Bases de la microscopie et quelques aspects avancés

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1 Bases de la microscopie et quelques aspects avancés Intervenant : François Waharte Plateforme Imagerie Cellulaire et Tissulaire UMR144 Institut Curie

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3 Bases de la microscopie François Waharte Imagerie Cellulaire et Tissulaire UMR144 - Institut Curie, Paris Formation Microscopie Confocale, Gif-sur- Yvette, 6 octobre 2008 Plan But de la microscopie La microscopie en transmission Techniques de contraste La microscopie de fluorescence Quelques aspects avancés

4 But de la microscopie Voir la structure fine des objets biologiques Explorer les propriétés moléculaires des échantillons (fixés ou vivants), de manière non-invasive (non-destructive) : - Localisation : marquages, colorations, colocations - Dynamique : Time-lapse, FRAP, FCS, - Interactions : FRET, FLIM, Comment voir les détails d un échantillon? élémentaire, mon cher Watson! La loupe : Loupe h h Rétine Grossissement = h h (de 1,5x à 10x) œil

5 Agrandir plus...le microscope! B A A1 Rétine Objectif B1 Oculaire œil Image à l infini Grossissement = grossissement de l objectif x grossissement de l oculaire agrandissement jusqu à 2000x! Agrandir ne suffit pas! Résolution! Grossissement identique!

6 La lumière : Vitesse de propagation : c = m.s -1 Onde électromagnétique Longueur d onde (couleur) Spectre visible Interférences

7 Diffraction La tache de diffraction diminue quand diminue Diffraction par une lentille Source ponctuelle idéale Ecran Figure de diffraction Objectif Point lumineux Distribution 3D de l intensité lumineuse : Point Spread Function (PSF)

8 Résolution longitudinale Distance minimale entre deux points de l échantillon dont l image est distinguable Critère de Rayleigh : d = N.A. (Formule pour objets lumineux) N.A. : ouverture numérique de l objectif Ex. : NA = 1.4, = 520 nm (GFP, FITC ) d = 226 nm (œil humain : d ~ 100 µm) La lumière violette donne une meilleure résolution que la rouge NA 0.95 d = nm d = nm Ouverture numérique N.A. = n sin(µ) n : indice de réfraction µ : demi-angle du cône d illumination N.A. 0,12 0,87 faible résolution haute résolution

9 Profondeur de champ Distance entre le point le plus haut et le point le plus bas de la préparation qui donne une image nette. (épaisseur de la tranche optique) Dépend de l ouverture numérique : la profondeur de champ diminue lorsque l ouverture numérique augmente. DOF = 0,61 NA tan Ex. : 2,5 µm à l objectif x10 (NA 0.3) 0,55 µm à l objectif x100 à immersion (NA 1.4) d But de la microscopie La microscopie en transmission Techniques de contraste La microscopie de fluorescence Quelques aspects avancés

10 Anatomie du microscope Le microscope à transmission Oculaires Objectifs Echantillon Condenseur Lampe Sources de lumière Soleil, lampe à incandescence, lampe halogène,...

11 Illumination Eclairage de Köhler : diaphragme de champ diaphragme d ouverture lentille d illumination condenseur objectif oculaire But : éclairage uniforme 2 conjugaisons nécessaires : filament foyer objet du condenseur diaphragme de champ échantillon Condenseur d = 1,22 N.A. obj + N.A. cond. (Objet éclairé)

12 Objectifs Principales spécifications : - ouverture numérique (ex. : 1,4) - grandissement (ex.: 60x) - milieu d immersion (air, eau, huile) - type de correction Les aberrations Sphérique Chromatique Courbure de champ

13 Différents types d objectifs suivant l application : Objective Type Spherical Aberration Chromatic Aberration Field Curvature Achromat 1 Color 546nm 2 Colors 486&656 nm No Plan Achromat 1 Color 2 Colors Yes Fluorite Semiapochromat 2-3 Colors 2-3 Colors No Plan Fluorite 3-4 Colors 2-4 Colors Yes Plan Apochromat 3-4 Colors 4-5 Colors Yes Objectif «à l infini» B A A2 A1 Rétine Objectif Lentille de tube B1 Oculaire œil B2

14 Objectifs corrigés à l infini Objectifs à immersion Réfraction

15 Oculaires Grossissement : 10-20x Nombre de champ (field number) : détermine la taille du champ observé But de la microscopie La microscopie en transmission Techniques de contraste La microscopie de fluorescence Quelques aspects avancés

16 Autres techniques de contraste Transmission Contraste de phase Contraste interférentiel (DIC/Nomarski) Le contraste de phase (Zernike, Nobel 1953) Déphasage à la traversée d un milieu d indice n2 > n1

17 Le contraste dépend des différences de longueur du chemin optique dans l échantillon Contraste interférentiel (DIC, Nomarski) Le contraste dépend des différences de vitesse de variation du chemin optique dans l échantillon! Ce n est pas une image topologique!

18 Comparaison contraste de phase/nomarski Contraste de phase Permet d utiliser le plastique (boîte de Petri par ex.) et des échantillons biréfringents Sensible au chemin optique parcouru Halos autour des objets, mais certains objets plus visibles (noyaux) Insensible à l orientation des structures (contraste «isotrope») Nomarski Limité au verre (notamment couvercle incubateur) Sensible à des variations (gradients) d indice Pas d halos autour des objets Utilisation optimale de l ouverture numérique, donc meilleure résolution Sensible à l orientation des structures (effet azimutal) Effet de coupe optique (analyse 3D) Plus cher! But de la microscopie La microscopie en transmission Techniques de contraste La microscopie de fluorescence Quelques aspects avancés

19 Notions sur la fluorescence (Voir cours Spencer) Niveaux d énergie Etat singulet Etat triplet S 2 T 2 Absorption T 1 Conversion intersystème ( sec) Fluorescence ( sec) S 1 Absorption S 0 Décalage de Stockes (séparation des spectres?) Anatomie du microscope

20 Sources de lumière Autres type de lampes Lampe à vapeur de mercure Spectre de la lumière émise Filtres Types de filtres : - dichroïque (passe-haut ou passe-bas) : permet de séparer la lumière en deux gammes spectrales - passe-bande : ne laisse passer qu une bande spectrale ± large Cube à filtre pour microscope

21 Problèmes possibles Sélection de la couleur dans le microscope

22 Exemple d image Cellules 3T3. Noyau (DAPI), mitochondries (MitoTracker), actine (phalloïdine-alexa488) Limites du microscope classique Point Spread Function (PSF) mauvaise discrimination des objets suivant l axe optique (profondeur) S affranchir de la lumière provenant des autres plans de l échantillon : la microscopie confocale!

23 Quelques aspects avancés François Waharte Imagerie Cellulaire et Tissulaire UMR144 - Institut Curie, Paris Formation Microscopie Confocale, Gif-sur- Yvette, 6 octobre 2008 Contrôle Source Source Sélection spectrale Image Détecteur

24 Une autre source pour la fluorescence : les lasers LASER = Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation (Amplification de lumière par émission stimulée) Miroir Pompage Milieu actif (amplificateur) Lumière laser Résonateur Génération de la lumière laser Emission stimulée Inversion de population E 1 On veut N 1 > N 0, mais : N 1 /N 0 = exp[-(e 1 -E 0 )/kt] toujours < 1 (Loi de Boltzmann) E 0 Système à deux niveaux non utilisable pour le laser E 2 rapide Système à trois ou quatre niveaux E 1 lent Transition laser E 0

25 Pompage - optique (Lasers rubis, Yag, Ti:S) : lampe flash, autre laser - électronique (Laser He-Ne): décharges électriques, faisceau d électrons, - chimique : combustion, - Amplification et génération de la lumière laser Cavité laser Lumière laser Condition pour l obtention de lumière laser : gain > pertes dans la cavité

26 Propriétés de la lumière laser Lumière «ordinaire» Lumière laser Plurichromatique Monochromatique Sans direction Directionnelle Désordonnée Cohérente Divergence du faisceau Profil gaussien Les différents types de laser

27 Utilisation pratique Réglages Choix du laser en fonction du fluorophore Couplage laser - fibre optique dérive possible en température Sécurité Lumière puissante, donc danger! porter des lunettes de protection adaptées à la longueur d onde du laser si non-fibré Contrôle Contrôle Source Sélection spectrale Image Détecteur

28 Sélection par modulation acousto-optique Principe Onde acoustique dans un cristal AOTF (Acousto-Optical Tunable Filter) L angle de diffraction dépend de : sin( ) = 2 sélection spectrale! sélection de la longueur d onde en choisissant la fréquence de l onde acoustique (F1 - F6)

29 Utilisation en microscopie Choix de la puissance pour chaque raie laser AOTF Bloqueur Vers le microscope Avantages de l AOTF - utilisation de plusieurs raies laser simultanément - puissance de chaque raie controlée indépendamment - basculement entre raies en quelques microsecondes - transmission supérieure à 90 %

30 AOBS (Acousto-Optical Beam Splitter) Utilisation en microscopie - utilisation plus souple - meilleure transmission et séparation des spectres

31 Ajout de nouvelles raies Avec un beam splitter Avec un AOBS

32 Contrôle Source Sélection Sélection spectrale spectrale Image Détecteur Sélection spectrale Techniques existantes : Filtres Utilisation d un prisme Réseau de diffraction Modulation acousto-optique (AOTF, AOBS)

33 Spectrophotomètre basé sur un prisme Performances - Bonne transmission (85 % ici) - Coupures franches - Choix précis de la bande spectrale permet de faire les spectres d émission des fluorophores!

34 Utilisation de réseaux de diffraction Utilisation de réseaux de diffraction Optimisation du signal transmis par rotation de polarisation

35 Contrôle Source Sélection spectrale Image Détecteur Détecteur Les photomultiplicateurs Structure Les détecteurs Types de PM

36 Photomultiplicateur multianode Acquisition spectrale (META Zeiss, Nikon, ) Photocathode Photocathode Photon Effet photoélectrique (Einstein, 1905, Prix Nobel) photo-électron Les dynodes e - e - e - Multiplication du nombre d électrons

37 Fonctionnement lumière (fluorescence) Signal électrique (amplifié) gain : 10 6! Numérisation (image) Réponse spectrale quantification de la fluorescence difficile!

38 Capteur CCD (Charge-Coupled Device) Capteur Photosite Technique de transfert de charge

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