il y en a des choses à dire comment dire merci Mama d être toi, ne change rien, enfin si change beaucoup de choses bref une gestionnaire-secrétaire d enfer, qui lors de ses pauses fait des démos de danse africaine dans le couloir, ça c est la classe! Mama, je sais que je te manque au labo, ne me le cache pas, avoue! Mama spéciale dédicace! Qui dit Mama, dit Mr Alain, rock star qui a besoin de lunettes de soleil pour y voir clair pendant les soutenances de thèse! Merci Alain pour ta gentillesse, tous les services rendus, les conneries et blagues racontées à midi! Christophe et Anne-Laure, merci pour les nombreux coups de main et pour les discussions scientifiques. Merci A-L et Jérémie pour m avoir sauvé, hébergé, etc lorsque tout allait mal avec ce foutu EndNote! Et puis, Christophe et A-L, potos de la pause café, de midi, et plus encore! La fin de thèse a été vraiment agréable en votre présence, surtout grâce à la terrasse du 4R3! A nous 3 (enfin 6 avec Emilie, Jérémie et Cindy), nous contribuons à abaisser la moyenne d âge du premier enfant, c est vraiment génial que nous pussions partager ces joieslà! Bonne route à vous! Sandrine, ma chère Sandrinette, ex-voisine de bureau, mais aussi d appartement! Merci pour tes coups de main en manip, les capsules de café offertes et les rigolades dans le bureau! Nous t avons sauvagement abandonné en cours de thèse, j en suis navré, tu nous l as beaucoup rappelé mais si Sandrine, on pensait à toi, je te jure! Bonne chance pour la suite! En tant qu ex-voisines de bureau, Béatrice et Valérie, vous avez comme Sandrine acquise un statut spécial! Merci de m avoir gentiment accueillis à mon arrivée dans le laboratoire, en plein été quand il n y avait pas un chat sauf vous 2! Les années passées en votre compagnie furent bien agréables. Petite Marie, Julie-Anne, l une championne du concours de crêpes l autre de guitare! Ces années passées à vos côtés étaient fortement sympathiques et j espère que nous aurons souvent l occasion de nous voir, malgré l éloignement. Je vous souhaite beaucoup de bonheur. Merci à vous, Manolita et Josi, pour votre extrême gentillesse, serviabilité et pour le gros boulot que vous effectuez quotidiennement et qui permet au labo de bien tourner! Merci Mireille pour ton rôle d ACMO que tu joues à merveille et t inquiètes, Lily aura son brevet Fingers in the noise! Merci à Michael et Sylvie-Anne pour les nombreuses manips effectuées au cours de leur stage de DESU et de maîtrise qui m a permis de présenter les nombreux résultats qui figurent dans ma thèse. J espère que vous réussirez dans votre avenir. Merci Anne G. pour avoir été aussi réactive lorsqu on t a sollicité pendant le rewieving du papier, et puis j ai bien apprécié travailler avec toi! Merci également Manue pour avoir pris de ton temps pour faire les nombreuses manips de rewieving qui malheureusement n ont pas

5 servit mais il fallait les faire pour voir les réultats J espère qu on aura l occasion de se revoir, peut être chez Anne L.? A+ Merci bien sûr aux services de zootechnie du CHU et de la fac pour l entretien des animaux (Yara, Corinne, Hubert ). Coucou aux autres, Yannick, Corinne B, Stéphanie, Sandra, Fabienne, les Cécile, Ambre, Alan, Thomas, Laurent, Marlène, Marie-Christine, Valérie, Géraldine, Lionel, Alexandra, Alice, Camille, Pascale, Laetitia, Nöellie, Farnoosh, Sandy Votre compagnie était fort agréable et je vous souhaite tout plein de bonnes choses pour la suite. Spéciale dédicace à Lulu, tu m as bien aidé en fin de rédaction à rentrer les références biblio, quand EndNote a planté et a mis en désordre les 300 réf dans le texte de ma thèse à 3 jours de rendre le manuscrit! Merci Micka et petzouille pour m avoir appris à me servir de Word pendant la rédaction de ma thèse et pour vos conseils par téléphone! Salut les copains de maîtrise et DEA, Fredouille, Steph, Edith, Julien, votre soutien et amitié sont précieux pour une bonne réussite! Enfin, merci maman, merci papa pour m avoir toujours soutenu quels que soient mes choix. Vous m avez permis de terminer mes études qui furent longues, alors en retour, je suis heureux d avoir pu lire dans vos yeux de la fierté après ma soutenance de thèse. Frérot Quentin, j étais super content que tu viennes à ma thèse, et t en remercie! Bon courage Mr le nouvel enseignant! Et puis cet événement heureux s en est suivi d un second puisque Junon est née dans la nuit du 16 juillet 2009! Merci ma fille d avoir laissé à ta maman le temps d assister à ma thèse, nous avons pu comme cela vivre, ensemble, tous les trois, les plus beaux moments de notre vie! Je vous aime très fort toutes les deux, je connaissais déjà la joie de t aimer de tout mon cœur, ma petite chérie Cindy, douce, jolie, attentionnée, avec qui le temps passe trop vite, et aujourd hui j ai la joie de découvrir un second amour! Ma fille tu es la plus belle! Cindy, on s est connu sur les bancs de la fac en 2003, depuis on trace notre route coude à coude, encore plus pendant la thèse qui comporte des moments difficiles Tu m a beaucoup soutenu moralement durant ces derniers mois d écriture et d oral pendant que moi-même je te soutenais pour la grossesse! Ton tour est proche, les rôles s inversent, je te souhaite une excellente thèse. Baiser d amour et longue vie à nous deux!

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7 RESUME L insuline joue un rôle clé dans le contrôle nerveux de l homéostasie énergétique, notamment en agissant au niveau de l hypothalamus pour réduire la prise alimentaire. Le rôle crucial des espèces actives de l oxygène (EAOs) dans le contrôle nerveux de la balance énergétique et dans la signalisation de l insuline commence à émerger. Cependant, leur implication dans l effet anorexigène de l insuline restait à déterminer. L objectif de notre travail a été d évaluer, chez la souris, le rôle joué par les EAOs dans l action anorexigène de l insuline. Nos résultats montrent que l injection intra-cérébro-ventriculaire (3 ème ventricule) d insuline (2.4nM) induit dans l hypothalamus 1) une élévation de la quantité d EAOs (+36% en 15min), 2) une inhibition de la respiration mitochondriale (-50/60% en 15min), et 3) une inhibition de la prise alimentaire sur 24h. Un prétraitement avec un antioxydant, des inhibiteurs de la NADPH oxydase (NOX), ou un agent découplant de la chaîne respiratoire mitochondriale supprime l ensemble des effets de l insuline. Ces résultats démontrent l implication des EAOs dans l action hypothalamique de l insuline, notamment celles dérivées de la NOX. Au final, nous montrons que le niveau de prise alimentaire est corrélé au niveau hypothalamique d EAOs et au flux respiratoire mitochondrial. Nous proposons donc que la régulation du niveau hypothalamique d EAOs et du flux respiratoire mitochondrial sont indispensables à l inhibition de la prise alimentaire induite par l insuline. En conclusion, notre travail révèle que les EAOs constituent de nouveaux acteurs de la signalisation hypothalamique de l insuline impliquée dans le contrôle du comportement alimentaire. 1

8 ABTRACT In addition to its peripheral hypoglycaemic action, insulin plays an important role in the hypothalamic control of energy balance, especially by reducing food intake. Emerging data point out a pivotal role for reactive oxygen species (ROS) in the energy homeostasis regulation and insulin signaling, but their involvement in the anorexigenic insulin effect was not determined yet. The main objective of our work was to investigate the contribution of hypothalamic ROS in the regulation of feeding behaviour by insulin in mice. Our results show that the intra-cerebro-ventricular injection (3 rd ventricle) of insulin at a physiological concentration (2.4nM) induces within the hypothalamus 1) a transient elevation of ROS level (+36%, at 15min), 2) an inhibition of mitochondrial respiration (- 50/60% in 15min) and 3) a 24h-food intake inhibition. A pretreatment with an antioxidant, two NADPH oxidase (NOX) inhibitors, or a mitochondrial respiratory chain (MRC) uncoupler suppresses insulin s effects. These results demonstrate the involvement of ROS in the hypothalamic insulin action, especially ROS derived from NOX. Finally, we show that the food intake level is correlated with the hypothalamic ROS level and mitochondrial respiration, which are also correlated themselves. Altogether, we suggest that the hypothalamic regulation of ROS level and mitochondrial respiration are required for the insulin-induced food intake inhibition. In conclusion, our work reveals that ROS constitute new molecular actors of the hypothalamic insulin signaling necessary to the control of feeding behaviour. 2

9 ABREVIATIONS α-msh : α-melanocyte-stimulating Hormone ACC : Acétyl-CoA Carboxylase ACS : Acyl-CoA Synthase ADP : Adénine Di-Phosphate AGL : Acides Gras Libres AgRP : Agouti Related Peptide AMP : Adénine Mono-Phosphate AMPK : Adenine Mono-Phosphate-Activated Kinase APS : Adaptator Protein containing PH and SH2 domains ATP : Adénine Tri-Phosphate BHE : Barrière Hémato-Encéphalique CART : Cocaine & Amphetamine-Related Transcript CCCP : Carbonyl Cyanide m-chlorophénylhydrazone CCK : Cholécystokinine CFTR : Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator CMLVs : Cellules Musculaires Lisses Vasculaires CPT : Carnitine-Palmitoyl Transferase CRM : Chaîne Respiratoire Mitochondriale C x : Complexe Cyst : Cystéine DMN : DorsoMedian Nucleus DPI : DiPhenyleneIodonium EAOs : Espèces Actives de l Oxygène enos : NOS endotheliale ERK: Extracellular signal-regulated Kinase FAS : Fatty Acid Synthase FoXO-1 : Forkhead BoX O-1 GABA-R : Récepteur au GABA GE : Gluco-Excited GHRH : Growth Hormone Releasing-Hormone 3

10 GI : Gluco-Inhibited GK : GlucoKinase GLP-1 : Glucagon-Like Peptide-1 GLUT : GLUucose Transporter GPx : Glutathion Peroxydase GR : Glutathion Réductase Grb2-SOS : Grb2-associated docking protein GSH : Glutathion réduit GSSG: Glutathion oxydé HFD : High-Fat Diet HGE : High Gluco-Exicted HGI : High Gluco-Inhibited Icv : Intra-cérébro-ventriculaire IGF : Insuline like Growth Factors inos : NOS inductible IRS : Insulin Receptor Substrate JAK : JAnus Kinase K ATP : Canal potassique sensible à l ATP Kir6.x: inwardly rectifying K + channel 6.x LCR : Liquide CéphaloRachidien LH : Lateral Hypothalamus MAPK: Mitogen-Activated Protein Kinase MAPKAP: Mitogen-Activated Protein Kinase-Associated Protein MCR : MelanoCortine Receptor meaos : EAOs mitochondriales mtnos : NOS mitochondriale NA : Noyau Arqué NIRKO : Neuronal Insulin Receptor Knock-Out nnos : NOS neuronale NOS : NO synthases NOX : NADPH oxydase Nox : sous-unité de la NADPH oxydase NPY : NeuroPeptide Y Ob-R : Obesity-Receptor (récepteur à la leptine) 4

11 OS : OrthoSympathique PDK : Phosphoinositide-Dependent Kinase PI3K : PhosphatdylInositol 3-Kinase PIP2 : PhosphatidylInositol-4,5-diPhosphate PIP3 : PhosphatidylInositol-3,4,5-triPhosphate PKB ou Akt : Protein Kinase B POMC: Pro-Opio-MélanoCortine PP2A : Protein Phosphatase 2A PS : ParaSympathique PTEN : Phosphatase and TENsin homolog PTPs : Protein Tyrosine Phosphatases PVN : ParaVentricular Nucleus PYY : Peptide YY RI : Récepteur à l Insuline Ser : Sérine SHC: Src-Homology2/ α Collagen SNA : Système Nerveux Autonome SNC : Système Nerveux Central SOD : SuperOxyde Dismutase TABlanc : Tissu Adipeux Blanc TABrun : Tissu Adipeux Brun Thr : Thréonine TRP : Transient Receptor Potentiel UCPs : UnCoupling Proteins VMH : VentroMedian Hypothalamus VMN : VentroMedian Nucleus 5

12 SOMMAIRE INTRODUCTION... 9 I. HOMEOSTASIE ENERGETIQUE A. GENERALITES 11 B. REGULATION METABOLIQUE DE L HOMEOSTASIE ENERGETIQUE Le glucose Les lipides 14 C. REGULATION HORMONALE DE L HOMEOSTASIE ENERGETIQUE La leptine L insuline 18 a. Régulation de la sécrétion d insuline 18 b. Actions de l insuline 20 c. Voies de signalisation de l insuline 23 D. REGULATION NERVEUSE DE L HOMEOSTASIE ENERGETIQUE Régulation de la prise alimentaire Régulation des métabolismes glucidique et lipidique 25 a. Régulation du métabolisme glucidique 26 b. Régulation du métabolisme lipidique 26 II. NOYAUX ET NEUROPEPTIDES HYPOTHALAMIQUES DANS LE CONTROLE DE L HOMEOSTASIE ENERGETIQUE A. LES PARTICULARITE DU NOYAU ARQUE 28 B. LES NEUROPEPTIDES DU NA NPY/AgRP : neuropeptides orexigènes POMC/CART : neuropeptides anorexigènes Interaction entre les systèmes à NPY/AgRP et à POMC/CART dans le NA 33 III. DETECTION HYPOTHALAMIQUE DES METABOLITES ET DES HORMONES A. DETECTION DES METABOLITES Le glucose 36 a. Effets physiologiques d une hypoglycémie cérébrale 36 b. Effets physiologiques d une hyperglycémie cérébrale 37 c. Les neurones sensibles au glucose du SNC 37 d. Les mécanismes moléculaires neuronaux de la détection du glucose Les acides gras 41 a. Les effets physiologiques d une hyperlipidémie cérébrale 41 b. Les neurones sensibles aux acides gras 42 c. Mécanismes moléculaires impliqués dans la détection cérébrale des acides gras 42 B. SENSIBILITE A L INSULINE Action centrale de l insuline : régulation de l homéostasie énergétique 44 a. Réduction de la prise alimentaire : limiter les apports d énergie 46 b. Régulation des métabolismes glucidique et lipidique : dépenser et stocker l énergie 47 6

13 2. Signalisation centrale de l insuline 49 a. Le récepteur à l insuline 49 b. Les voies de signalisation de l insuline Cibles cellulaires hypothalamiques de l insuline 53 a. Régulation de l expression des neuropeptides 53 b. Contrôle de l activité électrique Insuline, métabolisme mitochondrial, et prise alimentaire 56 IV. LES EAOs : SECONDS MESSAGERS DE LA SIGNALISATION DE L INSULINE A. LES PRINCIPALES EAOs L anion superoxyde : O Le peroxyde d hydrogène : H 2 O Le radical hydroxyle :. OH Les radicaux alkyles R. et peroxyles ROO Les EAOs azotées : le monoxyde d azote NO. et le peroxynitrite ONOO - 63 B. LES PRINCIPALES SOURCES CELLULAIRES D EAOs Les NADPH oxydases (NOX) La chaîne respiratoire mitochondriale (CRM) Les NO synthases (NOS) 68 C. LES SYSTEMES DE GESTION DES EAOs Détoxification directe des EAOs 68 a. Détoxification enzymatique 68 b. Les molécules piégeurs d EAOs Réparation des dommages oxydatifs 69 D. LES EAOS : DE VERITABLES SECONDS MESSAGERS Physiologie Pathologie 71 E. ROLES PHYSIOLOGIQUES DES OXYDANTS DANS L ACTION DE L INSULINE Les oxydants : insulino-mimétiques L insuline induit une production d oxydants: rôle de la NOX, de la CRM, et de la NOS 74 a. La NOX 74 b. La CRM 75 c. La NOS Les oxydants : seconds messagers de la signalisation de l insuline 76 RESULTAT & DISCUSSION OBJECTIFS DE L ETUDE PARTIE I : LES EAOs : NOUVEAUX ACTEURS DE LA SIGNALISATION HYPOTHALAMIQUE DE L INSULINE NECESSAIRE AU CONTROLE DE LA PRISE ALIMENTAIRE. Rôle de la NADPH oxydase A. INTRODUCTION & DEMARCHE EXPERIMENTALE 83 B. RESULTATS 85 C. RESULTATS COMPLEMENTAIRES, INTERPRETATIONS & DISCUSSION 90 7

14 PARTIE II : LES EAOs : NOUVEAUX ACTEURS DE LA SIGNALISATION HYPOTHALAMIQUE DE L INSULINE NECESSAIRE AU CONTROLE DE LA PRISE ALIMENTAIRE. Rôle de la chaîne respiratoire mitochondriale A. INTRODUCTION & DEMARCHE EXPERIMENTALE 96 B. RESULTATS 98 CONCLUSIONS & PERSPECTIVES ANNEXES I. MATERIEL ET METHODES A. FRACTIONNEMENT SUB-CELLULAIRE 128 B. WESTERN BLOT 128 II. AUTRES ARTICLES REFERENCES

15 INTRODUCTION 9

16 A B FIGURE 1 : Représentation schématique de l homéostasie énergétique (A) et de la boucle de régulation assurant son maintien (B). SNA (système nerveux autonome). 10

17 I. HOMEOSTASIE ENERGETIQUE A. GENERALITES L homéostasie énergétique est un état d équilibre dynamique entre les apports et les dépenses d énergie permettant le maintien d un milieu intérieur stable, à l échelle de la journée ou de la vie. Les apports trouvent leur origine dans l alimentation et la mobilisation des réserves d énergie de l organisme, tandis que les dépenses résultent principalement du métabolisme basal, de la thermorégulation et de l activité physique (FIGURE 1A). Par la tenue de cet équilibre, un individu conserve au cours de sa vie adulte un poids corporel stable compris dans un intervalle dont les limites inférieures et supérieures seraient génétiquement définies. En cas d éloignement par rapport à cet intervalle, tout un système de régulations se met en place afin d y revenir. L homéostasie énergétique est contrôlée et régulée à la fois au niveau de la périphérie et du système nerveux central (SNC). La régulation nerveuse de l homéostasie énergétique à court- ou long-terme n est concevable que si le SNC est informé en permanence du statut énergétique de l organisme par des signaux issus de la périphérie. Schématiquement, il existe donc un dialogue entre périphérie et SNC, faisant intervenir des signaux complémentaires et en perpétuelle interaction, de natures hormonale (insuline, leptine, ), métabolique (glucose, acides gras libres, ) et nerveuse (SNC et système nerveux autonome, SNA) (FIGURE 1B). L analyse de ces informations par le SNC déclenche alors des réponses adaptées à la fois comportementale (ajustement de la prise alimentaire) et végétatives (modification de l activité d organes périphériques par l intermédiaire du SNA). Notons que cet équilibre est également sous l influence de facteurs indépendants au métabolisme de l organisme comme par exemple les phénomènes sociaux, cognitifs ou, d une manière plus générale, l environnement. Ils sont importants, notamment chez l Homme, mais difficilement contrôlables ou mesurables. Dès 1953, Jean Mayer énonçait une théorie dite «glucostatique» permettant d expliquer la régulation de la prise alimentaire à court-terme (Mayer 1953). En effet, ses travaux expérimentaux montraient que la prise alimentaire était augmentée en quelques heures en réponse à une hypoglycémie. Il postula ainsi l existence d un mécanisme de régulation à 11

18 court-terme permettant d ajuster les dépenses énergétiques en fonction des besoins afin de maintenir un statut énergétique constant. Ce mécanisme dépendrait étroitement des réserves et de la disponibilité en glucides de l organisme. Cette théorie suppose donc l existence de mécanismes centraux permettant de détecter des variations du taux de glucose circulant afin de réguler, par voie nerveuse, l homéostasie énergétique. Sur un modèle similaire et peu de temps après, Mayer propose l existence d un mécanisme «lipostatique» fondé sur le maintien de la proportion de graisses mobilisées en fonction de la masse adipeuse. Ce mécanisme s exercerait pour une régulation de l homéostasie énergétique à long-terme et serait parfaitement intégré à la théorie «glucostatique». En effet, une augmentation des réserves en graisses augmenterait proportionnellement leur mobilisation et donc leur utilisation par les tissus, diminuant ainsi les besoins en glucides. Inversement, une diminution des réserves lipidiques conduirait à une diminution proportionnelle de leur mobilisation, augmentant ainsi les besoins en glucides. Les mécanismes de régulation à long-terme qui seraient ainsi dictés par le statut «lipidique», permettraient de corriger ou d ajuster les mécanismes de régulation à court-terme dépendants du statut «glucidique» (van Itallie 1990). Depuis ces travaux et théories précurseurs, de nombreux signaux circulants ont été identifiés comme étant impliqués dans le dialogue entre la périphérie et le SNC. Parmi ceuxci, il a été montré que les signaux métaboliques, tels que le glucose, mais aussi les acides gras libres permettent une régulation à court-terme de l homéostasie énergétique, tandis que les signaux hormonaux, comme la leptine et l insuline, constituent des facteurs prépondérants de la régulation à long-terme. En effet, il est actuellement admis que la leptine et l insuline constituent, au niveau central, un signal du niveau d adiposité périphérique reflétant le statut «lipidique» (théorie lipostatique). L insulinémie et la leptinémie varient de façon proportionnelle avec le statut énergétique et sont fortement corrélées à l adiposité. De plus, leur entrée dans le SNC est proportionnelle à leur concentration plasmatique. Enfin, de nombreux travaux ont clairement mis en évidence le rôle de la leptine et de l insuline dans le contrôle de la prise alimentaire et du poids corporel. La présence de ces deux hormones et de leurs récepteurs au niveau du SNC conforte cette hypothèse. 12

19 B. REGULATION METABOLIQUE DE L HOMEOSTASIE ENERGETIQUE Les métabolites sont des éléments essentiels à l intégrité de l organisme. Ils sont classés en trois groupes : les glucides, les lipides et les protéines, auxquelles il faut rajouter les minéraux et vitamines. Leurs rôles consistent au maintien des structures et/ou à l apport d énergie. De plus, parmi eux, le glucose et les acides gras libres représentent des signaux importants de la régulation à court-terme de l homéostasie énergétique. 1. Le glucose Le glucose est principalement métabolisé par les muscles et le cerveau, et stocké dans le foie. Il représente une source énergétique majeure pour toutes les cellules de l organisme. Cette énergie est fournie principalement par la mitochondrie sous forme de molécules d ATP (Adénine Tri-Phosphate) indispensables à de nombreux processus biochimiques permettant le maintien de l intégrité cellulaire. Le cerveau, ne dépendant en condition physiologique que du glucose comme source d énergie, il est vital de maintenir les taux circulants de ce métabolite dans une gamme «acceptable» qui se situe autour de 5mM, soit 1g/L. La moindre variation des taux circulants de glucose est détectée, intégrée, et à l origine de réponses physiologiques adaptées. Suite à un repas, le glucose est assimilé au niveau de la muqueuse digestive. Il est absorbé par les entérocytes de l intestin puis libéré dans la circulation sanguine. Il apparaît alors une hyperglycémie postprandiale dont l amplitude est influencée par la quantité et la nature des glucides ingérés, les processus digestifs, et des facteurs hormonaux. Selon la théorie glucostatique de Mayer, le déclenchement de mécanismes de régulation de l homéostasie énergétique implique une détection rapide des variations de la concentration de glucose. Cette détection peut avoir lieu à différents endroits de l organisme. Dans un premier temps, le passage des glucides dans le système gastro-intestinal induit la libération d hormones par la muqueuse, telles que la CCK (cholécystokinine), le PYY (peptide YY) et le GLP-1(glucagon-like peptide-1), tous les trois impliquées dans la régulation à court-terme de la prise alimentaire par leur action au niveau du SNC (FIGURE 2). Plus en aval, il existe un système sensible à l hyperglycémie au niveau de la veine hépatoportale. Ce détecteur de 13

20 glucose relaye l information «hyperglycémie» aux fibres afférentes de la branche hépatique du nerf vague (Marty et al. 2005). Cette information est ainsi acheminée jusqu au tronc cérébral où des réponses nerveuses adéquates (viscérales et comportementales) sont initiées : inhibition de la prise alimentaire, stimulation de l utilisation du glucose par les muscles et le tissu adipeux, stimulation du stockage du glucose au niveau hépatique, et inhibition de la production des hormones hyperglycémiantes (catécholamines, glucagon) (Russek 1970, Burcelin et al. 2000, Donovan et al. 1994) (FIGURE 2). De plus, la détection directe du glucose par les cellules β des îlots de Langhérans du pancréas déclenche l exocytose des vésicules contenant l insuline (Henquin et al. 2003), dont le rôle principal est la normalisation de la glycémie (hormone hypoglycémiante) (cf I.C.2) (FIGURE 2). L ensemble de ces régulations permet de limiter les apports d énergie et de favoriser les dépenses : une partie du glucose est stockée sous forme de glycogène dans le foie tandis que l autre est distribuée à l ensemble des organes. De plus, dans le SNC, l hypothalamus et le tronc cérébral sont capables de détecter directement les variations de la glycémie et participe pleinement au maintien de l homéostasie énergétique en déclenchant des réponses physiologiques adaptées. Certainement pour se préserver des effets délétères de la pénurie en glucose, le SNC est équipé pour détecter à la fois les hypo et les hyperglycémies, contrairement à la périphérie qui détecte principalement les hyperglycémies. Typiquement, une augmentation de la concentration cérébrale en glucose a pour conséquence de limiter les apports et de favoriser les dépenses d énergie, alors qu une hypoglycémie favorise les apports et limite les dépenses. Les mécanismes de la détection cérébrale du glucose et ses principaux effets sont détaillés dans le paragraphe III.A Les lipides Les lipides sont essentiellement utilisés par les muscles. Ils sont stockés dans les tissus adipeux blanc (TABlanc) et brun (TABrun) sous forme de triglycérides durant les périodes d excès caloriques Les adipocytes possèdent les voies métaboliques et les protéines de régulation associées aux processus de synthèse des triglycérides (lipogenèse, synthèse de novo à partir du glucose ou à partir d acides gras issus du milieu sanguin) et de lipolyse (Kersten 14

21 FIGURE 2 : Mécanismes de régulation mise en place suite à une hyperglycémie post-prandiale. SNA (système nerveux autonome), PYY (peptide YY), CCK (cholécystokinine), GLP-1 (glucagon-like peptide 1). 15

22 2001). Le TABlanc libère l énergie dans le sang sous forme d acides gras libres (AGL) en périodes de jeûne ou lorsque les dépenses énergétiques sont supérieures aux apports. Le TABrun participe aux dépenses énergétiques et à la production de chaleur grâce à l oxydation mitochondriale des acides gras. Par conséquent, le contrôle du métabolisme lipidique dans les TABlanc et TABrun est particulièrement important pour le maintien de l homéostasie énergétique. En plus d être des substrats énergétiques majeurs, les lipides, et plus particulièrement les AGL qui représentent leur forme «active», tiennent le rôle de molécules informatives, aussi bien au niveau périphérique que central, permettant ainsi de réguler l homéostasie énergétique, indépendamment des hormones (leptine ou insuline). Au niveau périphérique, les AGL influencent la sécrétion d insuline par les cellules β du pancréas (Girard 2003) (FIGURE 3). A court-terme (exposition aux AGL durant quelques heures) ils potentialisent cette libération hormonale en réponse au glucose, favorisant ainsi le stockage d énergie, alors qu ils l inhibent à long-terme (plusieurs jours). Au niveau du SNC, la détection d une augmentation de la concentration en AGL a pour conséquence de limiter les apports et de favoriser les dépenses et le stockage d énergie via l inhibition de la prise alimentaire et la potentialisation de la sécrétion pancréatique d insuline dépendante du glucose (FIGURE 3). En revanche, sur un long-terme, un régime riche en lipides entraîne une hyperphagie. Les mécanismes de la détection cérébrale des AGL et leurs principaux effets sont détaillés dans le paragraphe III.A.2. FIGURE 3 : Effets des acides gras libres sur la régulation de l homéostasie énergétique. SNA (système nerveux autonome), (acides libres). AGL gras 16

23 C. REGULATION HORMONALE DE L HOMEOSTASIE ENERGETIQUE De nombreuses hormones sont impliquées dans la régulation à court- et long-terme de l homéostasie énergétique, jouant leurs rôles en périphérie et/ou au niveau central, comme la CCK, le PYY, le GLP-1, le glucagon, la ghréline, la leptine, et l insuline (Ueno et al. 2005, Little et al. 2005, McGowan & Bloom 2004, Bojanowska 2005, Jiang & Zhang 2003, Morton et al. 2006). La leptine et l insuline, facteurs prépondérants de la régulation à long-terme, font l objet des deux paragraphes suivants consacrés à leurs effets généraux. Leurs mécanismes d action cérébraux seront développés dans le paragraphe III.B. 1. La leptine La leptine est le produit du gène ob («ob» pour obésité), communément appelé «gène de l obésité» (Zhang et al. 1994). Il s agit d une cytokine secrétée principalement par le tissu adipeux et de façon moindre par l épithélium gastrique, le muscle squelettique et le placenta (Ahima & Osei 2004). Sa sécrétion par les adipocytes est proportionnelle à la masse du tissu adipeux, ce qui fait que la leptinémie reflète le niveau d adiposité de l organisme à un instant donné. Le récepteur à la leptine, Ob-R (Obesity-Receptor), se présente sous plusieurs isoformes divisées en trois groupes : secrétée, courte et longue. La signalisation périphérique emprunte principalement les formes courtes qui ont une localisation ubiquitaire, tandis qu au niveau du SNC la signalisation induite par la leptine passe par la forme longue du récepteur, Ob-Rb, dont l expression la plus forte a été retrouvée dans l hypothalamus ventromédian (Bates & Myers 2003). Les Ob-R ne possèdent pas d activité enzymatique intrinsèque, mais la partie intracellulaire s associe avec les JAK (JAnus Kinases), membres de la famille des tyrosine kinases. Grâce à ses deux récepteurs, la leptine exerce une multitude d effets physiologiques (Moran & Phillip 2003). Son rôle dans la régulation à long-terme de l homéostasie énergétique est particulièrement connu et étudié. En effet, les souris ob/ob (déficientes en leptine), ainsi que les souris db/db (db pour diabète, déficientes pour le récepteur Ob-R), sont obèses et diabétiques, symptômes rappelant le syndrome humain de l obésité morbide, leur poids étant 17

24 triple et leur masse adipeuse quintuple par rapport à des souris sauvages soumises à un régime identique (Friedman & Halaas 1998). D une manière générale, une augmentation de la leptinémie conduit à une diminution des apports et une stimulation des dépenses d énergie. La leptine induit ainsi la réduction de la masse adipeuse en jouant sur le métabolisme lipidique, diminue le contenu en triglycérides des différents tissus, inhibe la synthèse d insuline par les cellules β du pancréas, régule le métabolisme du glucose et enfin, diminue la prise alimentaire (Moran & Phillip 2003). 2. L insuline L'insuline est une hormone polypeptidique formée, après élimination du peptide C par hydrolyses, de deux chaînes de 21 et 30 acides aminés, reliées par deux ponts disulfures. Elle fait partie du groupe des peptides appelés IGF (Insuline like Growth Factors) ou somatomédines. Dans le plasma, l insuline circule sous forme libre, non liée à une «protéine de transport». L insuline est une hormone quasi-exclusivement synthétisée par les cellules β des îlots de Langhérans du pancréas. Une petite production cérébrale existe, même si celle-ci prête encore à controverse (Schwartz et al. 1992, Banks 2004). a. Régulation de la sécrétion d insuline La sécrétion pancréatique d insuline est contrôlée par la détection directe du glucose (Henquin 2000) (FIGURE 4). En effet, les cellules β expriment un transporteur au glucose particulier, GLUT2 (GLUucose Transporter), dont les caractéristiques biochimiques permettent un passage du glucose dans la cellule de manière proportionnelle à sa concentration environnante. Il est ensuite rapidement phosphorylé en glucose-6-phosphate par la GK (GlucoKinase) qui détermine le niveau de glycolyse et ainsi la quantité de pyruvate qui entrera dans la mitochondrie pour emprunter le cycle de Krebs. Cette succession de réactions enzymatiques conduit à une augmentation du rapport ATP/ADP dans le cytoplasme, ce qui induit la fermeture des K ATP (canaux potassiques sensibles à l ATP). Celle-ci engendre alors une dépolarisation membranaire et l ouverture de canaux calciques sensibles au voltage. L augmentation de la concentration intracellulaire en ions Ca 2+ qui en résulte déclenche l exocytose des vésicules contenant l insuline. De plus, l ATP agit directement sur ces vésicules en favorisant leur migration vers la membrane cellulaire. En réponse à une hyperglycémie, l insuline est rapidement libérée. Sa concentration atteint un maximum 18

25 quelques minutes seulement après l absorption de glucose par voie orale ou intraveineuse (Del Prato 2003). Cette sécrétion initiale ne dure qu une dizaine de minutes et est suivie d une autre phase sécrétoire plus soutenue, se prolongeant pendant plusieurs heures jusqu à ce que la glycémie revienne à la valeur basale. Ces deux phases permettent de libérer respectivement 3% et 20% du contenu des cellules β en insuline. En cas d hypoglycémie, l insuline n est pas sécrétée étant donnée que sa sécrétion est proportionnelle à la glycémie. FIGURE 4 : Représentation schématique des mécanismes cellulaires responsables de la modulation de la sécrétion d insuline à court-terme. AGL (acides gras libres), SNA (système nerveux autonome), PS (parasympathique), OS (orthosympathique), K ATP (canaux potassiques sensibles à l ATP).. La sécrétion d insuline contrôlée par le glucose peut être modulée par l augmentation de la concentration en AGL. A court-terme, les AGL la potentialisent alors qu ils l inhibent à long-terme. Le premier mécanisme impliquerait l augmentation de la concentration intracellulaire d acyl-coa issue de la dégradation normale des AGL. En effet, l acyl-coa a la capacité de stimuler directement et indirectement l exocytose via la formation de diacylglycérol (Girard 2003). L effet inhibiteur des AGL pourrait être dû i) à l inhibition de la fermeture des canaux K ATP par les acyl-coa, ii) à la diminution de l expression de GLUT2 et de la GK ou iii) à l effet découplant des AGL sur la mitochondrie aboutissant à une diminution de la synthèse d ATP. De plus, la sécrétion d insuline est contrôlée directement par le système nerveux autonome para- et orthosympathique (PS et OS) qui innervent le pancréas endocrine. 19

26 Typiquement, l augmentation du tonus PS stimule la sécrétion d insuline tandis que celle de l OS l inhibe (FIGURE 4). Ces effets seront détaillés dans le paragraphe I.D.2. b. Actions de l insuline L insuline assure de multiples fonctions, notamment dans la croissance et la survie cellulaire, mais surtout constitue un facteur anabolique primordial pour le maintien de l homéostasie énergétique, au point que des souris totalement déficientes en son récepteur meurent peu de temps après leur naissance de céto-acidose et d un dysfonctionnement métabolique (Van Obberghen et al. 2001) (FIGURE 5). Au niveau périphérique, l insuline assure le maintien des normo-glycémie et - lipidémie. D une manière générale, l insuline favorise l utilisation et le stockage du glucose et des lipides par les tissus dits insulino-sensibles que sont les tissus adipeux, le foie et les muscles. Elle augmente ainsi le transport du glucose dans les cellules musculaires et adipocytaires en induisant la translocation du transporteur au glucose, GLUT4, vers la membrane plasmique (Chang et al. 2004b). Au niveau du foie, l insuline inhibe la glycogénolyse et la gluconéogenèse, tout en stimulant la glycogenèse, cette activation s observant également dans le muscle strié. Dans le foie et le tissu adipeux, elle augmente la lipogenèse et diminue la lipolyse (Baulieu & Kelly 1990) (FIGURE 5). Les effets hypoglycémiants de l insuline sont opposés à ceux du glucagon, hormone catabolique qui est synthétisé par les cellules α du pancréas, sécrétée en cas d hypoglycémie, et dont la synthèse est inhibée par l insuline en cas d hyperglycémie (Jiang & Zhang 2003). Aux effets périphériques de l insuline s ajoutent des effets centraux ayant un impact important sur l anabolisme de l organisme: régulation de la prise alimentaire, du poids corporel, des dépenses énergétiques, et des métabolismes glucidique et lipidique des tissus périphériques via le système nerveux autonome (FIGURE 5). L insuline est considérée comme un signal afférent primordial de la régulation centrale de l homéostasie énergétique qui limite les apports et favorise les dépenses d énergie (Stockhorst et al. 2004). Ses mécanismes d action et ses effets centraux seront détaillés dans le paragraphe III.B. 20

27 21 FIGURE 5 : Effets de l insuline. SNA (système nerveux autonome).

28 22 FIGURE 6: Principales voies de signalisation de l insuline. D après Combettes-Souverain & Issad 1998.

29 c. Voies de signalisation de l insuline Les effets de l insuline sont assurés par son récepteur, ubiquitaire, localisé dans la quasi-totalité des tissus des mammifères. Ceux présentant la plus forte densité sont les tissus dits insulino-sensibles et le SNC (White & Yenush 1998, Combettes-Souverain & Issad 1998, Elmquist et al. 1999) Le récepteur à l insuline (RI) est une glycoprotéine constituée de 2 sousunités α extracellulaires et de 2 autres β transmembranaires, liées entre elles par des liaisons covalentes formées par des ponts disulfures. L insuline, en se liant à la sous-unité α, déclenche l activité tyrosine kinase intrinsèque de la sous-unité β qui alors s autophosphoryle (FIGURE 6). Différents substrats de l activité tyrosine kinase intrinsèque du RI ont été identifiés dans les tissus périphériques : les protéines de la famille des IRS (Insulin Receptor Substrate) (White & Yenush 1998), SHC (Src-Homology2/ α Collagen) (Kasus-Jacobi et al. 1997, Sasaoka et al. 1994), Grb2-SOS (Grb2-associated docking protein) (Holgado-Madruga et al. 1996), et APS (Adaptator Protein containing PH and SH2 domains) (Moodie et al. 1999). Ces protéines sont recrutées au niveau du RI activé et sont phosphorylées sur leurs résidus tyrosine par l activité tyrosine kinase du RI. Les protéines ainsi activées assurent la transduction des signaux métaboliques et mitogéniques de l insuline, notamment via les voies de signalisation de la PI3K (PhosphatidylInositol 3-Kinase) et des MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase) (Combettes-Souverain & Issad 1998). Dans le SNC, le RI, notamment présent dans les régions impliquées dans la régulation de l homéostasie énergétique (Hill et al. 1986), comporte aussi une activité tyrosine kinase intrinsèque et les différentes protéines intervenant dans la transduction du signal de l insuline en périphérie sont présentes. Les nombreuses démonstrations de l implication de ces protéines dans la régulation centrale de l homéostasie énergétique par l insuline renforcent l idée que la liaison de l insuline à son récepteur dans le SNC permet l activation de cascades de transduction similaires à celles décrites dans les tissus périphériques (cf III.B.2). 23

30 D. REGULATION NERVEUSE DE L HOMEOSTASIE ENERGETIQUE Une partie de la régulation de l homéostasie énergétique est assurée par le système nerveux, central (SNC) et autonome (SNA) (FIGURE 7). Parmi les structures du SNC, l hypothalamus occupe une place privilégiée. En effet, il est le principal centre d intégration des informations en provenance et en partance vers les tissus périphériques. Il intègre à la fois les signaux circulants métaboliques et hormonaux, et les signaux nerveux issus du tronc cérébral, relais des afférences du SNA. L hypothalamus est localisé autour du 3 ème ventricule. Il est délimité antérieurement par le chiasma optique, la commissure antérieure (qui relie les 2 hémisphères) et la lame terminale (mur antérieur du 3 ème ventricule), postérieurement par les corps mamillaires, et dorsalement par le thalamus. Parmi les structures qui composent l hypothalamus, l aire latérale (LH, Lateral Hypothalamus), l aire ventromédiane (VMH, VentroMedian Hypothalamus) constituée du noyau ventromédian (VMN, VentroMedian Nucleus) et du noyau arqué (NA), le noyau dorsomédian (DMN, DorsoMedian Nucleus), et le noyau paraventriculaire (PVN, ParaVentricular Nucleus) sont les principales structures impliquées dans la régulation de l homéostasie énergétique. FIGURE 7 : Schéma d un cerveau de rongeur montrant les différentes régions hypothalamiques impliquées dans la régulation nerveuse de l homéostasie énergétique. L insert du haut représente une coupe longitudinale du cerveau. Les deux traits verticaux localisent le niveau des deux coupes frontales représentées en dessous. CC (corps calleux), CCX (cerébral cortex), FX (fornix), PVN (noyau paraventriculaire), DMN (noyau dorsomédian), LH (hypothalamus latéral), VMN (noyau ventromédian), 3V (3 ème ventricule), NA (noyau arqué), EM (éminence médiane), OC (chiasma optique). 24

31 1. Régulation de la prise alimentaire Le rôle de l hypothalamus dans le contrôle de la prise alimentaire et du poids corporel a été mis en évidence en 1940 par Hetherington et Ranson. La lésion du VMH (VMN + NA) entraîne une hyperphagie et l installation d une obésité. À l inverse, la lésion du LH provoque une diminution de la prise alimentaire, et sa stimulation une obésité. Ces résultats expérimentaux aboutirent à la théorie d un centre de la satiété (VMH) et d un centre de la faim (LH) (Elmquist et al. 1999). Depuis, d autres modèles expérimentaux de dérégulation de la prise alimentaire et/ou du poids corporel ont été mis au point, essentiellement par traitement pharmacologique provoquant des lésions spécifiques de noyaux hypothalamiques, venant ainsi renforcer et préciser la théorie précédemment formulée (Sanchis-Segura & Aragon 2002, Bestetti & Rossi 1980, Laughton & Powley 1981, Elmquist et al. 1999). Les mécanismes cellulaires et moléculaires de la régulation hypothalamique de la prise alimentaire sont détaillés dans les chapitres II et III. L hypothalamus est également en relation avec d autres grandes régions cérébrales, indirectement liées à l homéostasie énergétique, responsables des choix alimentaires faisant référence à la mémoire ou à des phénomènes cognitifs, gustatifs et/ou olfactifs. Il existe même des voies dites «de récompense», indépendantes du statut calorique, stimulant la prise alimentaire en dépit d une balance positive (Berthoud 2002). 2. Régulation des métabolismes glucidique et lipidique Les noyaux hypothalamiques (LH, VMH, PVN) régulent le métabolisme énergétique par l intermédiaire du système nerveux autonome (SNA) (FIGURE 8). En effet, par leurs projections sur les corps cellulaires des neurones pré-ganglionnaires orthosympathiques (OS) et parasympathiques (PS), respectivement au niveau de la moelle épinière et du tronc cérébral, ils modulent l activité des nerfs splanchniques OS et des rameaux du nerf vague PS du SNA. Les effets modulateurs provoqués par la stimulation du VMH ou du LH sur le métabolisme énergétique sont similaires à ceux observés par la stimulation, respectivement, des nerfs OS et PS. Ces nerfs innervent les principaux organes et tissus périphériques impliqués dans le contrôle du métabolisme énergétique, tels que le pancréas, le tractus digestif, les glandes surrénales, les TABlanc et TABrun, et les muscles. Généralement, les effets du système OS et 25

32 PS sont antagonistes et complémentaires sur un organe cible, impliquant comme neuromédiateurs la noradrénaline pour les fibres OS et l acétylcholine pour les fibres PS. Typiquement, la stimulation du VMH (et donc de l OS) provoque l activation des processus cataboliques (dépense d énergie), tandis que celle du LH (et donc du PS) engendre des réponses anaboliques (économie d énergie). Plus précisément, l augmentation du tonus OS provoque la mobilisation du glucose et des AGL à partir des tissus de réserves, tandis que celle du PS favorise leur utilisation et leur stockage (Scheurink & Nolan 1996) a. Régulation du métabolisme glucidique La concentration de glucose dans le sang est maintenue constante principalement grâce au contrôle fin de la sécrétion de 2 hormones : l insuline et le glucagon. Cette régulation met en jeu deux organes fondamentaux : le pancréas et le foie (cf I.B.1). Ainsi, l activation de l OS induit une augmentation de la sécrétion de glucagon et celle du PS stimule la libération d insuline par le pancréas (Nonogaki 2000) (FIGURE 8). Quant au foie, il se trouve sous la régulation du SNA à la fois de manière directe et indirecte : directe grâce à l innervation des hépatocytes, indirecte par l effet de l insuline sécrétée sous l influence du système PS (Nonogaki 2000). L innervation OS peut induire la libération de glucose dans la circulation sanguine, mais ce mécanisme semble mineur en comparaison à l action hormonale (via le glucagon) stimulant la glycogénolyse ou la gluconéogenèse. D un autre côté, l action directe du système PS sur le foie est requise pour que l insuline conduise à une capture du glucose efficace (Puschel 2004). Le métabolisme glucidique est également régulé au niveau des muscles squelettiques et du tissu adipeux qui sont aussi sous l influence du SNA. Au niveau des adipocytes, les fibres PS stimulent la capture du glucose en augmentant la sensibilité à l insuline (Fliers et al. 2003), et au niveau des cellules musculaires le système OS active la capture de glucose et la glycogénolyse (Nonogaki 2000). b. Régulation du métabolisme lipidique Le contrôle du métabolisme lipidique dans les tissus adipeux est particulièrement important pour le maintien de l homéostasie énergétique. Le système OS stimule la lipolyse et la libération des AGL dans ces tissus (Fliers et al. 2003) (FIGURE 8). Parallèlement, le système OS intervient dans le développement (prolifération et différenciation) des TABrun et 26

33 TABlanc, de manière opposée. En effet, la stimulation de l OS entraîne une hyperplasie du TABrun (Bukowiecki et al. 1986), tandis que le système OS exerce un tonus inhibiteur sur le développement du TABlanc (48). FIGURE 8: Effets du système nerveux autonome dans le contrôle de l homéostasie énergétique. AGL (acides gras libres). LH (hypothalamus latéral), VMH (hypothalamus ventromédian). Dans ce chapitre, nous avons défini l homéostasie énergétique et les principaux mécanismes de sa régulation périphérique et centrale. Dans les chapitres suivants, nous allons détailler les différents mécanismes impliqués dans le contrôle central de l homéostasie énergétique, et plus particulièrement celui assuré par l hypothalamus. 27

34 II. NOYAUX ET NEUROPEPTIDES HYPOTHALAMIQUES DANS LE CONTROLE DE L HOMEOSTASIE ENERGETIQUE Avant de détailler les différents mécanismes impliqués dans le contrôle central de l homéostasie énergétique, il est important de noter que le SNC est hétérogène sur le plan structural et fonctionnel. En effet, le cerveau est composé par 2 grands types cellulaires, les cellules neuronales et les cellules gliales. Les neurones constituent les cellules spécialisées dans la génération et la transmission de l information sous forme de signaux électriques. Les cellules gliales représentent l ensemble des cellules interstitielles assurant diverses fonctions de soutien et métaboliques pour les neurones. De plus, le cerveau est relativement isolé du reste de l organisme grâce à l existence de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Cette barrière, formée par l endothélium des vaisseaux intracérébraux et les pieds astrocytaires, limite le transfert de molécules entre le sang et le parenchyme nerveux. Cette particularité implique l existence de systèmes de transport permettant le passage des métabolites (glucose et AGL) ainsi que de différentes hormones (leptine, insuline) impliqués la régulation nerveuse de l homéostasie énergétique. Parmi la quarantaine de noyaux hypothalamiques, le NA joue un rôle fondamental dans le contrôle de l homéostasie énergétique. En effet, au même titre que la lésion globale du VMH, la destruction spécifique et chimique du NA conduit à un dérèglement important de la balance énergétique, notamment au développement d une hyperphagie et d une obésité (Bergen et al. 1998, Debons et al. 1982, Meister et al. 1989). A. LES PARTICULARITE DU NOYAU ARQUE De tous les noyaux hypothalamiques impliqués dans ce contrôle, le NA jouerait un rôle de tout premier ordre en raison de sa localisation et d autre part de son organisation. En effet, il est localisé à proximité du 3 ème ventricule et de l éminence médiane. Il se trouve donc à l interface entre le liquide céphalo-rachidien et la circulation sanguine. De plus, l endothélium vasculaire au niveau de l éminence médiane présente la particularité d être fenêtré. Il n y aurait donc pas de réelle BHE protégeant le NA (Ganong 2000). L entrée des 28

35 facteurs circulants métaboliques et hormonaux dans le parenchyme nerveux serait ainsi privilégiée au niveau de cette zone. Ainsi, le NA détecterait en premier les facteurs humoraux périphériques afin d intégrer puis de relayer ces informations vers des noyaux situés en aval, à savoir le VMN, le DMN, le LH et le PVN (Cone et al. 2001). L hypothèse d un rôle intégrateur du NA est renforcé par de nombreux travaux montrant que ce noyau possède toute la «machinerie» cellulaire nécessaire à la détection des facteurs périphériques métaboliques (glucose, AGL) et endocriniens (insuline, leptine). Deux autres particularités du NA résident dans la grande hétérogénéité de neurotransmetteurs et la complexité des projections neuronales. En effet, dans le NA sont exprimés de nombreux neurotransmetteurs de natures différentes (dopamine, GABA, somatostatine, neurotensine, sérotonine, GHRH, dynorphine, enképhalines) ainsi que plusieurs neuropeptides qui jouent un rôle clef dans la régulation de l homéostasie énergétique (NPY, AgRP, α-msh, CART). Cette grande hétérogénéité de neurotransmetteurs est vraisemblablement liée à la complexité des projections neuronales issues du NA. De plus, des connexions entre neurones au sein même du NA ont été mises en évidence et le NA projette vers les autres noyaux de l hypothalamus (PVN, LH, DMN, VMN), ainsi que vers des structures extra-hypothalamiques impliquées dans la régulation de l homéostasie énergétique (tronc cérébral, éminence médiane, système porte hypothalamo-hypophysaire) (FIGURE 9). En retour, le NA reçoit de nombreuses connexions provenant de structures hypothalamiques (LH, VMN et PVN) et extra-hypothalamiques (tronc cérébral). L hypothalamus est également en relation avec d autres grandes régions cérébrales, indirectement liées à l homéostasie énergétique, responsables des choix alimentaires faisant référence à la mémoire ou à des phénomènes cognitifs, gustatifs et/ou olfactifs. Il existe même des voies dites «de récompense», indépendantes du statut calorique, stimulant la prise alimentaire en dépit d une balance positive (Berthoud 2002). En conclusion, le NA occupe une position stratégique qui lui permet d être LE noyau hypothalamique intégrateur des paramètres périphériques métaboliques et endocriniens. De par ses projections, il relaye les informations vers d autres noyaux hypothalamiques qui, à la suite, projettent vers d autres structures cérébrales notamment vers le tronc cérébral qui contient les corps cellulaires des neurones pré-ganglionnaires OS et PS. Les connexions de l hypothalamus avec le tronc cérébral permettent le relais de l information nerveuse vers la 29

36 périphérie, et vice versa, refermant ainsi la boucle de rétrocontrôle, positif ou négatif, selon le contexte énergétique de l individu. FIGURE 9 : Représentation schématique des connexions neuronales intra- et extra-hypothalamiques impliquées dans la régulation nerveuse de l homéostasie énergétique. PVN (noyau paraventriculaire), DMN (noyau dorsomédian), LH (hypothalamus latéral), VMN (noyau ventromédian), NA (noyau arqué). 30

37 B. LES NEUROPEPTIDES DU NA Les neuropeptides hypothalamiques modulant l homéostasie énergétique sont classés en fonction de leur effet sur la prise alimentaire. Ainsi, ils sont dits orexigènes ou anorexigènes selon si respectivement, ils stimulent ou inhibent la prise alimentaire. Il existe, au sein du NA, deux populations de neurones qui jouent un rôle prépondérant dans la régulation de l homéostasie énergétique : les neurones à NPY (neuropeptide Y) (et à AgRP, Agouti Related Peptide) et les neurones à POMC (pro-opio-mélanocortine) (et à CART, Cocaine & Amphetamine-Related Transcript). 1. NPY/AgRP : neuropeptides orexigènes Les principaux neuropeptides du NA impliqués dans la régulation positive de la prise alimentaire sont le NPY et l AgRP. En effet, le NPY injecté en intra-cérébro-ventriculaire (icv) ou directement dans l hypothalamus stimule la prise alimentaire (Stanley et al. 1986) et diminue les dépenses énergétiques (Billington et al. 1991). L administration continue ou répétée de NPY conduit au développement d une obésité (Stanley et al. 1986, Zarjevski et al. 1993). Par ailleurs, l expression du gène et la sécrétion de ce peptide sont stimulées dans des conditions de déficit énergétique comme le jeûne ou l hypoglycémie, et diminuées lors d augmentation des taux de leptine et d insuline (Dryden et al. 1998, Schwartz et al. 1996, White 1998, White et al. 1990). Enfin, sur un plan physiopathologique, la délétion du gène du NPY dans le modèle de souris obèses déficientes pour le gène de la leptine (souris ob/ob) induit une diminution de l hyperphagie et de l état obèse des animaux (Erickson et al. 1996). L ensemble de ces travaux a conduit à émettre le constat que le NPY est une molécule signal de type «anabolique» au niveau cérébral. Néanmoins, la délétion du gène du NPY chez des souris «sauvages» n entraîne pas d altération du comportement alimentaire de ces animaux (Erickson et al. 1996). L absence du phénotype maigre attendu pourrait être «masquée» par un autre signal anabolique présent dans le SNC et qui compenserait l absence de NPY. Un des candidats est l AgRP. L administration icv d AgRP stimule la prise alimentaire (Rossi et al. 1998). De plus, des souris mutantes qui surexpriment de manière ectopique le peptide agouti (Souris jaunes A y/y ) sont hyperphagiques et développent une obésité (Yen et al. 1994). 31

38 L AgRP est colocalisé à 90 % dans les neurones à NPY du NA (Hahn et al. 1998) et serait libéré en même temps que ce dernier. Un autre neurotransmetteur également exprimé dans les neurones à NPY est le GABA (Horvath et al. 1997), impliqué dans l interaction entre les neurones à NPY et à POMC du NA. Les effets hyperphagiques du NPY sont dus à l interaction de ce peptide avec des sous-types spécifiques de son récepteur (Y 1 -Y 6 ) (Blomqvist & Herzog 1997, Lin et al. 2004a). De façon différente, l AgRP n exerce pas son action orexigène en stimulant un récepteur qui lui est propre mais en agissant de manière antagoniste sur le système anorexigène du NA. L AgRP est en effet un antagoniste des récepteurs MC4-R de l α-msh (voir le paragraphe suivant sur α-msh et son récepteur) (Fan et al. 1997, Ollmann et al. 1997). Les neurones exprimant le NPY sont distribués dans différentes régions du SNC. En plus du NA, où ils sont le plus représentés, ces neurones sont retrouvés dans le cortex, l hippocampe et le tronc cérébral mais également en faible quantité dans le VMN et le DMN (Allen et al. 1983). Les neurones à NPY du NA projettent principalement vers le PVN et le LH mais aussi vers le VMN et le DMN (Fetissov et al. 2004). Des projections au sein même du NA sont également présentes, notamment sur les neurones à POMC (Cowley 2003) (cf II.B.3). 2. POMC/CART : neuropeptides anorexigènes Le principal neuropeptide anorexigène du NA est l α-msh (α-melanocyte- Stimulating Hormone). Ce peptide est clivé à partir de son précurseur, la pro-opiomélanocortine (POMC). Les effets de l α-msh sont dus à l interaction de ce peptide avec des sous-types spécifiques des récepteurs aux mélanocortines (MC3- et MC4-R). En effet, des souris déficientes pour le gène codant pour le MC4-R sont hyperphagiques et développent une obésité sévère (Weide et al. 2003). L ensemble des études menées dans ce domaine a permis de conclure que les neurones à α-msh exerçaient un tonus anorexigène permanent via son récepteur MC4-R (Fan et al. 1997). Physiologiquement, c est l AgRP qui joue le rôle d antagoniste du récepteur MC4-R (Ollmann et al. 1997, Schwartz et al. 2000, Woods & Seeley 2000, Cone 2005). Une partie des neurones à POMC synthétisent et libèrent un autre peptide anorexigène, le CART (Elias et al. 1998, Kristensen et al. 1998, Lambert et al. 1998). 32

39 Le NA est la région du SNC qui contient la plus grande population de neurones à POMC mais de plus petites sont aussi présentes au niveau de l hippocampe et du tronc cérébral. Ces neurones sont localisés latéralement dans le NA ou accolés au 3 ème ventricule selon les espèces animales. Les neurones à POMC du NA, comme les neurones à NPY, projettent majoritairement vers le PVN et le LH où sont présents les récepteurs MC3- et MC4- R (Baker & Herkenham 1995, Elias et al. 1999, Lu et al. 2003). D autres projections au sein de l hypothalamus existent aussi, comme par exemple vers le DMN et le VMN. Des projections extra-hypothalamiques sont également présentent vers l amygdale et surtout le tronc cérébral. 3. Interaction entre les systèmes à NPY/AgRP et à POMC/CART dans le NA Au sein même du NA, les neurones à NPY/AgRP et à POMC/CART semblent interconnectés, notamment par l intermédiaire du GABA (FIGURE 10). En effet, il a été suggéré que les neurones à NPY inhibent les neurones à POMC via la libération de GABA (Cone et al. 2001). La présence de l enzyme de synthèse du GABA, la glutamic acid decarboxylase, et celle du récepteur MC3-R dans une partie des neurones à NPY/AgRP viennent renforcer l hypothèse de cette interconnexion entre ces deux populations neuronales (Horvath et al. 1997). Nous venons de voir que le NA joue un rôle pivot dans la régulation de l homéostasie énergétique. D une part, sa localisation privilégiée à proximité d un système vasculaire fenêtré lui permet d intégrer en premier les paramètres périphériques métaboliques et endocriniens. D autre part, les réseaux neuronaux présents au sein de l hypothalamus suggèrent une intégration des informations par le NA puis un relais vers les noyaux hypothalamiques et extra-hypothalamiques. Au sein du NA, les deux grands systèmes neuronaux ont des effets opposés dans la régulation de la prise alimentaire. Les neurones à NPY/AgRP/GABA constituent essentiellement le système orexigène en stimulant la prise alimentaire alors que les neurones à POMC/CART constituent principalement le système anorexigène en inhibant les apports d énergie. Les métabolites et hormones exercent leurs effets sur l homéostasie énergétique via ces systèmes (Schwartz et al. 2000). 33

40 FIGURE 10 : Représentation schématique de l interconnexion possible entre les neurones à NPY et à POMC au sein du noyau arqué. MC3-R (melanocortin receptor 3), Y1-R et Y2-R (récepteur 1 et 2 au NPY), GABA-R (récepteur au GABA), PVN (noyau paraventriculaire), LH (hypothalamus latéral). Dans la prochaine partie, nous allons nous intéresser aux mécanismes de sensibilité hypothalamique des principaux paramètres périphériques métaboliques (glucose, AGL) et hormonaux (insuline, leptine) qui régulent l homéostasie énergétique en agissant sur les structures et neurones de l hypothalamus. 34

41 III. DETECTION HYPOTHALAMIQUE DES METABOLITES ET DES HORMONES Seule sera traitée dans ce chapitre, la détection hypothalamique directe des métabolites et des hormones, excluant la réception des informations périphériques de nature métabolique relayées par le SNA. Leur détection est possible grâce à la circulation sanguine qui les véhicule, de la périphérie vers le SNC. Ils arrivent aux cellules cérébrales après avoir traversé la BHE et, une fois détectés, sont à l origine de cascades de signalisation aboutissant à une information nerveuse et à des réponses comportementales et végétatives adaptées permettant de réguler l homéostasie énergétique. A. DETECTION DES METABOLITES Au niveau du SNC, les métabolites jouent un rôle prépondérant dans le maintien des structures et/ou l apport d énergie. L origine des lipides cérébraux est double : extra-cérébrale (alimentation et processus cataboliques) et intra-cérébrale (synthèse locale). Les lipides ont principalement un rôle structural dans la composition des membranes. De ce fait, ils représentent environ 50% du poids sec du cerveau. De plus, ils sont des composants essentiels des voies de signalisation. Quant au glucose, il est le principal substrat énergétique des cellules nerveuses en condition physiologique. L origine du glucose est obligatoirement extracérébrale puisque seuls le foie et les reins sont capables de réaliser une synthèse de novo de glucose (par la néoglucogenèse). Une partie du glucose cérébral est stockée dans les astrocytes sous forme de glycogène. Selon les besoins, le glucose peut être métabolisé en lactate pour être distribué aux neurones. Il existe donc un transfert possible d énergie entre les astrocytes et les neurones. In vivo, la contribution du lactate au métabolisme cérébral a été évaluée à 35%, ce qui est non négligeable. A leurs rôles structural et/ou énergétique pour les centres nerveux, s ajoute celui de molécules informatrices reflétant le statut énergétique de l organisme. Les métabolites peuvent, par eux-mêmes, indépendamment des hormones, contrôler l homéostasie énergétique, notamment en agissant au niveau de l hypothalamus et du tronc cérébral. A l heure actuelle, la notion de détection cérébrale des métabolites («nutrient-sensing») est 35

42 acceptée par la communauté scientifique et de nombreuses équipes s emploient à en étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires. A côté du glucose et des AGL, les acides aminés jouent aussi le rôle de molécules informatruces au niveau du SNC. Il est en effet connu qu un régime riche en protéines possède un fort pouvoir satiétogène. Néanmoins, leur implication dans le contrôle de l homéostasie énergétique ne sera pas détaillée dans ce manuscrit. 1. Le glucose Le SNC est équipé pour détecter à la fois des hypo- et des hyper-glycémies permettant d induire des réponses physiologiques adaptées qui participent au maintien de l homéostasie énergétique. a. Effets physiologiques d une hypoglycémie cérébrale L utilisation de différents modèles animaux d hypoglycémie a permis de démontrer son rôle dans la stimulation de la prise alimentaire (Pénicaud et al. 1986). Le lien moléculaire entre l hypoglycémie et l initiation de la prise alimentaire serait le système orexigène à NPY. En effet, en réponse à l hypoglycémie, l activité électrique des neurones à NPY et l expression de ce neuropeptide dans l hypothalamus sont augmentées, et l effet orexigène d une injection icv de 2-déoxyglucose est supprimé chez des souris déficientes pour ce neuropeptide (Sindelar et al. 2004). Une autre conséquence de la détection d une hypoglycémie par le SNC est l initiation des réponses de la contre-régulation. Ainsi, la détection cérébrale d une hypoglycémie induit, via l activation du SNA, une libération de glucagon et de catécholamines, une stimulation de la production hépatique de glucose et une inhibition de la sécrétion d insuline (Biggers et al. 1989, Woods & Porte 1974). Ainsi, la détection de l hypoglycémie cérébrale stimule les apports d énergie et limite le stockage et les dépenses dans le but de restaurer une glycémie physiologique. Le VMH serait la région hypothalamique impliquée dans cet arc réflexe métabolique. (Borg et al. 1997, Borg et al. 1994). Néanmoins, d autres études attribuent un rôle non négligeable au tronc cérébral dans la détection cérébrale de l hypoglycémie et les phénomènes de contre-régulation (Ritter et al. 2000). 36

43 b. Effets physiologiques d une hyperglycémie cérébrale Les effets physiologiques de la détection d une hyperglycémie au niveau cérébral ont été beaucoup moins étudiés. Néanmoins, il a été montré qu une hyperglycémie cérébrale entraîne une inhibition de la prise alimentaire (Grossman 1986, Kurata 1985) et peut moduler l activité du SNA. Notre groupe a ainsi montré qu une injection intracarotidienne de glucose, en direction du cerveau, induit, en périphérie, une sécrétion rapide et transitoire d insuline par l intermédiaire d une activation du SNA parasympathique (Atef et al. 1995). D autres études ont montré que la modulation du SNA en réponse à une hyperglycémie cérébrale favorise les dépenses énergétiques en stimulant la thermogenèse (Larue-Achagiotis et al. 1989) et inhibe la production hépatique de glucose (Lam et al. 2005b). Ainsi, la détection de l hyperglycémie cérébrale limite les apports d énergie et stimule le stockage et les dépenses dans le but de restaurer une glycémie physiologique. c. Les neurones sensibles au glucose du SNC Deux types de neurones sensibles au glucose ont été définis selon leur réponse à une augmentation de la concentration en glucose ([glucose] e ) : des neurones gluco-excités (GE, Gluco-Exicted) et des neurones gluco-inhibés (GI, Gluco-Inhibited). Ces cellules sont présentes dans les structures cérébrales impliquées dans la régulation de l homéostasie énergétique, notamment l hypothalamus (NA, VMN, LH, PVN, DMN) et le tronc cérébral, mais aussi dans des structures à priori non impliquées dans cette fonction (substance noire, hippocampe et néocortex) (Pénicaud 2002, Levin 2002). Si on s intéresse plus spécifiquement au NA, qui occupe une position stratégique dans la détection des paramètres périphériques métaboliques, ce noyau comprend 4 sous populations de neurones sensibles aux variations de la [glucose] e. Des neurones GE et GI sont présents et répondent dans la gamme 0,1-5mM de glucose, qui correspond vraisemblablement à une situation d hypoglycémie (Wang 2004, Fioramonti et al. 2004), et des neurones sont gluco-excités ou gluco-inhibés dans la gamme 5-20mM, qui correspond vraisemblablement à une situation d hyperglycémie (Fioramonti et al. 2007). En raison de la gamme élevée de glucose détecté, ces neurones ont été nommés HGE (High Gluco-Exicted) et HGI (High Gluco-Inibited). Par conséquent, le NA est équipé de systèmes neuronaux spécialisés dans la détection des hypo comme des hyperglycémies (FIGURE 11). 37

44 L utilisation de lignées de souris transgéniques exprimant spécifiquement une protéine fluorescente (GFP-sapphire ou GFP-topaz) dans les neurones à NPY ou à POMC a permis de montrer que les neurones à NPY du NA sont de type GI, donc spécialisés dans la détection de l hypoglycémie (Fioramonti et al. 2007) (FIGURE 11). Or, l hypoglycémie augmente l expression du NPY dans l hypothalamus. Ainsi, la stimulation des neurones GI par l hypoglycémie permettrait une libération de NPY, et donc une augmentation des apports énergétiques via la stimulation de la prise alimentaire et des mécanismes de la contrerégulation. Concernant la sensibilité au glucose des neurones à POMC, les résultats sont contradictoires. En effet, contrairement à Ibrahim et coll. (Ibrahim et al. 2003), les travaux de Wang et coll. (Wang et al. 2004) ainsi que ceux de Fioramonti et coll. (Fioramonti et al. 2007) suggèrent que ces neurones sont insensibles au glucose. Leur rôle dans la détection des hypo- et des hyper-glycémies demande donc à être éclairci. D autre part, le NPY et l α-msh respectivement inhibe et active l activité des neurones de type GE (Wang et al. 2004), suggérant un rôle d intégration des signaux métaboliques et nerveux pour ces cellules. La nature neuropeptidergique des neurones de type GE, HGE et HGI reste à déterminer, ce qui permettra de mieux comprendre le rôle de chacun d entre eux dans la régulation de l homéostasie énergétique. FIGURE 11 : Représentation schématique des différents neurones sensibles au glucose du noyau arqué, des canaux et des neuropeptides mis en jeu. 3V (3 ème ventricule), NA (noyau arqué), GI (glucoinhibé), GE (gluco-excité), HGE (high GE), HGI (high GI), CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator), TRP (transient receptor potentiel), K ATP (canaux potassiques dépendants de l ATP). D après Fioramonti et coll. (Fioramonti et al. 2007). 38

45 d. Les mécanismes moléculaires neuronaux de la détection du glucose Dans le cadre de la recherche des mécanismes moléculaires impliqués dans la détection neuronale du glucose, la découverte de neurones gluco-excités a amené une grande partie de la communauté scientifique à faire l analogie avec la cellule β du pancréas (Yang et al. 1999). En effet, cette cellule est capable de détecter une augmentation de la [glucose] e et de la traduire par une augmentation de la sécrétion d insuline. Cette détection fait intervenir successivement le couple GLUT2/GK et le canal K ATP (cf. I.C.2.a). Le couple GLUT2/GK Le transporteur au glucose GLUT2 et la glucokinase (GK) sont exprimés dans les régions cérébrales contenant des neurones sensibles au glucose et impliquées dans la régulation de l homéostasie énergétique (hypothalamus et tronc cérébral) (Leloup et al. 1994, Arluison et al. 2004a, Arluison et al. 2004b). GLUT2 est impliquée dans la détection d une hyperglycémie cérébrale par le NA (Marty et al. 2005, Wan et al. 1998, Leloup et al. 1998) et la GK serait impliquée dans les réponses des neurones sensibles au glucose (Yang et al. 1999, Moriyama et al. 2004, Kang et al. 2004). Au niveau du NA, la GK colocalise avec le NPY ou la POMC (Dunn-Meynell et al. 2002), renforçant le rôle de ces deux sous populations neuronales dans la détection hypothalamique du glucose. Les canaux K ATP Les canaux K ATP sont des hétéro-octamères composés de 4 sous-unités α formant le canal Kir6.x (inwardly rectifying K + channel 6.x) et de 4 sous-unités β formant le complexe SUR (Sulfonylurea receptor) (Seino 1999). Kir6.x est un canal potassique à rectification entrante (ces canaux conduisent «mieux» le courant K + entrant que le courant sortant). Dans des conditions de concentrations physiologiques, intracellulaire et extracellulaire, en potassium (le K + est plus concentré à l intérieur des cellules), les ions K + sortent de la cellule. La fermeture des K ATP induit ainsi une accumulation des ions K +, et donc des charges à l intérieur des cellules, conduisant à leur dépolarisation. A l inverse, leur ouverture induit une hyperpolarisation de la cellule. 39

46 L activité des K ATP est modulée par le potentiel de membrane, par la fixation de ligands tels que l ATP et l ADP (Adénine Di-Phosphate), le PIP2 (PhosphatidylInositol-4,5- diphosphate) et le PIP3 (PhosphatidylInositol-3,4,5-triPhosphate), les sulphonylurées (antidiabétique), et par les acides gras. L ATP et les sulphonyurées induisent la fermeture du canal, et donc une dépolarisation de la cellule, tandis que l ADP, le PIP2, le PIP3, et les acides gras entraînent son ouverture, et donc une hyperpolarisation de la cellule. La régulation des K ATP par le ratio ADP/ATP cytosolique confère à ce canal un rôle de «senseur métabolique» (Nichols 2006, Miki et al. 2001). De plus, ces canaux sont sensibles aux espèces actives de l oxygène (EAOs) (Avshalumov et al. 2007, Avshalumov et al. 2005, Avshalumov & Rice 2003), qui peuvent être produites, dans le cas du métabolisme cellulaire du glucose, par la chaîne respiratoire mitochondriale, parallèlement à la production d ATP. Les K ATP seraient donc doublement sensibles au fonctionnement mitochondrial (au ratio ADP/ATP et aux EAOs), ce qui renforce leur rôle de «senseur métabolique». La sous unité Kir6.2 est exprimée dans différentes structures du SNC (Dunn-Meynell et al. 1998, Liss & Roeper 2001), et plus particulièrement dans le NA de l hypothalamus par la quasi-totalité des neurones à NPY et à POMC (Dunn-Meynell et al. 1998, Ibrahim et al. 2003) et par les neurones GE (Ibrahim et al. 2003, Lee et al. 1999). Les K ATP sont impliqués dans la détection du glucose par les neurones GE (Ashford et al. 1990, Kang et al. 2004, Song et al. 2001, Spanswick et al. 1997, Spanswick et al. 2000). Ainsi, en cas d hypoglycémie, la diminution du métabolisme intracellulaire du glucose entraînerait une augmentation du ratio ADP/ATP, ayant pour conséquence l ouverture des K ATP, et donc l hyperpolarisation des neurones GE enregistrée dans ce contexte (FIGURE 11). De plus, notre groupe montre que l effet de l hyperglycémie cérébrale sur la sécrétion pancréatique d insuline dépend d une augmentation des EAOs d origine mitochondriale (meaos) dans l hypothalamus (Leloup et al. 2006). Bien que les cibles moléculaires de ces EAOs n aient pas encore été identifiées, les canaux K ATP pourraient constituer de bons candidats. Autres acteurs: les canaux TRP et CFTR. L excitation des neurones HGE du NA en réponse à une augmentation de la [glucose] e au dessus de 5mM met en jeu un mécanisme indépendant des canaux K ATP, faisant intervenir la femeture de canaux cationiques non-selectifs (Fioramonti et al. 2004). Notre équipe propose que ces canaux soient apparentés à la super famille des canaux TRP (Transient 40

47 Receptor Potentiel) en raison du grand nombre de canaux perméables à plusieurs cations qu elle comprend et de leur sensibilité au statut redox de la cellule (Kraft et al. 2004). D autre part, la détection d une diminution de la [glucose] e en dessous de 5mM par les neurones GI met en jeu la fermeture d une conductance chlore (Fioramonti et al. 2007). Parmi les canaux chlore, les canaux CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator) pourraient constituer de bons candidats en raison de leur sensibilité aux variations de la concentration en ATP, due à leur domaine de liaison pour ce nucléotide (Baukrowitz et al. 1994). 2. Les acides gras Dans les paragraphes qui vont suivre, nous présenterons les effets physiologiques d une augmentation de la concentration en acides gras dans le SNC, l existence de neurones particuliers sensibles aux acides gras et enfin les mécanismes mis en jeu dans la détection de ces métabolites. Rappelons que les acides gras libres (AGL) représentent la forme «active» des lipides. Dans la plupart des travaux sur la détection cérébrale des acides gras, l acide oléique est le plus couramment utilisé car il représente l AGL essentiel le plus consommé dans l alimentation des sociétés occidentales. a. Les effets physiologiques d une hyperlipidémie cérébrale Une augmentation des taux d acides gras dans le SNC induit une inhibition de la prise alimentaire, indépendamment des paramètres humoraux (leptinémie, insulinémie, ou glycémie) (Benani et al. 2007, Obici et al. 2002b, Loftus et al. 2000). En plus de leur effet anorexigène, les AGL cérébraux modulent le métabolisme glucidique périphérique. En effet, une augmentation des taux d acides gras libres dans le SNC inhibe la production hépatique de glucose (Obici et al. 2002b) et potentialise la sécrétion d insuline en réponse à une hyperglycémie, indiquant que cette action périphérique des AGL sur les cellules β (cf I.B.2) passe au moins en partie par une détection cérébrale (Clement et al. 2002). Le lien entre la sensibilité hypothalamique aux AGL et la mise en place de mécanismes régulateurs périphériques s établirait grâce au SNA, et plus particulièrement grâce à une diminution du tonus sympathique contrôlée par l hypothalamus (Cruciani-Guglielmacci et al. 2004, Clement et al. 2002, Magnan et al. 1999). En revanche, à un long-terme, un régime riche en lipides entraîne le développement d une obésité associée à une hyperphagie. 41

48 De façon cohérente, les effets anorexigènes des AGL sont corrélés à une diminution de l expression des peptides orexigènes hypothalamiques NPY et AgRP, sans modification, néanmoins, des niveaux d expression de la POMC (peptide anorexigène) (Obici et al. 2002b, Morgan et al. 2004). L ensemble de ces données a permis de mettre en lumière le rôle des acides gras dans le contrôle de l homéostasie énergétique et ce, grâce à leur détection cérébrale. De nombreuses équipes étudient maintenant les mécanismes cellulaires et moléculaires sous jacents à ces effets cérébraux. b. Les neurones sensibles aux acides gras Il existe au sein de l hypothalamus des neurones particuliers dont l activité électrique est spécifiquement modulée par les AGL (Oomura et al. 1975). Il a été clairement démontré, in vivo et ex-vivo, que l activité électrique des neurones du noyau arqué est directement augmentée ou diminuée par l acide oléique, suite à une injection intracarotidienne ou une application directe sur tranches fraîches de cerveau (Wang 2005). La présence de ces neurones sensibles aux acides gras a également été montrée en suivant le pattern d expression du proto-oncogène c-fos, utilisé comme marqueur d activité (Chang et al. 2004a). c. Mécanismes moléculaires impliqués dans la détection cérébrale des acides gras Les acides gras à longue chaîne, tel que l acide oléique, sont majoritairement transportés dans la circulation sanguine par des lipoprotéines ou liés à l albumine, et sont présents dans le SNC, notamment dans le liquide céphalorachidien (Goto & Spitzer 1971). Une fois à l intérieur de cellules, les AGL sont rapidement métabolisés en acyl-coa par l ACS (Acyl-CoA Synthase) avant de pénétrer dans la mitochondrie pour y subir la β- oxydation. (FIGURE 12). Leur transport dans la mitochondrie est facilité par l intermédiaire de deux transporteurs, CPT1 (CPT1A et B) et CPT2 (Carnitine-Palmitoyl Transferase 1 et 2). CPT1 est localisé sur la membrane mitochondriale externe et CPT2 sur la membrane interne. La β-oxydation des acyl-coa conduit à la formation de coenzymes réduits (NADH et FADH 2 ) qui vont alimenter la chaîne respiratoire mitochondriale. De plus, une synthèse de novo d acyl-coa peut avoir lieu, notamment dans les cellules nerveuses, à partir du glucose. En effet, le glucose, qui est métabolisé en acétyl-coa peut alors être transformé en malonyl- CoA par l ACC (Acétyl-CoA Carboxylase). La FAS (Fatty Acid Synthase) synthétise alors de 42

49 l acyl-coa à partir de plusieurs molécules de malonyl-coa. Les acyl-coa peuvent donc être issus du métabolisme des AGL ou du glucose (FIGURE 12). Les mécanismes moléculaires par lesquels agissent les acides gras en tant que molécules informatives au niveau cérébral sont relativement controversés. Deux hypothèses s opposent (FIGURE 12): Hypothèse 1. La dégradation des acides gras par la β-oxydation mitochondriale serait l étape clé. Selon cette hypothèse, l augmentation des acides gras dans la cellule conduirait à une augmentation du fonctionnement mitochondrial (β-oxydation et respiration), se traduisant notamment par une production d meaos. En effet, l inhibition de l entrée des acyl-coa dans la mitochondrie (injection icv d étomoxir) entraîne une perte des effets des AGL sur la sécrétion d insuline dépendante du glucose (Cruciani-Guglielmacci et al. 2004) et sur la production d meaos nécessaire à l inhibition de la prise alimentaire induite par les AGL (Benani et al. 2007). Selon l hypothèse 2, ce serait l accumulation des acides gras dans le cytoplasme qui constituerait le signal clé. En effet, l inhibition de l entrée des acyl-coa dans la mitochondrie (injection icv d étomoxir ou de C75, inhibiteur de la FAS), qui conduit à leur accumulation cytosolique, mime les effets des AGL : inhibition de la prise alimentaire, du poids corporel et de la production hépatique de glucose (Obici et al. 2003). Avec l étomoxir, l augmentation de la concentration des acides gras dans le cytosol résulte directement de l inhibition de leur entrée dans la mitochondrie, tandis que l utilisation d inhibiteurs de la FAS induit indirectement une accumulation similaire d acyl-coa via l augmentation des taux de malonyl-coa, inhibiteur endogène de CPT1. FIGURE 12 : Représentation schématique des mécanismes cellulaires dans l hypothalamus par lesquels les acides gras régulent l homéostasie énergétique. AGL (acide gras libres), ACS (acyl-coa synthase), ACC (acetyl-coa carboxylase), CPT1/2 (carnitine-palmitoyltransferase 1 et 2). Schéma modifié à partir de Lam et coll. (Lam et al. 2005b). 43

50 Bien que les cibles moléculaires des acides gras et des produits dérivant de la régulation du métabolisme mitochondrial responsables de leurs effets dans l hypothalamus n aient pas encore été identifiées, les canaux K ATP pourraient constituer, comme pour les effets du glucose, de bons candidats théoriques étant donné leur sensibilité aux acides gras, aux EAOs et au ratio ADP/ATP (Obici et al. 2002b). B. SENSIBILITE A L INSULINE Comme nous l avons vu précédemment, la régulation hormonale est primordiale pour le maintien de l homéostasie énergétique. Au niveau cérébral, et plus particulièrement de l hypothalamus, sont exprimés les récepteurs spécifiques aux principales hormones impliquées dans ce contrôle, comme l insuline, la leptine, et la ghréline. Ceux-ci permettent la détection de leurs concentrations circulantes, assurant ainsi un ajustement de la prise alimentaire et des stocks et dépenses d énergie (Figlewicz 2003). Etant donné l intérêt de cette thèse pour l action centrale de l insuline, nous traiterons principalement d elle. Bien qu une petite production d insuline ait été démontrée au niveau du SNC, la majorité de l insuline présente dans le cerveau est d origine pancréatique et gagne cet organe par la circulation sanguine en traversant la BHE. Une petite fraction de l insuline circulante gagnerait le liquide céphalorachidien (LCR) au niveau des plexus choroïdiens. Il est actuellement proposé que le transport de l insuline vers le SNC, spécifique et saturable, soit assuré par le récepteur à l insuline (RI) présent sur les cellules endothéliales formant la BHE. Il permettrait ainsi le passage de l insuline du plasma vers le liquide interstitiel du parenchyme nerveux et le LCR des ventricules cérébraux (Schwartz et al. 1992). 1. Action centrale de l insuline : régulation de l homéostasie énergétique Au niveau du SNC, l insuline joue de nombreux rôles, notamment dans les processus cognitifs et neuronaux, la neuroprotection, le métabolisme cellulaire, la fertilité et la reproduction, la mémoire et l apprentissage, la vigilance, la longévité; l olfaction, et l homéostasie énergétique. 44

51 L insuline participe au maintien de l homéostasie énergétique de l organisme en assurant les normoglycémie et normolipidémie via ses actions complémentaires au niveau périphérique et central. Les principaux effets centraux de l insuline permettant de réguler les taux de nutriments sanguins sont la modulation de la prise alimentaire et des métabolismes glucidique et lipidique des tissus périphériques (stockage et dépenses énergétiques) (FIGURE 13). Figure 13 : Effets centraux de l insuline. SNA (système nerveux autonome), TABlanc (tissu adipeux blanc), TABrun (tissu adipeux brun). 45

52 a. Réduction de la prise alimentaire : limiter les apports d énergie L action de l insuline sur la prise alimentaire et le poids corporel a été démontrée dans de nombreuses espèces. Ainsi, l injection d insuline dans les ventricules cérébraux (3 ème ou 4 ème ventricule) chez la souris (Brown et al. 2006), le rat (Brief & Davis 1984), la chèvre (Foster et al. 1991), ou encore le babouin (Woods et al. 1979), produit une diminution de la quantité calorique ingérée et du poids corporel. Cet effet de l insuline est spécifique d une diminution de la prise alimentaire dans le sens où aucune différence de la prise hydrique ni du comportement général n a été observée (Schwartz et al. 1992). Ces effets sont similaires lorsque la perfusion est pratiquée directement dans l hypothalamus et ce pour des doses d insuline plus faibles que celles utilisés pour les perfusions intra-cérébro-ventriculaires (icv). Il est important de noter que l effet anorexigène de l insuline n est détectable qu après plusieurs heures voir plusieurs jours, en fonction de la dose utilisée et des espèces, mettant ainsi en évidence un rôle majoritairement dans la régulation à long-terme de la prise alimentaire. De plus, une simple injection icv d insuline avant le repas principal (période nocturne chez les rongeurs) est suffisante pour induire une diminution de la prise alimentaire sur 24h, dévoilant ainsi la puissance du signal insuline dans l initiation cérébrale de cette régulation à long-terme de l homéostasie énergétique (Brown et al. 2006). Les effets cérébraux de l insuline sur la prise alimentaire seraient principalement dus à une action au niveau hypothalamique. En effet, l administration de l hormone directement dans le VMH induit une hypophagie (McGowan et al. 1992a). De plus, l injection d anticorps dirigés contre l insuline dans cette même région provoque une augmentation de la prise alimentaire et du poids corporel (McGowan et al. 1992a, Strubbe & Mein 1977). Les effets de l insuline dans le PVN sont similaires à ceux observés dans le VMH (Menendez & Atrens 1991). Ainsi, le VMH et le PVN semblent représenter les deux structures hypothalamiques les plus sensibles à l action de l insuline, probablement lié à la densité en récepteurs à l insuline (Marks et al. 1990, Hill et al. 1986). Cependant, on sait aujourd hui que l insuline régule la prise alimentaire en agissant aussi sur d autres régions du SNC en lien avec les choix alimentaires faisant référence à la mémoire ou à des phénomènes cognitifs, gustatifs et/ou olfactif (Konner et al. 2009). 46

53 b. Régulation des métabolismes glucidique et lipidique : dépenser et stocker l énergie l énergie Stimulation de la thermogenèse du tissu adipeux brun : dépenser Le tissu adipeux brun (TABrun) participe de manière active au phénomène de thermogenèse dite de non-frisson, par opposition à celle produite par le frissonnement musculaire. La thermogenèse du TABrun est induite en condition physiologique suite à un apport énergétique, comme par exemple après un repas. Elle résulte principalement d une augmentation de l oxydation mitochondriale des acides gras provenant de la circulation sanguine ou de l hydrolyse des réserves en triglycérides contenues dans le TABrun, et dans une moindre mesure d une augmentation de l oxydation mitochondriale du glucose. Cette augmentation des métabolismes lipidique et glucidique est due à la stimulation de la protéine découplante UCP1 (UnCoupling Protein 1) qui entraîne une dissipation de l énergie sous forme de chaleur (Nicholls & Rial 1999). La thermogenèse du TABrun est partiellement contrôlée par le SNA sympathique, dans le sens d une augmentation lorsque ce dernier est activé. Différentes études ont permis de montrer qu une injection centrale d insuline (Muntzel et al. 1994, Rahmouni et al. 2004) ou une hyper-insulinémie périphérique (Young & Landsberg 1977a) étaient associées à une augmentation du tonus sympathique. A l inverse, les situations d hypo-insulinémie, telles que le jeûne ou le diabète induit par la streptozotocine (Young & Landsberg 1977b) sont associées à une diminution de l activité sympathique. Ces effets sont abolis lors de lésions de la partie ventrale de l hypothalamus (Muntzel et al. 1994). En accord avec ce résultat, l injection d insuline directement dans le VMN ou le PVN entraîne une augmentation de la température corporelle et des dépenses énergétiques (McGowan et al. 1992b, Muntzel et al. 1994). Ainsi, par son action au niveau de l hypothalamus, l insuline stimule l activité des fibres sympathiques innervant le TABrun, induisant une production de chaleur à partir de l oxydation des acides gras libres et du glucose, et donc une augmentation des dépenses énergétiques. Cette régulation par l insuline se produit parallèlement à la diminution de la 47

54 prise alimentaire. On peut donc en déduire que l action centrale de l insuline permet de diminuer les taux circulants en nutriments en jouant à la fois sur les apports (-) et les dépenses énergétiques (+). Inhibition de la production hépatique de glucose : stocker l énergie Dans le même ordre d idée, une infusion d insuline dans le 3 ème ventricule cérébral entraîne une forte diminution de la production hépatique de glucose, indépendamment de tout autre modification des taux circulants d insuline ou des hormones de la contre-régulation (Obici et al. 2002c). Depuis, ces résultats ont été confirmés par différentes études qui démontrent clairement que l action de l insuline au niveau du SNC constitue un paramètre physiologique déterminant pour un métabolisme glucidique hépatique normal (Obici et al. 2002a, Ono et al. 2008, Koch et al. 2008). Cependant, le mécanisme efférent permettant d expliquer cet effet central de l insuline reste inconnu, bien que l implication de l innervation hépatique par le SNA soit fortement suggérée. En conclusion, l inhibition de la production hépatique de glucose par l action centrale de l insuline permet de réguler négativement le taux de glucose dans le sang. Stimulation du stockage des triglycérides dans le tissu adipeux blanc : stocker l énergie Très récemment, il a été démontré qu un traitement chronique (7 jours) d insuline par voie icv chez la souris entraîne dans le tissu adipeux blanc (TABlanc) une augmentation de la masse grasse, de la taille des adipocytes et de l expression de lipoprotéine lipase adipocytaire, autant de paramètres caractéristiques de la lipogenèse (Koch et al. 2008). Cet effet de l insuline était connu depuis longtemps en périphérie via une action directe de l insuline sur les organes mais restait inconnu via une action indirecte par le SNC. Comme pour le contrôle de la production hépatique de glucose, le mécanisme efférent permettant d expliquer l effet central de l insuline sur le métabolisme lipidique périphérique reste inconnu, même si l implication du SNA est, de nouveau, fortement probable. En conclusion, cette action centrale de l insuline contribue à la régulation négative des taux circulants en lipides. 48

55 L ensemble de ces données démontrent que l action centrale de l insuline est en parfait accord avec ses effets périphériques visant à réduire les augmentations des taux circulants en nutriments générées par l alimentation (FIGURE 13). 2. Signalisation centrale de l insuline a. Le récepteur à l insuline Les effets centraux de l insuline décrits dans les paragraphes précédents sont liés à la présence de son récepteur au niveau du SNC. En effet, la diminution de l expression du récepteur à l insuline (RI) cérébral, obtenue par invalidation du gène codant pour le RI de type neuronal (souris NIRKO, Neuronal Insulin Receptor Knock-Out) (Bruning et al. 2000) ou par infusion icv (3 ème ventricule) chronique (7 jours) d oligonucléotides antisens ou d anticorps dirigés contre le RI (Obici et al. 2002a), entraîne une hyperphagie, une augmentation du poids corporel et une résistance périphérique à l action de l insuline sur le contrôle de la production hépatique de glucose. Plusieurs études ont permis de mettre en évidence la présence du RI dans le SNC grâce à des techniques d hybridation in situ et d immuno-histo-chimie. Ce dernier est présent dans l ensemble du cerveau avec une densité plus importante dans les régions directement impliquées dans le contrôle de la prise alimentaire et de l activité du SNA, telles que l hypothalamus, le tronc cérébral et les bulbes olfactifs (Hill et al. 1986). Dans l hypothalamus, il se concentre particulièrement dans le NA et de manière plus faible dans le VMN, le DMN, et dans le LH (Schwartz et al. 1992). Dans ces différentes régions du SNC, le marquage pour le RI est très similaire à la distribution de l insuline cérébrale (Baskin et al. 1988). Deux types différentes de RI ont été identifiés dans le SNC : un RI de type périphérique détecté dans les cellules gliales, les cellules endothéliales cérébrales, et les neurones périphériques (Waldbillig & LeRoith 1987), et un RI de type neuronal détecté en très forte densité dans les neurones centraux (LeRoith et al. 1988). Au niveau cellulaire, le RI de type neuronal est localisé préférentiellement au niveau du corps cellulaire, des dendrites et des synapses. A l échelle ultra-structurale, l immuno-réactivité pour le RI apparaît souvent associée aux membranes post synaptiques (Baskin et al. 1988). 49

56 Ces deux types de RI sont dotés de la même activité enzymatique tyrosine kinase, suggérant des capacités identiques à traduire le signal de l insuline (Adamo et al. 1989). Cependant, le RI de type neuronal présente des caractéristiques différentes de celles du récepteur périphérique. En effet, son poids moléculaire est inférieur (5kDa) à celui de type périphérique, pouvant s expliquer par une réduction de la glycosylation des sous-unités (Schulingkamp et al. 2000). Par ailleurs, les caractéristiques de régulation de l expression du RI de type neuronal sont différentes de celles du type périphérique. En effet, il n existe pour ce premier ni de régulation négative ni de régulation positive de son expression en réponse à des variations de l insulinémie, contrairement au RI de type périphérique. Ainsi, dans des situations d hypo-insulinémie (jeûne, diabète de type I), il n existe pas de régulation positive du RI au niveau central comme c est le cas en périphérie (Marks & Eastman 1989), et dans la situation inverse d hyper-insulinémie, comme c est le cas dans les modèles d obésité génétiques (rat Zucker fa/fa ou souris ob/ob), il n existe pas non plus de régulation négative du RI (Havrankova et al. 1979). Toutefois, il a été montré dans ces situations d hypo- ou d hyper-insulinémie, que la liaison de l insuline à son récepteur est diminuée, notamment au niveau des capillaires cérébraux, suggérant un défaut d entrée de l insuline par la BHE (Schwartz et al. 1990). Cette absence de régulation in vivo n est pas comprise mais pourrait être attribuée à la faible variabilité de la concentration de l insuline cérébrale par rapport à celle du plasma (Schwartz et al. 1992). b. Les voies de signalisation de l insuline IRS Dans les tissus périphériques, l activation du récepteur à l insuline est couplée à différentes voies de signalisation via des molécules adaptatrices, dont celles de la famille des IRS (cf I.C.2.c) (FIGURE 14A). IRS-1 fût la première à être identifiée, et bien que cette protéine semble jouer un rôle essentiel dans la transduction du signal de l insuline dans les tissus périphériques, son implication dans l action centrale de l insuline reste encore à élucider. En effet, les souris invalidées pour le gène de IRS-1 (IRS1 KO) ne présentent pas de phénotype anormal en terme d homéostasie énergétique (Tamemoto et al. 1994, Araki et al. 1994). De plus, pourtant exprimée dans l ensemble du SNC (Baskin et al. 1993), la protéine IRS-1 est peu concentrée dans les noyaux de l hypothalamus ventral où se situe la plus forte densité en récepteur à l insuline. En revanche, IRS-2 est relativement abondante dans le noyau 50

57 arqué (Torsoni et al. 2003), tout comme le récepteur à l insuline. L implication de cette protéine dans les effets hypothalamiques de l insuline sur la régulation de l homéostasie énergétique a été clairement établie. En effet, les souris invalidées pour le gène codant pour IRS-2 (IRS2 KO), notamment dans l hypothalamus, sont hyperphagiques et présentent une augmentation des dépôts adipeux (Kubota et al. 2004, Lin et al. 2004b). Cependant, si IRS-1 ne semble pas jouer de rôle primordial dans l action centrale de l insuline visant à réguler la balance énergétique, elle n en n est pas moins impliquée dans sa signalisation hypothalamique. En effet, l administration icv (3 ème ventricule) d insuline induit aussi bien la phosphorylation des résidus tyrosine de IRS-2 que ceux de IRS-1 (Ono et al. 2008, Rahmouni et al. 2004, Niswender et al. 2003b, Niswender et al. 2003a) dans l hypothalamus. De plus, un régime riche en gras de courte durée (1 jour) entraîne l altération de la régulation centrale de la production hépatique de glucose par l insuline parallèlement à une diminution de la phosphorylation hypothalamique de IRS-1, sans modification de celle de IRS-2 ou du RI lui-même (Ono et al. 2008). Ces résultats montrent que IRS-1 est bien impliquée dans la signalisation hypothalamique de l insuline mais vraisemblablement dans une régulation à court-terme de l homéostasie énergétique, contrairement à IRS-2 qui serait plutôt impliquée dans une régulation à long-terme. PI3K Dans les tissus périphériques, la fonction clé des IRS est de coupler l activation du RI aux voies de signalisation, notamment celle de la PI3K. Au niveau du SNC, la voie de la PI3K est essentielle à l action de l insuline. En effet, en réponse à une injection icv (3 ème ventricule) d insuline, la phosphorylation des IRS conduit à une augmentation rapide de l activité de la PI3K (en 15min) (Xu et al. 2005, Niswender et al. 2003b). L administration centrale (3 ème ventricule) d inhibiteurs de son activité (wortmannin ou LY294002) supprime les principaux effets hypothalamiques de l insuline sur la régulation de l homéostasie énergétique, à savoir la réduction de la prise alimentaire (Niswender et al. 2003b) et l inhibition de la production hépatique de glucose (Obici et al. 2002c). L activation de la PI3K permet la phosphorylation du PIP2 en PIP3 (Niswender et al. 2003b). Ce dernier permet de recruter des molécules effectrices situées en aval, telles la PDK (Phosphoinositide-Dependent Kinase) et Akt 51

58 (FIGURE 14A). Notons que l activation de la PI3K a lieu préférentiellement dans les cellules du noyau arqué contenant IRS-2 et PIP3. L importance du PIP3 et de la PDK dans le contrôle hypothalamique de l homéostasie énergétique a été clairement démontrée. En effet, les souris invalidées pour le gène de PDK-1 ou de PTEN (Phosphatase and TENsin homolog, enzyme responsable de la dégradation de PIP3 en PIP2), spécifiquement dans les neurones (à POMC) de l hypothalamus, présentent une hyperphagie et une augmentation du poids corporel (Plum et al. 2006b, Belgardt et al. 2008). Notons que les souris PDK1 KO présentent en plus une dérégulation du métabolisme glucidique périphérique alors que les souris PTEN KO développent une obésité accrue en réponse à un régime riche en gras. Finalement, Akt est phosphorylée dans l hypothalamus 5min après l activation de la voie IRS/PI3K/PIP3 par l insuline (Niswender et al. 2003b). L ensemble de ces données démontre l importance de la voie de signalisation de la PI3K dans les effets centraux de l insuline sur l homéostasie énergétique (FIGURE 14A). MAPK Les effets périphériques de l insuline dépendent également d une autre voie de signalisation, celle des MAPK. Les protéines IRS et SHC permettent de coupler l activation du RI à cette voie. Au niveau du SNC, l activité des MAPK semble également constituer un élément important de l action de l insuline. En effet, une injection icv d insuline induit, dans l hypothalamus, la phosphorylation des sous-unités p42 et p44 des MAPK sur leurs résidus tyrosine alors que l administration centrale d inhibiteurs de l activité des MAPK (PD98059 ou U0126) supprime l effet hypothalamique de l insuline sur l activation du système nerveux sympathique innervant le TABrun (Rahmouni et al. 2004). En conclusion, les voies de signalisation de la PI3K et des MAPK jouent un rôle critique dans le contrôle, périphérique et central, de l homéostasie énergétique par l insuline. 52

59 3. Cibles cellulaires hypothalamiques de l insuline a. Régulation de l expression des neuropeptides Nous avons vu précédemment que les réseaux neuronaux NPY/AgRP et POMC/CART, présents au sein du noyau arqué, assurent l intégration des informations métaboliques et hormonales pour les relayer vers les structures cérébrales impliquées dans la régulation de l homéostasie énergétique. Depuis longtemps, la modulation de l expression des neuropeptides de l hypothalamus est considérée comme un mécanisme pivot de l effet anorexigène de l insuline (FIGURE 14A). Les neurones à NPY/AgRP et à POMC possèdent le récepteur à l insuline (Konner et al. 2007, Schwartz et al. 2000, Benoit et al. 2002). L administration icv (3 ème ventricule) d insuline induit dans le noyau arqué une diminution de l expression du neuropeptide orexigène NPY (Obici et al. 2001, Schwartz et al. 1991). De plus, elle induit une augmentation de celle de la POMC et donc vraisemblablement de la quantité d α-msh. Nous avons vu précédemment que la voie de signalisation de la PI3K était indispensable à l action centrale de l insuline. L activation de la PI3K conduit à la phosphorylation d Akt qui est alors transloquée dans le noyau. Sa translocation entraîne celle du facteur de transcription FoXO-1 (Forkhead BoX O-1) vers le cytoplasme, inhibant ainsi son activité (Biggs et al. 1999), phénomène qui a lieu dans l hypothalamus 30min après l injection icv d insuline (Kim et al. 2006a). La liaison de FoXO-1 à l ADN stimule l expression de NPY et réprime celle de POMC. Par conséquent, via l inhibition de son activité, l insuline réprime l expression de NPY et stimule celle de POMC. L invalidation du gène de FoXO-1 spécifiquement dans l hypothalamus supprime l effet anorexigène de l insuline. FoXO-1 représente donc l élément moléculaire final permettant d expliquer les effets géniques de l insuline dans l hypothalamus (FIGURE 14A). b. Contrôle de l activité électrique L insuline hyperpolarise les neurones gluco-excités (Spanswick et al. 2000, Wang 2004) et les neurones à NPY et à POMC de l hypothalamus (Plum et al. 2006b, Choudhury et al. 2005). L effet hyperpolarisant de l insuline sur l activité électrique des neurones à NPY semble cohérent avec son effet inhibiteur sur l expression de ce neuropeptide orexigène. En 53

60 revanche, l hyperpolarisation des neurones à POMC est relativement contradictoire avec l augmentation de l expression de ce neuropeptide anorexigène et l inhibition de la prise alimentaire. A l heure actuelle, on ne connaît toujours pas la part de contribution de chaque sous population neuronale (NPY/AgRP et POMC/CART) dans les effets anorexigènes de l insuline, ce qui permettrait de mieux comprendre le mode d action de l insuline. Si les effets de l insuline sur l expression des neuropeptides hypothalamiques NPY et POMC sont cohérents avec la régulation de la prise alimentaire, ses effets sur l activité électrique des neurones à NPY et à POMC de l hypothalamus impliqués dans cette même fonction prêtent d avantage à confusion (FIGURE 14B). L effet hyperpolarisant de l insuline est dépendant de la stimulation (ouverture) des canaux K ATP (Spanswick et al. 2000, Wang 2004), bloquée par des inhibiteurs de la PI3K (Mirshamsi et al. 2004). Ainsi, cette action de l insuline serait liée à l activation de la PI3K qui régulerait l excitabilité des neurones de l hypothalamus via les K ATP (FIGURE 14C). Il a été démontré que le PIP3 peut se lier à ces canaux. Trois mécanismes de modulation de l activité des K ATP par le PIP3 ont été proposés. 1) Il augmenterait la probabilité d ouverture des K ATP ; 2) Il diminuerait directement la liaison de l ATP au canal (MacGregor et al. 2002, Baukrowitz et al. 1998, Shyng & Nichols 1998) ; 3) Il induirait la dégradation locale des filaments d actine autour des K ATP (Mirshamsi et al. 2004), les molécules intermédiaires entre le PIP3 et le canal pouvant être les petites protéines GTPases Rho ou Rac (Karschin et al. 1997). Néanmoins, seuls 45% des neurones du noyau arqué sensibles à l insuline ont une activité électrique modulée selon un mécanisme dépendant des K ATP Mirshamsi et al. 2004). Ces données révèlent que d autres mécanismes cellulaires permettant de réguler l activité électrique des neurones de l hypothalamus pourraient être mis en jeu dans la réponse à l insuline. Les K ATP de l hypothalamus sont impliqués dans l effet central de l insuline sur la production hépatique de glucose. En effet, l inhibition des K ATP par injection icv (3 ème ventricule) d un inhibiteur, la sulfonylurée tolbutamide, supprime l inhibition de la production hépatique de glucose induite par l insuline cérébrale (Pocai et al. 2005). Les neurones à NPY/AgRP de l hypothalamus sont les médiateurs de cette action de l insuline. En effet, l invalidation du récepteur à l insuline dans les neurones à AgRP diminue l effet de l insuline sur la production hépatique de glucose durant un clamp hyperinsulinémique-euglycémique (Konner et al. 2007). En revanche, les neurones à POMC ne sont pas impliqués. L implication des K ATP dans la régulation de la prise alimentaire par l insuline reste à être démontrée. 54

61 A B C Figure 14 : Cibles cellulaires hypothalamiques de l insuline (A-B), voies de signalisations impliquées dans la régulation de l expression des gènes (A) et de l activité électrique des neurones à NPY/AgRP et à POMC (C). Schéma modifié à partir de Plum et coll. (Plum et al. 2006a). 55

62 4. Insuline, métabolisme mitochondrial, et prise alimentaire Récemment, il a été démontré dans l hypothalamus que la régulation du métabolisme mitochondrial est un mécanisme indispensable aux effets des hormones anorexigène (leptine) et orexigène (ghréline). En effet, l inhibition de la prise alimentaire induite par la leptine dépend de l accumulation du taux cytosolique en acides gras via l inhibition de leur entrée dans la mitochondrie (Gao et al. 2007). A l inverse, la stimulation de la prise alimentaire induite par la ghréline dépend de la diminution du taux cytosolique en acides gras via la stimulation de leur entrée dans la mitochondrie (Andrews et al. 2008). Dans le cas de la ghréline, il a aussi été mis en évidence que la respiration mitochondriale est augmentée et que son action orexigène est dépendante de l augmentation de l activité de la protéine mitochondriale UCP2 (UnCoupling Protein 2) qui permet de diminuer la quantité d EAOs générées par l augmentation de la respiration. Ainsi, par leur action sur le métabolisme mitochondrial, les hormones (leptine et ghréline) peuvent réguler de manière appropriée l homéostasie énergétique. L action de ces hormones est rendue possible grâce aux propriétés de l AMPK (AMP- Activated Kinase) qui joue un rôle stratégique dans la régulation de l homéostasie énergétique (Hardie 2003, Kahn et al. 2005). Cette enzyme est activée par l AMP (Adénine Mono- Phosphate) par trois mécanismes qui sont inhibés par l ATP. L existence de cette triple régulation rend le système extrêmement sensible à la moindre variation du rapport AMP/ATP, et ainsi aux variations de la concentration en métabolites. Typiquement, l activité cérébrale de l AMPK est augmentée en condition de déficit énergétique, permettant ainsi d augmenter les apports et de diminuer les dépenses d énergie, et inversement en cas d excès énergétique (FIGURE 15). Ainsi, le jeûne, l hypoglycémie et la ghréline induisent son activation dans l hypothalamus, et à l inverse, l hyperglycémie, les acides gras, la leptine et l insuline diminuent son activité (Minokoshi et al. 2004, Kim et al. 2004a). De façon cohérente, l activation directe de l enzyme au niveau hypothalamique stimule la prise alimentaire (Andersson et al. 2004, Minokoshi et al. 2004) alors que son inhibition entraîne une hypophagie associée à une diminution du poids corporel (Minokoshi et al. 2004, Kim et al. 2004b). Au niveau intracellulaire, l AMPK activée inhibe l activité enzymatique de l ACC (acetyl-coa carboxylase) et donc consécutivement influence le métabolisme mitochondrial (cf III.2.c). C est en modulant l activité de l AMPK, de manière opposée, que la leptine et la 56

63 ghréline exercent leurs effets opposés sur le métabolisme mitochondrial, et successivement sur la prise alimentaire (Benani et al. 2007, Andrews et al. 2008) (FIGURE 15). FIGURE 15 : Représentation schématique potentielle du contrôle de la prise alimentaire via la modulation du métabolisme mitochondrial par les facteurs métaboliques et hormonaux. La prise alimentaire est inhibée par l augmentation du taux cytosolique en acides gras (par la leptine) ou du taux d EAOs (par les AGL), et stimulée par la diminution du taux cytosolique en acides gras et du taux d EAOs (par la ghréline). Schéma modifié à partir de Lam et coll. (Lam et al. 2005b). La leptine est une hormone anorexigène dont les effets hypothalamiques sur la voie de signalisation de la PI3K, de l AMPK, sur l activité électrique neuronale, l expression des gènes de NPY et POMC, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques sont similaires à ceux de l insuline (Plum et al. 2006a). Etant donné leur très forte synergie d action dans l hypothalamus, il est fortement probable que l insuline module également le métabolisme mitochondrial. Renforçant ces présomptions, il est effectivement connu que l insuline peut moduler le métabolisme mitochondrial. En effet, dans le SNC et les tissus périphériques sensibles à l insuline, l insuline stimule ou inhibe l activité de la pyruvate déshydrogénase, en fonction de sa concentration (Rinaudo et al. 1986b, Rinaudo et al. 1986a, Kim et al. 2006b). Cette enzyme convertit le pyruvate issu du métabolisme du glucose en acétyl-coa, au sein de la matrice mitochondriale. L oxydation de ce dernier par le cycle de Krebs permet d alimenter la chaîne respiratoire mitochondriale (CRM), productrice d ATP et d EAOs. De plus, dans les 57

64 tissus périphériques, l insuline stimule l activité de la cytochrome c oxidase, une enzyme clé du fonctionnement de la CRM, et induit la transcription des gènes codant pour la cytochrome c oxydase et pour la NADH déshydrogénase, une autre enzyme clé de la CRM (Stump et al. 2003). De façon cohérente avec ces effets, l insuline augmente la synthèse d ATP. L insuline peut aussi inhiber la respiration mitochondriale, ce qui permet de rediriger les flux métaboliques vers les voies de stockage d énergie, notamment vers la synthèse de glycogène (Finocchietto et al. 2008). Cet effet s accompagne d une production d EAOs mitochondriales. Les auteurs proposent que ces effets opposés de l insuline sur le métabolisme mitochondrial dans les tissus périphériques soient liés aux besoins énergétiques de l organisme. Ainsi, lorsque les apports sont insuffisants, l insuline favoriserait l oxydation cellulaire du glucose, tandis que lorsqu ils sont suffisants, l insuline favoriserait préférentiellement la mise en réserve de l énergie. Par conséquent, l insuline, comme la leptine ou la ghréline, est fortement susceptible de réguler l homéostasie énergétique via le taux cytosolique en acides gras et/ou le ratio ADP/ATP et/ou le taux d EAOs, dérivés de la modulation du métabolisme mitochondrial. Nous avons vu que le canal K ATP est considéré comme un véritable «senseur métabolique» en raison de la régulation de son activité par trois éléments en lien étroit avec le fonctionnement mitochondrial : le taux cytosolique en acides gras, le ratio ADP/ATP, et le taux d EAOs (cf III.A.1.d). Les voies de signalisation des principaux facteurs métaboliques (glucose, acides gras) et hormonaux (insuline et leptine) impliqués dans cette régulation convergeraient vers cette même protéine. En effet, les K ATP sont impliqués dans la réponse électrique des neurones sensibles au glucose et/ou à l insuline, dans les effets de l insuline sur la production hépatique de glucose, et leur implication a été envisagée dans la sensibilité aux acides gras (cf III.A.1.d ; III.A.2.c ; III.B.3.b). De plus, ils interviennent dans la réponse électrique des neurones sensibles à la leptine (Spanswick et al. 1997). Ainsi, les canaux K ATP représentent un maillon fondamental de la régulation hypothalamique de l homéostasie énergétique (Plum et al. 2006a). Par leur action opposée sur le métabolisme mitochondrial, les hormones (insuline, leptine et ghréline) pourraient moduler de manière opposée l activité des K ATP, permettant ainsi une régulation appropriée de l homéostasie énergétique en fonction du contexte métabolique (déficit ou excès énergétique). Depuis quelques années, le rôle crucial du métabolisme mitochondrial, et plus particulièrement des EAOs dans le contrôle nerveux de la balance énergétique et dans la 58

65 signalisation périphérique et centrale de l insuline commence à émerger. Cependant, leur implication dans l effet anorexigène de l insuline restait à déterminer. Ainsi, notre travail expérimental de thèse a essentiellement porté sur le rôle des EAOs, notamment celles dérivées des activités de la NADPH oxydase (NOX) et de la chaîne respiratoire mitochondriale (CRM) dans le contrôle hypothalamique de la prise alimentaire assuré par l insuline. Dans la suite de cette introduction bibliographique, nous allons faire un point rapide sur les EAOs, leur production et leur métabolisme, avant de décrire les arguments en faveur de leur implication dans les cascades de transduction de l insuline. 59

66 60

67 IV. LES EAOs : SECONDS MESSAGERS DE LA SIGNALISATION DE L INSULINE Les EAOs sont des espèces dérivées de l oxygène moléculaire (Gutteridge 1994, Bergendi et al. 1999). Elles sont soit des radicaux libres, soit des molécules. Les radicaux libres sont généralement instables et peuvent réagir plus ou moins rapidement avec d autres molécules chimiques environnantes. Ils peuvent alors soit arracher un e - (ils sont alors des oxydants) soit en céder un (ils sont alors des réducteurs). Ces réactions radicalaires conduisent souvent à la formation d un nouveau radical et le phénomène peut se propager par des réactions en chaîne. La molécule d oxygène est un bi-radical qui possède deux e - non appariés. L oxygène cherche donc à accepter des e - pour réapparier ses électrons célibataires et peut être un bon agent oxydant. A. LES PRINCIPALES EAOs 1. L anion superoxyde : O 2.- Il provient de la réduction monoélectronique de l oxygène moléculaire (FIGURE 16)..- O 2 a une demi-vie très courte, est peu diffusible et relativement peu réactif. Par contre il est le précurseur des autres EAOs, notamment du peroxyde d hydrogène (Gutteridge 1994, Bergendi et al. 1999). 2. Le peroxyde d hydrogène : H 2 O 2.- O 2 disparaît rapidement par dismutation spontanée pour former H 2 O 2 (FIGURE 16). H 2 O 2 est plus stable que O.- 2, ce qui lui confère une demi-vie plus longue. Il représente ainsi une véritable «bombe mobile» car contrairement à O.- 2, il diffuse librement dans les milieux aqueux et lipidiques. H 2 O 2 n est pas lui-même un radical mais par réduction mono- 61

68 électronique, il donne naissance à un des radicaux les plus réactifs, le radical hydroxyle (Gutteridge 1994, Bergendi et al. 1999). 3. Le radical hydroxyle :. OH. OH peut être formé par la scission homolytique de la liaison -O-O- de H 2 O 2, les réactions de Fenton et de Haber Weiss, ou par la réaction entre le monoxyde d azote NO., produit par certaines cellules (notamment par les cellules nerveuses), et O.- 2 (FIGURE 16). Ce radical a une durée de vie de l ordre de s et une très grande réactivité dans les milieux biologiques. Il oxyde pratiquement toutes les macromolécules voisines telles que les protéines, les acides nucléiques, les acides gras poly-insaturés et les glucides (Gutteridge 1994, Bergendi et al. 1999). 4. Les radicaux alkyles R. et peroxyles ROO. A titre d exemple, les radicaux R. et ROO. sont générés à la suite de l action oxydante de. OH sur les chaînes d acides gras poly-insaturés (RH). R. et ROO. sont à l origine des processus radicalaires en chaîne et en particulier de la peroxydation lipidique (FIGURE 16) (Gutteridge 1994, Bergendi et al. 1999). Figure 16 : Les principales EAOs et leurs sources cellulaires. NOX (nadph oxydase), CRM (chaîne respiratoire mitochondriale), NOS (NO synthase). Schéma modifié à partir de Bashan et coll. (Bashan et al. 2009). 62

69 5. Les EAOs azotées : le monoxyde d azote NO. et le peroxynitrite ONOO - NO. est formé à partir de l arginine métabolisé en citrulline, et d une molécule d O 2. Comme H 2 O 2, ce radical a une durée de vie longue, de l ordre de quelques secondes, et diffuse librement dans les milieux aqueux et lipidiques. NO. peut réagir avec O.- 2, ce qui génère ONOO -. Ce radical est d une très grande réactivité dans les milieux biologiques, bien supérieure à celle du NO. (FIGURE 16) (Gutteridge 1994, Bergendi et al. 1999). De plus, NO. et ONOO - peuvent agir à différents niveaux de la chaîne respiratoire mitochondriale, entraînant ainsi une production d O.- 2 (Carreras & Poderoso 2007). B. LES PRINCIPALES SOURCES CELLULAIRES D EAOs Au sein de la cellule, tous les processus qui utilisent de l oxygène sont susceptibles de produire des EAOs. Dans les prochains paragraphes, nous nous intéresserons aux NADPH oxydases (NOX) et à la chaîne respiratoire mitochondriale (CRM) qui représentent les deux sources majeures de production d EAOs, ainsi qu aux NO synthases (NOS), ces trois systèmes enzymatiques étant directement impliqués dans les effets cellulaires de l insuline (Bashan et al. 2009) (FIGURE 16). 1. Les NADPH oxydases (NOX) La NADPH oxydase (NOX) est une enzyme composée de plusieurs sous-unités associées aux membranes cellulaires (p22 phox et gp91 phox ) ou localisée dans le cytosol (p40 phox, p47 phox, et p67 phox ) (Babior 2004). Il existe plusieurs homologues de gp91 phox regroupés sous une même famille de protéines appelée Nox : Nox1, Nox2 (gp91 phox ), Nox3, Nox4, Nox5, Duox1 et 2 (Dual Oxidase 1 et 2) (Lambeth 2004). En conjugaison avec p22 phox, les homologues des Nox sont considérées comme étant les sous-unités catalytiques de la NADPH oxydase lui permettant de générer des EAOs à partir de l interaction des électrons provenant du NADPH ou NADH avec les molécules d O 2. Sous stimulation, l activation de petites protéines G (Rac1 ou Rac2) et la phosphorylation de p47 phox initie la translocation des sousunités cytosoliques vers la membrane plasmique, conduisant à la formation du complexe enzymatique fonctionnel de la NADPH oxydase (Hordijk 2006). Le rôle des NADPH 63

70 oxydases a été très étudié dans les cellules phagocytaires. Ainsi, l isoforme phagocytaire de la NOX activée produit de larges quantités d O.- 2 et de ses dérivés (Babior 2004). O.- 2 est ensuite rapidement dismuté en H 2 O 2 qui donnera. OH. Dans un contexte inflammatoire, cette production massive d EAOs, consommatrice d oxygène, est appelée la flambée respiratoire ou «burst oxydatif» et joue un rôle clé dans la première ligne de défense contre les organismes pathogènes. Plusieurs isoformes de la NOX non phagocytaires sont également présentent dans les cellules nerveuses, les cellules endothéliales, les cellules musculaires lisses, les cardiomyocytes, les adipocytes, et les hépatocytes. Ces NOX sont capables d utiliser aussi bien le NADPH que le NADH pour produire des EAOs. Elles jouent un rôle clé dans la régulation de voies de signalisation intracellulaires impliquées dans des fonctions physiologiques essentielles, comme la régulation du système cardiovasculaire (Griendling 2004, Infanger et al. 2006). Les différentes sous-unités des NADPH oxydases sont présentes dans de nombreuses régions du SNC (Infanger et al. 2006) (FIGURE 17). FIGURE 17 : Répartition des sous-unités de la NAPPH oxydase dans le SNC. SFO (subfornical organ), MnPO (median preoptic nucleus), OVLT (organum vasculosum of the lamina terminalis), PVN (paraventricular nucleus), PP (posterior pituitary), NTS (nucleus tractus solitarius), AP (area postrema), RVLM (rostral ventrolateral medulla), IML (interomedial lateral cell column of spinal cord). Schéma modifié à partir de Infanger et coll. (Infanger et al. 2006). 64

71 Dans l hypothalamus, les sous-unités essentielles à leur activité, telles que p47 phox, Nox2 et Nox4, sont présentes au niveau du NA, du VMN, et du PVN (Griendling 2004). Les NADPH oxydases interviennent dans des fonctions neuronales en conditions physiologiques (Infanger et al. 2006). A titre d exemple, l activité des NOX dans l hyppocampe est nécessaire à l induction du phénomène de potentialisation à long-terme qui permet la mise mémoire des informations nerveuses. Dans l hypothalamus, la signalisation redox dérivée de l activité de la NOX et initiée dans cette structure cérébrale par l angiotensine II est essentielle à la régulation centrale du système cardio-vasculaire. Les NOX jouent aussi un rôle important dans l induction du stress oxydant observé au niveau de la périphérie et du SNC en conditions pathologiques, comme dans l hypertension (Infanger et al. 2006) ou lors de la résistance à l insuline dans de l obésité (Bashan et al. 2009). 2. La chaîne respiratoire mitochondriale (CRM) La mitochondrie est un organite intracellulaire ubiquitaire hautement spécialisé dans la production d énergie sous forme d ATP, indispensable aux fonctions cellulaires. La mitochondrie est délimitée par deux membranes séparant la matrice mitochondriale du cytoplasme. La production d énergie sous forme d ATP se fait à partir du catabolisme des nutriments. Les voies métaboliques associées aux différents nutriments, glycolyse, catabolisme des acides aminés et β oxydation des acides gras convergent vers un produit carrefour : l acétyl CoA (FIGURE 18). Celui-ci est pris en charge par le cycle de Krebs. Le cycle de Krebs est une voie métabolique particulière qui libère très peu d énergie sous forme de liaison phosphate mais permet l oxydation complète de l acétyl CoA. L énergie ainsi libérée est transformée sous forme d équivalents réduits, NADH,H + et FADH 2, substrats donneurs d électrons à la chaîne respiratoire mitochondriale (CRM). Les e - sont transférés tout le long de la CRM au cours des réactions d oxydoréduction jusqu à l accepteur final, l oxygène. Les formes réduites, NADH,H + et FADH 2, cèdent respectivement leurs e - au complexe I et II de la CRM. Les électrons sont ensuite transférés au coenzyme Q. Le complexe III (coenzyme Q cytochrome c réductase) transfère les e - du coenzyme Q au cytochrome c. Le cytochrome c réduit est alors oxydé par le complexe IV (ou cytochrome c oxydase). La réduction complète d une molécule d O 2 en deux molécules d eau (H 2 O), au niveau de ce dernier complexe, utilise quatre e - provenant des chaînes de 65

72 transporteurs et quatre H +. Les réactions d oxydoréduction catalysées par les complexes I, III et IV sont exergoniques et libèrent de l énergie. Une partie de cette énergie est utilisée par l enzyme pour déplacer des H + depuis la matrice vers l espace inter membranaire. Ce flux de H + crée un gradient électrochimique de part et d autre de la membrane interne mitochondriale. Ce gradient de concentration constitue une force qui pousse les H + à entrer de nouveau dans la matrice mitochondriale. La membrane interne mitochondriale étant peu perméable aux H +, ils empruntent le canal à H + de l ATP synthase et l énergie qui est libérée lors de leur passage au travers de la membrane est alors utilisée pour synthétiser de l ATP à partir d ADP et de phosphate (Pi). FIGURE 18: Représentation schématique du métabolisme mitochondrial et du fonctionnement de la chaîne respiratoire. CK (cycle de Krebs). 66

73 En condition physiologique, 80% des EAOs de la cellule sont produites par la mitochondrie. Une proportion significative de l oxygène (2 à 6%) échappe à la réduction complète en molécule d eau et subit une réduction mono-électronique au niveau des complexes I et III de la CRM (FIGURE 19A-B). Ceci donne naissance à l anion superoxyde O.- 2. La contribution relative des différents complexes de CRM à la production totale.- mitochondriale d O 2 dépend fortement du tissu examiné (Kwong & Sohal 1998). Le complexe III a longtemps été considéré comme le site principal de production d O.- 2 (Turrens & Boveris 1980). Néanmoins, ces dernières années, il a été largement montré que le complexe I joue aussi un rôle important dans la production d O.- 2, notamment dans les cellules cérébrales (Liu et al. 2002, Barja 1999), en condition physiologiques et pathologiques comme lors du vieillissement ou de maladies neurodégénératives telles que la maladie de Parkinson (Schapira 1998). Dans certaines conditions, la perméabilité membranaire aux H + peut être augmentée. Ceux-ci entrent de nouveau dans la matrice sans passer par l ATP synthase (phénomène appelé découplage). De ce fait, les oxydations de la chaîne respiratoire ne sont plus associées à la synthèse d ATP et à la production d EAOs (FIGURE 19C). Ce découplage est dû aux protéines découplantes UCPs insérées dans la membrane interne mitochondriale (Nicholls & Rial 1999) et peut être induit par des molécules chimiques comme le CCCP (Carbonyl Cyanide m-chlorophénylhydrazone). A B C FIGURE 19: Représentation schématique de la production des EAOs par la chaîne respiratoire mitochondriale, en condition basale (A), en condition stimulée par l augmentation des voies métaboliques (B), ou en présence d un découplant (C). CCCP (carbonyl cyanide m- chlorophénylhydrazone). Schéma modifié à partir de Leloup et coll. (Leloup et al. 2006). 67

74 3. Les NO synthases (NOS) La synthèse de NO. est catalysée par les NO synthases (NOS) (Bergendi et al. 1999). Il existe 3 isoformes canoniques : l) Neuronale, NOS I ou nnos ; 2) Inductible, NOS II ou inos ; 3) Endothéliale, NOS III ou enos. De plus, il existe une variante de la nnos, la mtnos (NOS mitochondriale). Les NOS de type I et III sont constitutives et se caractérisent par une activation rapide et transitoire permettant de faciliter la transmission synaptique ou d induire la vasodilatation en réponse à des changements du débit sanguin. Au contraire, la NOS II n étant pas constitutive, son effet est lié à la modulation de son expression, par exemple par les médiateurs de l inflammation. C. LES SYSTEMES DE GESTION DES EAOs Les différents antioxydants présents dans la cellule constituent ensemble un système de gestion des EAOs qui permet de limiter leur concentration. Pour prendre en charge les EAOs, les cellules sont équipées de divers systèmes antioxydants de nature enzymatique ou non. Ces systèmes antioxydants peuvent agir principalement dans les tissus par détoxification directe des EAOs et/ou par réparation des dommages oxydatifs causés (Gutteridge 1994). 1. Détoxification directe des EAOs a. Détoxification enzymatique Plusieurs enzymes dégradent directement les EAOs (FIGURE 20). 1) La SOD.- (SuperOxyde Dismutase) assure la dismutation de O 2 en H 2 O 2 et O 2. Son action est couplée à celle d enzymes décomposant H 2 O 2. 2) La catalase décompose H 2 O 2 en H 2 O et O 2. 3) La GPx (Glutathion Peroxydase) décompose H 2 O 2 et les hydroperoxydes ROOH respectivement en H 2 O et alcool, en présence de GSH (Glutathion réduit). b. Les molécules piégeurs d EAOs Divers piégeurs non enzymatiques (sous leur forme réduite) peuvent prendre en charge la détoxification des radicaux libres (O.- 2,. OH, ROO. ). Les principaux systèmes de protection 68

75 lipophiles sont la vitamine E, le coenzyme Q ou ubiquinone, et les caroténoïdes, et ceux hydrophiles sont la vitamine C et le glutathion de la cellule. Ces molécules sont apportées par l alimentation de l homme (vitamine C, vitamine E, caroténoïdes) ou biosynthétisées par l organisme (glutathion, coenzyme Q) (Remarque : la souris synthétise aussi les vitamines C et E). Chélateurs de métaux FIGURE 20 : Principaux systèmes de défenses antioxydantes de la cellule. GPx (glutathion peroxydase), GR (glutathion réductase), SOD (superoxyde dismutase). Schéma modifié à partir de Bashan et coll. (Bashan et al. 2009). 2. Réparation des dommages oxydatifs Lors d une attaque directe des EAOs ou d une modification du potentiel redox intracellulaire, les protéines peuvent subir une oxydation au niveau des résidus cystéines : le groupe thiol (-SH) est alors oxydé. La thiorédoxine ou encore le glutathion sont considérés comme des «donneurs de SH» c est-à-dire qu ils sont capables de réduire les résidus cystéines oxydés. La régénération de la thiorédoxine réduite est assurée par la thiorédoxine réductase en présence de NADPH,H +. La Glutathion Réductase (GR) est absolument essentielle car elle permet la régénération du glutathion oxydé (GSSG) en glutathion réduit (GSH) en présence de NADPH,H + (FIGURE 20). Ce glutathion réduit joue de multiples rôles (piégeur de radicaux libres, cofacteur des GPx, et donneur de SH) et intervient aussi dans la réaction catalysée par les glutathion transférases. Cette réaction permet d éliminer les molécules R-X issues de la peroxydation lipidique. Néanmoins, suite à cette réaction, le GSH n est pas régénéré. 69

76 D. LES EAOS : DE VERITABLES SECONDS MESSAGERS D après leurs caractéristiques, les EAOs constituent des seconds messagers idéaux (Droge 2002). En effet, ils présentent : 1) Un temps de vie court ; 2) Une spécificité d action : fonctionnalité limitée dans le temps et l espace, réactivité chimique spécifique à chaque espèce ; 3) Une production «à la demande» sous contrôle ; 4) Une initiation de réactions en chaîne. 1. Physiologie En condition physiologique, le maintien de la balance entre les systèmes producteurs et les systèmes antioxydants à un état d équilibre constitue l homéostasie redox (Droge 2002). Une production relativement modérée d EAOs par les systèmes générateurs, d une part, et des systèmes de gestion efficaces, d autre part, induisent une augmentation physiologique aigue et transitoire de la concentration d EAOs (FIGURE 21). Si la production est trop faible, l exposition aux EAOs est sans effet pour les fonctions cellulaires. En revanche, lorsque la concentration dépasse un certain seuil, les EAOs peuvent modifier certaines molécules environnantes de manière réversible et agissent en tant que molécules «signal». Le terme de signalisation redox est donc utilisé et regroupe les modifications des molécules (par oxydation) sous l action des EAOs. Lorsque le système est bien géré, la signalisation redox met en jeu la réponse antioxydante qui permet un retour rapide à l état redox initial. Ainsi, les EAOs peuvent activer de façon transitoire des voies de signalisation intracellulaires, comme celle de l insuline (Bashan et al. 2009). Certains acides aminés comme la cystéine (Cyst) sont particulièrement sensibles à l oxydation via leur groupement thiol. L oxydation peut se faire directement par les EAOs ou par des modifications du potentiel redox d un couple prépondérant comme celui du glutathion. Un environnement oxydant favorise la formation de ponts disulfures (-S-S-) au niveau des cystéines. De plus, le groupement thiol (-SH) peut être oxydé. Ces oxydations sont réversibles sous l action de la thiorédoxine réduite ou du glutathion réduit, réducteurs recyclables. Ces cystéines peuvent se trouver dans des domaines particulièrement importants pour l activité de la protéine. Leur oxydation peut donc modifier la fonctionnalité de la protéine. Le degré de sensibilité des protéines à cette régulation redox dépend de leur 70

77 structure et de leur aptitude à être modifiée par oxydation. Ces cystéines critiques peuvent se situer dans des domaines importants pour la conformation tridimensionnelle, l activité catalytique d enzymes, l interaction d un facteur de transcription avec sa séquence consensus d ADN, la dimérisation de facteurs de transcription, comme ceux «à doigt de zinc», ou le trafic subcellulaire de protéines. FIGURE 21: Représentation schématique de la signalisation redox et de l apparition d un stress oxydant. 2. Pathologie Lorsque les systèmes de gestion des EAOs sont dépassés (en raison d un excès de production d EAOs et/ou d une diminution des systèmes antioxydants), un stress oxydant apparaît (Droge 2002). Ce stress résulte d une concentration d EAOs très élevée et/ou persistante dans le temps (FIGURE 21). L oxydation des molécules environnantes devient alors aspécifique et irréversible, pouvant entraîner une stimulation chronique des voies de signalisation. Dans ce contexte, les EAOs, devenues toxiques pour la cellule, peuvent être associées au développement de certains marqueurs pathologiques, comme la résistance à l insuline dans l obésité et le diabète de type 2 (Bashan et al. 2009). Cependant, une forte augmentation des défenses anti-oxydantes peut aussi être associée et responsable de l apparition de pathologies, comme la résistance à l insuline (Kobayashi et al. 2009). Il est donc important de comprendre que le maintien de l homéostasie des oxydants est primordial pour la physiologie, et qu un déséquilibre dans le sens d un excès comme d un déficit peu conduire dans les deux cas à une situation pathologique, notamment à la résistance à l insuline (Kobayashi et al. 2009). 71

78 E. ROLES PHYSIOLOGIQUES DES OXYDANTS DANS L ACTION DE L INSULINE 1. Les oxydants : insulino-mimétiques Les premières preuves permettant d établir un lien entre les oxydants et l action de l insuline furent apportées dès 1974 par Czech et coll (Czech et al. 1974a, Czech et al. 1974b) et May (May 1980). La voie de signalisation de l insuline est initiée à partir de la phosphorylation des résidus tyrosine (Y) de la chaîne β du récepteur à l insuline (RI) et de ses substrats directs (FIGURE 22). L application de fortes concentrations d H 2 O 2 (en absence d insuline) entraîne l activation de cette voie par augmentation de la phosphorylation des résidus Y du RI (Hayes & Lockwood 1987). Ces résultats suggéraient fortement que l H 2 O 2 emploie la même voie de signalisation que l insuline. La propagation du signal à partir de son récepteur permet à l insuline d assurer ses effets métaboliques. Ainsi, et de façon cohérente, l H 2 O 2 mime également les principaux effets métaboliques de l insuline : il augmente la capture du glucose par les adipocytes et le muscle (Kono et al. 1982, Higaki et al. 2008), et stimule la translocation de GLUT4 et la lipogenèse dans les adipocytes (May & de Haen 1979a, Mahadev et al. 2001a). L état de phosphorylation d une protéine reflète la balance entre kinases et phosphatases : une augmentation du niveau de phosphorylation de la protéine peut être due à une augmentation de l activité d une kinase et/ou à une inhibition de la phosphatase respective. Donc, théoriquement, inhiber l activité d une phosphatase doit avoir le même effet qu augmenter l activité de la kinase correspondante. En effet, l augmentation par l H 2 O 2 de la phosphorylation du RI résulte d une modulation de la balance kinase/phosphatase (Schmitt et al. 2005, Schmid et al. 1998). L H 2 O 2 est en effet capable de moduler directement l activité tyrosine kinase intrinsèque du RI nécessaire à son autophosphorylation et consécutivement au recrutement de ses substrats directs (IRSs). Cependant, le mécanisme cellulaire principal des effets d H 2 O 2 est l inhibition de l activité catalytique d un ensemble de phosphatases (FIGURE 22). L enzyme PTP1B, appartenant à la grande famille des PTPs (Protéines Tyrosine Phosphatases), est la tyrosine phosphatase principale qui intervient dans la régulation du RI et de IRS1. Elle constitue donc un régulateur négatif de la cascade de transduction de l insuline. Cette idée est confortée par les résultats obtenus avec des souris 72

79 invalidées pour le gène de PTP1B qui présentent une augmentation de la sensibilité à l insuline (Delibegovic et al. 2007). La régulation biochimique des PTPs se fait par oxydation spécifique (et réversible) d un résidu cystéine/thiol localisé dans leur site catalytique (Denu & Tanner 2002). L activité de PTP1B est dépendante de l état d oxydation de son résidu Cyst215 : la forme réduite de Cyst215 est nécessaire à l activité catalytique via la formation d une phospho-enzyme intermédiaire. A l inverse, la forme oxydée de Cyst215 rend l enzyme inactive. Cette modulation redox de la Cyst215 représente in vivo un mécanisme clé de la régulation de l activité enzymatique des PTPs (Meng et al. 2002). FIGURE 22 : Rôle des EAOs dans la signalisation de l insuline. Schéma modifié à partir de Bashan et coll. (Bashan et al. 2009). La phosphorylation du RI et de ses substrats est suivie d étapes supplémentaires de phosphorylation sur les résidus sérine (Ser) et thréonine (Thr) de protéines et phospholipides qui permettent la propagation de la cascade de transduction de l insuline (FIGURE 22). Comme PTP1B, l activité de certaines enzymes qui contrôlent ces étapes de phosphorylation sont la cible des oxydants. Ainsi, PP2A (Protein Phosphatase 2A), qui est un régulateur négatif majeur d Akt, de la p70 S6-kinase, et d ERK (Extracellular signal-regulated Kinase) (Ugi et al. 2004), contient un résidu cystéine sensible à l état redox, ce qui le rend sensible à l H 2 O 2 (Guy et al. 1993). De manière similaire, l activité de la MAPKAP-1 (Mitogen- Activated Protein Kinase-Associated Protein-1), qui est en dualité d action avec PP2A pour atténuer l activation de ERK induite par l insuline, dépend aussi de l état réduit d un de ses groupements thiol (Kusari et al. 1997). Enfin, la phosphatase PTEN (Phosphatase and TENsin 73

80 homolog), qui régule négativement la cascade de transduction de l insuline en catalysant la déphosphorylation de PIP3, est également inactivée par oxydation d un de ses résidus Cyst essentiel à son activité (Nakashima et al. 2000). L ensemble de ces données démontre clairement que les oxydants peuvent agir et activer différentes étapes de la voie de signalisation de l insuline en inactivant des phosphatases protéiques et lipidiques impliquées dans la régulation négative de la cascade de transduction de l insuline. 2. L insuline induit une production d oxydants: rôle de la NOX, de la CRM, et de la NOS a. La NOX A la fin des années 70, il a été démontré dans les adipocytes que l insuline (0,1-10nM) par elle-même était capable d induire une augmentation du niveau intracellulaire d H 2 O 2 (May & de Haen 1979b). Ce signal oxydant apparaît dès 1min après la stimulation, atteint son maximum au bout de 5min et commence à se dissiper à partir de 10min (Mahadev et al. 2001a). La caractérisation enzymologique de ce processus a permis de mettre en évidence que l insuline active un système enzymatique associé à la membrane plasmique et qui présente les caractéristiques d une NADPH oxydase (NOX) (Krieger-Brauer & Kather 1995, Krieger- Brauer et al. 1997, Mukherjee et al. 1978). L invalidation (par adénovirus ou sirna) de l expression de la Nox présente dans les adipocytes (Nox4), atténue ce signal oxydant (Mahadev et al. 2004). Inversement, sa surexpression l amplifie, et ceci s accompagne d une augmentation de l autophosphorylation du RI et de l inhibition de l activité de PTP1B. L ensemble de ces résultats suggère fortement que l activité des NOX établit le lien entre le récepteur à l insuline et la production d EAOs. Cette production d EAOs permet une amplification de la transduction du signal de l insuline, au moins en partie via l inhibition oxydative des PTPs cellulaires, et plus précisément de PTP1B (FIGURE 22). Cependant, les mécanismes qui sous-tendent la régulation de l activité de Nox4 par l insuline sont encore mal compris. Il a été suggéré que Rac et G αi2, deux protéines G connues pour jouer un rôle important dans les effets cellulaires de l insuline pourraient intervenir dans 74

81 cette régulation (Goldstein et al. 2005b, Chen et al. 1997, JeBailey et al. 2004, Moxham & Malbon 1996) (FIGURE 22). b. La CRM Récemment, il a été démontré sur des neurones en culture que l activité de la chaîne respiratoire mitochondriale (CRM) est également nécessaire à l élévation du niveau d EAOs induite par l insuline et à l amplification de l'autophosphorylation du récepteur à l insuline (Storozhevykh et al. 2007, Storozheva et al. 2008). En effet, le prétraitement des neurones avec un agent découplant de la CRM, le CCCP, qui bloque la possibilité de production d EAOs d origine mitochondriale, supprime ces effets de l insuline. Ces données suggèrent fortement que l insuline agit sur l activité de la CRM pour traduire son signal, bien que le mécanisme d action reste à déterminer. c. La NOS En plus de l H 2 O 2, l insuline est capable d induire une augmentation intracellulaire de monoxyde d azote (NO. ). Dans l endothélium vasculaire, cette production induite par l insuline résulte d une augmentation de l expression et/ou de l activité de la NOS endothéliale (enos) via la voie de la PI3K (Muniyappa et al. 2007). Ainsi, Akt phosphoryle la enos sur le résidu sérine 1179 (Ser1177 chez l homme) en réponse à l insuline, ce qui permet la vasodilatation (Dimmeler et al. 1999, Montagnani et al. 2001, Zeng et al. 2000). De manière similaire, dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs), l insuline stimule la production de NO. via la voie de la PI3K (Trovati et al. 1995). Dans ces cellules, en plus d un effet à court-terme sur la production de NO., une exposition prolongée (>4h) d insuline entraîne une augmentation de l expression de la enos (Govers & Rabelink 2001, Kuboki et al. 2000). L insuline peut aussi stimuler la production de NO. dans les cellules de l hypothalamus via la voie de la PI3K (Canabal et al. 2007). Dans le muscle, l insuline induit une production mitochondriale de NO. via la voie de la PI3K (Finocchietto et al. 2008). Dans ce cas, la translocation d Akt-2 du cytosol vers la matrice mitochondriale permet l activation de la nnos localisée dans la mitochondrie, la mtnos. La production de NO. qui en résulte entraîne une inhibition de la respiration mitochondriale, qui s accompagne d une production d O.- 2. Cette inhibition de la respiration 75

82 permet de rediriger les flux de substrats vers les voies du stockage d énergie, notamment vers la synthèse de glycogène (Finocchietto et al. 2008). Ces données montrent que l insuline peut augmenter le taux d EAOs par l intermédiaire des NOS et de la CRM, et laissent penser que l action de l insuline sur la CRM nécessaire à l élévation du niveau d EAOs dans les neurones pourrait reposer sur ce mécanisme (cf paragraphe précédent). L ensemble de ces données démontre clairement que l insuline induit la production d oxydants via la Nox, la CRM, et la NOS qui pourraient constituer de véritables seconds messagers de la signalisation de l insuline en conditions physiologiques. 3. Les oxydants : seconds messagers de la signalisation de l insuline Pour prouver expérimentalement que les oxydants peuvent effectivement constituer de véritables seconds messagers dans la signalisation de l insuline, il a été nécessaire de montrer que : 1) Les oxydants régulent le signal induit par l insuline à des concentrations physiologiques. Ainsi, dans les adipocytes et les cellules musculaires, des concentrations d H 2 O 2 relevantes en physiologie (<0,1mM) amplifient l activité kinase du RI induite par l insuline (Schmid et al. 1999), et inversement, l application d antioxydants de synthèse, comme la N-acétyl-cystéine, l inhibent (Schmid et al. 1998). Ces données révèlent que les oxydants (EAOs) potentialisent le signal induit par l insuline à des concentrations physiologiques, suggérant fortement la relevance physiologique de cette signalisation redox dans les effets cellulaires de l insuline. 2) L inhibition de la production d oxydants diminue l action de l insuline. Si on bloque la possibilité de production d H 2 O 2 avec de la catalase ou du DPI (DiPhenyleneIodonium), ce dernier étant couramment utilisé pour inhiber l activité des Nox, on réduit de plus de 50% l autophosphorylation du RI et la phosphorylation des IRSs induites par l insuline (Mahadev et al. 2001a, Mahadev et al. 2001b). De façon plus spécifique, l invalidation de l expression de Nox4 dans les adipocytes conduit à une inhibition de la phosphorylation du RI et de IRS-1 stimulées par l insuline (Mahadev et al. 2004). Ce résultat s accompagne d une diminution de la phosphorylation d Akt induite par l insuline. De plus, nous avons vu précédemment que la production d EAOs via Nox4 est associée à l inhibition 76

83 oxydative de l activité de PTP1B (Mahadev et al. 2001b). La surexpression de PTP1B inhibe la phosphorylation du RI induite par l insuline et cet effet est reversé par la surexpression concomitante de Nox4. De plus, dans les neurones, si on bloque la possibilité de production d EAOs d origine mitochondriale, avec un agent découplant, le CCCP, on réduit de plus de 50% la phosphorylation du RI induite par l insuline (Storozhevykh et al. 2007, Storozheva et al. 2008). L ensemble de ces données renforce l idée que les oxydants (EAOs), notamment ceux produits par les Nox et la mitochondrie, jouent un rôle clé dans la cascade de transduction de l insuline, et donc peuvent avoir une relevance physiologique dans les effets cellulaires de l insuline (Goldstein et al. 2005b, Bashan et al. 2009). 3) La production d oxydants précède l effet biologique de l insuline. Dans les adipocytes, le signal oxydant induit par l insuline apparaît 1min après la stimulation et commence à se dissiper à partir de 10min. Son inhibition par un inhibiteur des Nox bloque la translocation de GLUT4 à la membrane plasmique et la capture du glucose, stimulées par l insuline (Mahadev et al. 2001a, Mahadev et al. 2004). Ces résultats suggèrent fortement que les EAOs dérivées de l activité des Nox et produites très précocement dans la voie de signalisation de l insuline sont nécessaires aux effets biologiques différés de l insuline. D autre part, le rôle des EAO azotées, notamment du NO., en tant que second messager ou modulateur positif de la signalisation de l insuline a également été démontré dans plusieurs systèmes. Ainsi, dans des cardiomyocytes ou dans des CMLVs, le recrutement de GLUT4 et le transport du glucose stimulés par l insuline sont bloqués par un inhibiteur de la synthèse du NO. (Bergandi et al. 2003). In vivo, l invalidation de l expression de la nnos dans le muscle empêche la synthèse de glycogène induite par l insuline (Finocchietto et al. 2008). De plus, l administration intraveineuse de N G -mono-methyl-l-arginine, un inhibiteur compétitif de l ensemble des isoformes de la NOS, induit une résistance à l insuline intense (Baron et al. 1995, Sadri & Lautt 1998). De manière similaire, les souris invalidées pour le gène de la enos ou de la nnos sont résistantes à l insuline au niveau hépatique (souris enos -/- ou nnos -/- ) et des autres tissus périphériques insulino-sensibles (souris enos -/- ) (Shankar et al. 2000). Au niveau du SNC, l administration icv (3 ème ventricule) de N G -nitro-larginine methyl ester, inhibiteur des NOS, bloque l action hypothalamique de l insuline permettant de réguler les fonctions cardiovasculaires (Cabou et al. 2007). L inhibition des NOS perturbe aussi le comportement alimentaire (Morley et al. 1996), ce qui pourrait 77

84 suggèrer un rôle potentiel de cette enzyme dans la régulation hypothalamique de la prise alimentaire par l insuline. L ensemble de ces résultats démontre clairement que la production d oxydants induite par l insuline est indispensable aux effets biologiques de l hormone, aussi bien au niveau du système nerveux central que de la périphérie. 78

85 RESULTATS & DISCUSSION 79

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87 OBJECTIFS DE L ETUDE Comme nous l avons décrit dans l introduction bibliographique, l insuline joue un rôle important dans le contrôle hypothalamique de l homéostasie énergétique, notamment en réduisant la prise alimentaire. Depuis quelques années, le rôle des EAOs dans la régulation centrale de la balance énergétique et dans la signalisation centrale et périphérique de l insuline commence à émerger. Cependant, leur implication dans l effet anorexigène de l insuline n avait pas encore été explorée. Les données de la littérature montrent clairement qu au niveau des cellules périphériques sensibles à l insuline, les EAOs, notamment celles produites par la Nox font partie intégrante de la voie de signalisation de cette hormone et constituent un élément clé nécessaire à ses effets physiologiques. Notre 1 er objectif (Résultats & Discussion, Partie I) a été de déterminer si les EAOs, et plus particulièrement celles dérivées de la Nox dans l hypothalamus, étaient impliquées dans l effet anorexigène de l insuline. De plus, récemment, il a été suggéré que dans les neurones, les EAOs dérivées de l activité de la CRM constitueraient également un élément déterminant de la signalisation de l insuline. Notre 2 nd objectif (Résultats & Discussion, Partie II) a donc été de déterminer si l activité de la CRM dans l hypothalamus prenaient également part à l effet anorexigène de l insuline. Notre 3 ème objectif (Résultats & Discussion, Partie II) a été de rechercher s il existait un lien entre l activité de la Nox et celle de la CRM permettant à l insuline d exercer son effet anorexigène. 81

88 82

89 PARTIE I : LES EAOs : NOUVEAUX ACTEURS DE LA SIGNALISATION HYPOTHALAMIQUE DE L INSULINE NECESSAIRE AU CONTROLE DE LA PRISE ALIMENTAIRE. Rôle de la NADPH oxydase. A. INTRODUCTION & DEMARCHE EXPERIMENTALE Notre premier objectif a été de déterminer si les EAOs, et plus particulièrement celles dérivées de la NOX dans l hypothalamus, étaient impliquées dans l effet anorexigène de l insuline. Nous avons choisi de mener cette étude in vivo afin de se placer dans des conditions les plus physiologiques possibles. D après la littérature, l effet de l insuline sur la prise alimentaire est dépendant d un grand nombre de paramètres de nature variée (physiologique, comportementale et environnementale), plus ou moins bien maîtrisés en conditions expérimentales. Pour cette raison, nous avons utilisé scrupuleusement les mêmes paramètres d étude que ceux utilisés par les auteurs ayant démontré pour la première fois l effet anorexigène de l insuline chez la souris (Brown et al. 2006): la souche (C57BL6/J), l âge (7-8 semaines), et le sexe des souris (mâle) ; Le type (insuline recombinante humaine injectable) et la concentration d insuline (2,4nM) ; Le mode (icv, 3 ème ventricule), le débit (1µl/min), et le volume d injection (1µl) ; Le moment de la journée où l insuline est injectée (14h), celui où la nourriture est présentée (19h) et celui où la nourriture consommée est mesurée (12 et 24h après le début de la période nocturne qui débute à 19h). 1) Ce protocole nous a permis de reproduire et de confirmer l effet anorexigène de l insuline à moyen terme (24h), associé à une perte de poids (-2,5%), et sans modification de la glycémie périphérique (effet central spécifique). Notons que si ce protocole n est pas suivi, notamment concernant le site d injection, l inhibition de la prise alimentaire n est pas retrouvée. 83

90 2) Suivant le même protocole, nous avons dosé in vivo la quantité d EAOs (H 2 O 2 ) produites dans l hypothalamus après l injection icv d insuline. Nous avons prélevé l hypothalamus à différents temps (5, 15 et 30min après l injection). Ces temps ont été définis à partir de données de la littérature montrant que l activation de la NOX a lieu entre 1 et 10min après la stimulation avec l insuline dans les adipocytes en culture. Nous montrons que l insuline induit une élévation du taux d EAOs (+36%) dans l hypothalamus 15min après l injection, avec un retour au niveau basal dès 30min. 3) Afin de démontrer l implication de cette élévation du niveau hypothalamique d EAOs dans l effet anorexigène de l insuline, nous avons injecté dans le 3 ème ventricule un antioxydant, le Trolox, qui piège H 2 O 2, 30min avant l injection d insuline. Nous montrons ainsi que la suppression de l élévation hypothalamique d EAOs normalement induite par l insuline est associée à une perte de l effet anorexigène de l hormone. 4) Suivant la même stratégie, nous avons injecté un inhibiteur de la NOX, le dinitrophénolidinium (DPI), afin de démontrer l implication de cette enzyme dans l effet anorexigène de l insuline. Nous montrons ainsi que le DPI supprime l élévation hypothalamique d EAOs induite par l insuline, en association avec une perte de l effet anorexigène de l hormone. 5) Enfin, dans le but de valider la relevance physiologique de la signalisation EAOs que nous avons mis en évidence, nous avons choisi deux situations nutritionnelles (une mise à jeûn de 18h et une mise sous régime hyperlipidique hypercalorique de 3 jours) connus pour induire une résistance hypothalamique aux effets de l insuline, à la fois sur le plan moléculaire et comportemental. Nous montrons ainsi que ces deux conditions nutritionnelles suppriment l élévation hypothalamique d EAOs induite par l injection icv d insuline et l effet anorexigène de l hormone. L augmentation de la quantité de glutathion réduit (GSH, antioxydant endogène) dans l hypothalamus des souris soumises à ces deux conditions expérimentales pourrait être responsable des pertes d effets de l insuline. L ensemble de ces résultats nous permet donc de conclure que l effet anorexigène de l insuline est dépendant d une voie de signalisation hypothalamique impliquant les EAOs et la NOX. Nous proposons que l activation de la NOX induite par l insuline contribue à l élévation hypothalamique du niveau d EAOs. 84

91 B. RESULTATS Les résultats sont présentés dans l article I suivant (accepté pour publication dans le journal Diabetes). 85

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93 Article I 87

94 88

95 ORIGINAL ARTICLE rich4/zdb-diab/zdb-diab/zdb00709/zdb5764d09z xppws S 1 5/9/09 17:21 doi: /db artno: 1039 Hypothalamic Reactive Oxygen Species are Required for Insulin-Induced Food Intake Inhibition An NADPH Oxidase Dependent Mechanism Tristan Jaillard, 1,2 Michael Roger, 1,2 Anne Galinier, 1 3 Pascale Guillou, 1,2 Alexandre Benani, 1,2 Corinne Leloup, 1,2 Louis Casteilla, 1,2 Luc Penicaud, 1,2 and Anne Lorsignol 1,2 AQ: A OBJECTIVE Insulin plays an important role in the hypothalamic control of energy balance, especially by reducing food intake. Emerging data points to a pivotal role of reactive oxygen species (ROS) in energy homeostasis regulation, but their involvement in the anorexigenic effect of insulin is unknown. Furthermore, ROS signal derived from NADPH oxidase activation is required for physiological insulin effects in peripheral cells. In this study, we investigated the involvement of hypothalamic ROS and NADPH oxidase in the feeding behavior regulation by insulin. RESEARCH DESIGN AND METHODS We first measured hypothalamic ROS levels and food intake after acute intracerebroventricular injection of insulin. Second, effect of pretreatment with a ROS scavenger or an NADPH oxidase inhibitor was evaluated. Third, we examined the consequences of two nutritional conditions of central insulin unresponsiveness (fasting or short-term high-fat diet) on the ability of insulin to modify ROS level and food intake. RESULTS In normal chow-fed mice, insulin inhibited food intake. At the same dose, insulin rapidly and transiently increased hypothalamic ROS levels by 36%. The pharmacological suppression of this insulin-stimulated ROS elevation, either by antioxidant or by an NADPH oxidase inhibitor, abolished the anorexigenic effect of insulin. Finally, in fasted and short-term high-fat diet fed mice, insulin did not promote elevation of ROS level and food intake inhibition, likely because of an increase in hypothalamic diet-induced antioxidant defense systems. CONCLUSIONS A hypothalamic ROS increase through NADPH oxidase is required for the anorexigenic effect of insulin. Diabetes 58:1 2, 2009 The hypothalamus is a cerebral area involved in the regulation of energy homeostasis. In this context, insulin plays a pivotal role. By acting in the hypothalamus, insulin reduces food intake and body weight (1 2), activates sympathetic nerve outflow to the brown adipose tissue (3), and suppresses From the 1 Université de Toulouse, UPS, UMR 5241 Métabolisme, Plasticité et Mitochondrie, Toulouse, France; the 2 Centre National de la Recherche Scientifique, UMR 5241 Métabolisme, Plasticité et Mitochondrie, Toulouse, France; and the 3 Centre Hospitalier Universitaire Rangueil, Laboratoire de Biochimie, Toulouse, France. Corresponding author: Anne Lorsignol, [email protected]. Received 30 July 2008 and accepted 26 March Published ahead of print at on 23 April DOI: /db by the American Diabetes Association. Readers may use this article as long as the work is properly cited, the use is educational and not for profit, and the work is not altered. See -nc-nd/3.0/ for details. The costs of publication of this article were defrayed in part by the payment of page charges. This article must therefore be hereby marked advertisement in accordance with 18 U.S.C. Section 1734 solely to indicate this fact. hepatic endogenous glucose production (4 5). In a situation of excess nutrient intake, the hypothalamus rapidly becomes resistant to insulin before obesity and diabetes onset (6 7). Moreover, inactivation of the neuronal insulin receptor leads to the development of diet-induced obesity with an increase in body fat, mild insulin resistance, and elevated plasma insulin levels (8). Therefore, it is of prime importance to elucidate cellular mechanisms by which insulin acts on hypothalamic cells to understand central early-onset diet-induced obesity and diabetes. In recent years, emerging data points to a pivotal role of reactive oxygen species (ROS) in the energy homeostasis regulation by the hypothalamus. In response to an acute overload of nutrients, a subtle rise of the ROS concentration within this area is sufficient to reduce food intake (9) or stimulate the parasympathetic nervous system as well as pancreatic insulin secretion (10). Furthermore, the gut-derived hormone ghrelin exerts its central effect on feeding behavior by controlling hypothalamic ROS levels (11). However, the role of ROS in the anorexigenic effect of insulin and more generally in the brain insulin signaling remains unknown. In peripheral insulin-sensitive cells, ROS have been shown to control the crucial early steps in insulin signaling (12 14). Moreover, they contribute to propagation of the insulin cascade in these cells (15 17). Thus, transient bursts of small amounts of ROS triggered in response to insulin facilitate both the early and distal insulin signaling pathway. Reinforcing this concept, it has been recently shown that this transient insulin-induced ROS production is also required in neuronal cells for the enhancement of insulin receptor autophosphorylation, the first step in the insulin signaling pathway (18). These data lead us to hypothesize that insulin might trigger ROS elevation within the hypothalamus, which, in turn, would inhibit food intake. In peripheral cells, it is well established that both the insulin-induced ROS rise and insulin cascade activation are dependent on NADPH oxidase activity (12 17,19). Blocking insulin-induced ROS production with an inhibitor of NADPH oxidase activity (diphenyleneidonium) dramatically reduces insulin signaling pathway activation and thus its physiological effects (15). Despite the demonstration of the crucial role of ROS signaling and NADPH oxidase in peripheral insulin effects, their involvement in brain insulin signaling has not yet been investigated. Therefore, in this study we tested whether the anorexigenic insulin effect required a ROSdependent signaling pathway within the hypothalamus. For this purpose, we measured hypothalamic ROS levels and food intake after intracerebroventricular insulin injection. The involvement of ROS and NADPH oxidase in DIABETES, VOL. 58, JULY

96 rich4/zdb-diab/zdb-diab/zdb00709/zdb5764d09z xppws S 1 5/9/09 17:21 doi: /db artno: 1039 ROS-MEDIATED ANOREXIGENIC INSULIN EFFECT AQ: B insulin-induced food intake inhibition was evaluated by pretreatment with a ROS scavenger or an NADPH oxidase inhibitor. Because central insulin responsiveness is known to be altered by a short-term deficit (20) as well as an excess (7) of nutrient availability, we examined the consequence of 18-h fasting or 3 days high-fat diet on insulin s ability to modify hypothalamic ROS levels and food intake. RESEARCH DESIGN AND METHODS All animal experiments were carried out in strict accordance with European Communities Council Directive 86/609/EEC and the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, edited by the National Research Council. For this study, we used 7- to 8-week-old male C57BL6/J mice (Harlan Laboratories). The animals were kept in a temperature-controlled room (22 1 C) on a 12-h light/dark cycle with free access to food and water. Depending on the experiment being conducted, mice were fed ad libitum with standard diet (22.4% fat, 60.9% carbohydrate, and 16.7% protein, 2.9 kcal/g; R04T25; SAFE, Augy, France) or high-fat diet (42.5% fat, 42.5% carbohydrate, and 15% protein, 4.4 kcal/g; customized; SAFE). For the fasting group, food was removed just before dark onset (1900 h). For tissue collection, mice were killed by cervical dislocation. Brains were quickly removed and immediately immersed in ice-cold PBS containing 5 mmol/l HEPES. Surgery. Under anesthesia (0.4% isoflurane, 100% O 2 ), mice underwent stereotaxic surgery to implant a chronic stainless steel cannula (Charles River). The third cerebral ventricle was targeted using the following coordinates from bregma: anterior-posterior, mm; dorsal-ventral, 5 mm; and medial-lateral, 0 mm. The cannula was fixed to the skull using dental cement. Mice were finally housed individually and were allowed 1 week for recovery before the experiment. Drug administration. Injections into the third cerebral ventricle were performed in awake mice. The injections (1 l) consisted of either 0.4 U insulin (100 units/ml Actrapid recombinant human insulin; Novo Nordisk), 0.1 mmol/l Trolox (Calbiochem), 0.1 mmol/l diphenyleneiodonium (DPI; Sigma- Aldrich), or vehicle. Insulin, Trolox, and DPI were prepared as stock solutions in diluting medium for soluble insulin injection (Novo Nordisk), 1% ethanol, and 1% DMSO, respectively. For injections, all drugs and their respective vehicle were diluted in 0.9% NaCl. Injections were performed over 1 min. After the infusion, the guide cannula was kept in place for an additional 30 s to allow the drugs to diffuse away from the cannula tip. Food intake measurement. Food was removed 1 h before intracerebroventricular injection. Insulin was injected 4 h before dark onset (1500 h). Intracerebroventricular injections of Trolox or DPI were performed 30 min prior to the 0.4 U insulin injection. Just prior the beginning of the dark period (1900 h), food (10 g) was presented to the mice. Then, 12 and 24 h later, food intake and body weight were measured. Blood glucose measurement. Blood samples were collected from the tail 2 h after 4 U insulin intracerebroventricular injection and used for measurements of blood glucose. It was directly measured on a glucose analyzer (Accu-Chek Active meter). ROS detection. The dye 2,7 -dichlorofluorescein diacetate (H 2 DCFDA; Molecular Probes) was used to monitor intracellular change in H 2 O 2 levels. After intracerebroventricular injections, hypothalami were dissected and immediately frozen in liquid nitrogen. After rapid thawing, tissues were homogenized (20 strokes) with a Dounce homogenizer and a B-type pestle in 250 l of a ROS buffer (150 mmol/l KCl, 20 mmol/l Tris, 0.5 mmol/l EDTA, 1 mmol/l MgCl 2, 5 mmol/l glucose, and 0.5 mmol/l octanoïc acid, ph 7.4). Homogenates were exposed to 16 mol/l H 2 DCFDA and were incubated at 37 C for 30 min under agitation. Reaction was stopped with 125 l of 70% ethanol plus 125 l of 0.1 N HCl. Homogenates were then centrifuged at 3,000g for 15 min at 4 C. Supernatants were collected, neutralized with 175 l of 1 mol/l NaHCO 3, and centrifuged at 6,000g for 15 min at 4 C. As previously described (9 10), ROS level was evaluated by measuring fluorescence intensity with a microplate reader (Victor; Wallac). Intensity of fluorescence was expressed as arbitrary units per microgram of proteins. Reduced glutathione assay. Dissected hypothalami were immediately frozen in liquid nitrogen. Tissues were homogenized (20 strokes) with a Dounce homogenizer and a B-type pestle in a lysis saline solution (150 mmol/l KCl, and 3 mmol/l EDTA, ph 7.4). Homogenates (50 l) were mixed with 450 l of 5% metaphosphoric acid. Samples were then centrifuged at 1,500g for 10 min at 4 C. Supernatants were collected and used to detect reduced glutathione (GSH). Glutathione assay was performed by reverse-phase high-performance liquid chromatography as previously described (21). The results are expressed as ficomoles per microgram tissular protein. Protein assay. Protein concentration of samples was determined using the DC protein assay kit (Bio-Rad) according to the manufacturer s instructions. Statistical analysis. Data are the means SE. Depending on the experiment being conducted, data were compared by unpaired Student s t test, the Mann-Whitney U test, or one-way ANOVA. Differences among groups were considered significant at P RESULTS Third-ventricle insulin injection decreases food intake. To study the role of hypothalamic insulin signaling in food intake regulation, we first aimed to select the best paradigm of acute insulin injection (Fig. 1A). We chose a third-ventricle injection because acute insulin administration into the lateral ventricle was without effect on food intake in mice (22). In comparison to vehicle-injected animals, insulin significantly reduced food intake 12 and 24 h after injection (Fig. 1B). This represented a 40% decrease in daily food intake. Concurrently to this food intake inhibition, insulin also significantly reduced body weight at 12 and 24 h (Fig. 1C). To ensure that intracerebroventricularly injected insulin did not indirectly affect food intake through diffusion out of the brain, we injected a higher dose of insulin and measured glycemia. No change in plasma glucose was observed in this condition, showing that the insulin effect on food intake only depends on its effect on the brain (Fig. 1D). Insulin induces a transient hypothalamic ROS increase, which is required for food intake inhibition. To determine whether insulin could induce ROS increase in the hypothalamus, insulin was injected into the third ventricle at a dose that inhibits food intake. Mice were killed 5, 15, and 30 min later, and the ROS level was evaluated using the fluorescent redox-sensitive dye H 2 DCFDA. Figure 2A shows that insulin induced a significant increase ( 36%) in the ROS level 15 min postinjection. This insulin-induced ROS increase was transient because no modification of fluorescence intensity was observed at either 5 or 30 min postinjection. We then designed experiments to examine the physiological relevance of this insulin-induced hypothalamic ROS elevation. For this purpose, we assessed food intake in response to acute intracerebroventricular insulin injection in combination with an intracerebroventricular pretreatment of Trolox, a ROS scavenger. We first verified that Trolox alone did not induce significant change in basal ROS levels and food intake, and then we investigated the ability of Trolox to inhibit insulin-induced ROS production. As illustrated in Fig. 2B, Trolox delivery 30 min prior to insulin completely prevented insulin-stimulated ROS increase. We then measured the effect of Trolox pretreatment on food intake response. As for the ROS level, intracerebroventricular Trolox injection completely suppressed insulin-induced food intake inhibition without significantly modifying basal food intake (Fig. 2C). Therefore, these results indicate that the transient insulininduced ROS elevation in the hypothalamus is required for food intake inhibition. NADPH oxidase is required for insulin-induced ROS elevation and food intake inhibition. In peripheral tissues, ROS produced by membrane-bound NADPH oxidase are involved in the insulin signaling cascade. We questioned whether, as in the periphery, NADPH oxidase was involved in hypothalamic insulin ROS signaling to regulate food intake. For this purpose, we assessed food intake in response to acute intracerebroventricular insulin injection in combination with prior intracerebroventricular administration of DPI, a NADPH oxidase inhibitor. To test the ability of DPI to inhibit the ROS level increase, we F1 F2 2 DIABETES, VOL. 58, JULY 2009

97 rich4/zdb-diab/zdb-diab/zdb00709/zdb5764d09z xppws S 1 5/9/09 17:21 doi: /db artno: 1039 T. JAILLARD AND ASSOCIATES A 14h00 15h00 17h00 19h00 07h00 19h00 Dark period t = 0 t = 12h t = 24h B C D Food intake (Kcal/g body weight) Food withdrawal Insulin or vehicle injection Vehicle Insulin 12h ** 24h * Glycemia measurement Body weight (g) Food (10 g) Vehicle Insulin 12h * * 24h Food intake measurement Glycemia (mm) Vehicle Insulin FIG. 1. Acute insulin injection into the third ventricle reduces food intake at 12 and 24 h with no effect on plasma glucose. A: Schematic representation of experimental procedures for food intake measurement. B: Mice were injected into the third ventricle with insulin (0.4 U) or vehicle. Food intake was assessed by weighing residual chow 12 and 24 h after food presentation (n 9 10 mice per group). C: Body weight was also measured at these time points (n 9 10 mice per group). D: Mice were injected into the third ventricle with a higher dose of insulin (4 U) or vehicle. Plasma glucose was measured 2 h after injection (n 4 mice per group). Data are the means SE. *P < 0.05, **P < 0.01 vs. vehicle-injected group. F3 first measured the hypothalamic ROS level 15 min after insulin injection with DPI pretreatment. DPI delivery was effective in fully preventing insulin-stimulated ROS elevation (Fig. 3A). In this condition, DPI completely restored basal food intake in insulin-injected mice (Fig. 3B). DPI treatment alone did not significantly modify basal ROS levels as well as food intake. Therefore, these results indicate that NADPH oxidase dependent ROS increase within the hypothalamus is required for the central effect of insulin on food intake inhibition. Impairment of insulin-induced food intake inhibition is associated with a lack of hypothalamic ROS level increase. We then tested whether a modification of insulin effect on food intake was systematically associated with a change of ROS level within the hypothalamus. For this purpose, we chose two physiological situations that produce central insulin unresponsiveness: 18-h fasting (energy deficiency) (20) and 3 days high-fat diet (energy excess) (7). Figure 4A shows that these two conditions effectively suppressed insulin-induced food intake inhibition. According to our hypothesis, insulin did not promote elevation of ROS level within the hypothalamus 15 min after intracerebroventricular injection (Fig. 4B). Because cellular ROS levels result from the balance between their production and removal by various antioxidants, we quantifiedhypothalamic glutathione, which is considered as a major cellular ROS scavenging system (23). Figure 4C shows that hypothalamic GSH levels were increased by 18-h fasting ( 20%) and 3 days high-fat diet ( 36%, P 0,05). Therefore, impairment of insulin-induced inhibition of food intake was associated with a lack of ROS increase in the hypothalamus, likely because of higher GSH level. These results strengthen the crucial role F4 AQ: C A DCF fluorescence (au/µg proteins) Vehicle Insulin * min B DCF fluorescence relative to vehicles (%) Insulin Trolox ** * C Food intake relative to vehicles (%) Insulin Trolox ** + - *** + + FIG. 2. Insulin induces a transient hypothalamic ROS increase, which is required for food intake inhibition. A: Insulin effect on ROS production. After intracerebroventricular injection of insulin (0.4 U) or vehicle, ROS levels were assessed by oxidation of H 2 DCFDA probe in the hypothalamus at different times (n 5 mice per group). Dichlorofluorescein (DCF) fluorescence is expressed in arbitrary units per microgram of protein. B and C: Effect of Trolox on insulin-induced ROS production and food intake inhibition. Trolox (0.1 mmol/l) was intracerebroventricularly injected 30 min before insulin (0.4 U). ROS levels were assessed in the hypothalamus 15 min after injections (n 5 mice per group) (B). Food intake was assessed 12 h after food presentation (n 5 10 mice per group) (C). Data are the means SE. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < vs. vehicle- or insulin-injected group. DIABETES, VOL. 58, JULY

98 rich4/zdb-diab/zdb-diab/zdb00709/zdb5764d09z xppws S 1 5/9/09 17:21 doi: /db artno: 1039 ROS-MEDIATED ANOREXIGENIC INSULIN EFFECT A DCF fluorescence relative to vehicles (%) Insulin DPI * + - ** + + of hypothalamic ROS signaling in the anorexigenic effect of insulin. DISCUSSION In the current study, we describe the involvement of an NADPH oxidase dependent ROS signaling pathway in the anorexigenic insulin effect. We demonstrate for the first time the physiological relevance of this concept in conscious mice. Insulin was administrated into the third ventricle at a dose (2.4 nmol/l) that is consistent with brain insulin receptor affinity (24 25) and that produces maximal food intake inhibition in mice (2 and unpublished results). At this physiological concentration, insulin induced a transient ROS level elevation within the hypothalamus (Fig. 2). The current data demonstrate for the first time in vivo that insulin can effectively induce a change in ROS levels in the central nervous system. Despite a relatively low magnitude ( 36%), this ROS level increase is similar to that observed in the hypothalamus after glucose, lipid, or ghrelin stimulation (9 11). These subtle ROS changes play a key role in the control of the autonomous nervous system and food intake. We show that this insulin-induced ROS increase is required for food intake inhibition, thus demonstrating its physiological relevance. First, the suppression of insulin-stimulated ROS production using pharmacological tools prevented insulin inhibition of food intake. Second, in two nutritional conditions of central B Food intake relative to vehicles (%) Insulin DPI FIG. 3. NADPH oxidase is required for the insulin-induced hypothalamic ROS increase and food intake inhibition. Effect of DPI on insulin-induced ROS level change and food intake inhibition. DPI (0.1 mmol/l) was intracerebroventricularly injected 30 min before insulin (0.4 U). ROS levels were assessed in the hypothalamus 15 min after injection (n 10 animals per group) (A). Food intake was assessed 12 h after food presentation (n 5 10 animals per group) (B). Data are the means SE. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < vs. vehicle- or insulin-injected group. DCF,dichlorofluorescein ** ** insulin unresponsiveness (i.e., 18-h fasting or 3 days high-fat diet), impairment of the insulin effect on food intake was associated with a lack of insulin-stimulated ROS elevation within the hypothalamus. These data strongly support the notion that cellular ROS constitute a pivotal second messenger in hypothalamic signaling pathways involved in energy homeostasis regulation, especially by controlling nutrient sensing (9 10) and hormonal signaling (11). The involvement of an oxidant signal in the action of insulin has been suggested for decades, mainly with the observation that oxidants, including hydrogen peroxide, mimic insulin s effects on glucose transport and lipogenesis in adipose cells (26). A few years later, insulin itself was shown to elicit the generation of hydrogen peroxide in adipocytes (27). More recently, several elegant studies carried out by Mahadev and colleagues (13 16) clearly demonstrate that a physiological transient insulin-induced ROS elevation mediates the increase of glucose uptake though GLUT4 translocation to the plasma membrane in adipocytes. Finally, creating mildly and transiently oxidative intracellular conditions has been reported to enhance insulin receptor activation, suggesting that optimal insulin responsiveness involved a process of redox priming of the -subunit (17,28). Our results reinforce these previous data. Altogether, they strongly support the idea that a ROS increase induced by insulin 1) forms an integral part of insulin signaling pathway in the central nervous system as in the periphery and 2) is relevant in whole-body energy homeostasis. The observed insulin-induced ROS increase peaks and dissipates in a few minutes. Nevertheless, and in agreement with the study by Brown et al. (2), feeding behavior is significantly inhibited for several hours after acute intracerebroventricular insulin injection (Fig. 1). In adipocytes, the early insulin-stimulated production of ROS is required for insulin to elicit its late cellular responses, especially by activating the insulin receptor substrate (IRS)/phosphoinositide (PI)-3 kinase signaling pathway (13 16,18,29). Within the hypothalamus, both insulin-induced ROS and IRS/PI-3 kinase signaling pathways are essential for the long-term inhibitory insulin effect on food intake (Fig. 2) (30). Reciprocally, diet-induced impairment of insulin effect on food intake is associated with an alteration of these two insulin-activated signaling pathways (Fig. 4A-B) (7,31). The time course of insulininduced ROS level increase is similar to that observed for insulin-induced PI3K activation in the hypothalamus, with AQ: D A Food intake (Kcal/g body weight) Vehicle Insulin ** Standard diet Fasting High fat diet B DCF fluorescence relative to vehicle in standard diet fed mice (%) * Standard diet Fasting Vehicle Insulin High fat diet C GSH (fmol/µg proteins) Standard diet (+20%) Fasting * (+36%) High fat diet FIG. 4. Impairment of insulin-induced food intake inhibition is associated with a lack of ROS level elevation within the hypothalamus. Effect of 18 h fasting or 3 days high-fat diet on insulin-induced food intake regulation and ROS production, and on glutathione levels. A B: Mice were injected with insulin (0.4 U) or vehicle. Food intake (n 8 12 animals per group) (A) and ROS level (n 5 10 per group) (B) were assessed 12 h and 15 min after insulin injection, respectively. *P < 0.05, **P < 0.01 vs. vehicle-injected mice fed standard diet. C: Hypothalamic GSH level was measured in standard diet fed, fasted, and high-fat diet fed mice (n 5 10 per group). *P < 0.05 vs. mice fed with standard diet. 4 DIABETES, VOL. 58, JULY 2009

99 rich4/zdb-diab/zdb-diab/zdb00709/zdb5764d09z xppws S 1 5/9/09 17:21 doi: /db artno: 1039 T. JAILLARD AND ASSOCIATES activation a few minutes after stimulation, persisting for min, and gradually declining over min (32). Altogether, these data strongly suggest that the early insulin-induced ROS increase that we measured within the hypothalamus is a pivotal component of insulin-induced IRS/PI-3 kinase signaling pathway activation, leading to a long-term decrease in food intake, likely through modulation of the expression of genes such as neuropeptide Y (33). Actually, hypothalamic neuropeptide Y and pro-opio melanocortin C are well known to play a key role in food intake regulation and to be down- or upregulated by hormones such as leptin, ghrelin, or insulin (2,11,33 34). Because insulin-induced PI-3 kinase activation occurs in these neuronal subpopulations (32), one can speculate that the insulin-induced ROS increase occurs at least in one of these, as has been recently demonstrated for ghrelin (11). That insulin induces a rapid and transient increase in ROS level within the hypothalamus led us to investigate the involvement of NADPH oxidase. Indeed, this enzyme can be rapidly activated by insulin, leading to a rapid and transient ROS increase inperipheral cells (14 15). In our experimental conditions and similarly to Mahadev et al. (15), pretreatment with a NADPH oxidase inhibitor (DPI) completely abolished 1) the rapid and transient insulininduced ROS increase within the hypothalamus and 2) the inhibitory insulin effect on food intake (Fig. 3). We can thus conclude that NADPH oxidase plays a critical role in the insulin signaling pathway in the brain as in the periphery. There is now compelling evidence showing the presence of NADPH oxidase homologues in rodent or human brain tissue (35 38). Within the hypothalamus, immunoreactivity for NADPH oxidase subunits, such as p47 phox and gp91 phox, was found in arcuate, ventromedial, and paraventricular nuclei, which are well known to be involved in energy homeostasis regulation (36). Moreover, increasing data demonstrate the importance of redox signaling derived from NADPH oxidase in normal central nervous system processes, such as long-termpotentiation and hippocampal-dependent memory or the regulation of the cardiovascular system (38 42). Further in vivo studies would permit us to confirm that an acute insulin-induced NADPH oxidase activation mediates other hypothalamic insulin effects involved in energy homeostasis. After fasting or short-term high-fat feeding, the brain became less responsive to insulin, which resulted in a loss of its effects on food intake (Fig. 4A) (7,20). In this context, insulin-induced hypothalamic ROS elevation was suppressed (Fig. 4B). To explain this result, we explored the involvement of antioxidant defense systems. Indeed, the rise in free fatty acid availability during fasting (because of lipolysis) and short-term high-fat feeding (because of diet)likely induced an increase in hypothalamic lipid oxidation (9,11,43), a mechanism known to produce ROS (44). In the physiological range, excess ROS is scavenged at the cellular level by stimulating the synthesis of antioxidant defense systems (44), as already demonstrated within the hypothalamus of food-deprived animals (9,45). We reported that hypothalamic GSH level is effectively higher after high-fat feeding and to a lesser measure after fasting (Fig. 4C), with a concomitant hypothalamic normal ROS level. These data strongly suggest that 1) high-fat diet induced excessive hypothalamic ROS production, which had been well regulated by the cellular scavenging system, and 2) this increased antioxidant defense system could DPI Trolox IR NADPH oxidase ROS Insulin FOOD INTAKE FIG. 5. Proposed mechanism of the involvement of a hypothalamic NADPH oxidase dependent ROS signaling pathway in the anorexigenic effect of insulin. Insulin binds to its receptor leading to NADPH oxidase activation and generation of ROS. This ultimately leads to inhibition of food intake, likely though modulation of gene expression. IR, insulin receptor. consequently overquench ROS produced under insulin stimulation. Such a cellular mechanism has been already proposed to explain the impaired peripheral insulin sensitivity observed during physiological conditions such as pregnancy (46). In animal models of long-term high-fat diet induced obesity (47 48) associated with hypothalamic insulin resistance (47), oxidative stress appears in the brain (48). This cellular stress has been proposed to be critical mechanism underlying development of insulin resistance in obesity (49,50). We thus hypothesized that 1) the early diet-induced central insulin resistance is a consequence of an adaptive mechanism to avoid cytotoxic ROS production, although 2) in the long-term, the resistance might be caused by an overwhelming of antioxidant defense systems, and thus oxidative stress (44). In conclusion, we report that insulin injected into the third ventricle promoted a subtle and transient increase in ROS level within the hypothalamus. This mechanism is required for insulin food intake inhibition and involves NADPH oxidase (Fig. 5). We thus suggest that 1) an NADPH oxidase dependent ROS-sensitive signaling pathway is implied in hypothalamic insulin action, and 2) diet-induced impairment of hypothalamic ROS homeostasis may contribute to cerebral insulin resistance. ACKNOWLEDGMENTS This work was funded in part by Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-05-PNRA-004 and a grant from the Institut Benjamin Delessert. T.J. received a fellowship from the Ministère de l Enseignement Supérieur et de la Recherche and from the Fondation pour la Recherche Medicale. No potential conflicts of interest relevant to this article were reported. AQ: E F5 DIABETES, VOL. 58, JULY

100 rich4/zdb-diab/zdb-diab/zdb00709/zdb5764d09z xppws S 1 5/9/09 17:21 doi: /db artno: 1039 ROS-MEDIATED ANOREXIGENIC INSULIN EFFECT We are indebted to M. Nibbelink for her technical help. We thank M. Rigoulet for helpful discussions and insightful comments. REFERENCES 1. Woods SC, Lotter EC, McKay LD, Porte D. Chronic intracerebroventricular infusion of insulin reduces food intake and body weight of baboons. Nature 1979;29: Brown LM, Clegg DJ, Benoit SC, Woods SC. Intraventricular insulin and leptin reduce food intake and body weight in C57BL/6J mice. Physiol Behav 2006;89: Rahmouni K, Morgan DA, Liu X, Sigmund CD, Mark AL, Haynes WG. Hypothalamic PI3K and MAPK differentially mediate regional sympathetic activation to insulin. J Clin Invest 2004;114: Obici S, Zhang BB, Karkanias G, Rossetti L. Hypothalamic insulin signaling is required for inhibition of glucose production. Nat Med 2002;8: Koch L, Wunderlich T, Seibler J, Könner C, Hampel B, Irlenbusch S, Brabant G, Kahn R, Scwenk F, Brüning JC. Hypothalamic central insulin action regulates peripheral glucose and fat metabolism in mice. J Clin Invest 2008;118: Clegg DJ, Benoit SC, Reed JA, Woods SC, Dunn-Meynell A, Levin BE. Reduced anorexic effects of insulin in obesity-prone rats fed a moderatefat diet. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 2005;288:R981 R Ono H, Pocai A, Wang Y, Sakoda H, Asano T, Backer JM, Schwartz GJ, Rossetti L: Activation of hypothalamic S6 kinase mediates diet-induced hepatic insulin resistance in rats. J Clin Invest 2008;118: Brüning JC, Gautam D, Burks DJ, Gillette J, Schubert M, Orban PC, Klein R, Krone W, Müller-Wieland D, Kahn C. Role of brain receptor in control of body weight and reproduction. Science 2000;289: Benani A, Troy S, Carmona CM, Fioramonti X, Lorsignol A, Leloup C, Casteilla L, Pénicaud L. Role for mitochondrial reactive oxygen species in brain lipid sensing. Diabetes 2007;56: Leloup C, Magnan C, Benani A, Bonnet E, Alquier T, Offer G, Carriere A, Périquet A, Fernandez Y, Ktorza A, Casteilla L, Pénicaud L. Mitochondrial reactive oxygen species are required for hypothalamic glucose sensing. Diabetes 2006;55: Andrews ZB, Liu ZW, Walllingford N, Erion DM, Borok E, Friedman JM, Tschöp MH, Shanabrough M, Cline G, Shulman GI, Coppola A, Gao XB, Horvath TL, Diano S. UCP2 mediates ghrelin s action on NPY/AgRP neurons by lowering free radicals. Nature 2008;454: Goldstein BJ, Mahadev K, Wu X. Redox paradox: insulin action is facilitated by insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets. Diabetes 2005;54: Goldstein BJ, Mahadev K, Wu X, Motoshiba H. Role of insulin-induced reactive oxygen species in the insulin signaling pathway. Antioxid Redox Signal 2005;7: Mahadev K, Zilbering A, Zhu Li, Goldstein BJ. Insulin-stimulated hydrogen peroxide reversibly inhibits protein-tyrosine phosphatase 1B in vivo and enhances the early insulin action cascade. J Biol Chem 2001;276: Mahadev K, Wu X, Zilbering A, Zhu Li, Lawrence TR, Goldstein BJ. Hydrogen peroxide generated during cellular insulin stimulation is integral to activation of the distal insulin signalingcascade in 3T3 L1 adipocytes. J Biol Chem 2001;276: Mahadev K, Wu X, Motoshima H, Goldstein BJ. Integration of multiple downstream signals determines the net effect of insulin on MAP kinase vs. PI 3 -kinase activation: potential role of insulin-stimulated H 2 O 2. Cell Signal 2004;16: Mahadev K, Motoshima H, Wu X, Rudgy JM, Arnold RS, Cheng G, Lambeth JD, Goldstein BJ. The NAD(P)H oxidase homolog Nox4 modulates insulinstimulated generation of H 2 O 2 and plays an integral role in insulin signal transduction. Mol Cell Biol 2004;24: Storozhevykh TP, Senilova YE, Persiyantseva NA, Pinelis VG, Pomytkin IA. Mitochondrila respiratory chain is involved in insulin-stimulated hydrogen peroxide production and plays an integral role in insulin receptor autophosphorylation in neurons. BMC Neurosci 2007;8: Seo JH, Ahn Y, Lee SR, Yeo CY, Hur KC. The major target of the endogenously generated reactive oxygen species in response to insulin stimulation is phosphatase and tensin homolog and not phosphoinositide-3 kinase (PI-3 kinase) in the PI-3 kinase/akt pathway. Mol Biol Cell 2005;16: Plata-Salaman CR, Oomura Y, Shimizu N. Dependence of food intake on acute and chronic ventricular administration of insulin. Physiol Behav 1986;37: Galinier A, Carriere A, Fernandez Y, Caspar-Bauguil S, Periquet B, Periquet A, Pénicaud L, Casteilla L. Site specific changes of redox metabolism in adipose tissue of obese Zucker rats. FEBS Letter 2006;580: Woods SC, Chavez M, Park CR, Riedy C, Kaiyala K, Richardson RD, Figlewicz DP, Schwartz MW, Porte D Jr, Seeley RJ. The evaluation of insulin as a metabolic signal influencing behavior via the brain. Neurosci Biobehav Rev 1996;20: Wu G, Fang YZ, Yang S, Lupton JR, Turner ND. Glutathione metabolism and its implications for health. J Nutr 2004;134: Masters BA, Shemer J, Judkins JH, Clarke DW, Le Roith D, Raizada MK. Insulin receptors and insulin action in dissociated brain cells. Brain Res 1987;417: Schulingkamp RJ, Pagano TC, Hung D, Raffa RB. Insulin receptors and insulin action in the brain: review and clinical implications. Neurosci Rev 2000;24: Czech MP, Lawrence JC Jr, Lynn WS. Evidence for the involvement of sulfhydryl oxidation in the regulation of fat cell hexose transport by insulin. Proc Natl Acad Sci 1974;71: May JM, de Haën C. Insulin-stimulated intracellular hydrogen peroxide production in rat epididymal fat cells. J Biol Chem 1979;254: Schmid E, El Benna J, Galter D, Klein G, Dröge W. Redox priming of the insulin receptor -chain associated with altered tyrosine kinase activity and insulin responsiveness in the absence of tyrosine autophosphorylation. FASEB 1998;12: Leslie NR. The redox regulation of PI 3-kinase-dependent signaling. Antioxid Redox Signal 2006;8: Niswender KD, Morrison CD, Clegg DJ, Olson R, Baskin DG, Myers MG, Seeley RJ, Schwartz MW. Insulin activation of phosphatidylinositol 3-kinase in the hypothalamic arcuate nucleus. Diabetes 2003;52: Clodfeldder-Miller B, De Sarno P, Zmijewska AA, Song L, Jope RS. Physiological and pathological changes in glucose regulate brain Akt and glycogen synthase kinase-3. J Biol Chem 2005;280: Xu WA, Kaelin CB, Takeda K, Akira S, Schwartz MW, Barsh GS. PI3K integrates the action of insulin and leptin on hypothalamic neurons. J Clin Invest 2005;115: Kim MS, Pak YK, Jang PG, Namkoong C, Choi YS, Won JC, Kim KS, Kim SW, Kim HS, Park JY, Kim YB, Lee KU. Role of hypothalamic Foxo 1 in the regulation of food intake and energy homeostasis. Nature Neurosci 2006;9: Schwartz MW, Woods SC, Porte D, Seeley RJ, Baskin DG. Central nervous system control of food intake. Nature 2000;404: Serrano F, Kolluri N, Wientjes FB, Card JP, Klann E. NAD(P)H oxidase immunoreactivity in the mouse brain. Brain Res 2003;988: Kim MJ, Shin KS, Chung YB, Jung KW, Cha CI, Shin DH. Immunohistochemical study of p47 Phox and gp91 Phox distributions in rat brain. Brain Res 2005;1040: Vallet P, Charnay Y, Steger K, Ogier-Denis E, Kovari E, Herrmann F, Michel JP, Szanto I. Neuronal expression of the NADPH oxidase NOX4, and its regulation in mouse experimental brain ischemia. Neuroscience 2005;132: Cheng G, Cao Z, Xu X, Van Meir EG, Lambeth JD. Homologs of gp91 Phox : cloning and tissue expression of Nox3, Nox4, and Nox5. Gene 2001;269: Tejada-Simon MV, Serrano F, Villasana LE, Kanterewicz BI, Wu GY, Quinn MT, Klann E. Synaptic localization of a functional NADPH oxidase in the mouse hippocampus. Mol Cell Neurosci 2005;29: Kishida KT, Klann E. Sources and targets of reactive oxygen species in synaptic plasticity and memory. Antioxid Redox Signal 2007;9: Zimmermann MC, Davisson RL. Redox signaling in central neural regulation of cardiovascular function. Biophys Mol Biol 2004;84: Zimmermann MC, Dunlay RP, Lazartigues E, Zhang Y, Sharma RV, Engelhardt JF, Davisson RL. Requirement for Rac1-dependent NADPH oxidase in the cardiovascular and dipsogenic actions of angiotensin II in the brain. Circ Res 2004;84: Pocai A, Lam TKT, Obici S, Guiterrez-Juarez R, Muse ED, Arduini A, Rossetti L. Restauration of hypothalamic lipid sensing normalizes energy and glucose homeostasis in overfed rats. J Clin Invest 2006;116: Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MT, Mazur M, Telser J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol 2007;39: Kuhla B, Kuhla S, Rudolph PE, Albrecht D, Metges CC. Proteomics analysis of hypothalamic response to energy restriction in dairy cows. Proteomics 2007;7: Chen X, Scholl TO, Leskiw MJ, Donaldson MR, Stein TP. Association of glutathione peroxidase activity with insulin resistance and dietary fat intake during normal pregnancy. J Clin Endocrinol Metab 2003;88: Posey K, Clegg DJ, Printz RL, Byun J, Morton GJ, Vivekanandan-Giri A, Pennathur S, Baskin DG, Heinecke JW, Woods SC, Schwartz MW, Nis- 6 DIABETES, VOL. 58, JULY 2009

101 rich4/zdb-diab/zdb-diab/zdb00709/zdb5764d09z xppws S 1 5/9/09 17:21 doi: /db artno: 1039 T. JAILLARD AND ASSOCIATES wender KD. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet. Am J Physiol Endocrinol Metab 2009;296:E1003 E Zhang X, Dong F, Ren J, Driscoll MJ, Culver B. High dietary fat induces NADPH oxidase-associated oxidative stress and inflammation in rat cerebral cortex. Exp Neurol 2005;191: Houstis N, Rosen ED, Lander ES. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature 2006;440: Urakawa H, Katsuki A, Sumida Y, Gabazza EC, Murashima S, Morioka K, Maruyama N, Kitagawa N, Tanaka T, Hori Y, Nakatani K, Yano Y, Adachi Y. Oxidative stress is associated with adiposity and insulin resistance in men. J Clin Endocrinol Metab 2003;88: DIABETES, VOL. 58, JULY

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103 C. RESULTATS COMPLEMENTAIRES, INTERPRETATIONS & DISCUSSION Les résultats présentés dans l article I montrent pour la première fois in vivo que l insuline, à une concentration physiologique, induit une élévation du niveau d EAOs (H 2 O 2 ) dans le système nerveux central, et plus particulièrement dans l hypothalamus. Cette augmentation du niveau d EAOs est nécessaire à l effet anorexigène de l insuline, démontrant ainsi la relevance physiologique de cette signalisation. De plus, nous révélons l implication de la NOX dans cette signalisation. Les résultats de l article I mettent également en évidence que la restriction alimentaire totale de 18h (jeûne) ou la mise sous régime hyperlipidique hypercalorique pendant 3 jours (HFD, High-Fat Diet) suppriment l élévation hypothalamique du niveau d EAOs induite par l insuline et l effet anorexigène de cette hormone. En d autres termes, un déficit comme un excès d énergie entraîne une perte de sensibilité à l insuline. On peut donc se poser la question suivante: comment expliquer que deux situations nutritionnelles apparemment opposées aient la même conséquence sur la sensibilité à l insuline? Dans l article I, nous montrons que ces deux situations nutritionnelles apparemment opposées, entraînent une augmentation dans l hypothalamus de la quantité de glutathion réduit (GSH) qui constitue un système anti-oxydant majeur de la cellule. Nous avons proposé que cette augmentation des défenses anti-oxydantes soit responsable de l absence d élévation du niveau d EAOs en réponse à l injection icv d insuline, et donc de la perte de sensibilité à l hormone. Nous avons émis l hypothèse que ce phénomène soit dû à l afflux d acides gras libres (AGL), provenant de la lipolyse dans le cas du jeûne et de l apport alimentaire dans le cas du régime HFD. Cet afflux d AGL entraînerait une augmentation de la β-oxydation mitochondriale et, consécutivement, celle de la respiration, conduisant ainsi à une production accrue d EAOs. En retour, afin de préserver l intégrité cellulaire, les défenses anti-oxydantes seraient augmentées, permettant ainsi de piéger l excédent d EAOs, mais supprimant aussi l élévation transitoire de la quantité d EAOs induite par l insuline. Nous avons privilégié cette hypothèse en raison des données existantes de la littérature concernant les effets du jeûne et de l hyperlipidémie dans l hypothalamus sur les défenses anti-oxydantes. Néanmoins, les acides gras sont aussi connus pour moduler l activité de la NOX. En effet, l exposition des adipocytes 3T3-L1 aux acides gras entraîne une forte production 90

104 d EAOs, qui disparaît en présence d inhibiteurs de la NOX (Furukawa et al. 2004). De manière similaire, le niveau élevé d EAOs dans les adipocytes issus de souris soumises à un régime HFD de longue durée peut être restauré en traitant les cellules avec des inhibiteurs de la NOX (Talior et al. 2005). De plus, dans le muscle de ces souris, la surproduction d EAOs est également dépendante de l activité de la NOX (Bonnard et al. 2008). Finalement, au niveau du SNC, un régime HFD de longue durée induit une surproduction d EAOs, qui a été attribuée à la surexpression cérébrale des sous-unités de la NOX (Zhang et al. 2005). Au regard de l ensemble de ces données, il est donc possible que, dans nos conditions expérimentales, et plus particulièrement lorsque les souris sont soumises à un régime HFD, la stimulation de la NADPH oxydase par les AGL dans l hypothalamus soit aussi en partie responsable de l augmentation des défenses anti-oxydantes que nous mettons en évidence. En plus de l augmentation des défenses anti-oxydantes, nous avons cherché à savoir si les quantités hypothalamiques des sous-unités α et β du récepteur à l inuline (RI) contenues dans l homogénat tissulaire total et plus spécifiquement dans les membranes plasmiques purifiées (cf Annexes, Matériel & Méthodes) variaient entre les trois conditions expérimentales testées (régime standard, jeûne, et régime HFD). La détection par Western Blot des sous-unités α et β du RI dans l homogénat tissulaire total et les membranes plasmiques de l hypothalamus (FIGURE 23A) montre que le jeûne et le régime HFD n altèrent pas leur quantité (FIGURE 23B). Ces résultats sont en accord avec la littérature qui rapporte qu il n existe pas dans le SNC de régulation positive de l expression du RI en cas de déficit énergétique et/ou d hypo-insulinémie (jeûne ou diabète de type I), ni de régulation négative en cas d excès énergétique et/ou d hyper-insulinémie (rat Zucker fa/fa, souris ob/ob, ou souris soumises sur un long-terme à un régime HFD) (cf Introduction III.B.2.a). L ensemble de ces données suggère donc que l altération des effets centraux de l insuline ne peut pas être attribuée à un défaut de la quantité de RI. Lors de l altération des effets centraux de l insuline par un régime HFD de courte durée (1 jour), notamment sur le contrôle de la production hépatique de glucose, la quantité hypothalamique de RI ne varie pas alors que la phosphorylation de IRS-1 induite par l insuline est diminuée (Ono et al. 2008). De plus, le jeûne entraîne au niveau du SNC une diminution de la phosphorylation d Akt (Clodfeldder-Miller et al. 2005), suggérant ainsi une altération de la transduction du signal en cas de stimulation avec l insuline. Ces données, associées aux nôtres, montrent que plusieurs étapes de la voie de signalisation de la PI3K (EAOs, IRS-1, Akt) indispensable aux effets 91

105 A B C FIGURE 23 : Effets du jeûne (A-B) et du régime HFD (A-C) sur la quantité des sous-unités α (RI-α) et β (RI- β) du récepteur à l insuline (RI) dans l extrait total et les membranes plasmiques de l hypothalamus. La quantité relative de chaque sous-unité est exprimée en pourcentage par rapport au régime standard (STD). n = 3 dépôts d homogénats d hypothalami de 4 souris, par condition nutritionnelle et par sous-unité de RI détectée. 92

106 physiologiques de l insuline, sont rapidement altérés par le jeûne et le régime HFD. Or, la production d EAOs, dérivée de l activité de la NOX, permet une amplification de la transduction du signal de l insuline via l inhibition de PTP1B, régulateur négatif de la phosphorylation du RI et de IRS-1, et via l inhibition de PP2A, régulateur négatif majeur d Akt (cf Introduction IV.E.1). Par conséquent, en absence d induction de signal oxydant (due aux défenses anti-oxydantes augmentées), la régulation négative de la phosphorylation du RI, d IRS-1 et d Akt ne pourrait être levée lors de la stimulation avec l insuline. L activation de la voie de la PI3K étant essentielle à la régulation de l expression des neuropeptides NPY/AgRP et POMC responsables de l action anorexigène de l insuline (cf Introduction III.B), l altération de cette voie pourrait expliquer la perte d effet de l hormone sur le comportement alimentaire. En résumé, la stimulation de la NOX et/ou du métabolisme mitochondrial dus à l augmentation des AGL dans l hypothalamus pourrait entraîner une augmentation des défenses anti-oxydantes, et ainsi empêcher l activation de la voie de la PI3K, essentielle à l effet anorexigène de l insuline (FIGURE 24).. 93

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109 PARTIE II : LES EAOs : NOUVEAUX ACTEURS DE LA SIGNALISATION HYPOTHALAMIQUE DE L INSULINE NECESSAIRE AU CONTROLE DE LA PRISE ALIMENTAIRE. Rôle de la chaîne respiratoire mitochondriale. A. INTRODUCTION & DEMARCHE EXPERIMENTALE Dans la première partie (Article I), nous avons démontré que l effet anorexigène de l insuline est dépendant d une voie de signalisation hypothalamique impliquant les EAOs, notamment celles dérivées de la NOX. Or, dans les neurones, les EAOs dérivées de la CRM font également partie de la signalisation de l insuline (Storozhevykh et al. 2007, Storozheva et al. 2008). Nous avons donc voulu savoir si l activité de la CRM dans l hypothalamus prenaient également part à l effet anorexigène de l insuline. 1) Pour tester l implication de la CRM et confirmer celle de la NOX dans l action hypothalamique de l insuline, nous avons utilisé in vivo, suivant le même protocole d injection que celui utilisé dans l article I, deux agents pharmacologiques qui altèrent leurs capacités à produire des EAOs (l apocynin pour la NOX et le CCCP pour la CRM). Nous montrons ainsi que les effets de l insuline sur l élévation du niveau d EAOs et l inhibition de la prise alimentaire dépendent des EAOs dérivées de la NOX et de la CRM. 2) Nous avons ensuite cherché à déterminer si l insuline était capable in vivo, dans l hypothalamus, de moduler l activité de la CRM. Nous avons utilisé le même protocole d injection que celui décrit dans l article I. Les hypothalami ont été prélevés 15min après l injection icv d insuline, au moment où se produit le pic d EAOs dépendant de l activité de la NOX. L effet de l insuline sur l activité de la CRM a été évalué par mesure de la respiration mitochondriale. Nous montrons que l insuline diminue les capacités respiratoires maximales mitochondriales. L analyse pharmacologique plus fine de la respiration, réalisée ex-vivo et sur hypothalamus perméabilisé, montre que l insuline (10min d exposition) inhibe la respiration mitochondriale en limitant l utilisation des substrats par les C I et II de la CRM. 96

110 3) Les EAOs pouvant inhiber l activité des complexes de la CRM, nous avons émis l hypothèse selon laquelle elles interviennent dans l effet inhibiteur de l insuline sur la respiration. Pour tester cette hypothèse, nous avons pré-incubé les hypothalami perméabilisés avec un antioxydant (le trolox) pendant 10min, avant l ajout d insuline. Nous montrons ainsi que l effet inhibiteur de l insuline sur la respiration dépend des EAOs. 4) Suivant la même stratégie expérimentale, la pré-incubation des hypothalami perméabilisés avec un inhibiteur de l activité de la NOX, l apocynin (10min d exposition), avant l ajout d insuline, montre que l effet inhibiteur de l insuline sur la respiration dépend des EAOs dérivées de la NOX. 5) L activité de la CRM représentant 80% de la production basale d EAOs de la cellule, nous avons voulu tester si les EAOs d origine mitochondriale intervenaient également dans l effet inhibiteur de l insuline sur la respiration. La pré-incubation des explants avec un agent découplant, le CCCP (10min d exposition), avant l ajout d insuline, montre que l effet inhibiteur de l insuline sur la respiration est aussi dépendant des EAOs mitochondriales. 6) Dans l article I, nous avons démontré que dans une situation de perte de sensibilité cérébrale à l insuline (trois jours de régime HFD), l élévation de la quantité d EAOs qu induit l hormone est supprimée. Pour l article II, nous avons réutilisé cette condition nutritionnelle afin de tester si l altération de la «signalisation EAOs» était liée à une perte de l effet inhibiteur de l insuline sur la respiration. Nous montrons que trois jours de régime HFD induit, dans l hypothalamus, une altération de la respiration mitochondriale associée à une perte de l effet inhibiteur de l insuline sur la CRM. 7) L analyse de l ensemble des résultats obtenus dans l article I et II, en prenant en compte les différents traitements pharmacologiques utilisés (vehicules, trolox, apocynin, CCCP, ± insuline, régimes standard ou HFD), montre que le niveau de prise alimentaire dépend du taux d EAOs et de l activité de la CRM, qui sont eux-mêmes dépendants l un de l autre. L ensemble de ces résultats nous permet donc de démontrer l implication de la CRM dans l effet anorexigène de l insuline. Nous proposons que les EAOs dérivées de la NOX et 97

111 de la CRM permettent à l insuline d inhiber la respiration mitochondriale et d élever le niveau d EAOs, conduisant ainsi à l inhibition de la prise alimentaire. B. RESULTATS Les résultats sont présentés dans l article II suivant (en fin de rédaction). 98

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113 Article II 100

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115 Manuscrit en fin de rédaction Insulin restrains hypothalamic mitochondrial respiration by a ROSdependent mechanism. Consequence on food intake? Tristan Jaillard, Sylvie-Anne Gaillardou, Michael Roger, Pascale Guillou, Alexandre Benani, Anne Devin, Corinne Leloup, Michel Rigoulet, Louis Casteilla, Luc Pénicaud, and Anne Lorsignol. 102

116 INTRODUCTION L'hypothalamus est une aire cérébrale impliquée dans la régulation de l'homéostasie énergétique. Dans ce contexte, l'insuline joue un rôle pivot. En effet, par son action dans l'hypothalamus, l'insuline limite la prise alimentaire et réduit le poids corporel (Woods et al. 1979, Brown et al. 2006), stimule les voies afférentes sympathiques innervant le tissu adipeux brun (Rahmouni et al. 2004) et supprime la production hépatique de glucose (Obici et al. 2002c, Koch et al. 2008). Par ailleurs, l'inactivation du récepteur neuronal à l insuline conduit au développement d une obésité associée à une augmentation de la masse grasse, une résistance périphérique à l insuline et une insulinémie élevée (Brüning et al. 2000). Lors d une ingestion excessive d énergie (régime riche en gras), l'hypothalamus devient rapidement résistant à l'insuline avant même l apparition des symptômes caractérisant l obésité et/ou le diabète de type 2 (Ono et al. 2008, Clegg et al. 2005). Ces maladies métaboliques dites de surcharge représentent désormais une priorité mondiale en matière de santé publique. De fait, il est d une importance capitale d élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires par lesquels l'insuline agit dans l hypothalamus afin de mieux appréhender le développement de ces pathologies. Le rôle pivot des espèces actives de l'oxygène (EAOs) dans le contrôle hypothalamique de l'homéostasie énergétique émerge depuis quelques années. Leurs variations dans l hypothalamus, bien que subtiles, sont nécessaires au contrôle de la prise alimentaire par les lipides (Benani et al. 2007) ou la ghréline (Andrews et al. 2008) ainsi qu à la sécrétion pancréatique d insuline en réponse à une hyperglycémie cérébrale (Leloup et al. 2006). De plus, très récemment, notre laboratoire a montré qu une élévation rapide, de faible amplitude, et transitoire, de la quantité hypothalamique d EAOs est requise pour l effet anorexigène de l insuline (Jaillard et al. 2009) (Article I). L élévation du niveau hypothalamique d EAOs induite par l insuline est dépendante de la NADPH oxydase (NOX) (Jaillard et al. 2009). Au niveau périphérique, dans les cellules sensibles à l insuline, l activité de la NOX constitue le lien entre le récepteur à l insuline et la production d EAOs. Cette élévation d EAOs d origine membranaire amplifie ainsi la transduction du signal de l insuline, notamment via l inactivation oxydative des phosphatases qui régulent négativement cette cascade (Goldstein et al. 2005a, Bashan et al. 2009). Or, il a récemment été montré, dans les neurones, que les EAOs dérivées de l activité de la chaîne 103

117 respiratoire mitochondriale (CRM) sont également nécessaires à l élévation du niveau d EAOs induite par l insuline et à l amplification de l'autophosphorylation du récepteur à l insuline qui constitue une étape déterminante de la propagation du signal de l'insuline (Storozhevykh et al. 2007, Storozheva et al. 2008). Ces données suggèrent donc fortement que dans les cellules nerveuses, l insuline agisse à la fois sur l activité de la NOX et de la CRM pour traduire son signal. L insuline est en effet capable de modifier le métabolisme mitochondrial à court terme. Dans le système nerveux central et les tissus périphériques sensibles à l insuline, elle module l activité de la pyruvate déshydrogénase (stimulation ou inhibition selon la concentration d insuline) (Rinaudo et al. 1986b, Rinaudo et al. 1986a, Kim et al. 2006b). De plus, dans les tissus périphériques, elle stimule l activité de la cytochrome c oxydase, induit la transcription des gènes codant pour la NADH déshydrogénase et la cytochrome c oxydase, et augmente la synthèse d ATP (Stump et al. 2003). L insuline peut aussi inhiber la respiration mitochondriale, ce qui permet de rediriger les flux métaboliques vers les voies de stockage d énergie, notamment vers la synthèse de glycogène (Finocchietto et al. 2008). Cet effet s accompagne d une production d EAOs mitochondriales. Dans l hypothalamus, la modulation du métabolisme mitochondrial par les facteurs orexigène (ghréline) et anorexigènes (acides gras libres et leptine) fait partie des mécanismes indispensables au contrôle de la prise alimentaire (Gao et al. 2007, Andrews et al. 2008, Benani et al. 2007). Plusieurs mécanismes d actions de ces facteurs ont été décrits tels que i) la stimulation de l activité de la CRM (Benani et al. 2007, Andrews et al. 2008), ii) la stimulation de la β-oxydation (Cruciani-Guglielmacci et al. 2004), et iii) l inhibition de l entrée des acides gras dans la mitochondrie (Gao et al. 2007, Obici et al. 2003). Cependant, en dépit de leur importance, l implication de ces mécanismes dans l effet anorexigène de l insuline n a pas encore été explorée. L objectif de cette étude est de déterminer si la mitochondrie est impliquée dans l action anorexigène de l insuline. Dans ce but, nous avons évalué la participation de la CRM dans les effets de l insuline sur l élévation du niveau hypothalamique d EAOs et l inhibition de la prise alimentaire. Nous avons ensuite exploré les effets de l insuline sur la respiration mitochondriale, et l implication des EAOs, notamment ceux dérivées de la NOX, et de la CRM, dans les effets de l hormone. Enfin, pour démontrer leur relevance physiologique, nous avons testé si une situation nutritionnelle (3 jours de régime HFD), connue pour induire une 104

118 perte de sensibilité hypothalamique aux effets de l insuline sur la production d EAOs et la prise alimentaire, entraîne aussi une perte des capacités de l insuline à moduler la respiration mitochondriale. 105

119 MATERIEL ET METHODES Animaux. Les expériences sont réalisées sur des souris mâles sauvages, âgées de 8 à 10 semaines et de souche C57BL6/J (Harlan). Ces animaux sont hébergés dans une pièce thermo-régulée à C, soumise à un cycle obscurité/lumière de 12h-12h (lumière de 7h à 19h). Les souris sont nourries ad libitum avec un régime standard de laboratoire (STD, R04T25, Safe) dont la valeur énergétique est de 2.9kcal/g de croquette ou avec un régime riche en gras (High-Fat Diet, HFD, à façon, Safe) dont la valeur énergétique est de 4.4kcal/g de croquette. L eau est disponible à volonté. Pour les prélèvements des tissus, les animaux sont sacrifiés par élongation cervicale puis décapitation. Stéréotaxie. L animal, sous anesthésie gazeuse (mélange gazeux isoflurane 0.4% - O 2 100%) est placé dans un cadre stéréotaxique (Kopf Instrument). La tête est maintenue fixe par trois points : oreilles et mâchoire. La peau du crâne est incisée avant d y percer un trou à -0.8mm du Bregma, en accord avec l atlas stéréotaxique (Paxinos G et Watson C, The mouse brain in stereotaxic coordinates). Une canule est alors descendue à -5mm dans le 3 ème ventricule bordant l hypothalamus. La canule est maintenue avec du ciment dentaire (Paladur) ancré dans l os du crâne grâce à deux vis. Une période de rétablissement post-opératoire de 7 jours permet une récupération totale du poids corporel pré-opératoire. Injections intra-cérébro-ventriculaires (icv). Deux heures avant le début des injections, la litière est changée, les croquettes sont retirées, et les souris sont pesées. Entre 13h30 et 15h30, les drogues sont injectées en icv à un débit de 1µl/min (1µl final injecté). Les souris reçoivent l un des deux pré-traitements suivants : apocynin (10µM ; inhibiteur de la translocation à la membrane plasmique de la sous-unité p47 phox de la NOX, nécessaire à son activation) ou son contrôle (sérum physiologique à 1 d éthanol absolu) ; CCCP (1µM ; agent découplant de la mitochondrie) ou son contrôle (sérum physiologique à 0.5 d éthanol absolu). L injection icv d insuline (0.4µU soit 2.4nM) ou de son contrôle (Diluting Medium, Novonordisck) est réalisée 30min après le pré-traitement. Mesure de la prise alimentaire. Après les injections icv, aux alentours de 18h30, juste avant la période nocturne, les croquettes (20g), sont présentées aux souris. La pesée des souris et des croquettes restantes est effectuée 12 et 24h après. 106

120 Mesure des EAOs. Le taux d EAOs est mesuré à l aide d une sonde, la 2,7 - dichlorofluorescéine diacetate (H 2 DCF-DA, Molecular Probes). Cette molécule, une fois clivée par les estérases cellulaires, réagit avec H 2 O 2 en émettant un signal fluorescent. Les hypothalami sont prélevés 15min après l injection icv d insuline, puis homogénéisés dans 250µl de tampon EAO (150mM KCl, 20mM tris, 0.5mM EDTA, 1mM MgCl 2, 5mM glucose, 0.5mM acide octanoïc, ph 7.4) à l aide d un Dounce (20 passages). 1µl de la sonde (4mM) est ajouté à l homogénat (incubation à 37 C, 30min). La réaction est arrêtée avec 125µl d éthanol (70%) puis 125µl d HCl (0,1N ; 4 C). Après centrifugation (3000g ; 15min ; 4 C), le culot est mis de côté pour le dosage protéique. Le surnageant S1 est neutralisé avec 175µl de NaHCO 3 (1M ; 4 C) et centrifugé (6000g, 15min, 4 C). Le dosage des EAOs s effectue avec 200µl de surnageant S2 déposé sur microplaque (λex=490nm, λem=535nm). Les résultats sont standardisés par la teneur en protéines des échantillons. Dosage protéique. La détermination des quantités de protéines est réalisée en utilisant le kit de dosage colorimétrique DC Protein Assay (Biorad). La densité optique est lue à 750nm. La concentration en protéines est déterminée à partir d une courbe étalon établie avec de l albumine bovine sérique (BSA). Evaluation de l activité mitochondriale. Ex-vivo. L hypothalamus est prélevé dans du milieu A (250mM Sucrose, 0.5mM Na 2 EDTA, 10mM tris, 1g/l BSA, ph 7.4), placé dans du milieu BIOPS (2.77mM CaK 2 EGTA, 7.23mM K 2 EGTA, 5.77mM Na 2 ATP, 6.56mM MgCl 2, 20mM taurine, 15mM Na 2 P-créatine 20mM imidazole, 0.5mM DTT, 50mM MES, ph 7.1), puis séparé en deux selon l axe antéropostérieur. Chaque demi-hypothalamus est pesé et perméabilisé avec de la saponine (30min, 4 C, sous agitation). Après trois rinçages avec du MitoMed R05 (0.5mM EGTA, 3mM MgCl 2, 60mM K-lactobionate, 20mM taurine, 10mM KH 2 PO 4, 20mM d'hepes, 110mM sucrose, 1g/l BSA, ph 7.1) à température ambiante, les échantillons sont incubés à 4 C dans du milieu MitoMed R05 pendant 2h minimum avant le début de la mesure de la respiration mitochondriale. La respiration est mesurée en utilisant l oxygraphe 2K haute résolution de Oroboros Instruments. Chaque demi-hypothalamus est placé dans une chambre d analyse munie d une électrode à oxygène et remplie de milieu MitoMed R05. Les agents pharmacologiques utilisés pour moduler l'activité des complexes de la CRM (du C I au C IV ) et de l ATP synthase (C V ) sont les suivants: le glutamate (40mM final) approvisionne le C I en NADH,H + ; le succinate (25mM final), approvisionne le C II en 107

121 FADH 2 ; l ADP (250µM final), substrat du C V ; le CAT (CarboxyAtracTyloside, 5µM final) ou l oligomycine (10µM final), inhibiteurs de l activité du C V ; le CCCP (CarbonylCyanide-3- ChloroPhenylhydrazone, 2µM final), agent découplant qui forme de pores artificiels dans la membrane interne mitochondriale; le KCN (cyanure de potassium, 2.5mM final), inhibiteur du C IV. L ajout successif de ces agents permet de mesurer les différents états de respiration. L état basal correspond à la respiration non stimulée (tissu seul). L état 2 correspond à la respiration stimulée par un substrat (glutamate ou succinate ; les C I ou II, III, IV fonctionnent). L état 3 correspond à la respiration après stimulation du C V (les C I ou II, III, IV, V fonctionnent). L inhibition du C V permet d obtenir l état 4 dont la valeur est sensiblement la même que celle de l état 2. Le rapport état3/état4 (quotient respiratoire) rend compte du degré de couplage entre la chaîne respiratoire et l ATP synthase. La formation de pores artificiels par le CCCP permet de mesurer les capacités respiratoires maximales (les C I ou II, III, IV fonctionnent au maximum). Avant l ajout du premier agent pharmacologique, les tissus sont incubés pendant 10min avec 2.4nM final d insuline ou de son solvant. L exposition des tissus au trolox (100µM final), à l apocynin (10µM final), au CCCP (1µM final) ou à leurs solvants se fait, pendant 10min, avant l insuline ou son solvant. In vivo. Les hypothalami sont prélevés dans du milieu A 15min après l injection icv d insuline ou de son solvant. Ils sont pesés et placés dans du milieu BIOPS. Ils sont ensuite placés dans les chambres d enregistrement de l oxygraphe. De la même façon qu ex-vivo, mais sans apporter de substrats exogènes, le couplage puis les capacités respiratoires maximales sont mesurés en présence d un inhibiteur du C V puis du CCCP. Acquisition et traitement des données. La quantité totale (nmol O 2 /ml) et la vitesse de consommation de l oxygène par les tissus (pmol O 2 /s/mg) sont données par le logiciel d utilisation de l appareil, DataXLab. Chaque évènement (introduction des tissus ou injection des agents pharmacologiques) est suivi d un artefact identifiable puis d un plateau qui correspond à un état stable de respiration du tissu. Les valeurs numériques de la vitesse de consommation de l oxygène sont obtenues en faisant la moyenne de points au niveau des plateaux. Données statistiques. Les résultats sont exprimés sous forme de «moyenne ± écart-type moyen». Les statistiques sont validées avec les tests appropriés de Student, Mann-Withney ou ANOVA (test post hoc Newman Keuls). 108

122 RESULTATS Les effets hypothalamiques de l insuline sur la production d EAOs et la prise alimentaire dépendent des EAOs dérivées de la NOX et de la CRM. Pour confirmer l implication de la NOX (Jaillard et al. 2009) (Article I) et tester celle de la CRM dans les effets hypothalamiques de l insuline, nous avons utilisé in vivo deux agents pharmacologiques qui altèrent leurs capacités à produire des EAOs. 1) L apocynin (10µM) ou le CCCP (1µM), injectés dans le 3 ème ventricule, diminuent significativement le taux hypothalamique d EAOs (contrôle vs apocynin : -44 ± 3% ; contrôle vs CCCP : -31 ± 8%) (Figure 1A) et augmentent de façon significative la prise alimentaire (contrôle vs apocynin : +32 ± 2% ; contrôle vs CCCP : +41 ± 6 %) (Figure 1B). 2) L apocynin et le CCCP (30min de pré-traitement avant l insuline) suppriment les effets de l injection icv d insuline (2.4nM) sur l élévation du taux hypothalamique d EAOs (Figure 1A) et l inhibition de la prise alimentaire (Figure 1B) (apocynin vs apocynin + insuline : NS ; CCCP vs CCCP + insuline : NS). Ces résultats montrent que, dans l hypothalamus, 1) les EAOs dérivées de l activité de la NOX et de la CRM contrôlent le niveau d EAOs et la prise alimentaire et 2) les effets de l insuline dépendent des EAOs dérivées de la NOX et de la CRM. A B Figure 1 : Les effets hypothalamiques de l insuline sur la production d EAOs et la prise alimentaire dépendent des EAOs dérivées de la Nox et de la CRM. Effets de l apocynin (10µM) et du CCCP (1nM) injectés en icv sur la production hypothalamique d EAOs (15min après la dernière injection) (A) et l inhibition de la prise alimentaire (12h après la présentation de la nourriture) (B) induites par l injection icv d insuline (2.4nM). n = 5-10 animaux par groupe. Moyenne ± S.E.M. * p < 0.05, ** p <0.01, *** p < vs groupe contrôle. NS : non significatif. 109

123 L insuline inhibe la respiration mitochondriale dans l hypothalamus en limitant l utilisation des substrats par les C I et II de la CRM. Nous avons ensuite cherché à déterminer si l insuline était capable in vivo, dans l hypothalamus, de moduler l activité de la CRM. Pour tester cette hypothèse, nous avons choisi d utiliser l insuline à la dose (2.4nM) connue pour induire une élévation du taux d EAOs dans l hypothalamus 15min après son injection icv et pour inhiber la prise alimentaire pendant 24h (Jaillard et al. 2009) (Article I). Nos résultats montrent que l insuline injectée dans le 3 ème ventricule diminue significativement les capacités respiratoires maximales mitochondriales 15min après son injection (contrôle vs insuline : -60 ± 15%) (Figure 2A). L analyse pharmacologique plus fine de la respiration, réalisée ex-vivo et sur hypothalami perméabilisés (Benani et al., 2008), montre que l insuline (10min d exposition) diminue significativement l état 2 (contrôle vs insuline : glutamate : -36 ± 3% ; succinate : -36 ± 20%), l état 3 (contrôle vs insuline : glutamate : -44 ± 1% ; succinate : -56 ± 11%), et les capacités respiratoires maximales (glutamate : -41 ± 5%, succinate : -49 ± 10%), quelque soit le substrat (Figure 2B). In vivo et ex-vivo, l insuline ne modifie pas le couplage entre la consommation d oxygène et la synthèse d ATP (données non montrées). Nos résultats montrent donc que, dans l hypothalamus, l insuline inhibe la respiration mitochondriale en limitant l utilisation des substrats par les C I et II de la CRM. B A Figure 2 : L insuline inhibe la respiration mitochondriale dans l hypothalamus en limitant l utilisation des substrats par les C I et II de la CRM. (A) L insuline (2.4nM) injectée en icv diminue les capacités respiratoires maximales dans l hypothalamus, 15min après son injection. (B) Un traitement ex-vivo à l insuline (10min, 2.4nM) des hypothalami perméabilisés diminue tous les états de respiration, quelque soit le substrat. n = 5. Moyenne ± S.E.M. * p < 0.05, ** p < 0.01 vs contrôle. 110

124 L effet inhibiteur de l insuline sur la respiration dépend des EAOs. Les EAOs étant connues pour être de puissants inhibiteurs de l activité des complexes de la CRM (Zhang et al. 1990), nous avons émis l hypothèse selon laquelle les EAOs interviennent dans l effet inhibiteur de l insuline sur la respiration. 1) L utilisation ex-vivo d un anti-oxydant, le trolox (100µM, 10min d exposition) diminue significativement l utilisation du substrat du C I (glutamate : état 2 : contrôle vs trolox : -41 ± 9%) et augmente significativement celle du substrat du C II (succinate : état 3 : contrôle vs trolox: +74 ± 20%) (Figure 3). 2) Le trolox (pré-incubé avant l insuline) supprime l effet inhibiteur de l insuline (2.4nM) sur l utilisation des substrats des C I et II (glutamate et succinate : état 2 et 3 : trolox vs trolox + insuline : NS) (Figure 3). L ensemble de ces expériences montre que 1) la respiration mitochondriale est contrôlée par les EAOs et que 2) l effet inhibiteur de l insuline sur la respiration dépend des EAOs. Figure 3 : L effet inhibiteur de l insuline sur la respiration dépend des EAOs. Un pré-traitement ex-vivo des hypothalami perméabilisés avec un anti-oxydant (trolox 100µM, 10min), avant l ajout d insuline (2.4nM) supprime l effet inhibiteur de l insuline sur la respiration mitochondriale, quelque soit l état de respiration et le substrat. n = 5. Moyenne ± S.E.M. * p < 0.05, ** p < 0.01 vs contrôle. NS : non significatif. 111

125 L effet inhibiteur de l insuline sur la respiration dépend des EAOs dérivées de la NOX. Nous avons ensuite testé, ex-vivo, l implication des EAOs dérivées de la NOX dans l effet inhibiteur de l insuline sur la respiration, en utilisant un inhibiteur de son activité. 1) L apocynin (10µM, 10min d exposition) diminue significativement l utilisation du substrat du C I (glutamate : état 2 : contrôle vs apocynin : -34± 8%) (Figure 4). 2) L apocynin (pré-incubé avant l insuline) supprime l effet inhibiteur de l insuline (2.4nM) sur l utilisation des substrats par les C I et II (glutamate et succinate : état 2 et 3 : apocynin vs apocynin + insuline : NS) (Figure 4). Ces résultats montrent que 1) l utilisation du substrat du C I de la CRM est contrôlée par les EAOs dérivées de l activité de la NOX et que 2) l effet inhibiteur de l insuline sur la respiration dépend des EAOs dérivées de la NOX. Figure 4 : L effet inhibiteur de l insuline sur la respiration dépend des EAOs dérivées de la NOX Un prétraitement ex-vivo des hypothalami perméabilisés avec un inhibiteur de la NOX (apocynin 10µM, 10min), avant l ajout d insuline (2.4nM) supprime l effet inhibiteur de l insuline sur la respiration mitochondriale, quelque soit l état de respiration et le substrat. n = 5. Moyenne ± S.E.M. * p < 0.05, ** p < 0.01 vs contrôle. NS : non significatif. 112

126 L effet inhibiteur de l insuline sur la respiration dépend des EAOs mitochondriales. L activité de la CRM représentant 80% de la production basale d EAOs de la cellule, nous avons testé si les EAOs mitochondriales intervenaient également dans l effet inhibiteur de l insuline sur la respiration. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé un agent découplant, le CCCP qui altère les capacités de production des EAOs par la CRM. 1) Le CCCP (1µM, 10min d exposition) diminue effectivement le couplage (contrôle vs CCCP : glutamate: 1.9 ± 0.2 vs 1.2 ± 0.0, p<0.01 ; succinate: 2.9 ± 0.2 vs 1.1 ± 0.0, p<0.001) (données non montrées). De plus, le CCCP augmente significativement l utilisation du substrat du C II (succinate : contrôle vs CCCP : état 2 : +132 ± 21% ; état 3 : +48± 12%) (Figure 5). 2) Le CCCP (pré-incubation avant l insuline) supprime l effet inhibiteur de l insuline (2.4nM) sur l utilisation des substrats des C I et II (glutamate et succinate : état 2 et 3 : CCCP vs CCCP + insuline : NS) (Figure 5). Ces résultats montrent que l effet inhibiteur de l insuline sur la respiration dépend des EAOs mitochondriales. Figure 5 : L effet inhibiteur de l insuline sur la respiration dépend des EAOs mitochondriales Un prétraitement ex-vivo des hypothalami perméabilisés avec un agent découplant (CCCP, 1µM, 10min), avant l ajout d insuline (2.4nM) supprime l effet inhibiteur de l insuline sur la respiration mitochondriale, quelque soit l état de respiration et le substrat. n = 5. Moyenne ± S.E.M. * p < 0.05, ** p < 0.01 vs contrôle. NS : non significatif. 113

127 Une altération de la «signalisation EAOs» de l insuline est associée à une perte de l effet inhibiteur de l insuline sur la respiration. Afin de valider la relevance physiologique de l implication des EAOs dans le contrôle de la respiration par l insuline, nous avons choisi une situation nutritionnelle (trois jours de régime riche en gras, HFD) connue pour altérer la «signalisation EAOs» mise en jeu par l insuline dans l hypothalamus (Jaillard et al. 2009) (Article I). L analyse pharmacologique ex-vivo de la respiration mitochondriale d hypothalami de souris HFD, révèle que : 1) L utilisation du substrat du C I est significativement diminuée (glutamate : contrôle STD vs contrôle HFD: état 2 : -47 ± 3% ; état 3 : -53 ± 2%) et celle du substrat du C II est significativement augmentée (succinate : contrôle STD vs contrôle HFD : état 2 : +89 ± 17%) (Figure 6). 2) Dans ces conditions, l effet inhibiteur de l insuline (2.4nM) sur l utilisation des substrats par les C I et II est supprimé (glutamate et succinate : HFD : contrôle vs insuline : état 2 et 3 : NS) (Figure 6). Ces résultats montrent donc que trois jours de régime HFD induisent dans l hypothalamus, 1) une altération de la respiration mitochondriale, 2) associée à une perte de l effet inhibiteur de l insuline sur la respiration. Figure 6 : Une altération de la signalisation EAOs de l insuline est associée à une perte de l effet inhibiteur de l insuline sur la respiration. Un régime riche en gras (HFD) pendant 3 jours supprime l effet inhibiteur de l insuline (2.4nM) sur la respiration mitochondriale de souris nourries avec un régime standard (STD), quelque soit l état de respiration et le substrat. n = 5. Moyenne ± S.E.M. * p < 0.05, ** p <0.01 vs contrôle. NS : non significatif. 114

128 Le niveau de prise alimentaire dépend de la quantité d EAOs et de l activité de la CRM, qui sont elles-mêmes dépendantes l une de l autre. L analyse de l ensemble des résultats obtenus dans cette étude et dans le premier article (Jaillard et al. 2009), en prenant en compte les différents traitements pharmacologiques utilisés (vehicules, trolox, apocynin, CCCP, ± insuline, STD ou HFD), montre que : 1) Le niveau de prise alimentaire est inversement corrélé à la quantité hypothalamique d'eaos (Pearson r=-0.902, R square=0.814, p<0.001) (Figure 7A) et au ratio de l état 2 glutamate sur l état 2 succinate (ratio G/S) (Pearson r=-0.675, R square=0.456, p<0.05) (Figure 7B), et positivement corrélé à l état 2 succinate (Pearson r=0.641, R square=0.412, p<0.05) (Figure 7D). 2) Le niveau d'eaos est positivement corrélé au ratio G/S (Pearson r=0.647, R square=0.419, p<0.05) (Figure 7C). On peut donc en déduire que 1) le niveau de prise alimentaire dépend de la quantité d EAOs et de l activité de la CRM au niveau hypothalamique, et 2) la quantité d EAOs dépend de l activité de la CRM. A C B D Figure 7 : Le niveau de prise alimentaire dépend de la quantité d EAOs et de l activité de la CRM, qui sont elles-mêmes dépendantes l une de l autre. Le niveau de prise alimentaire est inversement corrélé à la quantité hypothalamique d'eaos (A) et au ratio de l état 2 glutamate sur l état 2 succinate (ratio G/S) (B), et positivement corrélé à l état 2 succinate (D). La quantité d'eaos est positivement corrélé au ratio G/S (C). n = Moyenne ± S.E.M. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p <

129 DISCUSSION Dans cette étude, nous démontrons l implication de la CRM dans l effet anorexigène de l insuline. Nous proposons que les EAOs dérivées de la NOX et de la CRM permettent à l insuline d inhiber la respiration mitochondriale et d élever la quantité hypothalamique d EAOs, conduisant ainsi à l inhibition de la prise alimentaire. Nous montrons que l inhibition de la respiration mitochondriale induite par l insuline dépend des EAOs. Les oxydants : O.- 2 (précurseur d H 2 O 2 ), H 2 O 2,. OH (dérivé de H 2 O 2 ou de la réaction entre O.- 2 et NO. ), NO., et ONOO - (O NO. ) peuvent effectivement inhiber l activité des complexes de la CRM (Zhang et al. 1990, Brookes et al. 1998, Carreras & Poderoso 2007). Dans le muscle, la production de NO. par la NOS mitochondriale de type neuronal lors de son activation via la voie de la PI3K permet à l insuline d inhiber la respiration mitochondriale (Finocchietto et al. 2008). Les auteurs ont proposé qu ONOO -, formé à partir de la réaction entre le NO. et O.- 2, puisse également participer à cette action de l insuline. Dans les cellules de l hypothalamus, l insuline peut stimuler la production de NO. via la voie de la PI3K (Canabal et al. 2007) et nous montrons que les EAOs produites en condition basale par les activités conjointes de la NOX et de la CRM, génératrices d O.- 2, sont nécessaires pour que l insuline inhibe la respiration. De fait, dans l hypothalamus, l activité basale de la NOX et de la CRM permettrait de maintenir un niveau suffisant d O.- 2, nécessaire à la formation d ONOO - à partir de la production de NO. induite par l insuline, permettant ainsi l inhibition de la respiration mitochondriale. De plus, dans les tissus périphériques, l activation de la NOX par l insuline est une étape cruciale pour que l hormone 1) élève le niveau d EAOs, 2) transmette intégralement son signal et 3) exerce ses effets physiologiques (Goldstein et al. 2005a, Bashan et al. 2009). Dans l hypothalamus, nos deux études (Jaillard et al et ce travail) montrent que l activité de la NOX est également indispensable pour que l insuline 1) élève le niveau d EAOs, 2) inhibe la respiration mitochondriale et 3) inhibe la prise alimentaire. Par conséquent, l activation hypothalamique de la NOX induite par l insuline pourrait permettre d augmenter la production d O.- 2, et consécutivement celle d ONOO -, ce qui amplifierait l inhibition de la respiration. De plus, il a été démontré que l inhibition de la respiration via le NO. ou ONOO -.- entraîne une production d O 2 d origine mitochondriale (Carreras & Poderoso 2007). Ainsi, l inhibition de la respiration induite par l insuline pourrait s auto-amplifier via la production 116

130 d EAOs mitochondriales. Notons que la quasi-totalité des EAOs de la cellule (80%) étant générée par la CRM, notamment dans le cerveau où la mitochondrie est la principale source d énergie de la cellule, il est fortement probable que les EAOs dérivées de l activité de la NOX servent principalement à contrôler la production d EAOs mitochondriales. De fait, ce serait majoritairement les EAOs d origine mitochondriale qui participeraient à l élévation du niveau d EAOs induite par l insuline. Cette hypothèse est renforcée par nos résultats qui montrent que la quantité hypothalamique d EAOs dépend de l activité de la CRM. L ensemble de ces données suggère donc que l inhibition de la respiration induite par l insuline dans l hypothalamus résulte vraisemblablement d effets combinés des oxydants générés par la NOX, la CRM, et la NOS. D autre part, nous montrons que 1) l insuline inhibe la respiration mitochondriale dans l hypothalamus en limitant l utilisation du substrat du C II de la CRM et que 2) le niveau de prise alimentaire est étroitement corrélé à l utilisation de ce substrat. In vivo, le substrat du C II, le FADH 2, est issu principalement de l oxydation mitochondriale des acides gras. Dans l hypothalamus, la régulation du métabolisme mitochondrial est un mécanisme indispensable aux effets des hormones anorexigène (leptine) et orexigène (ghréline). En effet, l inhibition de la prise alimentaire induite par la leptine dépend de l accumulation du taux cytosolique en acides gras, via l inhibition de leur entrée dans la mitochondrie (Gao et al. 2007). A l inverse, la stimulation de la prise alimentaire induite par la ghréline dépend de la diminution du taux cytosolique en acides gras, via la stimulation de leur entrée dans la mitochondrie (Andrews et al. 2008). Ainsi, par leur action sur le métabolisme mitochondrial, les hormones (leptine et ghréline) peuvent réguler de manière appropriée la prise alimentaire. Les effets hypothalamiques de la leptine sur les voies de signalisation, sur l activité électrique neuronale, l expression des gènes du NPY et de POMC, la prise alimentaire et les dépenses énergétiques sont similaires à ceux de l insuline (Plum et al. 2006a). L existence de cette très forte synergie d action entre la leptine et l insuline dans l hypothalamus suggère fortement que l insuline puisse, comme la leptine, entraîner une accumulation des acides gras dans le cytoplasme, notamment via l inhibition de la respiration mitochondriale, menant ainsi à l inhibition de la prise alimentaire. Par ailleurs, nous montrons que, dans l hypothalamus, l insuline inhibe l utilisation du substrat du C I de la CRM. Le C I prend en charge les électrons et les protons du NADH,H +, issus majoritairement de l oxydation mitochondriale du glucose. Récemment, il a été montré, 117

131 dans le muscle, que l inhibition de la respiration mitochondriale induite par l insuline via le NO. permet de rediriger les flux de substrats en faveur du stockage du glucose (Finocchietto et al. 2008). Dans le cerveau, un stockage du glucose sous forme de glycogène a lieu dans les astrocytes et peut être stimulé par l insuline (Dringen & Hamprecht 1992). De plus, dans ces cellules, le NO. peut moduler la respiration mitochondriale en inhibant de façon réversible la cytochrome c oxydase (complexe IV de la CRM) (Bolanos & Almeida 2006). Il est donc tout à fait concevable de proposer que l effet inhibiteur de l insuline sur l utilisation du NADH,H + par le C I de la CRM permette le stockage astrocytaire du glucose au niveau hypothalamique (Erol 2008). En périphérie, le rôle fondamental de l insuline est de maintenir une normoglycémie en favorisant l utilisation et le stockage du glucose par les tissus insulinosensibles (Combettes-Souverain & Issad 1998). Nos résultats suggèrent donc qu au niveau du système nerveux central, l insuline constituerait, comme en périphérie, un facteur régulateur du métabolisme cellulaire du glucose, bien que cette action de l insuline ne soit pas considérée comme sa principale fonction cérébrale (Gerozissis 2003). Nous rapportons qu en condition basale les EAOs, notamment H 2 O 2, stimulent l utilisation du substrat du C I, NADH,H +, issu majoritairement du métabolisme du glucose, et inhibent celle du substrat du C II, FADH 2, issu majoritairement du métabolisme des acides gras. Il a été proposé que H 2 O 2 puisse effectivement avoir des effets opposés sur les voies de métabolisation du glucose et des acides gras (Hurd et al. 2007). Ainsi, par inhibition de la PDHK (pyruvate deshydrogénase kinase), H 2 O 2 stimule la pyruvate déshydrogénase (PDH), ce qui favoriserait la production de NADH,H +, et ainsi son utilisation par le C I. A l inverse, l inhibition d enzymes impliquées dans la β-oxydation limiterait la production de FADH 2, et ainsi son utilisation par le C II. De plus, dans le cerveau, ONOO - peut stimuler l utilisation du substrat du C I et inhiber celle du substrat du C II (Brookes et al. 1998). Ces actions des oxydants sont valables à concentration faible ou modérée, tandis qu à forte concentration ils deviennent inhibiteurs sur l activité des complexes de la CRM (Brookes et al. 1998, Zhang et al. 1990). Nos résultats renforcent donc l idée qu en condition basale, l action des oxydants favoriserait l utilisation des glucides au détriment des lipides. Cette hypothèse est d autant plus pertinente que le glucose est la source énergétique principale du cerveau. Ainsi, le niveau basal d EAOs conditionnerait la source énergétique à utiliser par les cellules cérébrales. En condition stimulée par l insuline, la modulation du taux hypothalamique d EAOs permettrait de contrôler le devenir des substrats énergétiques. L ensemble de ces résultats suggère donc que l action de l insuline sur la respiration mitochondriale dans l hypothalamus permet de réguler le métabolisme énergétique à la fois à 118

132 l échelle de l organisme (prise alimentaire) et de la cellule (possibilité de stockage). Nous proposons que cette double action de l insuline ait lieu préférentiellement dans les neurones pour la régulation de la prise alimentaire et dans les astrocytes pour la régulation des réserves énergétiques. En conclusion, dans cette étude, nous décrivons un nouveau mécanisme intracellulaire complexe impliqué dans le contrôle de la prise alimentaire par l hypothalamus. A partir de l ensemble de nos résultats, nous proposons que le contrôle de la respiration mitochondriale par les EAOs dérivées des activités conjointes de la NOX et de la CRM permet de maintenir l homéostasie hypothalamique en EAOs, et ainsi, un niveau standard de prise alimentaire (Figure 8A). L intégrité de ce mécanisme serait nécessaire à l insuline pour élever le niveau d EAOs et inhiber la respiration mitochondriale, et ainsi inhiber la prise alimentaire (Figure 8B). Lors d une ingestion excessive d énergie (régime HFD), la dérégulation de ce mécanisme complexe pourrait expliquer la perte des effets hypothalamiques de l insuline observés, notamment sur la production d EAOs, l inhibition de la respiration et de la prise alimentaire. Figure 8 : Mécanisme potentiel du contrôle redox de la prise alimentaire en condition basale (A) et en condition stimulée par l insuline (B). RI (récepteur à l insuline), AGL (acides gras libres). 119

133 CONCLUSIONS & PERSPECTIVES 120

134 121

135 Depuis quelques années, le rôle clé des EAOs dans le contrôle nerveux de la balance énergétique et dans la signalisation périphérique et centrale de l insuline commence à émerger. Cependant, leur implication dans l effet anorexigène de l insuline restait à déterminer. Nos résultats montrent que les EAOs font partie intégrante de la signalisation hypothalamique de l insuline et sont indispensables à la régulation de la prise alimentaire par cette hormone. Dans un premier temps (Résultats & Dicussion, Partie I), nous avons montré qu une élévation de la quantité hypothalamique d EAOs et que l activité de la NADPH oxydase (NOX), génératrice d EAOs, sont toutes deux nécessaires à l action anorexigène de l insuline. Par analogie avec les effets périphériques de l insuline, nous avons proposé que l activation de la NOX induite par l insuline contribue à l élévation hypothalamique du niveau d EAOs. Dans un second temps (Résultats & Dicussion, Partie II), nous avons montré que l activité de la chaîne respiratoire mitochondriale (CRM), également génératrice d EAOs, est aussi nécessaire à l action anorexigène de l insuline. D un point de vue mécanistique, nous montrons que l insuline inhibe l activité de la CRM via les EAOs, notamment celles produites par la NOX et la CRM. Sur la base de corrélations, nous suggérons que ce contrôle de l activité de la CRM est impliqué dans l action anorexigène de l insuline. Plusieurs perspectives s offrent pour la suite de notre étude. Nous allons présenter celles qui nous semblent les plus pertinentes. 1) Nous montrons que l insuline inhibe la respiration mitochondriale dans l hypothalamus. Nous suggérons que cette action hormonale puisse avoir les mêmes conséquences que celle de la leptine sur l accumulation des acides gras dans le cytosol, permettant ainsi l inhibition de la prise alimentaire (cf Résultats & Dicussion, Article II, Discussion). En condition stimulée par l insuline, le dosage des acides gras dans l hypothalamus, ainsi que celui des activités des principales enzymes impliquées dans la voie de signalisation de la leptine (AMPK, ACC, CPT1) permettrait de tester leur implication dans l action inhibtrice de l insuline sur la respiration mitochondriale. 122

136 2) Nous avons mis en évidence, à l aide d outils pharmacologiques, que la NOX est impliquée dans la signalisation redox de l insuline, sans pour autant en préciser la nature. En périphérie, la sous-unité Nox4 est indispensable aux effets physiologiques de l insuline. Par conséquent, l utilisation de souris invalidées ou surexprimant (par adénovirus ou sirna) la sous-unité Nox4 spécifiquement dans l hypothalamus permettrait de démontrer l implication de ce sous type de NOX dans l action centrale de l insuline. De plus, nous avons proposé à partir des nombreuses données de la littérature, que la NO synthase (NOS) pourrait jouer un rôle capital dans la sensibilité hypothalamique à l insuline, plus particulièrement dans l action inhibitrice de l insuline sur la respiration mitochondriale. L utilisation de souris nnos -/- ou enos -/-, d inhibiteurs des NOS, et de donneurs de NO. permettrait ainsi de déterminer le rôle joué par cette enzyme dans l action hypothalamique de l insuline. Si c est le cas, l implication de la voie de signalisation de la PI3K devra être explorée (cf Résultats & Dicussion, Article II, Discussion). 3) Dans notre étude, nous avons dosé dans un premier temps une seule sorte d EAOs, le peroxyde d hydrogène, H 2 O 2, dont l implication a été clairement démontrée dans la signalisation centrale et périphérique de l insuline (cf Introduction, IV.E). Cependant, les autres oxydants, comme O.- 2,. OH, NO., ou ONOO- sont également largement susceptibles d intervenir dans les effets hypothalamiques de l insuline, notamment sur la respiration mitochondriale (cf Article II, Discussion). Leur dosage spécifique permettrait de préciser lesquels d entre eux sont impliqués dans la signalisation de l insuline. Cette caractérisation est très importante car les oxydants, selon leur nature et leur concentration, peuvent entraîner l apparition d une résistance à l insuline (cf Introduction, IV). En effet, si à concentration physiologique les oxydants ont des effets bénéfiques en intervenant comme seconds messagers dans les voies de signalisation, de façon réversible (exemple du NO. dans la signalisation de l insuline), leur trop forte ou trop faible concentration peut altérer les voies de.- signalisation (l excès d O 2 ou le déficit en NO. sont impliqués dans la résistance à l insuline). La détermination de la nature des oxydants impliqués dans la signalisation de l insuline est par conséquent capitale pour développer des molécules thérapeutiques adaptées visant à améliorer la sensibilité à l insuline. 123

137 4) Nous avons mis en évidence un nouveau mécanisme intracellulaire impliqué dans la détection hypothalamique de l insuline en condition physiologique. Nous avons pu voir que l intégrité de ce mécanisme peut être très rapidement altérée par un déséquilibre alimentaire, notamment par trois jours de régime HFD. Etant donné l importance de ce mécanisme dans l action anorexigène de l insuline, et la rapidité avec laquelle l'hypothalamus devient résistant à l'insuline avant même l apparition de symptômes caractérisant les maladies métaboliques dites de surcharges, comme l obésité et le diabète de type 2 (Ono et al. 2008, Clegg et al. 2005), nous pensons que la dérégulation centrale de ce mécanisme pourrait contribuer au développement de ces pathologies. Il serait donc intéressant de déterminer si ce mécanisme est également dérégulé dans le cas de pathologiques installées, comme par exemple chez des souris obèses et diabétiques soumises à un régime HFD de longue durée ou chez des souris obèses ob/ob, ou diabétiques db/db. Si c est le cas, il serait alors très intéressant de comprendre qu elles sont les causes de la mise en place de ces dérégulations et d essayer de les contrer afin de réverser la résistance hypothalamique à l insuline. 5) Enfin, nos résultats soulèvent une question qui demeure depuis longtemps sans réponse franche: l insuline peut-elle agir sur le métabolisme cérébral du glucose, comme c est le cas en périphérie? D après les données de la littérature, l insuline n affecterait pas ou peu la capture neuronale du glucose via GLUT4 comme c est le cas en périphérie, mais influencerait plutôt le flux glycolytique et le stockage du glycogène dans les astrocytes (Gerozissis 2003). Cette action de l insuline pourrait résulter de l effet inhibiteur réversible du NO. sur la respiration mitochondriale (Bolanos & Almeida 2006, Erol 2008). Ainsi, l insuline permettrait d approvisionner les neurones en énergie (Erol 2008). En effet, les astrocytes peuvent dégrader les réserves de glycogène en lactate (Lam et al. 2005a, Pellerin et al. 2007), immédiatement ou de manière différée, selon les besoins (Kong et al. 2002). Les neurones sont capables de capturer le lactate et de le transformer en pyruvate, dont le catabolisme aboutit à la synthèse d ATP (Bouzier-Sore et al. 2002). Une dérégulation de cette action de l insuline pourrait être responsable de l apparition de pathologies nerveuses (Erol 2008). En effet, les processus de neuro-dégénérescence qui ont lieu dans la maladie d Alzheimer pourraient être dus à une altération de la signalisation centrale de l insuline, entraînant ainsi une réduction du métabolisme du glucose dans les astrocytes, et consécutivement un déficit d approvisionnement en énergie pour les neurones 124

138 (Erol 2008). En parallèle, l altération de la signalisation de l insuline entraînerait une dérégulation de l homéostasie cérébrale en oxydants, notamment une surproduction de NO. et de ONOO -, due à l activation de la NOS inductible. L excès d oxydants conduirait à la mise en place d une inflammation cérébrale. Le déficit en énergie et l inflammation sont deux paramètres délétères pour la survie neuronale. En cas d obésité et de diabète de type 2 induits par un régime HFD de longue durée, la résistance centrale aux effets de l insuline sur l activation de ses voies de signalisation et sur l inhibition de la prise alimentaire s accompagnent d une inflammation hypothalamique (Posey et al. 2009). Par conséquent, l altération de l effet de l insuline sur le métabolisme cérébral du glucose pourrait également intervenir dans le développement des pathologies métaboliques de surcharge. De fait, savoir si l insuline peut agir sur le métabolisme cérébral du glucose est fondamental. Nos résultats obtenus in vivo et ex-vivo montrent clairement que l insuline inhibe la respiration mitochondriale dans l hypothalamus, notamment en limitant l utilisation du substrat du complexe I de la chaîne respiratoire mitochondriale, issu majoritairement de l oxydation du glucose. La détermination du type cellulaire, astrocytes et/ou neurones, dans lequel l insuline inhibe la respiration mitochondriale permettrait d avancer dans la compréhension de l action métabolique de l insuline dans le système nerveux central. L ensemble de nos résultats de thèse apporte de nouvelles preuves de la conservation des voies de signalisation de l insuline entre la périphérie et le système nerveux central dont une partie semble avoir été adaptée à des fins spécifiques aux fonctions cérébrales, notamment la régulation de la prise alimentaire. 125

139 ANNEXES 126

140 127

141 I. MATERIEL ET METHODES A. FRACTIONNEMENT SUB-CELLULAIRE Une extraction des fractions cellulaires nécessite «de pooler» 4 hypothalami de souris. Les cerveaux sont prélevés et plongés dans du PBS-Hepes à 4 C sur de la glace. Les hypothalami sont récupérés et immergés pendant 15min dans du tampon A (TpA) (10mM Hepes, 10mM KCl, 240mM Sucrose, 0.5mM DTT, et un cocktail d inhibiteurs de protéases; ph 7.4). Ce tampon hypotonique rend les cellules plus faciles à lyser mécaniquement. Les hypothalami sont alors homogénéisés avec un Dounce muni d un piston de type B (20 passages) dans 60µl de TpA. L homogénat est ressuspendu dans 1ml de TpA. Dans le but d éliminer les gros débris, il est centrifugé rapidement avec une centrifugeuse de paillasse (2000g, 10s). 50µl du surnageant (S1) sont lysés dans 50µl de tampon B (TpB) (10mM hepes, 420mM NaCl, 0.5mM DTT, et un cocktail d inhibiteur de protéases, ph 7.4). Ce tampon hypertonique permet de lyser les membranes appartenant aux organelles intracellulaires (mitochondries, vésicules, noyau). L homogénat obtenu constitue l extrait total. S1 est alors centrifugé (30000g, 10min, 4 C). Le culot est éliminé. Le surnageant S2 est ultracentrifugé (100000g, 1h, 4 C). Le culot est resuspendu dans 65µl de TpB et constitue la fraction membranaire La pureté et l enrichissement de chaque fraction par les protéines qui lui sont propres a été déterminé par western-blot grâce aux anticorps dirigés contre les marqueurs cellulaires suivants : β5-intégrines, marqueur de la membrane plasmique (AB1926, Chemicon-Product) ; β-actine, marqueur cytosolique (ab1801, Abcam) ; lamines A et C, marqueurs nucléaires (ab 8984, Abcam) ; et OxPhos, marqueur mitochondrial (M 5604, Mitosciences). B. WESTERN BLOT Les protéines (30 µg par puits) sont séparées sur un gel SDS-PAGE 10% et transférées sur une membrane Hybond-P (Amersham). La membrane est plongée pendant 1h à température ambiante et sous agitation dans du lait en poudre écrémé 5% préparé dans du TBST (Tris-Buffered Saline Tween-20). Ceci permet de supprimer les sites d interactions non spécifiques entre la membrane et l anticorps. La membrane est incubée, toute la nuit à 4 C, en 128

142 présence d un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre la sous-unité α ou la sous-unité β du récepteur à l insuline (respectivement sc-710 ou sc-711, Santa Cruz Biotechnology). Les protéines sont détectées en utilisant un anticorps secondaire anti-lapin obtenu chez l âne, (Amersham NA934V) et doté d une activité peroxydase (Amersham), révélée à l aide d un kit d amplification chimioluminescente (Amersham). La quantification est réalisée sur chaque bande grâce au logiciel QuantyOne. Les valeurs obtenues sont exprimées en unité arbitraire et sont calculées à partir de l intensité de la bande (en niveau de gris) par rapport à leur surface (mm 2 ). Le logiciel Prism a été utilisé pour les différents calculs statistiques en utilisant le Test t de Student ou le Test U de Mann-Whitney lorsque les variances étaient significativement différentes. II. AUTRES ARTICLES Au cours de mon travail de thèse, j ai eu l occasion de participer aux travaux de thèse d Anne-Laure Colombani, de l équipe, et de Pascaline Aimé, en collaboration, notamment pour adapter et réaliser les techniques de fractionnement sub-cellulaire et de respiration mitochondriale que nous avons mises au point dans mon travail de thèse. Les résultats obtenus par Anne-Laure et Pascaline sont présentés dans les articles suivants (respectivement en révision dans Diabetes et soumission dans Journal of Endocrinologie). 129

143 Diabetes Page 36 of 70 Enhanced Hypothalamic Glucose Sensing In Obesity: Alteration of Redox Signaling Short title: Hypothalamic Redox Signaling In Obesity For Peer Review Only Anne-Laure Colombani 1, Lionel Carneiro 1, Alexandre Benani 1, Anne Galinier 1, Tristan Jaillard 1, Thibaut Duparc 1, Géraldine Offer 1, Anne Lorsignol 1, Christophe Magnan 2, Louis Casteilla 1, Luc Pénicaud 1, Corinne Leloup 1 1 Métabolisme, Plasticité et Mitochondrie, Unité Mixte de Recherche 5241, Centre National de la Recherche Scientifique, Université Paul Sabatier, Toulouse, France 2 Physiopathologie de la Nutrition, Unité Mixte de Recherche 7059, Centre National de la Recherche Scientifique, Université Denis Diderot, Paris, France Corresponding author: Corinne Leloup, Institut Fédératif Louis Bugnard BP UMR 5241 CNRS UPS Toulouse Cedex 4 Tel , Fax [email protected] or [email protected] 4626 words 1 Table 7 Figures 1

144 Page 37 of 70 Diabetes ABSTRACT Objective : Recent data demonstrate that glucose sensing in different tissues is initiated by an intracellular redox-signaling pathway in physiological conditions. However, relevance of such mechanism in metabolic disease is not known. The aim of the present study was to determine whether brain-glucose hypersensitivity present in obese Zücker rat is related to an For Peer Review Only alteration in redox signaling. Research design and Methods: Brain glucose sensing alteration was investigated in vivo through the evaluation of electrical activity in arcuate nucleus, changes in ROS level and hypothalamic glucose induced-insulin secretion. In basal conditions, modifications of redox state and mitochondrial function were assessed through oxidized glutathione, glutathione peroxidase, manganese superoxide dismutase, aconitase activities and mitochondrial respiration. Results : Hypothalamic hypersensitivity to glucose was characterized by enhanced electrical activity of the arcuate nucleus and increased insulin secretion at a low glucose concentration which does not produce such effect in normal rats. It was associated with 1) increased ROS level in response to this low glucose load, 2) constitutive oxidized environment coupled with lower antioxidant enzymes activity at both cellular and mitochondrial level, and 3) overexpression of several mitochondrial subunits of the respiratory chain coupled with a global dysfunction in mitochondrial activity. Moreover, pharmacological restoration of the glutathione hypothalamic redox state by reduced-glutathione infusion in the third ventricle fully reversed the cerebral hypersensitivity to glucose. Conclusions : Altogether, these data demonstrate that obese Zücker rats impaired hypothalamic regulation in terms of glucose sensing is linked to an abnormal redox signaling which originates from mitochondria dysfunction. 2

145 Diabetes Page 38 of 70 INTRODUCTION It is now well established that the brain has a critical role in regulating the energy needs of the body (1). Both carbohydrate and lipid stores are monitored by the brain using metabolic, hormonal and neural signals from the periphery (2; 3). These signals enter the brain and trigger neuroendocrine and autonomic responses that maintain energy homeostasis (4; 5). For Peer Review Only Among the metabolic signals, glucose has long been identified and the physiological relevance of hypothalamic gluco-responsive neurons has been directly demonstrated (6). The molecular mechanisms underlying glucose responsiveness of neurons in the hypothalamus exhibit -cell analogy involving GLUT2, glucokinase and K ATP channels (7-10). Recently, a novel signaling pathway involving mitochondrial Reactive Oxygen Species (mros) has been identified (11-13). Both pancreatic and hypothalamic studies pointed out mros as a necessary signal to initiate the response to glucose sensing, insulin secretion for instance. These studies suggest that a fine controlled mros production depending on mitochondrial activity might be considered as a master physiological messenger in metabolite sensitive cells. Obesity is a major health problem in western societies coupled with a high risk of developing insulin resistance. Rodent experimental models of obesity display impaired metabolic and hormonal brain sensing (14). Recent work has demonstrated that the alteration of the hypothalamic glucose sensing mechanism was sufficient to induce dramatic effects on energy balance, correlated to mitochondrial abnormalities (6; 15). The Zücker rat exhibits a strong obesity and an insulin-resistance with dramatic autonomic perturbations, i.e., modification of the sympatho-vagal balance (16; 17). This model is also characterized by cerebral hypersensitivity to glucose, which initiates an abnormal vagus-induced-insulin secretion (18; 19). In this study, we set out to determine the role of redox signaling in hypothalamic 3

146 Page 39 of 70 Diabetes hypersensitivity to glucose in this model of obesity. To that end, hypothalamic electrical activity has been characterized and shown to be correlated to aberrant mros level, redox state and mitochondrial activity. Finally, restoration of the redox state fully reversed the cerebral hypersensitivity to glucose. For Peer Review Only 4

147 Diabetes Page 40 of 70 RESEARCH DESIGN AND METHODS : Animals: Genetically obese (fa/fa) and lean (Fa/?) male Zücker rats (7 weeks old; Charles River) were housed in a controlled environment (12 h light/dark cycle, light on at 7:00 a.m., 22 C), fed ad libitum (Harlan, Gannat, France). Surgeries and experiments were performed under pentobarbital anesthesia (50 mg/kg, Centravet, Dinan, France) except when notified. All procedures involving rats were in accordance with the European Communities Council For Peer Review Only Directive (86/609/EEC) and were reviewed by a local committee. All experiments were carried out after a period of 3 hours fasting beginning at time of light on. Intracarotid (ic) injection of glucose towards the brain: a catheter was inserted into the carotid artery, pushed on 5 mm in the cranial direction. A bolus of 3 or 9 mg/kg glucose in 100 µl saline was injected towards the brain in 30s. Saline and glucose solutions were equiosmolar (300 mosm). Neuronal activity recordings : Multiunit recordings within arcuate were made using a monopolar platinum electrode (Phymep, Paris, France) as previously described (20). Rats were placed in a stereotaxic apparatus (David Kopf) and arcuate nucleus was targeted according to coordinates obtained from Paxinos stereotaxic atlas : -3.1 mm posterior to bregma, -8.7 mm under the brain surface and 0.4 from the midline). Action potentials were displayed and saved on a computer after initial amplification through a low-noise amplifier (BIO amplifier, AD Instrument, Rabalot, France). Data were digitized with digitizer PowerLab/4sp. Signals were amplified 10 5 and filtered at low and high frequency cut-off of 100 and 1000 Hz and monitored with computer program Chart 4. Baseline unit activity was recorded for 10 min before infusion of a compound. Multiunit recordings were made in response to a 100 µl intracarotid ipsilateral injection either of saline or glucose. Osmotic pump implantation (Figure 1) : Cannula (Plastics one, Phymep) was targeted to the third ventricle (2.6 mm posterior to the bregma and 10.0 mm below the dura). Four days later, 5

148 Page 41 of 70 Diabetes only rats which dipsogenic effects (angiotensin II, 60 pmol; 3 µl; Sigma-Aldrich, St Quentin Fallavier, France) were used for intra-cerebro-ventricular (i.c.v.) infusions. Four days later, the osmotic minipump (model 1003D, Alzet, Charles River, St germain sur l arbresle, France, 1 µl/h, 3 days), filled either with PBS-Hepes (5 mm) or with glutathione (1 mol/l) (21) (Sigma-Aldrich) was implanted under isoflurane gas anesthesia. Experiments were performed three days later. For Peer Review Only Mitochondrial extraction: Animals were killed by cervical dislocation. Brains were removed and immediately immersed in ice-cold PBS-Hepes (5 mm). Dissected tissue were immersed for 15 min in a buffer A (10 mm Hepes, 10 mm KCl, 240 mm sucrose, protease inhibitor cocktail tablet (complete Mini, Roche, Meylan, France)), and homogenized with a dounce homogenizer (7.5 µl/10 mg tissues of buffer A). The homogenate was re-suspended in 125 µl/10 mg tissues of buffer A and centrifuged (1000g, 10 min, 4 C). The supernatant was centrifuged (12000g, 10 min, 4 C). The remaining mitochondrial pellet was re-suspended either in 8.2 µl/10 mg tissues of B buffer (10 mm Hepes, 420 mm NaCl, 0.5 mm Dithiothreitol, protease inhibitor cocktail tablet) for Western blot analysis or in 16.5 µl/10 mg tissus of solution Mitomed R05 (0.5 mm EGTA, 60 mm K-Lactobionate, 20 mm Taurine, 10 mm KH 2 PO 4, 3 mm MgCl 2, 110 mm sucrose, 1 g/l free fatty acid BSA, 20 mm Hepes, ph=7.1) for O 2 consumption measurement. Immunoblotting analysis of respiratory chain complexes: Mitochondrial proteins (10µg) were separated on SDS-PAGE 15% for OXPHOS immunolabelling, using a cocktail of antibodies that recognizes respiratory chain complexes. After transfer onto a Hybond membrane (Amersham, GE Healthcare, Ramonville, France), blocking was achieved for 1h at room temperature in 5% nonfat milk prepared in Tris-buffered saline with tween 0.2%. Membranes were probed with 1/500 of mouse anti-oxphos (Mitosciences, Euromedex, Souffelweyersheim, France) overnight at 4 C. Specific bands of OXPHOS were detected by 6

149 Diabetes Page 42 of 70 using a goat anti-mouse peroxidase-conjugated secondary antibody (Amersham) revealed with a chemioluminescence kit (Amersham) and exposed to autoradiographic films. Immunolabelled bands were quantified from densitometry analysis. O 2 consumption measurement on mitochondria: Oxygen consumption was measured using a respirometer (Oxygraph-2k, Oroboros Intruments, Innsbruck, Austria) as previously described (22). Measurements were performed with stirring (750 rpm) in 2 ml of Mitomed For Peer Review Only R05 at 30 C. The medium was equilibrated with air for 30 min, and mitochondria (200 µg) were transferred into the respirometer glass chambers. Mitochondrial respiration was stimulated by successive addition of substrates 1, 5 and 20 mm glutamate to achieve the apparent state mm ADP was added to achieve the apparent state 3 respiration. 5 µm carboxy-atractylate (CAtr) was added to block ATP synthesis and achieve the apparent state 4 respiration. Finally, 1 µm Potassium cyanide (KCN) was added to obtain the nonmitochondrial O 2 consumption. Mitochondrial states 2, 3 and 4 were calculated by subtracting the non mitochondrial O 2 consumption from apparent states. The respiratory control ratio (RCR) was the ratio state 3/state 4. Uncoupled respiration was assessed using glutamate (20 mm), CAtr (5 µm) and palmitate (300 µm) stimulation. CCCP (0.4 µm), a chemical uncoupler, was used to measure the maximal respiration. Oxygen consumption was calculated using DataGraph software. Media were prepared according to the guide provided by Oroboros Intruments. Technical sheets are available as pdf files on their web site at ROS level measurement: one minute after glucose injection, rats were decapitated, brains quickly removed, hypothalami and thalami dissected on ice-cooled glass plate. Brain areas were immediately frozen in nitrogen liquid and stored at -80 C. ROS were assessed with the 2-7-dichlorofluorescein diacetate probe (23) (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) and 7

150 Page 43 of 70 Diabetes quantified in a Fluorescent Plate Reader at 535 nm under excitation at 490 nm using a microplate reader (Victor Wallac, Perkin Elmer, Courtaboeuf, France). Aconitase activity measurement: maximum aconitase activity measurement was performed using a protocol already described (24). The photochrome was measured at 525 nm using the UVIKON Spectrophotometer 922. Enzymatic and non enzymatic antioxidant : tissue pieces were homogenized in a lysis saline For Peer Review Only solution (3 mm EDTA, 150 mm KCl, ph=7.4). Homogenates (50 µl) mixed with 450 µl of 5% metaphosphoric acid were then centrifuged (1500g, 10 min, 4 C). Final supernatant was used for glutathione and antioxidant enzyme assays. Glutathione assay was performed by reverse-phase high-performance liquid chromatography (HPLC) as previously described (25). Total glutathione (GSx) was the sum of reduced glutathione (GSH) and two fold oxidized glutathione (GSSG) concentrations ([GSx] = [2 x GSSG] + [GSH]). We then calculated the redox state of glutathione as (GSSG/GSx) x 100. SOD activity (Mn SOD and Cu/Zn SOD) were assayed by using the inhibition of pyrogallol autoxidation (26). One enzymatic unit (e.u.) of SOD activity was defined as the amount of enzyme that inhibited pyrogallol autoxidation by 50%. GPx activity was measured using t-butylhydroperoxide as substrate (27). One e.u. of GPx activity corresponds to the oxidation of 1 mmol of NADPH/min. Mitochondrial quantification : Citrate synthase assay was measured according to the procedure of Srere (28), one e.u. of citrate synthase was equal to the reduction of 1 mmol of 5-5 -dithiobis-2-nitrobenzoic acid/min. Cytochrome oxidase activity: Fresh hypothalami were homogenized in cold buffer (0.25 M sucrose, 5 mm TES, ph=7.2) and cox activity measured as previously described (29). Protein assay: concentration of samples was determined using the DC protein assay kit (Biorad, Marnes la Coquette, France) according to the manufacturer's instructions. 8

151 Diabetes Page 44 of 70 Plasma glucose and insulin concentrations: plasma was isolated from the blood collected at the rat-tail vessels. Glucose and insulin were determined using a glucose analyzer (One touch II, USA) and an ultrasensitive ELISA kit (Eurobio, Paris, France) respectively. Statistical analysis: Results are presented as mean ± SEM. Comparisons between groups were carried out for each parameter using Prism 4.0 software (GraphPad Software). A two-ways analysis of variance (ANOVA) was first applied to detect For Peer Review Only interaction between genotype and treatment. When genotype did not produce any significant effect one-way ANOVA was then applied, otherwise groups were analyzed independently using Student s or Mann-Whitney s tests when appropriate. After one-way ANOVA, multiple comparisons of means were further computed with Newman-Keuls test. Both Bartlett s and Shapiro Wilk s tests were also applied to check equality in variance and normality of distribution respectively. For some parameters, non-parametric Kruskal-Wallis and Mann- Whitney s test were used when appropriate, i.e. heterogeneity of variances. For single comparison, i.e. lean vs. obese, Student s non-paired test was applied. Significant difference was noted *, **, or *** on the graphic representation when p value was < 0.05, 0.01, and 0.001, respectively. 9

152 Page 45 of 70 Diabetes RESULTS: Seven weeks-old obese Zücker rats were hyperinsulinaemic ( ± 2.68 vs ± 3.26 µu/ml) but normoglycemic (5.96 ± 0.07 vs ± 0.15 mm) (Table 1). Obese rats exhibit brain hypersensitivity to glucose. We first confirmed the cerebral hypersensitivity exhibited by obese rats in response to glucose. Thus, 9 mg/kg glucose injection into the carotid artery towards the brain caused a rapid and transient increase of For Peer Review Only plasma insulin (50 µu/ml) one minute after the carotid injection in lean and obese rats (Figure 2A) (18; 30). When a similar test was performed with a lower dose of glucose (3 mg/kg), insulin secretion did not occur in lean rats. By contrast, in obese Zücker rats, this lower dose of glucose was sufficient to produce a rapid and transient increase in plasma insulin concentration. Statistical analysis revealed interaction between genotype and treatment (two-ways ANOVA, p interaction =0.0023), therefore single comparison were done using Mann-Whitney s test. Amplitude and delay of this 3 mg/kg glucose-stimulated insulin secretion were similar to that observed with a glucose dose of 9 mg/kg in lean rats (p=0.5737), (Figure 2A). These results demonstrate that obese animals exhibit brain glucose hypersensitivity. This intracarotid glucose injection did not raise systemic glucose level at any time of the test (Figure 2B). Therefore, the insulin response is only due to cerebral glucose sensing and can not result from peripheral effects. Stimulation of multicellular hypothalamic electrical activity at the low glucose dose in obese rats. We previously showed that the activation of extra-cellular hypothalamic activity in arcuate nucleus in response to glucose was required to initiate insulin secretion in normal rats (12). Here we explored the effect of 3 mg/kg glucose on extra-cellular arcuate nucleus electrical activity in both phenotypes. Statistical analysis revealed interaction between genotype and treatment (two-ways ANOVA, p interaction =0.0243), therefore single comparison 10

153 Diabetes Page 46 of 70 were done using Student s test. The basal glycaemia at the time of recording was 5.91±0.33, 6.05±0.22, 5.89±0.26 and 5.90±0.59 mm for lean and obese NaCl-injected rats and lean and obese glucose 3 mg/kg-injected rats respectively. In lean rats, 3 mg/kg glucose induced a slight increase in arcuate electrical activity compared to saline injection (+ 33%, p<0.01). It also induced a significant increase in electrical events in obese animals when compared to saline injection (+ 71%, p<0.001) (Figure 3) which differ significantly from the one observed For Peer Review Only in lean rats injected with glucose (p<0.01). Moreover, in contrast to obese rats, glucose 3mg/kg induced-electrical activity was not associated with insulin secretion in lean rats. Obese rat exhibit hypothalamic ROS production in response to the low glucose load. We measured ROS level after saline or glucose injection. For this purpose, rats were injected through the carotid artery towards the brain with either the low dose of glucose or saline and killed one minute after the injection (time when insulin secretion occurred). ROS level was assessed in both hypothalamus and thalamus. Statistical analysis revealed global differences but no interaction between genotype and treatment (two-ways ANOVA, p interaction =0.4968), therefore multiple comparisons were done using post hoc Newman-Keuls test (p one-way anova=0.0125). Interestingly, basal constitutive ROS level, i.e. assessed after saline intracarotid injection, was similar in both genotypes (Figure 4). Glucose stimulation did not induce a significant change in hypothalamic ROS level in lean rats. However, ROS level was significantly increased (+ 37 %, p<0.05) in obese rats injected with 3 mg/kg glucose when compared either to obese animals injected with saline or to lean rats injected with the same glucose load (p<0.05, Figure 4). Thus, low glucose stimulation mediates an increase in ROS level only in obese rats. No such increase in ROS level was found in thalamus, suggesting a regional specificity for this response (Figure S1A). 11

154 Page 47 of 70 Diabetes Abnormal ROS signaling is correlated to an alteration in the hypothalamic redox state. ROS level results from the balance between ROS production and detoxification. We measured enzymatic and non enzymatic antioxidants in basal conditions (i.e. without glucose stimulation) and compared them using Student s unpaired test. The glutathione redox state, defined as GSSG/GSx ratio, as it is the major antioxidant that scavenges ROS, was 2-fold (p<0.001) more oxidized in the hypothalamus of obese rats (Figure 5A). Glutathione For Peer Review Only peroxidase activity was found significantly lower in the hypothalamus of obese rats (266.0±28.7 vs ±21.5 ; p<0.01 in lean vs. obese rats) (Figure 5B). Glutathione peroxidase activity did not vary in the thalamus (Figure S1B). The mitochondrial MnSOD activity was also decreased in obese rats (0.0102± vs ± e.u. /mg proteins ; p<0,01 in lean vs. obese rats) whereas extramitochondrial CuZnSOD was not statistically different between the two genotypes (Figure 5C, 5D). This strongly suggests a mitochondrial defect in antioxidant enzymes activity in hypothalamus of obese rats. This is reinforced by the activity of the aconitase, an enzyme of the Krebs s cycle sensitive to mros and thus revealing the intra-mitochondrial redox state (31). This activity was significantly decreased (- 39%; p<0.001) in the hypothalamus of obese Zücker rats (Figure 5E). Altogether, these results demonstrate that the hypothalamic redox state is lower in obese rats than in lean rats regardless of the intracellular compartment studied. Hypothalamic mitochondria exhibit increased activity in response to substrates. We explored the cytochrome c oxidase activity (cox, complex IV) which reflects the oxidative potential of the mitochondrial respiratory chain. Cox activity was significantly increased (+51%; p<0.01) in the hypothalamus of obese Zücker rats (Figure 6A), as assessed by Student s unpaired test. To get further insights into the hypothalamic mitochondrial function, oxygen consumption by electron transport chain was explored on isolated mitochondria 12

155 Diabetes Page 48 of 70 (Figure 6B). We performed titrations with glutamate (1, 5 and 20 mm) to determine the substrate-driven respiration. Repeated measures ANOVA was applied and revealed global difference between genotype (p=0.002) and glutamate dose (p=0.002). Therefore single comparisons were tested using Mann-Whitney s test. We highlighted a greater increase in the O 2 flux in response to glutamate in obese rats compared to the lean ones. This increase was significant for each dose of glutamate (1 mm: 2.54±1.03 vs. 6.34±2; 0.56 p<0.05; 5 mm: For Peer Review Only 4.70±1.54 vs ±2.30 p<0.05 and 20 mm: 7.81±1.38 vs ±5.57 p<0.05; O 2 flux in pmol/(s*mg) in lean vs. obese rats), revealing a hypersensitivity to this substrate at the level of the respiratory chain. State 3 (substrates/adp-driven) respiration was assessed with saturating ADP concentration. The O 2 flux 13.25±2.43 pmol/(s*mg) vs ±5.69 pmol/(s*mg) in lean and obese rats respectively was increase in obese rats (p<0.05). Carboxyatractylate (CAtr), an ATP-ADP exchange inhibitor, was then added in order to obtain the ADP-independent resting state 4 while respiration is only driven by substrates. State 4 was significantly enhanced in obese rats. Finally, the Respiratory Control Ratio (RCR=State 3/State 4) in the lean rats (1.50±0.52) was not significantly different from obese ones (1.50±0.19). The total respiratory capacity induced by carbonyl cyanide m- chlorophenylhydrazone (CCCP) was significantly increased in obese rats (36.43±1.00 pmol/(s*mg)) compared to the lean ones (28.80±2.44 pmol/(s*mg)) p<0.05, (Figure 6C). We next examined the uncoupling respiration. Stimulation of the uncoupling proteins with 300µM palmitate (Palm) did not reveal difference between lean (25.39±2.17 pmol/(s*mg)) and obese (27.83±3.86 pmol/(s*mg)) rats (Figure 6D). This result reveals no difference in uncoupling respiration. To conclude, these results indicate an increase in hypothalamic mitochondria activity at the complex I and IV, as revealed with glutamate assay and cox activity measurement. The increase in total respiratory capacity further supports these data. No difference was present regarding these parameters in the thalamus (Figure S1C, D, E). 13

156 Page 49 of 70 Diabetes The expression of the five complexes of the respiratory chain was examined. Both nuclear (30 kda subunit of complex II, core protein 2 subunit of complex III, and the alpha subunit of complex V) and mitochondrial (ND6 subunit of complex I and subunit 1 of complex IV) complexes encoded were quantified at the protein level by western blotting (Figure 6E). Statistical analysis reveals differences (Kruskal-Wallis, p=0.0001). The expression of the complex I, II, III and IV (cox) were increased in hypothalamic mitochondria from obese rats For Peer Review Only (+177%, 153%, 128% and 159%, respectively). Complex V expression (105% respectively) was unchanged (Figure 6F). These results indicate an increased quantity of most of complexes of the electron transport chain in the mitochondria of obese rats. These differences were not due to a change in mitochondrial number since citrate synthase activity was identical in both genotypes (p t.test = 0.164) (Figure 6G). Restoration of hypothalamic redox state normalizes the response to glucose load in obese rats. We decided to normalize the glutathione redox state in obese rats in order to test whether this could explain impaired ROS production stimulated by the low glucose load (3 mg/kg). Therefore, reduced glutathione (GSH) was intra-cerebro-ventricularly (i.c.v.) infused over 3 days using an osmotic mini-pump. Well-being of the animals (weight gain and food intake) was preserved during the infusion (Figure S2 A-B). HPLC analysis revealed that the GSH-chronic i.c.v. infusion was efficient to restore GSH redox state within hypothalami of obese rats (Figure 7A). By contrast, it did not reverse mitochondrial function as measured on glutamate titration by oxygraphy (Figure 7B). ROS level and pancreatic insulin secretion was measured after the intracarotid 3 mg/kg glucose injection in glutathione-infused obese rats. Obese glutathione-infused rats did not have anymore exacerbated ROS level in response to the low glucose load and exhibited a ROS level similar to that of normal rats (Figure 7C). Regarding the insulin response, it showed a full restoration of their sensitivity to glucose 14

157 Diabetes Page 50 of 70 since their insulin peak was completely abolished in response to 3 mg/kg glucose. This result indicates a master role of mros level in response to glucose, at least for the control of the nervous control of insulin secretion (Figure 7D). For Peer Review Only 15

158 Page 51 of 70 Diabetes DISCUSSION: It has recently been demonstrated that glucose sensing was triggered by an intracellular redox-signaling pathway in physiological conditions in pancreas and hypothalamus as well (11; 12). However, the relevance of such a mechanism in metabolic disease is not known. We hypothesized that an alteration in redox signaling in the brain could participate to metabolic diseases. To test this hypothesis, we explored the redox signaling in For Peer Review Only the Zücker rat. These rats are obese, insulin-resistant and dyslipidemic but normoglycemic. One original feature of this model is its hypothalamic hypersensitivity to glucose (18). We specifically aim to understand whether this hypersensitivity to glucose present in obese Zücker rats could be related to alteration in redox signaling. For the first time we revealed that this hypersensitivity was associated, within the hypothalamus, with (i) an increased ROS level in response to the low glucose load, (ii) a constitutive oxidized environment at both the cellular and the mitochondrial level, and (iii) an overexpression of several mitochondrial subunits of the respiratory chain coupled with a global dysfunction in the mitochondrial activity. Moreover pharmacological restoration of the hypothalamic redox state fully reversed the altered cerebral hypersensitivity to glucose. Altogether, these data suggest that this impaired metabolic regulation in obese Zücker rat is linked to an abnormal redox signaling which originates from mitochondria dysfunction. In normal animals, hypothalamic glucose sensing promotes an increase in the hypothalamic electrical activity and a rapid and transient vagal-mediated insulin secretion (12; 19). Moreover we previously demonstrated that a key step in these events requires redox signaling as they were abolished when mros were quenched (12). The hypersensitivity to glucose of obese Zücker rats has been demonstrated as an abnormal insulin response occurring after a low glucose load (3 mg/kg vs. 9 mg/kg) that is inefficient in lean littermates 16

159 Diabetes Page 52 of 70 (18). We confirmed this data regarding the peripheral insulin release and reinforced the notion of cerebral hypersensitivity to glucose in obese rats as assessed by the hypothalamic glucose-stimulated electrical activity. Indeed, we brought to light an increased level in the whole multi-cellular electrical activity in the arcuate nucleus of obese rats in response to 3 mg/kg glucose. Contrary to lean rats, this enhanced glucose-stimulated electrical activity was associated with the insulin response in obese rats. This suggests that the electrical activity of For Peer Review Only the arcuate nucleus in response to 3 mg/kg glucose was high enough to promote insulin secretion in obese rats. Electrical activity was recorded under pentobarbital anesthesia which has depressive effects on nervous activity (32), thus suggesting a much bigger effect on vigil rats. The multicellular recordings do not allow distinguishing between direct vs. presynaptic effects. However, numerous arcuate glucose sensitive neurons have the ability to detect directly a change in glucose concentration (33). This cerebral hypersensitivity to glucose may explain the elevated parasympathetic tone which consequently contributes to the development of hyperinsulinemia in obese Zücker rat (17; 34). In obese rats, there was a significant increase in ROS level within the hypothalamus under low glucose stimulation at the time when plasma insulin increases. ROS concentration results from the balance between production and scavenging. The later depends on the intracellular redox state (35; 36). The glutathione redox (ratio of the oxidized/total form) constitutes an accurate indicator of the cellular redox state because glutathione is in large amount in cells (1-5 mm) and considered as the major ROS detoxifying system (37). It has a pivotal and synergetic role with many other antioxidants by reducing pro-oxidant forms (36). In the hypothalamus of obese rats, glutathione was twofold more oxidized in basal conditions. Decreased GPx actvivity in hypothalamus from obese rats further confirmed that basal redox state was deeply modified in this area. In order to get insight into the oxidative 17

160 Page 53 of 70 Diabetes environment in the mitochondria, we evaluated MnSOD and aconitase activity. MnSOD and aconitase, an enzyme involved in the Krebs cycle and sensitive to ROS, are exclusively located in the mitochondria (31). Their activities were decreased in the hypothalamus of the obese Zücker rat. By contrast, Cu/ZnSOD located in the cytosol did not vary. Altogether, these data reveal a constitutive oxidative environment in the hypothalamus of obese Zücker rats whatever the intracellular compartment (cytosol or mitochondria). These results are in For Peer Review Only accordance with numerous studies showing a drop in the antioxidant defenses such as reduced glutathione, -tocopherol, and catalase in several tissues of obese Zücker rats (38; 39). Finally, the more oxidized cellular environment within hypothalamus of obese rats could partly explain why an increased ROS level in response to the low glucose load is not buffered as in lean rats. ROS are produced by electron leakage during mitochondrial metabolism, and the rate of their formation is enhanced as the mitochondrial metabolism increases (40-42). We thus explored the mitochondrial function in hypothalamus of Zücker rats. Both oxidative ability of the respiratory chain as determined by the cytochrome c oxidase activity, the total respiratory function as assessed with saturating substrate and the chemical uncoupling, were strongly increased in the hypothalamus of obese rats. Secondly, the apparent affinity of the mitochondrial respiration for substrate was higher in obese rats as assessed by glutamate titration. Thirdly, alteration of the expression of mitochondrial complexes (I to IV) was increased in obese rats. These results are consistent with previous studies showing an increased oxidative capacity in muscle of such rats associated with an increasing number of functional units in mitochondrial respiratory chain (43; 44). No change in mitochondrial number has been observed in the hypothalamus of obese rats as revealed by citrate synthase activity assay. Furthermore, it might be underlined that all these alterations are specific to 18

161 Diabetes Page 54 of 70 hypothalamus since no change was observed in the thalamus. Taken together with the absence of modification of complex V, the alterations seen between complexes I to IV may result in an enhancement in respiratory chain constraints (45). As an improved mitochondrial metabolism promotes ROS production under stimulation, this could represent the molecular basis of the abnormal increased ROS level within hypothalamus of obese rats in response to a low glucose load, in concert with the higher oxidized environment. One can speculate that the For Peer Review Only exceeding mitochondrial ROS production might be a primary and causal link to the overoxidation of the redox state. Recent observations from our laboratory and others (12; 15; 46) argue that ROS are part of hypothalamic activity control for the regulation of energy homeostasis. To date, ROS have been proposed as second messengers in brain glucose and lipid sensing (12; 46). For example, fasting abolished increased ROS in brain lipid sensing by increasing hypothalamic mitochondrial uncoupling (46); ghrelin signals are ROS dependently integrated in NPY/AgRP neurons (15). Moreover, this latest study suggests that ROS signaling takes place in the neuronal population, although other cell types remain to be explored. Here we show for the first time that dysfunction in the hypothalamic redox signaling could be the molecular basis of impaired brain glucose sensing, and might explain some features of the metabolic defects in obese rats such as hyperinsulinism. This has been strengthened by the experiment using a pharmacological approach (GSH treatment) which normalized the glutathione redox state. Indeed, such normalization reversed the increased ROS level as well as the peripheral insulin secretion in response to a low glucose load (3 mg/kg). These findings highlight the necessity of a fine and balanced level of ROS, dependant of the mitochondrial metabolism and the redox environment, which is required to trigger the appropriate redox signaling in response to glucose. 19

162 Page 55 of 70 Diabetes In summary, we demonstrated that the cerebral hypersensitivity to glucose in obese rats results from both impaired redox signaling and increased mitochondrial respiratory chain activity which lead to excessive ROS level. One can postulate that this increased ROS level activates redox signaling that involved ROS-sensitive voltage-dependant channels (47; 48). Changes in channel conformation will then modulate electrical activity that in turn triggers vagal mediated-insulin secretion. To define whether hypothalamic mitochondrial dysfunction For Peer Review Only is of primary importance in the etiology of the hyperinsulinism in obesity, long-term treatment aiming to normalize redox state would provide interesting clues. 20

163 Diabetes Page 56 of 70 ACKNOWLEDGMENTS: We fully acknowledge Jésus Garcia for his help in statistical analysis and the expertise of the Zootechnic department of IFR31 especially Christine Fourreau. This work was supported by grants from the Agence Nationale pour la Recherche (Nutrisens 05-PNRA-004) and from the Programme National de Recherche sur le Diabète (PNRD- 0602). For Peer Review Only 21

164 Page 57 of 70 Diabetes REFERENCES: 1. Levin BE: Metabolic sensing neurons and the control of energy homeostasis. Physiol Behav 89: , Sandoval D, Cota D, Seeley RJ: The integrative role of CNS fuel-sensing mechanisms in energy balance and glucose regulation. Annu Rev Physiol 70: , Goldstone AP: The hypothalamus, hormones, and hunger: alterations in human obesity and illness. Prog Brain Res 153:57-73, Schwartz MW, Porte D, Jr.: Diabetes, obesity, and the brain. Science 307: , Penicaud L, Leloup C, Fioramonti X, Lorsignol A, Benani A: Brain glucose sensing: a subtle mechanism. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 9: , Parton LE, Ye CP, Coppari R, Enriori PJ, Choi B, Zhang CY, Xu C, Vianna CR, Balthasar N, Lee CE, Elmquist JK, Cowley MA, Lowell BB: Glucose sensing by POMC neurons regulates glucose homeostasis and is impaired in obesity. Nature 449: , Yang XJ, Kow LM, Funabashi T, Mobbs CV: Hypothalamic glucose sensor: similarities to and differences from pancreatic beta-cell mechanisms. Diabetes 48: , Kang L, Routh VH, Kuzhikandathil EV, Gaspers LD, Levin BE: Physiological and molecular characteristics of rat hypothalamic ventromedial nucleus glucosensing neurons. Diabetes 53: , Leloup C, Arluison M, Lepetit N, Cartier N, Marfaing-Jallat P, Ferre P, Penicaud L: Glucose transporter 2 (GLUT 2): expression in specific brain nuclei. Brain Res 638: , Leloup C, Orosco M, Serradas P, Nicolaidis S, Penicaud L: Specific inhibition of GLUT2 in arcuate nucleus by antisense oligonucleotides suppresses nervous control of insulin secretion. Brain Res Mol Brain Res 57: , Pi J, Bai Y, Zhang Q, Wong V, Floering LM, Daniel K, Reece JM, Deeney JT, Andersen ME, Corkey BE, Collins S: Reactive oxygen species as a signal in glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes 56: , Leloup C, Magnan C, Benani A, Bonnet E, Alquier T, Offer G, Carriere A, Periquet A, Fernandez Y, Ktorza A, Casteilla L, Penicaud L: Mitochondrial reactive oxygen species are required for hypothalamic glucose sensing. Diabetes 55: , Leloup C, Tourrel-Cuzin C, Magnan C, Karaca M, Castel J, Carneiro L, Colombani AL, Ktorza A, Casteilla L, Penicaud L: Mitochondrial Reactive Oxygen Species Are Obligatory Signals For Glucose-Induced Insulin Secretion. Diabetes, Levin BE, Magnan C, Migrenne S, Chua SC, Jr., Dunn-Meynell AA: F-DIO obesityprone rat is insulin resistant before obesity onset. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 289:R , Andrews ZB, Liu ZW, Walllingford N, Erion DM, Borok E, Friedman JM, Tschop MH, Shanabrough M, Cline G, Shulman GI, Coppola A, Gao XB, Horvath TL, Diano S: UCP2 mediates ghrelin's action on NPY/AgRP neurons by lowering free radicals. Nature 454: , York DA, Marchington D, Holt SJ, Allars J: Regulation of sympathetic activity in lean and obese Zucker (fa/fa) rats. Am J Physiol 249:E , Penicaud L, Cousin B, Leloup C, Atef N, Casteilla L, Ktorza A: Changes in autonomic nervous system activity and consecutive hyperinsulinaemia: respective roles in the development of obesity in rodents. Diabetes Metab 22:15-24, Alquier T, Leloup C, Atef N, Fioramonti X, Lorsignol A, Penicaud L: Cerebral insulin increases brain response to glucose. J Neuroendocrinol 15:75-79, Atef N, Ktorza A, Penicaud L: CNS involvement in the glucose induced increase of islet blood flow in obese Zucker rats. Int J Obes Relat Metab Disord 19: , 1995 For Peer Review Only 22

165 Diabetes Page 58 of Wang R, Cruciani-Guglielmacci C, Migrenne S, Magnan C, Cotero VE, Routh VH: Effects of oleic acid on distinct populations of neurons in the hypothalamic arcuate nucleus are dependent on extracellular glucose levels. J Neurophysiol 95: , Anderson MF, Nilsson M, Eriksson PS, Sims NR: Glutathione monoethyl ester provides neuroprotection in a rat model of stroke. Neurosci Lett 354: , Benani A, Barquissau V, Carneiro L, Salin B, Colombani AL, Leloup C, Casteilla L, Rigoulet M, Penicaud L: Method for functional study of mitochondria in rat hypothalamus. J Neurosci Methods 178: , Szabados E, Fischer GM, Toth K, Csete B, Nemeti B, Trombitas K, Habon T, Endrei D, Sumegi B: Role of reactive oxygen species and poly-adp-ribose polymerase in the development of AZT-induced cardiomyopathy in rat. Free Radic Biol Med 26: , Zheng W, Ren S, Graziano JH: Manganese inhibits mitochondrial aconitase: a mechanism of manganese neurotoxicity. Brain Res 799: , Galinier A, Carriere A, Fernandez Y, Caspar-Bauguil S, Periquet B, Periquet A, Penicaud L, Casteilla L: Site specific changes of redox metabolism in adipose tissue of obese Zucker rats. FEBS Lett 580: , Marklund S, Marklund G: Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and a convenient assay for superoxide dismutase. Eur J Biochem 47: , Gunzler WA, Kremers H, Flohe L: An improved coupled test procedure for glutathione peroxidase (EC ) in blood. Z Klin Chem Klin Biochem 12: , Faloona GR, Srere PA: Escherichia coli citrate synthase. Purification and the effect of potassium on some properties. Biochemistry 8: , Prunet-Marcassus B, Moulin K, Carmona MC, Villarroya F, Penicaud L, Casteilla L: Inverse distribution of uncoupling proteins expression and oxidative capacity in mature adipocytes and stromal-vascular fractions of rat white and brown adipose tissues. FEBS Lett 464: , Guillod-Maximin E, Lorsignol A, Alquier T, Penicaud L: Acute intracarotid glucose injection towards the brain induces specific c-fos activation in hypothalamic nuclei: involvement of astrocytes in cerebral glucose-sensing in rats. J Neuroendocrinol 16: , Tretter L, Adam-Vizi V: Alpha-ketoglutarate dehydrogenase: a target and generator of oxidative stress. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 360: , Kitahara S, Yamashita M, Ikemoto Y: Effects of pentobarbital on purinergic P2X receptors of rat dorsal root ganglion neurons. Can J Physiol Pharmacol 81: , Fioramonti X, Lorsignol A, Taupignon A, Penicaud L: A new ATP-sensitive K+ channelindependent mechanism is involved in glucose-excited neurons of mouse arcuate nucleus. Diabetes 53: , Rohner-Jeanrenaud F, Hochstrasser AC, Jeanrenaud B: Hyperinsulinemia of preobese and obese fa/fa rats is partly vagus nerve mediated. Am J Physiol 244:E , Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MT, Mazur M, Telser J: Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol 39:44-84, Nordberg J, Arner ES: Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian thioredoxin system. Free Radic Biol Med 31: , Wu G, Fang YZ, Yang S, Lupton JR, Turner ND: Glutathione metabolism and its implications for health. J Nutr 134: , Soltys K, Dikdan G, Koneru B: Oxidative stress in fatty livers of obese Zucker rats: rapid amelioration and improved tolerance to warm ischemia with tocopherol. Hepatology 34:13-18, 2001 For Peer Review Only 23

166 Page 59 of 70 Diabetes 39. Poirier B, Lannaud-Bournoville M, Conti M, Bazin R, Michel O, Bariety J, Chevalier J, Myara I: Oxidative stress occurs in absence of hyperglycaemia and inflammation in the onset of kidney lesions in normotensive obese rats. Nephrol Dial Transplant 15: , Brownlee M: The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes 54: , Nishikawa T, Edelstein D, Du XL, Yamagishi S, Matsumura T, Kaneda Y, Yorek MA, Beebe D, Oates PJ, Hammes HP, Giardino I, Brownlee M: Normalizing mitochondrial superoxide production blocks three pathways of hyperglycaemic damage. Nature 404: , Yamagishi SI, Edelstein D, Du XL, Brownlee M: Hyperglycemia potentiates collageninduced platelet activation through mitochondrial superoxide overproduction. Diabetes 50: , Turner N, Bruce CR, Beale SM, Hoehn KL, So T, Rolph MS, Cooney GJ: Excess lipid availability increases mitochondrial fatty acid oxidative capacity in muscle: evidence against a role for reduced fatty acid oxidation in lipid-induced insulin resistance in rodents. Diabetes 56: , Bonnard C, Durand A, Peyrol S, Chanseaume E, Chauvin MA, Morio B, Vidal H, Rieusset J: Mitochondrial dysfunction results from oxidative stress in the skeletal muscle of diet-induced insulin-resistant mice. J Clin Invest 118: , Adam-Vizi V, Chinopoulos C: Bioenergetics and the formation of mitochondrial reactive oxygen species. Trends Pharmacol Sci 27: , Benani A, Troy S, Carmona MC, Fioramonti X, Lorsignol A, Leloup C, Casteilla L, Penicaud L: Role for mitochondrial reactive oxygen species in brain lipid sensing: redox regulation of food intake. Diabetes 56: , Hudasek K, Brown ST, Fearon IM: H2O2 regulates recombinant Ca2+ channel alpha1c subunits but does not mediate their sensitivity to acute hypoxia. Biochem Biophys Res Commun 318: , Avshalumov MV, Chen BT, Koos T, Tepper JM, Rice ME: Endogenous hydrogen peroxide regulates the excitability of midbrain dopamine neurons via ATP-sensitive potassium channels. J Neurosci 25: , 2005 For Peer Review Only 24

167 Diabetes Page 60 of 70 TABLE LEGEND Table 1 : Characteristics of Zücker rats. Basal values of body weight, insulinemia and glycemia are expressed as mean ± SEM (7 weeks-aged rats). Significant differences according to the student s unpaired t test (n=7) compared to lean littermates: ***, p< FIGURE LEGENDS Figure 1 Schematic representation of experimental procedure for reduced glutathione infusion (GSH-EE, reduced glutathione ethyl ester). For Peer Review Only Figure 2 : Hypothalamic hypersensitivity to glucose in the obese Zücker rat: A - Insulin secretion in response to glucose. Plasma insulin in obese and lean rats in response to saline (dotted line), 3 mg/kg (G3- dash line) or 9 mg/kg (G9- black line) glucose injection towards the brain. Results are expressed as mean + SEM (delta from basal insulinemia at t=0). Asterisk indicates significant differences according to independent statistical analysis using Mann-Whitney s test at t = 1 min, n=6-9 per genotype (*, p<0.05; ***, p<0.001). B No change in glycemia during the glucose sensing test. Glycemia in response to saline (dotted line), 3 mg/kg (G3- dash line) or 9 mg/kg (G9- black line) glucose injection towards the brain. Results are expressed as mean + SEM (delta from basal glycemia at t=0). No significant difference was detected using to two-ways ANOVA analysis at t = 1 min, n=6-9 per genotype. Figure 3 : Increased hypothalamic electrical activity in response to the low glucose dose. A - Multiunit sample recordings of arcuate nucleus neuronal activity in lean and obese Zücker rats after the carotid injection of saline (Nacl), or glucose 3mg/kg (G3). B - Quantification of multiunit activity recorded in arcuate nucleus. Data are expressed as the mean + SEM corresponding to the % of the spikes number measured in lean rats injected with saline. The histogram depicts the electrical activity during the first minute following carotid injection of saline (NaCl) or glucose 3 mg/kg (G3) in lean (white bar) and in obese rats (black bar). Asterisks indicate significant differences according to the Student s unpaired test after checking equality of variances, n=6 per genotype (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0,0001). Figure 4 : Hypothalamic ROS production of obese rats in response to the low glucose load. ROS production in the hypothalamus in response to saline (NaCl) or to 3mg/kg (G3) glucose injection towards the brain measured in lean (white bar) and in obese rats (black bar). ROS level assessed in hypothalamic area by oxidation of DCFDA probe one minute after intracarotid injection. Data were expressed as the mean + SEM (% of the ROS fluorescence observed in obese rats injected with saline). Asterisk indicates significant differences according to the post hoc Newman-Keul s test, n=8-11 per genotype (*, p<0.05). DCFDA, dichlorofluorescein diacetate. Figure 5 : Increased ROS production is linked to abnormal hypothalamic redox state: A - Obese rats display an abnormal hypothalamic glutathione redox state. GSH and GSSG levels measured by HPLC in hypothalamic homogenates of lean (white bar) and obese rats (black bar). The redox state of glutathione was calculated as the (GSSG/GSx) x100. Asterisk indicates significant difference according to the student s unpaired test, n=6 per genotype 25

168 Page 61 of 70 Diabetes (***, p<0.001). B - Obese rats present a decreased in Glutathione Peroxidase activity. Glutathione Peroxidase (GPx) activity measured in the hypothalamus of lean (white bar) and obese (black bar) rats (e.u. enzymatic units). Asterisk indicates significant difference according to the student s unpaired test, n=6 per genotype (**, p<0.01). C - Obese rats present no difference in extramitochondrial Cu/Zn SOD activity. Superoxide dismutase (SOD) activity measured in the hypothalamus of lean (white bar) and obese (black bar) rats (e.u. enzymatic units). No difference according to the student s unpaired test, n=6 per genotype was present. D - Obese rats present a decreased in mitochondrial MnSOD activity. Mitochondrial manganese superoxide dismutase (Mn SOD) activity measured in the hypothalamus of lean (white bar) and obese (black bar) rats (e.u. enzymatic units). Asterisk indicates significant difference according to the student s unpaired test, n=6 per genotype (*, p<0.05). E - Obese rats show a decreased activity of the ROS sensitive mitochondrial aconitase. Maximal aconitase activity measured in the hypothalamus of lean (white bar) and obese (black bar) rats (e.u. enzymatic units). Asterisk indicates significant difference according to the student s unpaired test, n=6 per genotype (***, p<0.001). For Peer Review Only Figure 6 : Functional study of hypothalamic mitochondria. A - Obese rats exhibit an increased oxidative potential of the respiratory chain. Maximal cytochrome c oxidase activity in hypothalamic homogenates in basal conditions was significantly increased in obese. Data were expressed as the mean + SEM corresponding to the % of cox activity in lean rats. Asterisk indicates significant difference according to the student s unpaired test, n=9-10 per genotype (**, p<0.01). B - Obese rats mitochondria display a hypersensitivity to glutamate. Pharmacological settings for oxygraphic analysis on isolated hypothalamic mitochondria: glutamate titration (1, 5, 20 mm) to achieve the non-phosphorylating respiration; saturating Adenosine diphosphate (ADP) concentration to achieve state 3 respiration; full inhibition of ATP-synthase by Carboxy-Artractylate (CAtr) gives state 4 respiration. Single comparisons were performed using unpaired Student s test to compare lean vs. obese. Asterisk indicates significant difference (*, p<0.05). C- Obese rats mitochondria exhibit an enhanced maximal respiration capacity. Maximal respiration induced by CCCP (0.4 µm). Asterisk indicates significant difference according to the Mann- Whitney s test, n=6-8 per genotype (*, p<0.05). C- Obese rats mitochondria exhibit no uncoupling respiration. Uncoupling protein activation induced by palmitate (Palm) (300 µm). No difference according to the student s unpaired test (n=6 per genotype) was present. E - F - Overexpression of respiratory chain complexes I to IV in hypothalamic mitochondria of obese rats. Western blot performed on isolated hypothalamic mitochondria. Immunoblots were quantified by densitometry analysis. Asterisk indicates significant differences according to the Mann-Whitney s test, n=6-8 per genotype (**, p<0.01 ; ***, p<0.001). G - No difference in mitochondrial content. Mitochondrial content assessed by citrate synthase activity in the hypothalamus of lean (white bar) and obese (black bar) rats (e.u. enzymatic units). No difference according to the student s unpaired t test (n=6 per genotype) was present. Figure 7 : Hypothalamic redox state after 3 days of i.c.v. GSH infusion in obese rats normalizes the response to the low glucose load. A - Normalization of the hypothalamic redox state. GSH and GSSG levels measured by HPLC in hypothalamic homogenates. The redox state of glutathione was calculated as (GSSG/GSx)x100. Results are expressed as mean + SEM of the glutathione redox state. Asterisk indicates significant difference according to the Student s unpaired test, n=5-6 per genotype (***, p<0.001) compared to obese group. B No change in hypothalamic mitochondrial hypersensitivity to glutamate in obese glutathione restored rats. 26

169 Diabetes Page 62 of 70 Glutamate titration (1, 5, 20 mm) in obese GSH-restored rats (gray bar) did not differ from the vehicle treated obese rats (black bar). No significant difference present according to the repeated measures ANOVA analysis (n=4-6); p anova = 0,1576. C - Normalization of hypothalamic ROS production. ROS production measured in obese rats after either vehicle i.c.v. infusion and saline carotid injection (ob NaCl, black bar n=2), vehicle i.c.v. infusion and glucose 3mg/kg carotid injection (ob G3, dotted black bar n=2), or GSH i.c.v. infusion and glucose 3mg/kg carotid injection (ob GSH G3, dotted gray bar n=7). ROS level was carried out on hypothalamic homogenates with the DCFDA probe one minute after carotid injection. Data are expressed as the mean + SEM of the % of ROS fluorescence of the obese rats receiving the vehicle i.c.v. and saline carotid injection. Asterisk indicates significant differences according to the Newman-Keuls s test, n=5-6 per genotype, compared to obese G3 group (*, p<0.05; **, p<0.01). DCFDA, dichlorofluorescein diacetate. D - Normalization of insulin secretion : Plasma insulin assessed in obese rats in response to 3 mg/kg glucose injection towards the brain (black) and in obese GSH-infused rats in response to 3 mg/kg glucose (gray). Results are expressed as mean + SEM corresponding to delta from basal insulinemia at t=0. Asterisk indicates significant differences according to independent statistical analysis using Mann-Whitney s test at t = 1 min, n=5-6 per genotype (***, p<0.001). For Peer Review Only 27

170 Page 63 of 70 Diabetes Table 1 : Characteristics of Zücker rats. Basal values of body weight, insulinemia and glycemia are expressed as mean ± SEM (7 weeks-aged rats). Significant differences according to the student s unpaired t test (n=7) compared to lean littermates: ***, p< For Peer Review Only 28

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179 1 2 Full title: Insulin finely modulates olfactory sensitivity Abbreviated title: Insulin and olfaction Aimé P. 1, Savigner A. 2, Jaillard T. 3, Letexier D. 4, Garcia S. 1, Lorsignol A. 3, Duchamp C. 4, Palouzier- Paulignan B. 1, Julliard A.K Université de Lyon, F-69366, Lyon, France; Université Lyon 1; CNRS, UMR 5020, Neurosciences Sensorielles, Comportement, Cognition. Department of Neuroscience, University of Pennsylvania, School of Medicine, 215 Stemmler Hall, 3450 Hamilton Walk, Philadelphia, PA 19104, USA Université de Toulouse, F-31062, Toulouse, France; Université Paul Sabatier; CNRS/UPS, UMR5241, Métabolisme Plasticité Mitochondrie Université de Lyon, F-69622, Villeurbanne, France Université Lyon 1; CNRS UMR 5123, Physiologie Intégrative Cellulaire et Moléculaire, Address all correspondence and requests for reprints to: Pascaline Aime, CNRS/UCBL1 - UMR 5020 Neurosciences sensorielles, Comportement, Cognition, 50 avenue Tony Garnier, Lyon Cedex 7, tel: +33 (0) , fax: +33 (0) , [email protected] Keywords: Insulin, olfaction, food intake, detection threshold This work was supported by Agence Nationale de la Recherche Grant ANR-05-PNRA 1E07Aromalim. 1

180 Abstract In the brain, insulin is involved in multiple regulatory mechanisms, including learning and memory, as well as in feeding behaviors. Numerous data have provided strong evidence that the olfactory bulb (OB) is an important site for insulin action; although the exact role of insulin in the OB remains unclear. In previous studies, we have shown that the nutritional state modulates olfactory sensitivity, suggesting that olfactory function is under the control of neuroendocrine signals that modulate feeding behavior. To study the physiological role of insulin signaling and its mechanism of action in the OB, we have performed behavioral, biochemical, histological, and electrophysiological experiments. We demonstrated, in rats, that 1) insulin modulates olfactory sensitivity: intracerebroventricular (ICV) injections of insulin at 4 or 14 mu had a dose dependent effect, i.e., a low dose increased olfactory sensitivity, and a higher dose decreased it; 2) the OB insulin level was modulated by the feeding state and ICV injections of insulin; 3) the feeding state had no effect on insulin receptor (IR) mrna and protein levels in the OB; 4) IRs were strongly expressed in the OB and preferentially localized to the plasma membrane and cytosol of mitral and granular cells in the external plexiform layer, and in the glomerular neuropil; and 5) insulin modulates the spontaneous activity of mitral cells either through increased or decreased mean firing frequency. These results suggest that the sense of smell participates in the regulation of ingestive behavior via the response to hormonal cues of nutritional status. 2

181 Introduction The sensory inputs that arise from food are major components of the satiation phenomenon. Olfactory sensory-specific satiety (OSS) has been described in various species (1-4), but the mechanisms of this process are still far from clear. The OSS relies on decreased olfactory pleasantness concomitant with decreased neuronal activity in the olfactory cortex when foods are eaten to repletion (2-4). At this level, hunger and satiety influence olfactory processing in order to regulate highly integrated cognitive tasks such as hedonic evaluation. Nutritional status also exerts an influence at a lower level in the olfactory bulb (OB), the first central relay of olfactory information, by modulating the reactivity of the output neurons (mitral cells) to food odors (5-7). To understand why and how satiety signals are disrupted in nutritional pathologies such as obesity, it is first necessary to decipher the neuroendocrine mechanisms responsible for the cross-talk between food intake, body weight regulation systems and olfactory pathways. We recently demonstrated that feeding states modulate olfactory sensitivity: fasting increases and satiation decreases the detection threshold for neutral odors (8). Two major peptides involved in energy homeostasis regulation also take part in such olfactory modulation. Intracerebroventricular (ICV) injections of orexin and leptin increase and decrease olfactory detection, respectively, similarly to fasting and satiation (9). Furthermore, orexin modulates the reactivity of mitral cells in the bulbar network (10). Altogether, these findings suggest that the neuropeptides involved in the regulation of food intake also act on the olfactory system to modulate the sense of smell. Therefore, we hypothesized that orexigenic peptides released during fasting increase olfactory detection, while anorexigenic peptides released during satiation reduce it. The pancreatic hormone insulin is a promising candidate for influencing olfactory sensitivity. Insulin, produced by the pancreas, crosses the blood brain barrier (BBB) (11) through a receptor-mediated saturable transport system (12, 13) to directly affect the central nervous system (CNS). Insulin receptors (IRs) are found throughout the brain; in situ hybridization and autoradiographic studies have demonstrated the highest densities of insulin and IRs in the hypothalamus, the hippocampus, and the OB (16-18). Consistent with IR localization in the hypothalamus, insulin is a key regulator of energy balance (14). ICV injections of insulin decrease 3

182 food intake and lead to body weight loss (15-19). Insulin resistance is also a common feature in the pathophysiology of the metabolic syndrome associated with obesity (20). Consistent with IR localization in the hippocampus, insulin has been implicated in cognitive processes such as learning and memory. ICV injections of insulin enhance memory, while cognitive deficits in Alzheimer s disease involve impairment of insulin activity (21, 22). An increasing body of evidence suggests that the role of insulin in the OB might be crucial. The transport rate of insulin into the OB is two to eight fold higher than into the whole brain (23); consequently, the OB is the brain region that contains the highest level of insulin (24). However, the central role of insulin on olfactory function has never been addressed. In this study, we wanted to determine whether insulin acts on the OB network to modulate olfactory sensitivity in close relation to the nutritional status. 4

183 Materials and methods Animals Experiments were carried out in accordance with the European Community Council Directive of November 24, 1986 (86/609/EEC) for the care and use of laboratory animals. The experimental protocols were approved by the Comité d Expérimentation Animale de l Université Lyon1. On arrival, male Wistar rats (Charles River) were housed individually in Plexiglas chambers at constant temperature and relative humidity (22 ± 0.5 C and 50 ± 5%). Animals were kept under a 12 h light:12 h dark cycle (lights off at 7:00 a.m.). Before invasive procedures, deep anesthesia was ensured by i.p. injection of ketamine (80 mg/kg) / xylazine (10 mg/kg) Behavioral experiments Surgery and ICV drug administration: Adult male Wistar rats (2 months old, 250 g) were anesthetized and secured in a stereotaxic frame, and a 22-gauge cannula (Plastics One, Roanoke, VA) was placed stereotaxically into the left lateral cerebral ventricle using a previously described method (9). Insulin (Sigma) was administrated in a 2 µl saline vehicle over 60 s, using a 10 µl Hamilton syringe at doses of 4 mu/rat (n = 13) or 14 mu/rat (n = 9). Behavioral protocol: One week prior to testing, rats were habituated to a 22 hours/day water and food restriction schedule (Fig. 1A). Animals had access to food and water from 01:00 to 03:00 p.m. Individual body weights and food consumptions were recorded daily. During the overall course of the behavioral experiment, rats received a daily ICV injection of either saline (0.09% NaCl) or insulin at 09:00 a.m. Animals were tested daily during two five-minute sessions at 10:00 a.m. (S1) and at 11:00 a.m. (S2). The experimental set-up allowing recording of licking behavior using a two-tube device has been described elsewhere (8, 9). The behavioral experiments were based on conditioned olfactory aversion (COA). The rats were first trained to drink pure water in the experimental cage for three days. During the following three days, corresponding to establishment of COA (Fig.1B: D-3, D-2, D-1), they only had access to water odorized with isoamyl-acetate (ISO, Sigma) at 10-5 (1 µl of ISO in 100 ml of water). At this dilution, the ISO is only perceived olfactorily (25). ISO consumption of 5

184 above 0.5 ml was paired with an intraperitoneal injection of LiCl (10 ml/kg at 0.15 M) 15 min later to induce gastric malaise. The aversion was tested by giving the animals a choice between pure water and water odorized with ISO 10-5 (aversion test, D0). During the test period (from D1 to D8), the rats were offered a choice between pure water and water odorized with ISO at different concentrations (10-10, 10-9, 10-8, 10-7 ). At the end of the experiments, COA stability was checked by giving the rats the choice between ISO 10-5 and pure water (aversion retest, D9). Data processing: Licking was analyzed using SciPy and MySql database software (Open Source Licenses). An olfactory detection (OD) index was calculated, corresponding to the proportion of the number of licks at the pure water tube with respect to the total number of licks (odorized + pure water). When rats perceived the ISO (and consequently avoided it), they drank more pure water during the experimental session, resulting in a higher OD index. To cover the duration of the pharmacological action of the injected insulin, the raw data collected from S1 and S2 were used to calculate the OD indices and the number of changes of side Insulin extraction and ELISA assay Fasted rats received an ICV injection of either 2 µl saline (n = 5), 2 µl of 4 mu insulin (n = 6), or 2 µl of 14 mu insulin (n = 5) at 9:00 a.m. At 04:00 p.m., satiated rats (n = 5) received a 2 µl ICV injection of saline. Animals were anesthetized and killed 1 h after ICV injections, and OBs were immediately frozen. Trunk blood was collected in heparinized tubes, and the plasma fraction was separated by centrifugation for five minutes. Insulin was extracted from BO tissues according to the procedure of Baskin et al. (24). To determine the influence of the extraction procedure on insulin output, a sample with a quantified amount of insulin was submitted to exactly the same protocol. The mean extraction output was estimated to be around 40%. Plasma and OB insulin levels were determined using a solid-phase two-site enzyme immunoassay (Mercodia Ultrasensitive Rat Insulin ELISA) following the manufacturer s protocol Semi-quantitative RT-PCR 6

185 Animals were anesthetized, killed either in the fasted state at 09:00 a.m. (n = 6) or the satiated state at 04:00 p.m. (n = 6), and the OBs were immediately frozen. The total RNA was extracted from the entire OB using Trizol (Invitrogen), and the concentration and purity were checked by measuring the optical density at 260 and 280nm. RNA integrity was checked by 1% agarose gel electrophoresis (Eurobio). IR mrna relative abundance was measured by semi-quantitative RT-PCR using cyclophilin as reference. Reverse-transcription assays were performed from 1 µg of total RNA with M-MLV Reverse Transcriptase (Promega). The following primer sequences were used : cyclophilin (sense 5 -GTGGCAAGTCCATCTACGGAG-3 ; antisense 5 -CCACAGTCGGAGATGGTGATC-3, NM_017101, 265 bp), IR (sense 5 -GTCTTCGAGAACGGATCGAG-3, antisense 5 - CATGTCGGAAGAAGCAGTGA-3, NM_017071, 467 bp). PCR reactions were performed using Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) with 30 and 25 cycles for IR and cyclophilin, respectively (denaturation for 1 min at 94 C, annealing for 1 min at 60 C, elongation for 1 min at 72 C). Products were analysed on 2% agarose gel prestained with ethidium bromide. Relative band intensities were determined using a Kodak Digital Science 1D 2.0 system (Kodak Scientific Imaging System) and the ratio of IR to cyclophilin was determined for each sample Western Blot Analysis Animals were anesthetized and killed either in the fasted state at 09:00 a.m. (n = 4) or the satiated state at 04:00 p.m. (n = 4). The dissected OBs were immersed for 15 min in a hypotonic buffer (10 mm HEPES, 10 mm KCl, 240 mm sucrose, and 0.5 mm dithiothreitol, ph = 7.4) supplemented with complete protease inhibitor cocktail tablets (Complete Mini, Roche). The OBs were then homogenized with a Dounce homogenizer and a B-type pestle in 60 µl of buffer. The homogenate was resuspended in 1 ml of buffer and quickly centrifuged. 50 µl of the supernatant was taken as the total fraction. Proteins (30 µg per lane) were separated on 10% SDS-PAGE and transferred onto a Hybond membrane (Amersham). Blocking was achieved by 1 h incubation at room temperature in 5% non-fat dry milk prepared in Tris-buffered saline with Tween. The membranes were then probed with 0.4 µg/ml of either rabbit anti-irβ primary antibody ([C-19], sc-711, Santa Cruz Biotechnology) or 7

186 rabbit anti-irα primary antibody (sc-710, Santa Cruz Biotechnology), and mouse anti-actin α antibody (MAB1501, Chemicon) overnight at 4 C. Blots were detected using a goat anti-rabbit peroxidaseconjugated secondary antibody (Amersham) and an enhanced chemioluminescence kit (Amersham). Finally, blots were exposed to autoradiographic films. Equality of protein loading was checked using Coomassie blue staining of the transferred membrane. An arbitrary unit of band intensity was obtained by densitometric analysis Immunofluorescence Animals were anesthetized and killed either in the fasted state at 09:00 a.m. (n = 3) or the satiated state at 04:00 p.m. (n = 3). Immunofluorescence was performed by modification of a published method (26) using fresh frozen brain samples. Brain cryosections were preincubated for 15 min with a blocking buffer containing 0.1 M PBS, ph = 7.4, 3% BSA, and 5% normal serum from the host species of the antibodies. All antibodies were diluted in a blocking buffer. The sections were then incubated for 2 h at room temperature with mouse monoclonal anti-ir primary antibody (directed against the β subunit, 1:50, Biosource). The sections were washed with 0.1 M PBS/3% BSA and incubated for 1 h at room temperature with sheep anti-mouse IgG conjugated with Cy3 (1:500, Jackson Immunoresearch), and with Hoechst (1:100000, Sigma). The IR immunoreactivity of brain sections from the rostral part of the OB to the caudal part of the hypothalamus was analyzed. Hypothalamus cryosections were incubated with rabbit polyclonal anti-igf1r primary antibody (directed against the β subunit, 1:50, Santa Cruz Biotechnology). The secondary antibody (anti-rabbit IgG conjugated with Alexa 488, 1:500, Molecular Probes) and Hoechst (1:100000) reactions were carried out as above. After the final wash with PBS, slides were mounted in an anti-fading mounting medium (Sigma). No specific staining was detected in control cryosections in which the primary antibody was omitted Immunoelectron microscopy Animals were anesthetized and killed in the fasted state at 09:00 a.m. Small pieces of the OB were immediately frozen with a Leica EMPACT high-pressure (2100 bar atmosphere) freezing 8

187 apparatus. The specimens were transferred into liquid nitrogen and immersed and freeze-substituted in acetone (-90 C) containing uranyl acetate 0.25% for 48 h (Leica EM AFS). The temperature was increased progressively over 18 h from -90 C to -35 C. After washing in acetone at -35 C for 3 h, infiltration with lowicryl K4M resin was performed at -35 C by replacing the substitution medium containing pure acetone with successive mixtures containing 3:1, 1:1, and 1:3 (v/v) acetone:k4m for 2 h each and finally in pure K4M overnight. Polymerization was performed under UV light (Leica EM UV). The temperature was then increased progressively over 18 h from -35 C to room temperature under UV exposure, and the polymerization was ended by a final UV exposure for 48 h at room temperature. Ultra-thin sections (70-90 nm) were cut (Reichert Ultramicrotome) and mounted on nickel grids. Post-embedding immunogold labeling was done as described elsewhere (27) with mouse monoclonal anti-ir primary antibody (directed against the β subunit, 1:50, Biosource), and then with goat anti-mouse secondary antibodies coated with gold particles (10 nm 1:40, British BioCell). Controls in which the primary antibody was omitted showed no labeling and provided an indication of background levels. Section and labeling were examined at 80kV in a Jeol 1200 EX electron microscope Patch-clamp recordings Rats were maintained in the same cage as the mother until P25 to delay weaning and associated metabolic changes (28, 29). This precaution allows the consideration of the rat population as homogeneous with regard to the diet. Animals were anesthetized and killed OBs were immersed in Ringer s solution at 2-4 C and oxygenated with 95%O 2 / 5%CO 2 (in mm: 125 NaCl, 4 KCl, 25 NaHCO 3, 2 CaCl 2, 1.25 NaH 2 PO 4, 1 MgCl 2, and 5.5 glucose; ph = 7.4, 320 mosm adjusted with sucrose). Sagittal slices (240 µm thick) were obtained as previously described (30) and incubated in Ringer s solution in a Gibb's chamber at 32 C for 1h and then at room temperature. Patch-clamp recordings were performed on the mitral cells in a cell-attached or a perforated configuration (using amphotericin B) as previously described (31). Borosilicate pipettes were filled with internal solution (in mm: 121 KMeSO 4, 13.5 KCl, 10 HEPES, 1 MgCl 2, 0.5 CaCl 2, and 5 EGTA, ph = 7.3, 310 mosmol adjusted with sucrose) supplemented or not with 130 µm amphotericin B. 9

188 Insulin (human recombinant insulin, 1 µg/ml = nm = 248 mu/l, Sigma) was dissolved in Ringer s solution and perfused throughout the entire slice. This concentration is reported to not interact with insulin-like growth factor pathways on OB neurons in vitro (32, 33). Data were acquired using PClamp 9.2 software (Axon Instruments). Firing was analyzed using Open Electrophy software as well as SciPy and MySql database software (Open Source Licenses). The mean firing frequency was calculated based on the overall perfusion duration for short perfusions. For perfusions longer than five minutes, the mean firing frequency was calculated based on the five minutes flanking the maximum effect Statistical analysis Statistical comparisons were performed with the non-parametric Wilcoxon rank-sum test (n < 30) and the parametric Student t-test (n > 30) using R software. 10

189 Results Central insulin modulates olfactory detection During the aversion test (D0), when the rats had the choice between ISO 10-5 and pure water, their OD indices were close to 100% (Fig. 2A, black diamond: 97%; Fig. 2B, 99%) showing that the COA was perfectly established. In both experiments, on D9, the OD indices for the ISO 10-5 were still close to 100% (Fig. 2A, 99%; Fig. 2B, 90%), and statistically not different from D0, indicating that the aversion was maintained throughout the behavioral experiment. Fig. 2 shows dual effects of insulin since the rat OD was increased by injection of insulin at low dose (4 mu) but decreased at a higher dose (14 mu). The OD index was significantly increased by insulin at 4 mu as compared to ICV injection of saline at an odorant concentration of ISO (Fig. 2A, NaCl, 31%; insulin 4 mu, 50%; *P < 0.05). In contrast, the OD index was significantly decreased by ICV injection of insulin at 14 mu as compared to saline at an odorant concentration of ISO 10-9 (Fig. 2B, NaCl, 57%, insulin 14 mu 38%, *P < 0.05). Neither the 4 mu nor the 14 mu insulin ICV injections affected food consumption. In the 4 mu experiment, food consumption was 4.2 ± 0.1 and 4.3 ± 0.1% BW in rats receiving ICV injections of saline and insulin, respectively. In the 14 mu experiment, food consumption was 5.3 ± 0.2 and 5.0 ± 0.1 %BW in rats receiving ICV injections of saline and insulin, respectively Nutritional status and insulin ICV injection modulate the insulin level in the olfactory bulb In control animals injected with NaCl, plasma and OB insulin levels were modulated in the same way by fasting and satiety (Fig. 3). Plasma (3.91 ± 0.60 ng/ml) and OB (0.21 ± 0.03 ng/g) insulin levels of satiated rats were significantly higher than plasma (0.96 ± 0.29 ng/ml, ***P < 0.005) and OB (0.10 ± 0.01 ng/g, **P < 0.01) insulin levels of fasted animals. Plasma insulin levels of fasted rats receiving an ICV injection of either 4 mu or 14 mu of insulin were not significantly different with respect to the control fasted animals. In contrast, the OB insulin level of fasted rats injected with 14 mu of insulin (0.24 ± 0.05 ng/g) was significantly higher than that of fasted rats injected with 4 mu of insulin (0.14 ± 0.01 ng/g, *P < 0.05) and NaCl (0.10 ± 0.01 ng/g, **P < 0.01). The OB insulin level of fasted rats injected with 4 mu of insulin was slightly higher that of control fasted rats, but not 11

190 1 2 statistically significant. Furthermore, there was no significant difference between OB insulin levels of fasted rats injected with 14 mu of insulin and those of satiated control rats receiving NaCl Nutritional status does not modulate insulin receptor mrna and protein levels in the olfactory bulb Semi-quantitative analysis of IR gene expression showed no significant differences between fasted and satiated states (Fig. 4A; satiated, 0.76 ± 0.05; fasted, 0.8 ± 0.04). Western blot analysis of IR α and β subunit protein levels also revealed no differences between nutritional states (Fig. 4B; IRα satiated, 0.71 ± 0.01; IRα fasted, 0.76 ± 0.05; IRβ satiated, 1.01 ± 0.05; IRβ fasted, 0.96 ± 0.03) Insulin receptor structural and ultrastructural immunolocalizations Brain regions showing the highest IR signal were the OB, the hypothalamus, and the hippocampus, as described earlier (34). The other brain regions showed weak or inconsistent immunostaining (data not shown). At the structural level, no differences in immunoreactivity appeared between brain sections from fasted or satiated animals (data not shown). Strong IR immunoreactivity was observed in the apical part of epithelial cells lining the third ventricle, and numerous immunoreactive cell bodies were found in various parts of the hypothalamus such as the ventromedial nucleus (Fig. 5, K-N). These hypothalamic stainings were positive controls for our immunohistochemistry procedure. The IR and the IGF1R displayed close sequence identity and structural homology (35, 36). In order to test the specificity of our antibody, we compared IR and IGF1R immunolocalization in the third ventricle epithelium (data not shown). The IR is strongly expressed at the apical pole of epithelial cells, whereas the IGF1R is homogeneously localized in the cytoplasm, indicating that the IR antibody does not cross-react with the IGF1R. In the OB (Fig. 5, A-J), the highest degree of IR immunostaining appeared in the mitral cell and granular cell layers. A strong signal also appeared in the glomerular and external plexiform layers (EPL). Within glomeruli, the neuropil zones were highly stained, but the soma of the periglomerular cells did not present any IR signal. The EPL demonstrated strong and homogeneous staining. Surrounding the OB, the nerve layer presented no IR immunoreactivity. 12

191 At the ultrastructural level (Fig. 6), a strong IR immunogold signal labeled mitral cells (Fig. 6, B-D). Gold particles were preferentially located in the subplasma membrane cytoplasm or close to the plasma membrane. The signal was located in membrane invaginations and within light vesicles. Numerous particles also appeared in the cytoplasm of granular cells, preferentially located close to the plasma membrane (Fig. 6E). In conventional electron microscopy techniques, main neuronal processes located in the olfactory glomerular neuropil are distinguished by the type of synaptic contacts they establish, the synaptic vesicle morphology, the electron density of the process cytoplasm, and the relative size and outline of their profiles (37). In the glomerular neuropil, gold particles were located mainly in the light processes, corresponding to the terminal dendrites of mitral/tufted cells, whereas thin dark processes corresponding to the axons of the OSN were devoid of immunogold signals (Fig. 6F) Insulin modulates the spontaneous activity of mitral cells differently according to the duration of the perfusion. Insulin perfusion modulated the spontaneous activity of all mitral cells tested (n = 25) either by decreasing (Fig. 7A) or by increasing it (Fig. 7C). We sorted the responses based on the duration of the perfusion applied (Fig. 7B). Short perfusions (perf < 5min) mainly decreased the mean firing frequency of the cells (71% of the responses), in contrast to long perfusions (10 < perf < 20 min), which mainly increased it (86% of the responses). Intermediate perfusions (5 < perf < 10 min) gave rise to a balanced repartition of increasing/decreasing responses. 13

192 Discussion Altogether, these data show that insulin released in close relation to the nutritional status acts on OB network cellular components to modulate their activity and thus change the olfactory sensitivity. Our behavioral experiments demonstrate that insulin modulates olfactory detection in two opposite ways: a small dose of insulin (4 mu) improved the olfactory detection, whereas a high dose (14 mu) diminished it. Interestingly, each dose changed the olfactory detection for a single odorant dilution: ISO for 4 mu and ISO 10-9 for 14 mu. In previous studies, we demonstrated that leptin decreases olfactory detection and orexin increases it, and that these effects are strong, reproducible, and significant for only one odorant concentration (9). Other authors similarly reported that the action of a chemical compound (rolipram) on the olfactory detection threshold was restricted to a single dilution of the odorant (38). This effect is involved in enlarging or narrowing the range of the detectable odor concentrations, thus increasing or decreasing olfactory sensitivity. We showed that OB and plasma insulin levels were higher in satiated than in fasted animals. This result indicates that the OB, is highly sensitive to fluctuations of insulin levels in the circulating blood. Under physiological conditions, a peripheral increase of insulinemia is correlated with increased OB insulin content, and inversely, a decrease is correlated with reduced OB insulin content. This result is consistent with the general agreement that most insulin entering the brain is produced by the pancreas and transported across the wall of brain capillaries via receptor-mediated saturable transcytosis (12-14, 23, 39-41). Indeed, there is a positive correlation between blood and CSF insulin levels (42). The involvement of receptor-mediated transport allows the rate of insulin entrance into the brain to be regulated by several physiological factors including nutritional status (12, 43); the CSF and the plasma insulin levels are very low during fasting and very high after refeeding. When animals are 24 fasted, the ability of insulin to cross the BBB is reduced (43). We also demonstrated that ICV injection of 4 mu of insulin slightly elevates the OB insulin level in fasted rats, while a higher dose of 14 mu brings the OB insulin level of fasted rats up to the level of satiated animals. Thus, OB insulin levels obtained after the ICV injections remain in the physiological range. Moreover, neither of the 14

193 injected doses affected the plasma insulin level, indicating that insulin administered centrally does not affect the peripheral insulin concentration. The doses of insulin used for our behavioral paradigm mimic OB physiological increases upon cephalic and postprandial insulin secretion (60-63). The cephalic phase of insulin secretion occurs in response to food-related sensory stimuli, i.e. at the beginning of a meal, before nutrient absorption. This leads to a short and small-amplitude increase in the plasma insulin level that plays a role in glucose tolerance. Post-prandial insulin secretion occurs in response to nutrient absorption and subsequent hyperglycemia. This long-lasting and high-amplitude increase in plasma insulin level promotes glucose storage. Here, ICV injection of 4 mu insulin elevated the OB insulin content of fasted animals as observed during the cephalic phase of insulin secretion, while the 14 mu dose brought the OB insulin level of fasted animals up to the level of satiated rats, similarly to post-prandial insulin secretion. The two doses of insulin we used for injections in the lateral ventricle effectively modulated the olfactory sensitivity but had no effect on food consumption, although many reports have indicated that central administration of insulin decreases food intake (17-21). First, we made acute injections into the lateral ventricle to preferentially target the OB, whereas in most reports, insulin is injected chronically into the third ventricle surrounded by the hypothalamus (17, 19-21). Second, as reported elsewhere (18), insulin seems ineffective for modulating food intake in food-deprived animals. Immunolabeling demonstrated that IRs are localized in various regions of the OB network, especially in rich synaptic contact areas such as the EPL and the glomerular neuropil. Electronmicroscopy micrographs support this glomerular localization by showing IRs in mitral cell terminal dendrites within the neuropil. The localization of IRs in the EPL is consistent with previous reports (14, 44) that used in situ hybridization (45), immunohistochemistry (34), and autoradiographic insulin binding (39, 46, 47). It was also shown that the IRs are selectively expressed in the dendro-dendritic synaptosomes of the OB EPL (48), the specific zone of the synaptic contacts between mitral cells and granular cell dendrites. We also show that IRs are localized to the cell bodies at the level of the plasma membrane, and in the cytoplasm of the mitral and granular cells. Altogether, these data indicate that IR gene expression occurs in granular and mitral cell bodies, where some IRs are translocated to the 15

194 dendrites at the level of the EPL and in the glomeruli. Insulin activity in these synaptic contact layers may participate in the modulation of synaptic transmission of odor-related stimuli. RT-PCR analysis showed that IR synthesis in the OB is not modulated by the feeding state as reported for brain regions involved in energy homeostasis, where nutrient availability does not modulate IR mrna levels (49). Furthermore, our western blot experiment showed that the IR protein level is not decreased in chronically fasted rats. An early report demonstrated that chronic fasting reduced insulin binding in the OB (50). It was hypothesized that this reduction might be due to a decline in the number of receptor sites, triggered by a loss of cell surface receptors via catabolism and/or reduced IR synthesis. Here, we demonstrated that this is more likely due to internalization and relocalization of receptors from the plasma membrane to other intracellular components. In peripheral tissues, IR cellular trafficking is sensitive to diet composition (50), diabetes and obesity (51), and insulin levels (52). So far, IR endocytosis regulation in the brain remains unknown. On ultrastructural observation of mitral cells, we identified IRs in invaginations of the plasma membrane, and IR trafficking from the plasma membrane to the cytosol in light vesicles as described by others in peripheral organs (53-56). These vesicles have been identified as clathrin-coated caveolae (57). This raises the possibility that insulin signaling in the OB, closely dependent on IR cellular trafficking dynamics, is modulated by nutritional states. The patch-clamp experiments corroborate the behavioral results by showing that short insulin perfusions decreased the firing rate of most mitral cells, while long perfusions increased it. Consistent with previous work, insulin acted directly on mitral cells to reinforce their firing (31, 32). The firing rate decrease can be explained by indirect action of the hormone on GABAergic granular cells. Because the resistivity of small cells is higher than that of large cells, the response of the granular cells should occur faster than that of mitral cells, and thus appear predominant during short perfusions. During longer perfusions, the direct action on mitral cells would be strengthened, and depending on network excitability, it might overcome the indirect inhibition. Thus, the spontaneous firing increase in mitral cells decreases the signal/noise ratio, concealing the information transmitted to the centers. Moreover, based on their basal firing rhythm, mitral cells are pre-tuned to participate in neuron assembly synchronization during odor stimulation (58). This oscillatory synchronization is essential 16

195 for olfactory information and is generated by the synaptic activity of inhibitory granular cells, capable of synchronizing the activity of mitral cells (59). Thus, the reduction or alteration of GABAergic inhibition induces a specific loss of odor identification (60, 61). Such consequences are consistent with the decreased olfactory performance induced by 14 mu ICV insulin injection. In contrast, by making the odor response more salient, insulin could improve the olfactory performances, consistent with the 4 mu ICV insulin injection. The present study supplies convergent evidence that insulin has complex actions on the olfactory system with two opposing roles that depend on temporal and quantitative parameters. 17

196 References 1. Le Magnen J 1956 Induction of hyperphagia in white rats by changing the mechanism of peripheral satiety. C R Séances Société de Biologie 150: Critchley HD, Rolls ET 1996 Hunger and satiety modify the responses of olfactory and visual neurons in the primate orbitofrontal cortex. J Neurophysiol 75: Rolls ET, Rolls JH 1997 Olfactory sensory-specific satiety in humans. Physiol Behav 61: O'Doherty J, Rolls ET, Francis S, Bowtell R, McGlone F, Kobal G, Renner B, Ahne G 2000 Sensory-specific satiety-related olfactory activation of the human orbitofrontal cortex. Neuroreport 11: Cain DP 1975 Effects of insulin injection on responses of olfactory bulb and amygdala single units to odors. Brain Res 99: Pager J, Giachetti I, Holley A, Le Magnen J 1972 A selective control of olfactory bulb electrical activity in relation to food deprivation and satiety in rats. Physiol Behav 9: Giachetti I, Mac Leod P, Le Magnen J 1970 [Influence of hunger and satiety states on responses of the olfactory bulb in rats]. J Physiol (Paris) 62 Suppl 2: Aime P, Duchamp-Viret P, Chaput MA, Savigner A, Mahfouz M, Julliard AK 2007 Fasting increases and satiation decreases olfactory detection for a neutral odor in rats. Behav Brain Res 179: Julliard AK, Chaput MA, Apelbaum A, Aime P, Mahfouz M, Duchamp-Viret P 2007 Changes in rat olfactory detection performance induced by orexin and leptin mimicking fasting and satiation. Behav Brain Res 183: Hardy AB, Aioun J, Baly C, Julliard KA, Caillol M, Salesse R, Duchamp-Viret P 2005 Orexin A modulates mitral cell activity in the rat olfactory bulb: patch-clamp study on slices and immunocytochemical localization of orexin receptors. Endocrinology 146: Margolis RU, Altszuler N 1967 Insulin in the cerebrospinal fluid. Nature 215: Woods SC, Seeley RJ, Baskin DG, Schwartz MW 2003 Insulin and the blood-brain barrier. Curr Pharm Des 9: Banks WA 2004 The source of cerebral insulin. Eur J Pharmacol 490: Schwartz MW, Figlewicz DP, Baskin DG, Woods SC, Porte D, Jr Insulin in the brain: a hormonal regulator of energy balance. Endocr Rev 13: Ikeda H, West DB, Pustek JJ, Figlewicz DP, Greenwood MR, Porte D, Jr., Woods SC 1986 Intraventricular insulin reduces food intake and body weight of lean but not obese Zucker rats. Appetite 7: Plata-Salaman CR, Oomura Y 1986 Effect of intra-third ventricular administration of insulin on food intake after food deprivation. Physiol Behav 37: Plata-Salaman CR, Oomura Y, Shimizu N 1986 Dependence of food intake on acute and chronic ventricular administration of insulin. Physiol Behav 37: Brief DJ, Davis JD 1984 Reduction of food intake and body weight by chronic intraventricular insulin infusion. Brain Res Bull 12: Air EL, Benoit SC, Blake Smith KA, Clegg DJ, Woods SC 2002 Acute third ventricular administration of insulin decreases food intake in two paradigms. Pharmacol Biochem Behav 72: Eckel RH, Grundy SM, Zimmet PZ 2005 The metabolic syndrome. Lancet 365:

197 Park CR 2001 Cognitive effects of insulin in the central nervous system. Neurosci Biobehav Rev 25: Zhao WQ, Alkon DL 2001 Role of insulin and insulin receptor in learning and memory. Mol Cell Endocrinol 177: Banks WA, Kastin AJ, Pan W 1999 Uptake and degradation of blood-borne insulin by the olfactory bulb. Peptides 20: Baskin DG, Porte D, Jr., Guest K, Dorsa DM 1983 Regional concentrations of insulin in the rat brain. Endocrinology 112: Slotnick BM, Westbrook F, Darling FMC 1997 What the rat's nose tells the rat's mouth: Long delay aversion conditioning with aqueous odors and potentiation of tatse by odors. Animal Learning & Behaviour 25: Julliard AK, Hartmann DJ 1998 Spatiotemporal patterns of expression of extracellular matrix molecules in the developing and adult rat olfactory system. Neuroscience 84: Saucier D, Julliard AK, Monod G, Bréchard H, Astic L 1999 CYP1A1 immunolocalization in the olfactory organ of rainbow trout and its possible induction by -naphthoflavone: analysis in adults and embryos around hatching Fish Physiology and Biochemistry 21: Ferré P, Decaux JF, Issad T, Girard J 1986 Changes in energy metabolism during the suckling and weaning period in the newborn. Reproduction, nutrition, development 26: Ktorza A, Bihoreau MT, Nurjhan N, Picon L, Girard J 1985 Insulin and glucagon during the perinatal period: secretion and metabolic effects on the liver. Biology of the neonate 48: Palouzier-Paulignan B, Duchamp-Viret P, Hardy AB, Duchamp A 2002 GABA(B) receptor-mediated inhibition of mitral/tufted cell activity in the rat olfactory bulb: a whole-cell patch-clamp study in vitro. Neuroscience 111: Palouzier-Paulignan B, Savigner A, Duchamp-Viret P 2006 Insulin reduces several types of potassium conductances in mitral cell. Chemical senses 31: Fadool DA, Tucker K, Phillips JJ, Simmen JA 2000 Brain insulin receptor causes activity-dependent current suppression in the olfactory bulb through multiple phosphorylation of Kv1.3. J Neurophysiol 83: Colley B, Tucker K, Fadool DA 2004 Comparison of modulation of Kv1.3 channel by two receptor tyrosine kinases in olfactory bulb neurons of rodents. Receptors & channels 10: Unger J, McNeill TH, Moxley RT, 3rd, White M, Moss A, Livingston JN 1989 Distribution of insulin receptor-like immunoreactivity in the rat forebrain. Neuroscience 31: Bondy CA, Cheng CM 2004 Signaling by insulin-like growth factor 1 in brain. Eur J Pharmacol 490: LeRoith D 1996 Insulin-like growth factor receptors and binding proteins. Baillieres Clin Endocrinol Metab 10: Pinching AJ, Powell TP 1971 The neuropil of the glomeruli of the olfactory bulb. J Cell Sci 9: Pho V, Butman ML, Cherry JA 2005 Type 4 phosphodiesterase inhibition impairs detection of low odor concentrations in mice. Behav Brain Res 161: Havrankova J, Schmechel D, Roth J, Brownstein M 1978 Identification of insulin in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A 75: Baskin DG, Wilcox BJ, Figlewicz DP, Dorsa DM 1988 Insulin and insulin-like growth factors in the CNS. Trends Neurosci 11:

198 Banks WA, Jaspan JB, Huang W, Kastin AJ 1997 Transport of insulin across the blood-brain barrier: saturability at euglycemic doses of insulin. Peptides 18: Woods SC, Porte D, Jr Relationship between plasma and cerebrospinal fluid insulin levels of dogs. Am J Physiol 233:E Strubbe JH, Porte D, Jr., Woods SC 1988 Insulin responses and glucose levels in plasma and cerebrospinal fluid during fasting and refeeding in the rat. Physiol Behav 44: Schulingkamp RJ, Pagano TC, Hung D, Raffa RB 2000 Insulin receptors and insulin action in the brain: review and clinical implications. Neurosci Biobehav Rev 24: Marks JL, Porte D, Jr., Stahl WL, Baskin DG 1990 Localization of insulin receptor mrna in rat brain by in situ hybridization. Endocrinology 127: Hill JM, Lesniak MA, Pert CB, Roth J 1986 Autoradiographic localization of insulin receptors in rat brain: prominence in olfactory and limbic areas. Neuroscience 17: Baskin DG, Schwartz MW, Sipols AJ, D'Alessio DA, Goldstein BJ, White MF 1994 Insulin receptor substrate-1 (IRS-1) expression in rat brain. Endocrinology 134: Matsumoto H, Rhoads DE 1990 Specific binding of insulin to membranes from dendrodendritic synaptosomes of rat olfactory bulb. J Neurochem 54: Clegg DJ, Benoit SC, Reed JA, Woods SC, Dunn-Meynell A, Levin BE 2005 Reduced anorexic effects of insulin in obesity-prone rats fed a moderate-fat diet. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 288:R Hahn-Obercyger M, Graeve L, Madar Z 2009 A high-cholesterol diet increases the association between caveolae and insulin receptors in rat liver. J Lipid Res 50: Trischitta V, Brunetti A, Chiavetta A, Benzi L, Papa V, Vigneri R 1989 Defects in insulin-receptor internalization and processing in monocytes of obese subjects and obese NIDDM patients. Diabetes 38: Carpentier JL, Robert A, Grunberger G, van Obberghen E, Freychet P, Orci L, Gorden P 1986 Receptor-mediated endocytosis of polypeptide hormones is a regulated process: inhibition of [125I]iodoinsulin internalization in hypoinsulinemic diabetes of rat and man. J Clin Endocrinol Metab 63: Foti M, Porcheron G, Fournier M, Maeder C, Carpentier JL 2007 The neck of caveolae is a distinct plasma membrane subdomain that concentrates insulin receptors in 3T3-L1 adipocytes. Proc Natl Acad Sci U S A 104: Carpentier JL, Gazzano H, Van Obberghen E, Fehlmann M, Freychet P, Orci L 1986 Internalization and recycling of 125I-photoreactive insulin-receptor complexes in hepatocytes in primary culture. Mol Cell Endocrinol 47: Carpentier JL, Gazzano H, Van Obberghen E, Fehlmann M, Freychet P, Orci L 1986 Intracellular pathway followed by the insulin receptor covalently coupled to 125I-photoreactive insulin during internalization and recycling. J Cell Biol 102: Carpentier JL 1989 The cell biology of the insulin receptor. Diabetologia 32: Carpentier JL, Gorden P, Robert A, Orci L 1986 Internalization of polypeptide hormones and receptor recycling. Experientia 42: Cenier T, David F, Litaudon P, Garcia S, Amat C, Buonviso N 2009 Respirationgated formation of gamma and beta neural assemblies in the mammalian olfactory bulb. Eur J Neurosci [in press] 59. Lledo PM, Gheusi G, Vincent JD 2005 Information processing in the mammalian olfactory system. Physiol Rev 85:

199 Gheusi G, Cremer H, McLean H, Chazal G, Vincent JD, Lledo PM 2000 Importance of newly generated neurons in the adult olfactory bulb for odor discrimination. Proc Natl Acad Sci U S A 97: Nusser Z, Kay LM, Laurent G, Homanics GE, Mody I 2001 Disruption of GABA(A) receptors on GABAergic interneurons leads to increased oscillatory power in the olfactory bulb network. J Neurophysiol 86: Acknowledgments Electron microscopy was performed at the Centre Technologique des Microstructures (UCB Lyon I). We thank Béatrice Burdin for the expert technical assistance with the cryofixation procedure

200 Figure legends FIG. 1: Behavioral paradigm. (A) Daily schedule. During the behavioral test period, the rats followed a 22 hour/day water and food restriction schedule. Animals had access to food and water from 1:00 pm to 3:00 p.m. Rats received a daily ICV injection of either NaCl or insulin at 9:00 a.m. and were tested in the experimental cage during sessions of five minutes at 10:00 a.m. (S1) and at 11:00 a.m. (S2). (B) Behavioral design. After habituation to the experimental device, rats were trained to have a conditioned olfactory aversion (COA) to isoamyl acetate (ISO) diluted by 10-5 for three days (D-3, D- 2, D-1). At this step, ISO consumption above 0.5 ml was paired with an intraperitoneal (IP) injection of LiCl (10 ml/kg at 0.15 M). Once the COA was established, aversion was tested by giving the animals a choice between pure water (W) and water odorized with ISO 10-5 (aversion test, D0). During the test period (from D1 to D8), rats were offered a choice between pure water and water odorized with ISO at different concentrations varying between and Each ISO concentration was tested under NaCl ICV injection (N) and under insulin ICV injection (I). At the end of the experiments, the COA stability was checked by giving the rats a choice between ISO 10-5 and pure water (aversion retest, D9) FIG. 2: The dual effect of the ICV injections of 4 mu (A) or 14 mu (B) of insulin on olfactory detection. Before the behavioral test, animals were trained to drink in a two-tube experimental device and then underwent the COA to ISO During the test, rats were offered a choice between pure water and water odorized with ISO at different concentrations. Each animal was tested following ICV injection of NaCl (open diamonds, dotted line) or insulin (black squares, full line). At the end of the test, the persistence of an aversion was checked (black diamonds = aversion retest). For each ISO concentration, an olfactory detection (OD) index corresponding to the percentage (mean ± SEM) of the number of licks at the pure water tube with respect to the total number of licks at the pure water plus the odorized water tubes was calculated. Statistical significances were evaluated by nonparametric Wilcoxon rank-sum test (*P < 0.05)

201 FIG. 3: Insulin concentrations in the olfactory bulb and plasma of fasted and satiated animals following ICV injection of NaCl or insulin at 4 mu or 14 mu. The insulin concentrations (mean ± SEM) measured by ELISA assay are expressed as ng/g of tissue in the OB (black bars) and as ng/ml in the plasma (white bars). For plasma and OB, statistical significances were evaluated using a non-parametric Wilcoxon rank-sum test (***P < 0.005, **P < 0.01, *P < 0.05) FIG. 4: Insulin receptor mrna and protein levels in the olfactory bulb were not modulated by nutritional states. (A) The relative abundance of insulin receptor mrna in the OB was determined by semi-quantitative RT-PCR using IR and cyclophilin primers on 1 µg of total RNA extracted from fasted and satiated rats. Amplified cdnas were quantified by densitometry after migration in a 2% agarose gel. Histograms represent the relative abundance of IR mrna after normalization to cyclophilin (mean ± SEM). (B) IR protein levels in the OB. Proteins were extracted from the OB of fasted (hatched bars) and satiated (open bars) rats. Western blot analysis of the total fraction was performed using anti-irα and anti-irβ antibodies. Immunoblot results were quantified by densitometry. The histograms represent the ratios of IR subunit protein levels after normalization against actin FIG.5: Light micrographs of olfactory bulb and hypothalamus IR immunostaining in fresh-frozen slices. The same images are presented with IR immunostaining alone (the red signal in A, C, E, G, I, K, and M) and as merged images with Hoechst nuclear signals (the blue signal) and IR immunostaining (B, D, F, H, J, L, and N). In the OB (A-J), no staining was found in the nerve layer (A, B), whereas strong staining appeared in the glomeruli (C, D: Glom), the external plexiform layer (E, F: EPL), the somata of mitral cells (G, H: white arrows, MCs), and in the somata of granular cells (I, J: GCs). In the hypothalamus (K-N), numerous immunoreactive cell bodies were detected in the ventro-medial nucleus of the hypothalamus (K, L: VMH) and at the apical portion of epithelial cells lining the third ventricle (M, N: 3V)

202 FIG. 6: Electron micrographs from high-pressure frozen and freeze-substituted OB sections showing IR immunogold labeling. (A) Low magnification overview of a mitral cell (MC) surrounded by granular cells (GCs). (B-D) In mitral cells, gold particles (10 nm, black arrows) were consistently found at the plasma membrane, in invaginations of the plasma membrane, and in light vesicles located in the cytosol. (E) In granular cells, the gold particles (black arrows) were consistently found close to the plasma membrane (F). In the glomeruli, numerous gold particles were found within electron-lucent and large mitral cell dendrites. Olfactory sensory receptor axons were easily recognizable by their thin and electron-dense appearance FIG. 7: Insulin exerts a dual effect on mitral cell spontaneous firing depending on the perfusion duration. Mitral cell spontaneous activity was recorded in the control condition (Ringer s solution perfusion) and during short (A), intermediate, or long (C) insulin perfusions (1 µg/ml). (B) The histograms represent the mitral cell responses (dark grey, decreased mean firing frequency or MFF; light grey, increased MFF) as a function of the duration of the insulin perfusion (perfusion < 5 min = short perfusion lasting 5 minutes or less, 5 < perfusion < 10 min = intermediate perfusions lasting 5 to 10 minutes, 10 < perfusion < 20 min = long perfusion lasting 10 to 20 minutes)

203 Figure 1 Figure 2 Figure 3 Figure 4

204 Figure 5

205 Figure 6 Figure 7

206

207 REFERENCES 130

208 131

209 Adamo, M., Raizada, M. K. and LeRoith, D. (1989) Insulin and insulin-like growth factor receptors in the nervous system. Mol Neurobiol, 3, Ahima, R. S. and Osei, S. Y. (2004) Leptin signaling. Physiol Behav, 81, Allen, Y. S., Adrian, T. E., Allen, J. M., Tatemoto, K., Crow, T. J., Bloom, S. R. and Polak, J. M. (1983) Neuropeptide Y distribution in the rat brain. Science, 221, Andersson, U., Filipsson, K., Abbott, C. R., Woods, A., Smith, K., Bloom, S. R., Carling, D. and Small, C. J. (2004) AMP-activated protein kinase plays a role in the control of food intake. J Biol Chem, 279, Andrews, Z. B., Liu, Z. W., Walllingford, N. et al. (2008) UCP2 mediates ghrelin's action on NPY/AgRP neurons by lowering free radicals. Nature, 454, Araki, E., Haag, B. L., 3rd and Kahn, C. R. (1994) Cloning of the mouse insulin receptor substrate-1 (IRS-1) gene and complete sequence of mouse IRS-1. Biochim Biophys Acta, 1221, Arluison, M., Quignon, M., Nguyen, P., Thorens, B., Leloup, C. and Penicaud, L. (2004a) Distribution and anatomical localization of the glucose transporter 2 (GLUT2) in the adult rat brain--an immunohistochemical study. J Chem Neuroanat, 28, Arluison, M., Quignon, M., Thorens, B., Leloup, C. and Penicaud, L. (2004b) Immunocytochemical localization of the glucose transporter 2 (GLUT2) in the adult rat brain. II. Electron microscopic study. J Chem Neuroanat, 28, Ashford, M. L., Boden, P. R. and Treherne, J. M. (1990) Glucose-induced excitation of hypothalamic neurones is mediated by ATP- sensitive K+ channels. Pflugers Arch, 415, Atef, N., Ktorza, A. and Penicaud, L. (1995) CNS involvement in the glucose induced increase of islet blood flow in obese Zucker rats. Int J Obes Relat Metab Disord, 19, Avshalumov, M. V., Bao, L., Patel, J. C. and Rice, M. E. (2007) H2O2 signaling in the nigrostriatal dopamine pathway via ATP-sensitive potassium channels: issues and answers. Antioxid Redox Signal, 9, Avshalumov, M. V., Chen, B. T., Koos, T., Tepper, J. M. and Rice, M. E. (2005) Endogenous hydrogen peroxide regulates the excitability of midbrain dopamine neurons via ATPsensitive potassium channels. J Neurosci, 25, Avshalumov, M. V. and Rice, M. E. (2003) Activation of ATP-sensitive K+ (K(ATP)) channels by H2O2 underlies glutamate-dependent inhibition of striatal dopamine release. Proc Natl Acad Sci U S A, 100, Babior, B. M. (2004) NADPH oxidase. Curr Opin Immunol, 16, Baker, R. A. and Herkenham, M. (1995) Arcuate nucleus neurons that project to the hypothalamic paraventricular nucleus: neuropeptidergic identity and consequences of adrenalectomy on mrna levels in the rat. J Comp Neurol, 358, Banks, W. A. (2004) The source of cerebral insulin. Eur J Pharmacol, 490, Barja, G. (1999) Mitochondrial oxygen radical generation and leak: sites of production in states 4 and 3, organ specificity, and relation to aging and longevity. J Bioenerg Biomembr, 31, Baron, A. D., Zhu, J. S., Marshall, S., Irsula, O., Brechtel, G. and Keech, C. (1995) Insulin resistance after hypertension induced by the nitric oxide synthesis inhibitor L-NMMA in rats. Am J Physiol, 269, E Bashan, N., Kovsan, J., Kachko, I., Ovadia, H. and Rudich, A. (2009) Positive and negative regulation of insulin signaling by reactive oxygen and nitrogen species. Physiol Rev, 89,

210 Baskin, D. G., Sipols, A. J., Schwartz, M. W. and White, M. F. (1993) Immunocytochemical detection of insulin receptor substrate-1 (IRS-1) in rat brain: colocalization with phosphotyrosine. Regul Pept, 48, Baskin, D. G., Wilcox, B. J., Figlewicz, D. P. and Dorsa, D. M. (1988) Insulin and insulinlike growth factors in the CNS. Trends Neurosci, 11, Bates, S. H. and Myers, M. G., Jr. (2003) The role of leptin receptor signaling in feeding and neuroendocrine function. Trends Endocrinol Metab, 14, Baukrowitz, T., Hwang, T. C., Nairn, A. C. and Gadsby, D. C. (1994) Coupling of CFTR Clchannel gating to an ATP hydrolysis cycle. Neuron, 12, Baukrowitz, T., Schulte, U., Oliver, D., Herlitze, S., Krauter, T., Tucker, S. J., Ruppersberg, J. P. and Fakler, B. (1998) PIP2 and PIP as determinants for ATP inhibition of KATP channels. Science, 282, Baulieu, EE. and Kelly, PA. (1990) Hormones: from molecules to disease. Hermann, publishers in arts and science, Paris. Belgardt, B. F., Husch, A., Rother, E. et al. (2008) PDK1 deficiency in POMC-expressing cells reveals FOXO1-dependent and -independent pathways in control of energy homeostasis and stress response. Cell Metab, 7, Benani, A., Troy, S., Carmona, M. C., Fioramonti, X., Lorsignol, A., Leloup, C., Casteilla, L. and Penicaud, L. (2007) Role for mitochondrial reactive oxygen species in brain lipid sensing: redox regulation of food intake. Diabetes, 56, Benoit, S. C., Air, E. L., Coolen, L. M., Strauss, R., Jackman, A., Clegg, D. J., Seeley, R. J. and Woods, S. C. (2002) The catabolic action of insulin in the brain is mediated by melanocortins. J Neurosci, 22, Bergandi, L., Silvagno, F., Russo, I., Riganti, C., Anfossi, G., Aldieri, E., Ghigo, D., Trovati, M. and Bosia, A. (2003) Insulin stimulates glucose transport via nitric oxide/cyclic GMP pathway in human vascular smooth muscle cells. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 23, Bergen, H. T., Mizuno, T. M., Taylor, J. and Mobbs, C. V. (1998) Hyperphagia and weight gain after gold-thioglucose: relation to hypothalamic neuropeptide Y and proopiomelanocortin. Endocrinology, 139, Bergendi, L., Benes, L., Durackova, Z. and Ferencik, M. (1999) Chemistry, physiology and pathology of free radicals. Life Sci, 65, Berthoud, H. R. (2002) Multiple neural systems controlling food intake and body weight. Neurosci Biobehav Rev, 26, Bestetti, G. and Rossi, G. L. (1980) Hypothalamic lesions in rats with long-term streptozotocin-induced diabetes mellitus. A semiquantitative light- and electronmicroscopic study. Acta Neuropathol, 52, Biggers, D. W., Myers, S. R., Neal, D., Stinson, R., Cooper, N. B., Jaspan, J. B., Williams, P. E., Cherrington, A. D. and Frizzell, R. T. (1989) Role of brain in counterregulation of insulin-induced hypoglycemia in dogs. Diabetes, 38, Biggs, W. H., 3rd, Meisenhelder, J., Hunter, T., Cavenee, W. K. and Arden, K. C. (1999) Protein kinase B/Akt-mediated phosphorylation promotes nuclear exclusion of the winged helix transcription factor FKHR1. Proc Natl Acad Sci U S A, 96, Billington, C. J., Briggs, J. E., Grace, M. and Levine, A. S. (1991) Effects of intracerebroventricular injection of neuropeptide Y on energy metabolism. Am J Physiol, 260, R Blomqvist, A. G. and Herzog, H. (1997) Y-receptor subtypes--how many more? Trends Neurosci, 20,

211 Bojanowska, E. (2005) Physiology and pathophysiology of glucagon-like peptide-1 (GLP-1): the role of GLP-1 in the pathogenesis of diabetes mellitus, obesity, and stress. Med Sci Monit, 11, RA Bolanos, J. P. and Almeida, A. (2006) Modulation of astroglial energy metabolism by nitric oxide. Antioxid Redox Signal, 8, Bonnard, C., Durand, A., Peyrol, S., Chanseaume, E., Chauvin, M. A., Morio, B., Vidal, H. and Rieusset, J. (2008) Mitochondrial dysfunction results from oxidative stress in the skeletal muscle of diet-induced insulin-resistant mice. J Clin Invest, 118, Borg, M. A., Sherwin, R. S., Borg, W. P., Tamborlane, W. V. and Shulman, G. I. (1997) Local ventromedial hypothalamus glucose perfusion blocks counterregulation during systemic hypoglycemia in awake rats. J Clin Invest, 99, Borg, W. P., During, M. J., Sherwin, R. S., Borg, M. A., Brines, M. L. and Shulman, G. I. (1994) Ventromedial hypothalamic lesions in rats suppress counterregulatory responses to hypoglycemia. J Clin Invest, 93, Bouzier-Sore, A. K., Merle, M., Magistretti, P. J. and Pellerin, L. (2002) Feeding active neurons: (re)emergence of a nursing role for astrocytes. J Physiol Paris, 96, Brief, D. J. and Davis, J. D. (1984) Reduction of food intake and body weight by chronic intraventricular insulin infusion. Brain Res Bull, 12, Brookes, P. S., Land, J. M., Clark, J. B. and Heales, S. J. (1998) Peroxynitrite causes proton leak in brain mitochondria. Biochem Soc Trans, 26, S332. Brown, L. M., Clegg, D. J., Benoit, S. C. and Woods, S. C. (2006) Intraventricular insulin and leptin reduce food intake and body weight in C57BL/6J mice. Physiol Behav, 89, Bruning, J. C., Gautam, D., Burks, D. J. et al. (2000) Role of brain insulin receptor in control of body weight and reproduction. Science, 289, Bukowiecki, L. J., Geloen, A. and Collet, A. J. (1986) Proliferation and differentiation of brown adipocytes from interstitial cells during cold acclimation. Am J Physiol, 250, C Burcelin, R., Dolci, W. and Thorens, B. (2000) Portal glucose infusion in the mouse induces hypoglycemia: evidence that the hepatoportal glucose sensor stimulates glucose utilization. Diabetes, 49, Cabou, C., Cani, P. D., Campistron, G., Knauf, C., Mathieu, C., Sartori, C., Amar, J., Scherrer, U. and Burcelin, R. (2007) Central insulin regulates heart rate and arterial blood flow: an endothelial nitric oxide synthase-dependent mechanism altered during diabetes. Diabetes, 56, Canabal, D. D., Song, Z., Potian, J. G., Beuve, A., McArdle, J. J. and Routh, V. H. (2007) Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 292, R Carreras, M. C. and Poderoso, J. J. (2007) Mitochondrial nitric oxide in the signaling of cell integrated responses. Am J Physiol Cell Physiol, 292, C Chang, G. Q., Karatayev, O., Davydova, Z. and Leibowitz, S. F. (2004a) Circulating triglycerides impact on orexigenic peptides and neuronal activity in hypothalamus. Endocrinology, 145, Chang, L., Chiang, S. H. and Saltiel, A. R. (2004b) Insulin signaling and the regulation of glucose transport. Mol Med, 10, Chen, J. F., Guo, J. H., Moxham, C. M., Wang, H. Y. and Malbon, C. C. (1997) Conditional, tissue-specific expression of Q205L G alpha i2 in vivo mimics insulin action. J Mol Med, 75,

212 Choudhury, A. I., Heffron, H., Smith, M. A. et al. (2005) The role of insulin receptor substrate 2 in hypothalamic and beta cell function. J Clin Invest, 115, Clegg, D. J., Benoit, S. C., Reed, J. A., Woods, S. C., Dunn-Meynell, A. and Levin, B. E. (2005) Reduced anorexic effects of insulin in obesity-prone rats fed a moderate-fat diet. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 288, R Clement, L., Cruciani-Guglielmacci, C., Magnan, C., Vincent, M., Douared, L., Orosco, M., Assimacopoulos-Jeannet, F., Penicaud, L. and Ktorza, A. (2002) Intracerebroventricular infusion of a triglyceride emulsion leads to both altered insulin secretion and hepatic glucose production in rats. Pflugers Arch, 445, Clodfeldder-Miller, B., De Sarno, P., Zmijewaska, A. A., Song, L., Jope, R. (2005) Physiological and pathological changes in glucose regulate brain Akt and glycogen synthase kinase-3. J Biol Chem, 280, Combettes-Souverain, M. and Issad, T. (1998) Molecular basis of insulin action. Diabetes Metab, 24, Cone, R. D. (2005) Anatomy and regulation of the central melanocortin system. Nat Neurosci, 8, Cone, R. D., Cowley, M. A., Butler, A. A., Fan, W., Marks, D. L. and Low, M. J. (2001) The arcuate nucleus as a conduit for diverse signals relevant to energy homeostasis. Int J Obes Relat Metab Disord, 25 Suppl 5, S Cowley, M. A. (2003) Hypothalamic melanocortin neurons integrate signals of energy state. Eur J Pharmacol, 480, Cruciani-Guglielmacci, C., Hervalet, A., Douared, L., Sanders, N. M., Levin, B. E., Ktorza, A. and Magnan, C. (2004) Beta oxidation in the brain is required for the effects of non-esterified fatty acids on glucose-induced insulin secretion in rats. Diabetologia, 47, Czech, M. P., Lawrence, J. C., Jr. and Lynn, W. S. (1974a) Evidence for electron transfer reactions involved in the Cu2+ -dependent thiol activation of fat cell glucose utilization. J Biol Chem, 249, Czech, M. P., Lawrence, J. C., Jr. and Lynn, W. S. (1974b) Evidence for the involvement of sulfhydryl oxidation in the regulation of fat cell hexose transport by insulin. Proc Natl Acad Sci U S A, 71, Debons, A. F., Siclari, E., Das, K. C. and Fuhr, B. (1982) Gold thioglucose-induced hypothalamic damage, hyperphagia, and obesity: dependence on the adrenal gland. Endocrinology, 110, Del Prato, S. (2003) Loss of early insulin secretion leads to postprandial hyperglycaemia. Diabetologia, 46 Suppl 1, M2-8. Delibegovic, M., Bence, K. K., Mody, N., Hong, E. G., Ko, H. J., Kim, J. K., Kahn, B. B. and Neel, B. G. (2007) Improved glucose homeostasis in mice with muscle-specific deletion of protein-tyrosine phosphatase 1B. Mol Cell Biol, 27, Denu, J. M. and Tanner, K. G. (2002) Redox regulation of protein tyrosine phosphatases by hydrogen peroxide: detecting sulfenic acid intermediates and examining reversible inactivation. Methods Enzymol, 348, Dimmeler, S., Fleming, I., Fisslthaler, B., Hermann, C., Busse, R. and Zeiher, A. M. (1999) Activation of nitric oxide synthase in endothelial cells by Akt-dependent phosphorylation. Nature, 399, Donovan, C. M., Hamilton-Wessler, M., Halter, J. B. and Bergman, R. N. (1994) Primacy of liver glucosensors in the sympathetic response to progressive hypoglycemia. Proc Natl Acad Sci U S A, 91,

213 Dringen, R. and Hamprecht, B. (1992) Glucose, insulin, and insulin-like growth factor I regulate the glycogen content of astroglia-rich primary cultures. J Neurochem, 58, Droge, W. (2002) Free radicals in the physiological control of cell function. Physiol Rev, 82, Dryden, S., Pickavance, L., Henderson, L. and Williams, G. (1998) Hyperphagia induced by hypoglycemia in rats is independent of leptin and hypothalamic neuropeptide Y (NPY). Peptides, 19, Dunn-Meynell, A. A., Rawson, N. E. and Levin, B. E. (1998) Distribution and phenotype of neurons containing the ATP-sensitive K+ channel in rat brain. Brain Res, 814, Dunn-Meynell, A. A., Routh, V. H., Kang, L., Gaspers, L. and Levin, B. E. (2002) Glucokinase is the likely mediator of glucosensing in both glucose-excited and glucose-inhibited central neurons. Diabetes, 51, Elias, C. F., Aschkenasi, C., Lee, C., Kelly, J., Ahima, R. S., Bjorbaek, C., Flier, J. S., Saper, C. B. and Elmquist, J. K. (1999) Leptin differentially regulates NPY and POMC neurons projecting to the lateral hypothalamic area. Neuron, 23, Elias, C. F., Saper, C. B., Maratos-Flier, E. et al. (1998) Chemically defined projections linking the mediobasal hypothalamus and the lateral hypothalamic area. J Comp Neurol, 402, Elmquist, J. K., Elias, C. F. and Saper, C. B. (1999) From lesions to leptin: hypothalamic control of food intake and body weight. Neuron, 22, Erickson, J. C., Hollopeter, G. and Palmiter, R. D. (1996) Attenuation of the obesity syndrome of ob/ob mice by the loss of neuropeptide Y. Science, 274, Erol, A. (2008) An integrated and unifying hypothesis for the metabolic basis of sporadic Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis, 13, Fan, W., Boston, B. A., Kesterson, R. A., Hruby, V. J. and Cone, R. D. (1997) Role of melanocortinergic neurons in feeding and the agouti obesity syndrome. Nature, 385, Fetissov, S. O., Kopp, J. and Hokfelt, T. (2004) Distribution of NPY receptors in the hypothalamus. Neuropeptides, 38, Figlewicz, D. P. (2003) Adiposity signals and food reward: expanding the CNS roles of insulin and leptin. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 284, R Finocchietto, P., Barreyro, F., Holod, S. et al. (2008) Control of muscle mitochondria by insulin entails activation of Akt2-mtNOS pathway: implications for the metabolic syndrome. PLoS ONE, 3, e1749. Fioramonti, X., Contie, S., Song, Z., Routh, V. H., Lorsignol, A. and Penicaud, L. (2007) Characterization of glucosensing neuron subpopulations in the arcuate nucleus: integration in neuropeptide Y and pro-opio melanocortin networks? Diabetes, 56, Fioramonti, X., Lorsignol, A., Taupignon, A. and Penicaud, L. (2004) A new ATP-sensitive K+ channel-independent mechanism is involved in glucose-excited neurons of mouse arcuate nucleus. Diabetes, 53, Fliers, E., Kreier, F., Voshol, P. J., Havekes, L. M., Sauerwein, H. P., Kalsbeek, A., Buijs, R. M. and Romijn, J. A. (2003) White adipose tissue: getting nervous. J Neuroendocrinol, 15, Foster, L. A., Ames, N. K. and Emery, R. S. (1991) Food intake and serum insulin responses to intraventricular infusions of insulin and IGF-I. Physiol Behav, 50, Friedman, J. M. and Halaas, J. L. (1998) Leptin and the regulation of body weight in mammals. Nature, 395,

214 Furukawa, S., Fujita, T., Shimabukuro, M. et al. (2004) Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome. J Clin Invest, 114, Ganong, W. F. (2000) Circumventricular organs: definition and role in the regulation of endocrine and autonomic function. Clin Exp Pharmacol Physiol, 27, Gao, S., Kinzig, K. P., Aja, S. et al. (2007) Leptin activates hypothalamic acetyl-coa carboxylase to inhibit food intake. Proc Natl Acad Sci U S A, 104, Gerozissis, K. (2003) Brain insulin: regulation, mechanisms of action and functions. Cell Mol Neurobiol, 23, Girard, J. (2003) [Contribution of free fatty acids to impairment of insulin secretion and action: mechanism of beta-cell lipotoxicity]. Med Sci (Paris), 19, Goldstein, B. J., Mahadev, K. and Wu, X. (2005a) Redox paradox: insulin action is facilitated by insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets. Diabetes, 54, Goldstein, B. J., Mahadev, K., Wu, X., Zhu, L. and Motoshima, H. (2005b) Role of insulininduced reactive oxygen species in the insulin signaling pathway. Antioxid Redox Signal, 7, Goto, M. and Spitzer, J. J. (1971) Fatty acid profiles of various lipids in the cerebrospinal fluid. Proc Soc Exp Biol Med, 136, Govers, R. and Rabelink, T. J. (2001) Cellular regulation of endothelial nitric oxide synthase. Am J Physiol Renal Physiol, 280, F Griendling, K. K. (2004) Novel NAD(P)H oxidases in the cardiovascular system. Heart, 90, Grossman, S. P. (1986) The role of glucose, insulin and glucagon in the regulation of food intake and body weight. Neurosci Biobehav Rev, 10, Guillod-Maximin E, L. A., Alquier T, Penicaud L (2004) Acute intracarotid glucose injection towards the brain induces specific c-fos activation in hypothalamic nuclei: involvement of astrocytes in cerebral glucose-sensing in rats. Journal of Neuroendocrinology, 16, Gutteridge, J. M. (1994) Biological origin of free radicals, and mechanisms of antioxidant protection. Chem Biol Interact, 91, Guy, G. R., Cairns, J., Ng, S. B. and Tan, Y. H. (1993) Inactivation of a redox-sensitive protein phosphatase during the early events of tumor necrosis factor/interleukin-1 signal transduction. J Biol Chem, 268, Hahn, T. M., Breininger, J. F., Baskin, D. G. and Schwartz, M. W. (1998) Coexpression of Agrp and NPY in fasting-activated hypothalamic neurons. Nat Neurosci, 1, Hardie, D. G. (2003) Minireview: the AMP-activated protein kinase cascade: the key sensor of cellular energy status. Endocrinology, 144, Havrankova, J., Roth, J. and Brownstein, M. J. (1979) Concentrations of insulin and insulin receptors in the brain are independent of peripheral insulin levels. Studies of obese and streptozotocin-treated rodents. J Clin Invest, 64, Hayes, G. R. and Lockwood, D. H. (1987) Role of insulin receptor phosphorylation in the insulinomimetic effects of hydrogen peroxide. Proc Natl Acad Sci U S A, 84, Henquin, J. C. (2000) Triggering and amplifying pathways of regulation of insulin secretion by glucose. Diabetes, 49, Henquin, J. C., Ravier, M. A., Nenquin, M., Jonas, J. C. and Gilon, P. (2003) Hierarchy of the beta-cell signals controlling insulin secretion. Eur J Clin Invest, 33, Higaki, Y., Mikami, T., Fujii, N., Hirshman, M. F., Koyama, K., Seino, T., Tanaka, K. and Goodyear, L. J. (2008) Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake 137

215 through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Am J Physiol Endocrinol Metab, 294, E Hill, J. M., Lesniak, M. A., Pert, C. B. and Roth, J. (1986) Autoradiographic localization of insulin receptors in rat brain: prominence in olfactory and limbic areas. Neuroscience, 17, Holgado-Madruga, M., Emlet, D. R., Moscatello, D. K., Godwin, A. K. and Wong, A. J. (1996) A Grb2-associated docking protein in EGF- and insulin-receptor signalling. Nature, 379, Hordijk, P. L. (2006) Regulation of NADPH oxidases: the role of Rac proteins. Circ Res, 98, Horvath, T. L., Bechmann, I., Naftolin, F., Kalra, S. P. and Leranth, C. (1997) Heterogeneity in the neuropeptide Y-containing neurons of the rat arcuate nucleus: GABAergic and non-gabaergic subpopulations. Brain Res, 756, Hurd, T. R., Prime, T. A., Harbour, M. E., Lilley, K. S. and Murphy, M. P. (2007) Detection of reactive oxygen species-sensitive thiol proteins by redox difference gel electrophoresis: implications for mitochondrial redox signaling. J Biol Chem, 282, Ibrahim, N., Bosch, M. A., Smart, J. L., Qiu, J., Rubinstein, M., Ronnekleiv, O. K., Low, M. J. and Kelly, M. J. (2003) Hypothalamic proopiomelanocortin neurons are glucose responsive and express K(ATP) channels. Endocrinology, 144, Infanger, D. W., Sharma, R. V. and Davisson, R. L. (2006) NADPH oxidases of the brain: distribution, regulation, and function. Antioxid Redox Signal, 8, Jaillard, T., Roger, M., Galinier, A., Guillou, P., Benani, A., Leloup, C., Casteilla, L., Penicaud, L. and Lorsignol, A. (2009) Hypothalamic reactive oxygen species are required for insulin-induced food intake inhibition. A NADPH oxidase-dependent mechanism. Diabetes. JeBailey, L., Rudich, A., Huang, X., Di Ciano-Oliveira, C., Kapus, A. and Klip, A. (2004) Skeletal muscle cells and adipocytes differ in their reliance on TC10 and Rac for insulin-induced actin remodeling. Mol Endocrinol, 18, Jiang, G. and Zhang, B. B. (2003) Glucagon and regulation of glucose metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab, 284, E Kahn, B. B., Alquier, T., Carling, D. and Hardie, D. G. (2005) AMP-activated protein kinase: ancient energy gauge provides clues to modern understanding of metabolism. Cell Metab, 1, Kang, L., Routh, V. H., Kuzhikandathil, E. V., Gaspers, L. D. and Levin, B. E. (2004) Physiological and molecular characteristics of rat hypothalamic ventromedial nucleus glucosensing neurons. Diabetes, 53, Karschin, C., Ecke, C., Ashcroft, F. M. and Karschin, A. (1997) Overlapping distribution of K(ATP) channel-forming Kir6.2 subunit and the sulfonylurea receptor SUR1 in rodent brain. FEBS Lett, 401, Kasus-Jacobi, A., Perdereau, D., Tartare-Deckert, S., Van Obberghen, E., Girard, J. and Burnol, A. F. (1997) Evidence for a direct interaction between insulin receptor substrate-1 and Shc. J Biol Chem, 272, Kersten, S. (2001) Mechanisms of nutritional and hormonal regulation of lipogenesis. EMBO Rep, 2, Kim, E. K., Miller, I., Aja, S., Landree, L. E., Pinn, M., McFadden, J., Kuhajda, F. P., Moran, T. H. and Ronnett, G. V. (2004a) C75, a fatty acid synthase inhibitor, reduces food intake via hypothalamic AMP-activated protein kinase. J Biol Chem, 279,

216 Kim, M. S., Pak, Y. K., Jang, P. G. et al. (2006a) Role of hypothalamic Foxo1 in the regulation of food intake and energy homeostasis. Nat Neurosci, 9, Kim, M. S., Park, J. Y., Namkoong, C. et al. (2004b) Anti-obesity effects of alpha-lipoic acid mediated by suppression of hypothalamic AMP-activated protein kinase. Nat Med, 10, Kim, Y. I., Lee, F. N., Choi, W. S., Lee, S. and Youn, J. H. (2006b) Insulin regulation of skeletal muscle PDK4 mrna expression is impaired in acute insulin-resistant states. Diabetes, 55, Kobayashi, H., Matsuda, M., Fukuhara, A., Komuro, R. and Shimomura, I. (2009) Dysregulated glutathione metabolism links to impaired insulin action in adipocytes. Am J Physiol Endocrinol Metab, 296, E1326-E1334. Koch, L., Wunderlich, F. T., Seibler, J. et al. (2008) Central insulin action regulates peripheral glucose and fat metabolism in mice. J Clin Invest, 118, Konner, A. C., Janoschek, R., Plum, L. et al. (2007) Insulin action in AgRP-expressing neurons is required for suppression of hepatic glucose production. Cell Metab, 5, Konner, A. C., Klockener, T. and Bruning, J. C. (2009) Control of energy homeostasis by insulin and leptin: Targeting the arcuate nucleus and beyond. Physiol Behav. Kono, T., Robinson, F. W., Blevins, T. L. and Ezaki, O. (1982) Evidence that translocation of the glucose transport activity is the major mechanism of insulin action on glucose transport in fat cells. J Biol Chem, 257, Krieger-Brauer, H. I. and Kather, H. (1995) The stimulus-sensitive H2O2-generating system present in human fat-cell plasma membranes is multireceptor-linked and under antagonistic control by hormones and cytokines. Biochem J, 307 ( Pt 2), Krieger-Brauer, H. I., Medda, P. K. and Kather, H. (1997) Insulin-induced activation of NADPH-dependent H2O2 generation in human adipocyte plasma membranes is mediated by Galphai2. J Biol Chem, 272, Kristensen, P., Judge, M. E., Thim, L. et al. (1998) Hypothalamic CART is a new anorectic peptide regulated by leptin. Nature, 393, Kraft, R., Grimm, C., Grosse, K. et al. (2004) Hydrogen peroxide and ADP-ribose induce TRPM2-mediated calcium influx and cation currents in microglia. Am J Physiol Cell Physiol, 286, C Kuboki, K., Jiang, Z. Y., Takahara, N. et al. (2000) Regulation of endothelial constitutive nitric oxide synthase gene expression in endothelial cells and in vivo : a specific vascular action of insulin. Circulation, 101, Kubota, N., Terauchi, Y., Tobe, K. et al. (2004) Insulin receptor substrate 2 plays a crucial role in beta cells and the hypothalamus. J Clin Invest, 114, Kurata, K., K Fujimoto, T Sakata, H Etou, K Fukagawa (1985) D-Glucose suppression of eating after intra-third ventricule infusion in rat. Physiol Behav, 37, Kusari, A. B., Byon, J., Bandyopadhyay, D., Kenner, K. A. and Kusari, J. (1997) Insulininduced mitogen-activated protein (MAP) kinase phosphatase-1 (MKP-1) attenuates insulin-stimulated MAP kinase activity: a mechanism for the feedback inhibition of insulin signaling. Mol Endocrinol, 11, Kwong, L. K. and Sohal, R. S. (1998) Substrate and site specificity of hydrogen peroxide generation in mouse mitochondria. Arch Biochem Biophys, 350, Lam, T. K., Gutierrez-Juarez, R., Pocai, A. and Rossetti, L. (2005a) Regulation of blood glucose by hypothalamic pyruvate metabolism. Science, 309, Lam, T. K., Schwartz, G. J. and Rossetti, L. (2005b) Hypothalamic sensing of fatty acids. Nat Neurosci, 8,

217 Lambert, P. D., Couceyro, P. R., McGirr, K. M., Dall Vechia, S. E., Smith, Y. and Kuhar, M. J. (1998) CART peptides in the central control of feeding and interactions with neuropeptide Y. Synapse, 29, Lambeth, J. D. (2004) NOX enzymes and the biology of reactive oxygen. Nat Rev Immunol, 4, Larue-Achagiotis, C., Poussard, A. M. and Louis-Sylvestre, J. (1989) Effect of interscapular brown adipose tissue denervation on body weight and feed efficiency in alcohol drinking rats. Physiol Behav, 46, Laughton, W. and Powley, T. L. (1981) Bipiperidyl mustard produces brain lesions and obesity in the rat. Brain Res, 221, Lee, K., Dixon, A. K., Richardson, P. J. and Pinnock, R. D. (1999) Glucose-receptive neurones in the rat ventromedial hypothalamus express KATP channels composed of Kir6.1 and SUR1 subunits. J Physiol, 515, Leloup, C., Arluison, M., Lepetit, N., Cartier, N., Marfaing-Jallat, P., Ferre, P. and Penicaud, L. (1994) Glucose transporter 2 (GLUT 2): expression in specific brain nuclei. Brain Res, 638, Leloup, C., Magnan, C., Benani, A. et al. (2006) Mitochondrial reactive oxygen species are required for hypothalamic glucose sensing. Diabetes, 55, Leloup, C., Orosco, M., Serradas, P., Nicolaidis, S. and Penicaud, L. (1998) Specific inhibition of GLUT2 in arcuate nucleus by antisense oligonucleotides suppresses nervous control of insulin secretion. Brain Res Mol Brain Res, 57, LeRoith, D., Lowe, W. L., Jr., Shemer, J., Raizada, M. K. and Ota, A. (1988) Development of brain insulin receptors. Int J Biochem, 20, Levin, B. E. (2002) Metabolic sensors. Viewing glucosensing neurons from a broader perspective. Physiol Behav, 76, Lin, S., Boey, D. and Herzog, H. (2004a) NPY and Y receptors: lessons from transgenic and knockout models. Neuropeptides, 38, Lin, X., Taguchi, A., Park, S., Kushner, J. A., Li, F., Li, Y. and White, M. F. (2004b) Dysregulation of insulin receptor substrate 2 in beta cells and brain causes obesity and diabetes. J Clin Invest, 114, Liss, B. and Roeper, J. (2001) Molecular physiology of neuronal K-ATP channels (review). Mol Membr Biol, 18, Little, T. J., Horowitz, M. and Feinle-Bisset, C. (2005) Role of cholecystokinin in appetite control and body weight regulation. Obes Rev, 6, Liu, Y., Fiskum, G. and Schubert, D. (2002) Generation of reactive oxygen species by the mitochondrial electron transport chain. J Neurochem, 80, Loftus, T. M., Jaworsky, D. E., Frehywot, G. L., Townsend, C. A., Ronnett, G. V., Lane, M. D. and Kuhajda, F. P. (2000) Reduced food intake and body weight in mice treated with fatty acid synthase inhibitors. Science, 288, Lu, X. Y., Barsh, G. S., Akil, H. and Watson, S. J. (2003) Interaction between alphamelanocyte-stimulating hormone and corticotropin-releasing hormone in the regulation of feeding and hypothalamo-pituitary-adrenal responses. J Neurosci, 23, MacGregor, G. G., Dong, K., Vanoye, C. G., Tang, L., Giebisch, G. and Hebert, S. C. (2002) Nucleotides and phospholipids compete for binding to the C terminus of KATP channels. Proc Natl Acad Sci U S A, 99, Magnan, C., Collins, S., Berthault, M. F., Kassis, N., Vincent, M., Gilbert, M., Penicaud, L., Ktorza, A. and Assimacopoulos-Jeannet, F. (1999) Lipid infusion lowers sympathetic nervous activity and leads to increased beta-cell responsiveness to glucose. J Clin Invest, 103,

218 Mahadev, K., Motoshima, H., Wu, X., Ruddy, J. M., Arnold, R. S., Cheng, G., Lambeth, J. D. and Goldstein, B. J. (2004) The NAD(P)H oxidase homolog Nox4 modulates insulinstimulated generation of H2O2 and plays an integral role in insulin signal transduction. Mol Cell Biol, 24, Mahadev, K., Wu, X., Zilbering, A., Zhu, L., Lawrence, J. T. and Goldstein, B. J. (2001a) Hydrogen peroxide generated during cellular insulin stimulation is integral to activation of the distal insulin signaling cascade in 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem, 276, Mahadev, K., Zilbering, A., Zhu, L. and Goldstein, B. J. (2001b) Insulin-stimulated hydrogen peroxide reversibly inhibits protein-tyrosine phosphatase 1b in vivo and enhances the early insulin action cascade. J Biol Chem, 276, Marks, J. L. and Eastman, C. J. (1989) Effect of starvation on insulin receptors in rat brain. Neuroscience, 30, Marks, J. L., Porte, D., Jr., Stahl, W. L. and Baskin, D. G. (1990) Localization of insulin receptor mrna in rat brain by in situ hybridization. Endocrinology, 127, Marty, N., Dallaporta, M., Foretz, M., Emery, M., Tarussio, D., Bady, I., Binnert, C., Beermann, F. and Thorens, B. (2005) Regulation of glucagon secretion by glucose transporter type 2 (glut2) and astrocyte-dependent glucose sensors. J Clin Invest, 115, May, J. M. (1980) The insulin-like effects of low molecular weight thiols: role of trace metal contamination of commercial thiols. Horm Metab Res, 12, May, J. M. and de Haen, C. (1979a) The insulin-like effect of hydrogen peroxide on pathways of lipid synthesis in rat adipocytes. J Biol Chem, 254, May, J. M. and de Haen, C. (1979b) Insulin-stimulated intracellular hydrogen peroxide production in rat epididymal fat cells. J Biol Chem, 254, Mayer, J. (1953) Glucostatic mechanism of regulation of food intake. N Engl J Med, 249, McGowan, B. M. and Bloom, S. R. (2004) Peptide YY and appetite control. Curr Opin Pharmacol, 4, McGowan, M. K., Andrews, K. M. and Grossman, S. P. (1992a) Chronic intrahypothalamic infusions of insulin or insulin antibodies alter body weight and food intake in the rat. Physiol Behav, 51, McGowan, M. K., Andrews, K. M. and Grossman, S. P. (1992b) Role of intrahypothalamic insulin in circadian patterns of food intake, activity, and body temperature. Behav Neurosci, 106, Meister, B., Ceccatelli, S., Hokfelt, T., Anden, N. E., Anden, M. and Theodorsson, E. (1989) Neurotransmitters, neuropeptides and binding sites in the rat mediobasal hypothalamus: effects of monosodium glutamate (MSG) lesions. Exp Brain Res, 76, Menendez, J. A. and Atrens, D. M. (1991) Insulin and the paraventricular hypothalamus: modulation of energy balance. Brain Res, 555, Meng, T. C., Fukada, T. and Tonks, N. K. (2002) Reversible oxidation and inactivation of protein tyrosine phosphatases in vivo. Mol Cell, 9, Miki, T., Iwanaga, T., Nagashima, K., Ihara, Y. and Seino, S. (2001) Roles of ATP-sensitive K+ channels in cell survival and differentiation in the endocrine pancreas. Diabetes, 50 Suppl 1, S Minokoshi, Y., Alquier, T., Furukawa, N. et al. (2004) AMP-kinase regulates food intake by responding to hormonal and nutrient signals in the hypothalamus. Nature, 428,

219 Mirshamsi, S., Laidlaw, H. A., Ning, K., Anderson, E., Burgess, L. A., Gray, A., Sutherland, C. and Ashford, M. L. (2004) Leptin and insulin stimulation of signalling pathways in arcuate nucleus neurones: PI3K dependent actin reorganization and KATP channel activation. BMC Neurosci, 5, 54. Montagnani, M., Chen, H., Barr, V. A. and Quon, M. J. (2001) Insulin-stimulated activation of enos is independent of Ca2+ but requires phosphorylation by Akt at Ser(1179). J Biol Chem, 276, Moodie, S. A., Alleman-Sposeto, J. and Gustafson, T. A. (1999) Identification of the APS protein as a novel insulin receptor substrate. J Biol Chem, 274, Moran, O. and Phillip, M. (2003) Leptin: obesity, diabetes and other peripheral effects--a review. Pediatr Diabetes, 4, Morgan, K., Obici, S. and Rossetti, L. (2004) Hypothalamic responses to long-chain fatty acids are nutritionally regulated. J Biol Chem, 279, Moriyama, R., Tsukamura, H., Kinoshita, M., Okazaki, H., Kato, Y. and Maeda, K. (2004) In vitro increase in intracellular calcium concentrations induced by low or high extracellular glucose levels in ependymocytes and serotonergic neurons of the rat lower brainstem. Endocrinology, 145, Morley, J. E., Kumar, V. B., Mattammal, M. B., Farr, S., Morley, P. M. and Flood, J. F. (1996) Inhibition of feeding by a nitric oxide synthase inhibitor: effects of aging. Eur J Pharmacol, 311, Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S. and Schwartz, M. W. (2006) Central nervous system control of food intake and body weight. Nature, 443, Moxham, C. M. and Malbon, C. C. (1996) Insulin action impaired by deficiency of the G- protein subunit G ialpha2. Nature, 379, Mukherjee, S. P., Lane, R. H. and Lynn, W. S. (1978) Endogenous hydrogen peroxide and peroxidative metabolism in adipocytes in response to insulin and sulfhydryl reagents. Biochem Pharmacol, 27, Muniyappa, R., Montagnani, M., Koh, K. K. and Quon, M. J. (2007) Cardiovascular actions of insulin. Endocr Rev, 28, Muntzel, M. S., Morgan, D. A., Mark, A. L. and Johnson, A. K. (1994) Intracerebroventricular insulin produces nonuniform regional increases in sympathetic nerve activity. Am J Physiol, 267, R Nakashima, N., Sharma, P. M., Imamura, T., Bookstein, R. and Olefsky, J. M. (2000) The tumor suppressor PTEN negatively regulates insulin signaling in 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem, 275, Nicholls, D. G. and Rial, E. (1999) A history of the first uncoupling protein, UCP1. J Bioenerg Biomembr, 31, Nichols, C. G. (2006) KATP channels as molecular sensors of cellular metabolism. Nature, 440, Niswender, K. D., Gallis, B., Blevins, J. E., Corson, M. A., Schwartz, M. W. and Baskin, D. G. (2003a) Immunocytochemical detection of phosphatidylinositol 3-kinase activation by insulin and leptin. J Histochem Cytochem, 51, Niswender, K. D., Morrison, C. D., Clegg, D. J., Olson, R., Baskin, D. G., Myers, M. G., Jr., Seeley, R. J. and Schwartz, M. W. (2003b) Insulin activation of phosphatidylinositol 3-kinase in the hypothalamic arcuate nucleus: a key mediator of insulin-induced anorexia. Diabetes, 52, Nonogaki, K. (2000) New insights into sympathetic regulation of glucose and fat metabolism. Diabetologia, 43,

220 Obici, S., Feng, Z., Arduini, A., Conti, R. and Rossetti, L. (2003) Inhibition of hypothalamic carnitine palmitoyltransferase-1 decreases food intake and glucose production. Nat Med, 9, Obici, S., Feng, Z., Karkanias, G., Baskin, D. G. and Rossetti, L. (2002a) Decreasing hypothalamic insulin receptors causes hyperphagia and insulin resistance in rats. Nat Neurosci, 5, Obici, S., Feng, Z., Morgan, K., Stein, D., Karkanias, G. and Rossetti, L. (2002b) Central administration of oleic acid inhibits glucose production and food intake. Diabetes, 51, Obici, S., Feng, Z., Tan, J., Liu, L., Karkanias, G. and Rossetti, L. (2001) Central melanocortin receptors regulate insulin action. J Clin Invest, 108, Obici, S., Zhang, B. B., Karkanias, G. and Rossetti, L. (2002c) Hypothalamic insulin signaling is required for inhibition of glucose production. Nat Med, 8, Ollmann, M. M., Wilson, B. D., Yang, Y. K., Kerns, J. A., Chen, Y., Gantz, I. and Barsh, G. S. (1997) Antagonism of central melanocortin receptors in vitro and in vivo by agoutirelated protein. Science, 278, Ono, H., Pocai, A., Wang, Y., Sakoda, H., Asano, T., Backer, J. M., Schwartz, G. J. and Rossetti, L. (2008) Activation of hypothalamic S6 kinase mediates diet-induced hepatic insulin resistance in rats. J Clin Invest, 118, Oomura, Y., Nakamura, T., Sugimori, M. and Yamada, Y. (1975) Effect of free fatty acid on the rat lateral hypothalamic neurons. Physiol Behav, 14, Pellerin, L., Bouzier-Sore, A. K., Aubert, A., Serres, S., Merle, M., Costalat, R. and Magistretti, P. J. (2007) Activity-dependent regulation of energy metabolism by astrocytes: an update. Glia, 55, Penicaud, L., Leloup, C, Lorsignol, A, Alquier, T, Guillod, E. (2002) Brain glucose sensing mechanism and glucose homeostasis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care, 5, Penicaud, L., Thompson, D. A. and Le Magnen, J. (1986) Effects of 2-deoxy-D-glucose on food and water intake and body temperature in rats. Physiol Behav, 36, Plum, L., Belgardt, B. F. and Bruning, J. C. (2006a) Central insulin action in energy and glucose homeostasis. J Clin Invest, 116, Plum, L., Ma, X., Hampel, B. et al. (2006b) Enhanced PIP3 signaling in POMC neurons causes KATP channel activation and leads to diet-sensitive obesity. J Clin Invest, 116, Pocai, A., Lam, T. K., Gutierrez-Juarez, R., Obici, S., Schwartz, G. J., Bryan, J., Aguilar- Bryan, L. and Rossetti, L. (2005) Hypothalamic K(ATP) channels control hepatic glucose production. Nature, 434, Posey, K. A., Clegg, D. J., Printz, R. L. et al. (2009) Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet. Am J Physiol Endocrinol Metab, 296, E Puschel, G. P. (2004) Control of hepatocyte metabolism by sympathetic and parasympathetic hepatic nerves. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Biol, 280, Rahmouni, K., Morgan, D. A., Morgan, G. M., Liu, X., Sigmund, C. D., Mark, A. L. and Haynes, W. G. (2004) Hypothalamic PI3K and MAPK differentially mediate regional sympathetic activation to insulin. J Clin Invest, 114, Rinaudo, M. T., Bedino, S., Curto, M., Testore, G. and Bruno, R. (1986a) Characterization of a pyruvate dehydrogenase modulator purified from insulin-treated rat brain plasma membranes. Ital J Biochem, 35, Rinaudo, M. T., Curto, M. and Bruno, R. (1986b) Effect of insulin on pyruvate dehydrogenase in a mixture of plasma membranes and mitochondria from normal and alloxan treated rat brains. Int J Biochem, 18,

221 Ritter, S., Dinh, T. T. and Zhang, Y. (2000) Localization of hindbrain glucoreceptive sites controlling food intake and blood glucose. Brain Res, 856, Rossi, M., Kim, M. S., Morgan, D. G. et al. (1998) A C-terminal fragment of Agouti-related protein increases feeding and antagonizes the effect of alpha-melanocyte stimulating hormone in vivo. Endocrinology, 139, Russek, M. (1970) Demonstration of the influence of an hepatic glucosensitive mechanism on food-intake. Physiol Behav, 5, Sadri, P. and Lautt, W. W. (1998) Blockade of nitric oxide production in the liver causes insulin resistance. Proc West Pharmacol Soc, 41, Sanchis-Segura, C. and Aragon, C. M. (2002) Consequences of monosodium glutamate or goldthioglucose arcuate nucleus lesions on ethanol-induced locomotion. Drug Alcohol Depend, 68, Sasaoka, T., Rose, D. W., Jhun, B. H., Saltiel, A. R., Draznin, B. and Olefsky, J. M. (1994) Evidence for a functional role of Shc proteins in mitogenic signaling induced by insulin, insulin-like growth factor-1, and epidermal growth factor. J Biol Chem, 269, Schapira, A. H. (1998) Human complex I defects in neurodegenerative diseases. Biochim Biophys Acta, 1364, Scheurink, A. J. and Nolan, L. J. (1996) Food intake, fuel homeostasis, and the autonomic nervous system. Appetite, 26, 304. Schmid, E., El Benna, J., Galter, D., Klein, G. and Droge, W. (1998) Redox priming of the insulin receptor beta-chain associated with altered tyrosine kinase activity and insulin responsiveness in the absence of tyrosine autophosphorylation. FASEB J, 12, Schmid, E., Hotz-Wagenblatt, A., Hacj, V. and Droge, W. (1999) Phosphorylation of the insulin receptor kinase by phosphocreatine in combination with hydrogen peroxide: the structural basis of redox priming. FASEB J, 13, Schmitt, T. L., Hotz-Wagenblatt, A., Klein, H. and Droge, W. (2005) Interdependent regulation of insulin receptor kinase activity by ADP and hydrogen peroxide. J Biol Chem, 280, Schulingkamp, R. J., Pagano, T. C., Hung, D. and Raffa, R. B. (2000) Insulin receptors and insulin action in the brain: review and clinical implications. Neurosci Biobehav Rev, 24, Schwartz, M. W., Baskin, D. G., Bukowski, T. R. et al. (1996) Specificity of leptin action on elevated blood glucose levels and hypothalamic neuropeptide Y gene expression in ob/ob mice. Diabetes, 45, Schwartz, M. W., Figlewicz, D. F., Kahn, S. E., Baskin, D. G., Greenwood, M. R. and Porte, D., Jr. (1990) Insulin binding to brain capillaries is reduced in genetically obese, hyperinsulinemic Zucker rats. Peptides, 11, Schwartz, M. W., Figlewicz, D. P., Baskin, D. G., Woods, S. C. and Porte, D., Jr. (1992) Insulin in the brain: a hormonal regulator of energy balance. Endocr Rev, 13, Schwartz, M. W., Marks, J. L., Sipols, A. J., Baskin, D. G., Woods, S. C., Kahn, S. E. and Porte, D., Jr. (1991) Central insulin administration reduces neuropeptide Y mrna expression in the arcuate nucleus of food-deprived lean (Fa/Fa) but not obese (fa/fa) Zucker rats. Endocrinology, 128, Schwartz, M. W., Woods, S. C., Porte, D., Jr., Seeley, R. J. and Baskin, D. G. (2000) Central nervous system control of food intake. Nature, 404, Seino, S. (1999) ATP-sensitive potassium channels: a model of heteromultimeric potassium channel/receptor assemblies. Annu Rev Physiol, 61,

222 Shankar, R. R., Wu, Y., Shen, H. Q., Zhu, J. S. and Baron, A. D. (2000) Mice with gene disruption of both endothelial and neuronal nitric oxide synthase exhibit insulin resistance. Diabetes, 49, Shyng, S. L. and Nichols, C. G. (1998) Membrane phospholipid control of nucleotide sensitivity of KATP channels. Science, 282, Sindelar, D. K., Ste Marie, L., Miura, G. I., Palmiter, R. D., McMinn, J. E., Morton, G. J. and Schwartz, M. W. (2004) Neuropeptide Y is required for hyperphagic feeding in response to neuroglucopenia. Endocrinology, 145, Spanswick, D., Smith, M. A., Groppi, V. E., Logan, S. D. and Ashford, M. L. (1997) Leptin inhibits hypothalamic neurons by activation of ATP-sensitive potassium channels. Nature, 390, Spanswick, D., Smith, M. A., Mirshamsi, S., Routh, V. H. and Ashford, M. L. (2000) Insulin activates ATP-sensitive K+ channels in hypothalamic neurons of lean, but not obese rats. Nat Neurosci, 3, Stanley, B. G., Kyrkouli, S. E., Lampert, S. and Leibowitz, S. F. (1986) Neuropeptide Y chronically injected into the hypothalamus: a powerful neurochemical inducer of hyperphagia and obesity. Peptides, 7, Stockhorst, U., de Fries, D., Steingrueber, H. J. and Scherbaum, W. A. (2004) Insulin and the CNS: effects on food intake, memory, and endocrine parameters and the role of intranasal insulin administration in humans. Physiol Behav, 83, Storozheva, Z. I., Proshin, A. T., Sherstnev, V. V. et al. (2008) Dicholine salt of succinic acid, a neuronal insulin sensitizer, ameliorates cognitive deficits in rodent models of normal aging, chronic cerebral hypoperfusion, and beta-amyloid peptide-(25-35)-induced amnesia. BMC Pharmacol, 8, 1. Storozhevykh, T. P., Senilova, Y. E., Persiyantseva, N. A., Pinelis, V. G. and Pomytkin, I. A. (2007) Mitochondrial respiratory chain is involved in insulin-stimulated hydrogen peroxide production and plays an integral role in insulin receptor autophosphorylation in neurons. BMC Neurosci, 8, 84. Strubbe, J. H. and Mein, C. G. (1977) Increased feeding in response to bilateral injection of insulin antibodies in the VMH. Physiol Behav, 19, Stump, C. S., Short, K. R., Bigelow, M. L., Schimke, J. M. and Nair, K. S. (2003) Effect of insulin on human skeletal muscle mitochondrial ATP production, protein synthesis, and mrna transcripts. Proc Natl Acad Sci U S A, 100, Talior, I., Tennenbaum, T., Kuroki, T. and Eldar-Finkelman, H. (2005) PKC-delta-dependent activation of oxidative stress in adipocytes of obese and insulin-resistant mice: role for NADPH oxidase. Am J Physiol Endocrinol Metab, 288, E Tamemoto, H., Kadowaki, T., Tobe, K. et al. (1994) Insulin resistance and growth retardation in mice lacking insulin receptor substrate-1. Nature, 372, Torsoni, M. A., Carvalheira, J. B., Pereira-Da-Silva, M., de Carvalho-Filho, M. A., Saad, M. J. and Velloso, L. A. (2003) Molecular and functional resistance to insulin in hypothalamus of rats exposed to cold. Am J Physiol Endocrinol Metab, 285, E Trovati, M., Massucco, P., Mattiello, L., Cavalot, F., Mularoni, E., Hahn, A. and Anfossi, G. (1995) Insulin increases cyclic nucleotide content in human vascular smooth muscle cells: a mechanism potentially involved in insulin-induced modulation of vascular tone. Diabetologia, 38, Turrens, J. F. and Boveris, A. (1980) Generation of superoxide anion by the NADH dehydrogenase of bovine heart mitochondria. Biochem J, 191, Ueno, H., Yamaguchi, H., Kangawa, K. and Nakazato, M. (2005) Ghrelin: a gastric peptide that regulates food intake and energy homeostasis. Regul Pept, 126,

223 Ugi, S., Imamura, T., Maegawa, H. et al. (2004) Protein phosphatase 2A negatively regulates insulin's metabolic signaling pathway by inhibiting Akt (protein kinase B) activity in 3T3-L1 adipocytes. Mol Cell Biol, 24, van Itallie, T. B. (1990) The glucostatic theory : roots and branches. Int J Obes, 14 Suppl 3, Van Obberghen, E., Baron, V., Delahaye, L. et al. (2001) Surfing the insulin signaling web. Eur J Clin Invest, 31, Waldbillig, R. J. and LeRoith, D. (1987) Insulin receptors in the peripheral nervous system: a structural and functional analysis. Brain Res, 409, Wan, H. Z., Hulsey, M. G. and Martin, R. J. (1998) Intracerebroventricular administration of antisense oligodeoxynucleotide against GLUT2 glucose transporter mrna reduces food intake, body weight change and glucoprivic feeding response in rats. J Nutr, 128, Wang, R., Cruciani-Guglielmacci, C., Migrenne, S., Magnan, C., Cotero, V.E.. and Routh, V.H. (2005) The effects of oleic-acid (OA) on distinct populations of neurons in the hypothalamic arcuate nucleus (ARC) are dependent on extracellular glucose levels. J Neuro Physiol (in press). Wang, R., Liu, X., Hentges, S. T., Dunn-Meynell, A. A., Levin, B. E., Wang, W. and Routh, V. H. (2004) The regulation of glucose-excited neurons in the hypothalamic arcuate nucleus by glucose and feeding-relevant peptides. Diabetes, 53, Wang, R., Liu, X., Hentges, S. T., Dunn-Meynell, A. A., Levin, B. E., Wang, W., Routh, V. H. (2004) The regulation of glucose-excited neurons in the hypothalamic arcuate nucleus by glucose and feeding-relevant peptides. Diabetes, 53, Weide, K., Christ, N., Moar, K. M., Arens, J., Hinney, A., Mercer, J. G., Eiden, S. and Schmidt, I. (2003) Hyperphagia, not hypometabolism, causes early onset obesity in melanocortin-4 receptor knockout mice. Physiol Genomics, 13, White, J. D., Olchovsky, D., Kershaw, M. and Berelowitz, M. (1990) Increased hypothalamic content of preproneuropeptide-y messenger ribonucleic acid in streptozotocin-diabetic rats. Endocrinology, 126, White, M. F. (1998) The IRS-signaling system: a network of docking proteins that mediate insulin and cytokine action. Recent Prog Horm Res, 53, White, M. F. and Yenush, L. (1998) The IRS-signaling system: a network of docking proteins that mediate insulin and cytokine action. Curr Top Microbiol Immunol, 228, Woods, S. C., Lotter, E. C., McKay, L. D. and Porte, D., Jr. (1979) Chronic intracerebroventricular infusion of insulin reduces food intake and body weight of baboons. Nature, 282, Woods, S. C. and Porte, D., Jr. (1974) Neural control of the endocrine pancreas. Physiol Rev, 54, Woods, S. C. and Seeley, R. J. (2000) Adiposity signals and the control of energy homeostasis. Nutrition, 16, Xu, A. W., Kaelin, C. B., Takeda, K., Akira, S., Schwartz, M. W. and Barsh, G. S. (2005) PI3K integrates the action of insulin and leptin on hypothalamic neurons. J Clin Invest, 115, Yang, X. J., Kow, L. M., Funabashi, T. and Mobbs, C. V. (1999) Hypothalamic glucose sensor: similarities to and differences from pancreatic beta-cell mechanisms. Diabetes, 48, Yen, T. T., Gill, A. M., Frigeri, L. G., Barsh, G. S. and Wolff, G. L. (1994) Obesity, diabetes, and neoplasia in yellow A(vy)/- mice: ectopic expression of the agouti gene. Faseb J, 8,

224 Young, J. B. and Landsberg, L. (1977a) Stimulation of the sympathetic nervous system during sucrose feeding. Nature, 269, Young, J. B. and Landsberg, L. (1977b) Suppression of sympathetic nervous system during fasting. Science, 196, Zarjevski, N., Cusin, I., Vettor, R., Rohner-Jeanrenaud, F. and Jeanrenaud, B. (1993) Chronic intracerebroventricular neuropeptide-y administration to normal rats mimics hormonal and metabolic changes of obesity. Endocrinology, 133, Zeng, G., Nystrom, F. H., Ravichandran, L. V., Cong, L. N., Kirby, M., Mostowski, H. and Quon, M. J. (2000) Roles for insulin receptor, PI3-kinase, and Akt in insulin-signaling pathways related to production of nitric oxide in human vascular endothelial cells. Circulation, 101, Zhang, X., Dong, F., Ren, J., Driscoll, M. J. and Culver, B. (2005) High dietary fat induces NADPH oxidase-associated oxidative stress and inflammation in rat cerebral cortex. Exp Neurol, 191, Zhang, Y., Marcillat, O., Giulivi, C., Ernster, L. and Davies, K. J. (1990) The oxidative inactivation of mitochondrial electron transport chain components and ATPase. J Biol Chem, 265, Zhang, Y., Proenca, R., Maffei, M., Barone, M., Leopold, L. and Friedman, J. M. (1994) Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature, 372,

225

226 RESUME L insuline joue un rôle clé dans le contrôle nerveux de l homéostasie énergétique, notamment en agissant au niveau de l hypothalamus pour réduire la prise alimentaire. Le rôle crucial des espèces actives de l oxygène (EAOs) dans le contrôle nerveux de la balance énergétique et dans la signalisation de l insuline commence à émerger. Cependant, leur implication dans l effet anorexigène de l insuline restait à déterminer. L objectif de notre travail a été d évaluer, chez la souris, le rôle joué par les EAOs dans l action anorexigène de l insuline. Nos résultats montrent que l injection intra-cérébro-ventriculaire (3 ème ventricule) d insuline (2.4nM) induit dans l hypothalamus 1) une élévation de la quantité d EAOs (+36% en 15min), 2) une inhibition de la respiration mitochondriale (-50/60% en 15min), et 3) une inhibition de la prise alimentaire sur 24h. Un prétraitement avec un antioxydant, des inhibiteurs de la NADPH oxydase (NOX), ou un agent découplant de la chaîne respiratoire mitochondriale supprime l ensemble de ces effets de l insuline. Ces résultats démontrent l implication des EAOs dans l action hypothalamique de l insuline, notamment celles dérivées de la NOX. Au final, nous montrons que le niveau de prise alimentaire est corrélé au niveau hypothalamique d EAOs et au flux respiratoire mitochondrial. Nous proposons donc que la régulation du niveau hypothalamique d EAOs et du flux respiratoire mitochondrial sont indispensables à l inhibition de la prise alimentaire induite par l insuline. En conclusion, notre travail révèle que les EAOs constituent de nouveaux acteurs de la signalisation hypothalamique de l insuline impliquée dans le contrôle du comportement alimentaire. ABSTRACT In addition to its peripheral hypoglycaemic action, insulin plays an important role in the hypothalamic control of energy balance, especially by reducing food intake. Emerging data point out a pivotal role for reactive oxygen species (ROS) in the energy homeostasis regulation and insulin signaling, but their involvement in the anorexigenic insulin effect was not determined yet. The main objective of our work was to investigate the contribution of hypothalamic ROS in the regulation of feeding behaviour by insulin in mice. Our results show that the intra-cerebro-ventricular injection (3 rd ventricle) of insulin at a physiological concentration (2.4nM) induces within the hypothalamus 1) a transient elevation of ROS level (+36%, at 15min), 2) an inhibition of mitochondrial respiration (- 50/60% in 15min) and 3) a 24h-food intake inhibition. A pretreatment with an antioxidant, two NADPH oxidase (NOX) inhibitors, or a mitochondrial respiratory chain (MRC) uncoupler suppresses insulin s effects. These results demonstrate the involvement of ROS in the hypothalamic insulin action, especially ROS derived from NOX. Finally, we show that the food intake level is correlated with the hypothalamic ROS level and mitochondrial respiration, which are also correlated themselves. Altogether, we suggest that the hypothalamic regulation of ROS level and mitochondrial respiration are required for the insulin-induced food intake inhibition. In conclusion, our work reveals that ROS constitute new molecular actors of the hypothalamic insulin signaling necessary to the control of feeding behaviour.