Synthèse du premier brin d ADNc

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1 Synthèse du premier brin d ADNc (1 er juin 2004) L ARN total doit avoir une concentration d au moins 2 µg/µl pour la synthèse du premier brin d ADNc. Si la concentration d ARN total est inférieure à 2 µg/µl, une précipitation de l ARN total est nécessaire. L amorce T 7 -T 24 se lie à la terminaison 3 de l ARNm car elle comporte une séquence de nucléotides T (oligo dt) qui s hybride à la séquence poly- A de l ARNm. Cela permet à la transcriptase inverse SSII de transcrire l ARNm dans la direction 5 à 3. L amorce contient également un promoteur T7 essentiel à la production d ARN. Précipitation (au besoin) Pipettez un volume contenant 20 µg d ARN dans un tube de 1,5 ml, puis procédez comme suit. a) Ajoutez de l eau sans ARNase pour arriver à un volume total de 50 µl (ARN + eau = 50 µl). b) Ajoutez 1/10 du volume de NaAc 3 M (50/10 = 5 µl). Mélangez, puis centrifugez. c) Ajoutez 3 fois le volume d éthanol 100 % à la température de la pièce (50*3 = 150 µl). Mélangez au vortex. d) Déposez sur de la glace carbonique ou mettez dans un congélateur à -80 C pendant 30 minutes. e) Centrifugez à vitesse maximum ( tr/min) à 4 C pendant 15 minutes. f) Lavez avec 100 µl d éthanol 75 % à la température de la pièce. g) Centrifugez à vitesse maximum ( tr/min) à 4 C pendant 5 minutes. h) Aspirez l éthanol, centrifugez, puis aspirez l éthanol résiduel. i) Séchez à l air 5 minutes puis diluez dans 10 µl d eau sans ARNase. Si la concentration d ARN total est de 2 µg/µl 1. Pipettez un volume contenant 20 µg d ARN dans un tube de 1,5 ml. Ajoutez de l eau sans ARNase* pour arriver à un volume total de 10 µl. Ajoutez 1 µl d amorce T 7 - T pmole/µl. Mélangez, puis centrifugez. 2. Chauffez à 70 C pendant 10 minutes. Déposez immédiatement sur la glace pour empêcher la formation de structures secondaires. Laissez sur la glace 2 minutes. Centrifugez. 3. Ajoutez : Réactif Volume (n = 1) Tampon premier brin 5X 4 µl DTT 0,1 M 2 µl dntp 10 mm 1 µl Centrifugez puis incubez à 37 C pendant 2 minutes. 4. Ajoutez à chaque tube :

2 2 µl Transcriptase inverse SSII (400 U) Mélangez bien, puis centrifugez. 6. Incubez à 42 C pendant 1 heure. (L ARN fait moins de structures secondaires à 42 C qu à 37 C.) *À toutes les étapes de ce protocole, utilisez de l eau distillée commerciale sans ADNase ni ARNase. De l eau DEPC est employée dans l appareil de fluides et la préparation de certains tampons, comme le tampon A.

3 Synthèse du deuxième brin d ADNc L ARNase H est employée pour couper le brin d ARN de l hybride ARN-ADN produit à l étape précédente. L ADN polymérase I se lie au niveau des coupures pour amorcer la synthèse du deuxième brin d ADNc. Une ligase est employée pour réparer les coupures. L ADN polymérase T4 est ajoutée par la suite pour former des extrémités franches, et enfin de l EDTA est ajouté pour interrompre la réaction. L ADNc peut être conservé jusqu à trois mois à -80 C, après que l EDTA a été ajouté. 1. Solution de synthèse du deuxième brin (130 µl pour une réaction) Réactif Volume (n = 1) Eau sans ARNase 91 µl Tampon de synthèse du deuxième brin 30 µl dntp 10 mm 3 µl ADN ligase 1 µl (10 U) ADN polymérase I 4 µl (40 U) ARNase H 1 µl (2 U) 2. Centrifugez les tubes contenant la solution de synthèse du premier brin et mettezles sur la glace. Ajoutez 130 µl de solution de synthèse du deuxième brin dans chaque tube. 3. Mélangez, puis centrifugez. Incubez 2 heures à 16 C. 4. Ajoutez 2 µl d ADN polymérase T4 (10 U), puis incubez 5 minutes à 16 C. 5. Ajoutez 10 µl d EDTA 0,5 M pour interrompre la réaction.

4 Lavage de l ADNc double brin (Au moyen d un gel à phase stationnaire) Un lavage des ADNc doubles brins, consistant en une extraction au phénol suivie d une précipitation à l éthanol, est requis pour éliminer les enzymes et l excès de dntp, ajoutés lors des étapes de synthèse des deux brins d ADNc. Après la centrifugation du tube, la phase organique et l interphase sont emprisonnées sous le gel à phase stationnaire, tandis que la phase aqueuse demeure au-dessus du gel, ce qui prévient la contamination par le phénol. 1. Centrifugez les tubes de gel à phase stationnaire (PLG) 20 à 30 secondes à vitesse maximum. 2. Ajoutez 162 µl de phénol-chloroforme dans chaque tube de synthèse du deuxième brin, puis mélangez au vortex. Centrifugez brièvement. 3. Transférez le phénol et la phase aqueuse dans un tube PLG préalablement centrifugé, puis centrifugez 2 à 3 minutes. 4. Transférez le surnageant (environ 150 µl) dans un tube propre de 1,5 ml, puis ajoutez : Réactif Volume (n = 1) Glycogène 1 µl NH 4 Ac 7,5 M 0,5X (75 µl) Ajoutez les composantes suivantes à chaque tube. Éthanol -20 C (100 %) 2,5X (375 µl) Nota : Si vous n avez que du NaAc 3 M, ajoutez-en à la solution l équivalent de 1/10 du volume du surnageant (p. ex, ajoutez 15 µl de NaAc 3M au lieu de 75 µl de NH 4 Ac 7,5 M) 5. Agitez au vortex, puis centrifugez immédiatement (à vitesse maximum) 20 minutes à la température de la pièce. 6. Lavez le précipitat deux fois avec 500 µl d éthanol 80 % (-20 C), en centrifugeant 10 minutes entre chaque lavage. 7. Séchez le précipitat à l air. 8. Diluez dans 20 µl d eau, puis centrifugez.

5 Transcription in vitro (TIV) (Au moyen du ENZO BioArray High Yield RT Labeling Kit) Pour produire l ARNc marqué, l ADNc à double brin est transcrit par l ARN polymérase T7, qui synthétise un ARN anti-sens en se liant au site promoteur T7 inclu dans l amorce T 7 -T 24 de l ADNc. La molécule d ARNc, également nommée «cible», est marquée au moyen de ribonucléotides biotinylés. Solution de réaction : Réactif Volume (n = 1) Eau sans ARNase 2 µl Tampon de réaction HY (10X) 4 µl Ribonucléotides biotinylés (10X) 4 µl DTT (10X) 4 µl Inhibiteur d ARNase (10X) 4 µl ARN polymérase T7 (20X) 2 µl 1. Pour chaque réaction : ADN dans 20 µl d eau sans ARNase 20 µl de solution de réaction 2. Centrifugez le tube et déposez-le dans un bain d eau à 37 C. Incubez 4 à 5 heures et agitez délicatement (en tapotant le tube puis en centrifugeant) à intervalles de minutes.

6 Lavage de l ARNc (Au moyen de RNeasy) Le lavage de l ARNc élimine les ribonucléotides marqués non polymérisés. Au départ, l ARNc se lie à la membrane RNeasy en raison du contenu élevé en sels du tampon RLT. Une fois que l excès de ribonucléotides est enlevé, l ARNc est élué de la membrane avec de l eau sans ARNase. 1. Purifiez la moitié de l ARNc Réactif Volume (n = 1) ARNc 20 µl Eau sans ARNase 80 µl Tampon RLT (avec ß-ME*, 10 µl/1 ml) 350 µl Mélangez, puis centrifugez brièvement Éthanol % 250 µl Mélangez, mais ne centrifugez pas pour éviter la précipitation de l ARN *Le ß-ME est nécessaire pour extraire l ARN du tissu ou de la culture cellulaire ; cependant, il peut être omis à cette étape. 2. Mettez l échantillon dans la colonne de centrifugation RNeasy, puis centrifugez 15 secondes à tr/min, à la température de la pièce. 3. Remettez l éluat dans la colonne et centrifugez de nouveau 15 secondes à tr/min, à la température de la pièce. 4. Déposez la colonne sur un nouveau tube collecteur de 2 ml. Pipettez 500 µl de tampon de lavage RPE (avec éthanol), puis centrifugez 15 secondes à tr/min, à la température de la pièce. 5. Jetez l éluat, mais utilisez le même tube collecteur de 2 ml pour l étape suivante. Pipettez 500 µl de tampon de lavage RPE, puis centrifugez 2 minutes à vitesse maximum, à la température de la pièce. 6. Déposez la colonne sur un nouveau tube collecteur de 2 ml (ou sur un tube de 1,5 ml dont le capuchon aura été enlevé). Mettez 60 µl d eau sans ARNase directement sur le filtre de la colonne et laissez reposer 2 minutes à la température de la pièce. Centrifugez 15 secondes à tr/min. 7. Mettez l éluat dans la colonne et centrifugez 2 minutes à tr/min. 8. Transférez l éluat dans des tubes de 1,5 ml et déposez sur de la glace. 9. Faites migrer les échantillons originaux d ARNc dans un gel d agarose 1 % ou analysez-les au Bioanalyzer. On devrait normalement observer des fragments d une

7 longueur de 500 à 3000 paires de bases dans le gel. La présence de fragments de plus petite taille pourrait indiquer une dégradation. 10. Mesurez la concentration d ARNc au moyen d un spectrophotomètre. Un facteur de dilution initial de 50 à 125 est recommandé. Nota : nm = 40 µg/ml d ARN ou 0,04 µg/µl d ARN Avec un facteur de dilution de 50, une DO de 0,3 correspond à un échantillon d une concentration de : 50 * 0,3 * 0,04 = 0,6 µg/µl

8 Fragmentation de l ARNc Un tampon de fragmentation, qui contient principalement des sels, est employé pour fragmenter 20 µg d ARNc. Les fragments finaux devraient avoir une longueur d environ 100 pb. 1. Ajoutez les composantes suivantes à chaque tube à PCR. 20 µg d ARNc Tampon de fragmentation 5X (voir le manuel Affymetrix pour le protocole de composition) 12 µl Eau sans ARNase Volume final 60 µl 2. Mélangez avec une pipette. 3. Chauffez 35 minutes à 95 C. (Utilisez le programme FRAG du thermocycleur. Il est préférable d utiliser les thermocycleurs PTC-100 avec les couvercles blancs, étant donné qu une évaporation importante a été remarquée dans les autres thermocycleurs.)

9 Préparation de la cible d hybridation Quinze microgrammes d ARNc fragmenté sont requis pour chaque hybridation. De l ADN de sperme de hareng est ajouté à la solution pour bloquer l hybridation non spécifique par compétition. L oligo contrôle B2 forme un motif en damier sur la bordure de la micro-puce, observable au balayage optique. L ajout d un anticorps biotinylé et de SAPE à la micro-puce, après la coloration initiale avec la SAPE seule, amplifie l intensité du signal. 1. Ajoutez 200 µl de tampon d hybridation 1X dans la micro-puce à la température de la pièce (ou 80 µl si vous utilisez une micro-puce de test). Incubez la micro-puce à 45 C pendant 10 minutes avec rotation (60 tr/min). Remarque sur le chargement de l échantillon dans la micro-puce : Insérez un embout de 10 µl dans chacune des ouvertures de caoutchouc au dos de la micro-puce. Au moyen d un long embout de chargement pour gel, injectez l échantillon dans l ouverture située au coin inférieur gauche de la micro-puce. 2. Mettez dans un tube de 1,5 ml : Tampon d hybridation 2X 150 µl ADN de sperme de hareng (10 mg/ml) 3 µl BSA acétylée (50 mg/ml) 3 µl Contrôle eucaryote 20X 15 µl Oligo contrôle B2 (3 nm) 5 µl ARNc fragmenté 15 µg (soit 45 µl d ARNc fragmenté) Eau sans ARNase 79 µl Volume final de 300 µl 3. Incubez la solution d ARNc cible d abord 5 minutes à 99 C, puis 5 minutes à 45 C. Centrifugez 5 minutes à vitesse maximum. 4. Retirez le tampon d hybridation de la micro-puce, puis ajoutez 200 µl de solution d ARNc cible. 5. Incubez la micro-puce à 45 C pendant 16 heures avec rotation (60 tr/min). 6. Transférez la solution d ARNc cible de la micro-puce au tube original (conservez l échantillon d ARNc à -80 C pour la prochaine hybridation). Ajoutez 200 µl de tampon de lavage A dans la micro-puce. La solution d hybridation ainsi conservée peut être réutilisée deux fois sans dégradation notable du signal. 7. Préparez la solution de coloration et mettez-la dans des tubes eppendorf ambrés (la solution de coloration est utilisée avant et après la coloration par anticorps, soit la coloration 1 et la coloration 3, respectivement).

10 Réactif Volume (n = 1) Tampon de coloration 2X 300 µl BSA acétylée (50 mg/ml) 24 µl (concentration finale 2 mg/ml) SAPE 6 µl Eau sans ARNase 270 µl Volume final 600 µl 8. Préparez la solution d anticorps et mettez-la dans des tubes eppendorf (transparents). Réactif Volume (n = 1) Tampon de coloration 2X 300 µl BSA acétylée (50 mg/ml) 24 µl (concentration finale 2 mg/ml) IgG de chèvre 10 mg/ml 6 µl Anticorps biotinylés 0,5 mg/ml 3,6 µl Eau sans ARNase 266,4 µl Volume final 600,0 µl

11 Coloration et balayage optique 1. Allumez les appareils Scanner et Fluidics Station, puis lancez le programme GeneChip. 2. Créez un dossier dans le répertoire «Today» en suivant la nomenclature suivante. ASAAMMJJ ; p. ex. AS011230ba AS : Initiales de l usager (Alya a Sammak) AAMMJJ : Date (011230) Le dossier «Today» se trouve dans : H:/ChipData/Today sur Tournesol. Le dossier «Today» se trouve dans : E:/ChipData/Today sur Jonquille. 3. Pour que le programme MicroArray Suite dirige les fichiers de résultats vers le dossier qui a été créé à l étape précédente, allez à : Tools/Defaults/File Locations/Experiment Data et mettez le dossier que vous venez de créer comme dossier par défaut (default location). 4. Sélectionnez Experiment Info dans Run. Entrez l information A) Nom de l expérience GBYYMMDDCHNN: GB: Initiales de l usager (GeBing) AAMMJJ : Date (040216) MP : Type de micro-puce** NN : Numéro (01, 02...) ** Human HµgeneFL Array Human U95 A ou B ou C ou D ou E Human U133 A ou B Human U133+2 Murine U74 A ou B ou C Murine MOE430 A ou B Murine MOE430v2 Rat U34 A ou B ou C Rat RAE230 A ou B Rat RAE230v2 Yeast Genome S98 Array Arabidopsis Genome Array ATH1 Canine Genome Array Drosophila P53 Zebrafish ChipGene Test3 HGF HGA, HGB, HGC, HGD, HE H133A, H133B H133P MGA, MGB, MGC MOA, MOB MOT RGA, RGB, RGC RAA, RAB RAT YGS AtG ATH DOG DRO P53 ZEB GT3

12 B) Probe array type Indiquez le type de micro-puce dans le menu qui paraît à l écran. C) Probe array lot Tapez le numéro de lot de la micro-puce. D) Operator name Tapez vos initiales. E) Sample type Indiquez la méthode d extraction de l ARN. F) Sample description Tapez le nom de l échantillon. 5. Allumez le laser au moins 15 minutes avant de commencer le balayage optique. Sélectionnez Scanner dans Run. Cliquez sur TurnOn Laser 6. Sélectionnez Fluidics dans Run. Amorcez le système Fluidics Station : Changez les bouteilles (utilisez les tampons de lavage A et B) Sélectionnez le protocole Prime, puis Run. 7. Coloration et lavage 1. Sélectionnez le protocole EukGE-WS2v4. 2. Insérez la micro-puce dans le bloc de lavage. 3. Mettez la solution de coloration 1 (tube ambré). Cette procédure prend environ 40 minutes. 4. Ajoutez la solution d anticorps. À la fin de cette étape, (10 minutes), remplacez la solution d anticorps par la solution de coloration 3. Si la micro-puce contient des bulles à la fin de cette procédure, remettez simplement la micro-puce dans le bloc de lavage et recommencez la procédure. La Fluidic Station purgera automatiquement la micro-puce et la remplira de nouveau avec du tampon de lavage A. Répétez la procédure jusqu à ce que la micropuce ne contienne plus de bulles. 5. Bouchez les ouvertures de la micro-puce avec des Tough-spots. Essuyez la surface de verre avec une Kimwipe et de l eau pour enlever la poussière et autres saletés. 6. Sélectionnez Scanner dans Run et choisissez le nom du balayage. Tapez 2 dans Number of scans, puis cliquez sur Start. Insérez la micro-puce, puis cliquez sur OK. 8. N oubliez pas d éteindre le laser après la dernière lecture. Laissez le laser refroidir 15 minutes avant d éteindre le lecteur optique. 9. Une fois que toutes les micro-puces ont été lues, rendez-vous à Tools/Analysis settings/expression, indiquez le type de micro-puce et mettez les autres paramètres par défaut. Allez ensuite à Run/Batch analysis/add et chargez les fichiers appropriés. Appuyez sur Analyze.

13 10. Ouvrez chaque fichier et sauvegardez la section Metrics. Ouvrez chaque fichier séquentiellement et sauvegardez la section Pivot en employant la nomenclature décrite précédemment.