Hantavirus Puumala IgG/IgM ELISA
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- Anne-Marie Vachon
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1 Fiche technique Hantavirus Puumala IgG/IgM ELISA Test immuno-enzymatique pour la détermination qualitative des anticorps IgG/IgM contre le sérotype Puumala d'hantavirus dans le sérum humain. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)
2 1. BUT DU TEST Test immuno-enzymatique pour la détermination qualitative des anticorps IgG/IgM contre le sérotype Puumala d'hantavirus dans le sérum humain. Le test ELISA est approprié pour la détection des anticorps IgG ou IgM spécifiques du virus Puumala, dans les cas de suspicion de néphropathie épidémique (NE), la variante européenne de fièvre hémorragique avec syndrome rénal (HFRS). La détection d'infection par le virus Hantaan ou d'autres hantavirus inconnus est encore limitée (voir Interprétation des résultats / Efficacité du diagnostic). 2. SOMMAIRE ET INTRODUCTION La néphropathie endémique (NE) est la forme scandinave de la FHSR, causée par l infection à hantavirus puumala. L évolution de la maladie a une gravité très variable. Le plus souvent, la durée de l incubation est de 10 à 20 jours. Elle débute par un syndrome de type grippal. Les autres manifestations cliniques comportent des douleurs abdominales et lombaires ainsi qu'une néphropathie interstitielle aiguë limitée et transitoire. Les résultats de laboratoire habituels comportent une thrombocytopénie et une leucocytose. En comparaison avec la fièvre hémorragique avec syndrome rénal (FHSR), causée par une hantavirose, la néphropathie endémique (NE) est une affection plus bénigne. La NE est fréquente en Finlande, dans toute la Scandinavie, en Russie de l Ouest, dans les Balkans et dans de nombreuses régions de l Europe occidentale. Le virus puumala est transmis à l homme par contacts directs avec des rongeurs (campagnol amphibie, campagnol roussâtre), leurs excréments et des aérosols. Les militaires, les fermiers et les campeurs sont les populations particulièrement à risque. 3. PRINCIPE DU TEST La plaque de microtitration est recouverte de protéine recombinante de nucléocapside de virus Puumala. Pour la détermination des anticorps de type IgM, le sérum du patient doit être incubé avec un absorbant des IgG avant de débuter la procédure de test, de façon à éliminer les réactions non spécifiques causées par les IgG ou le facteur rhumatoïde. Lors de l'incubation de l'échantillon l'anticorps à mettre en évidence forme des complexes immuns avec l'antigène recombinant fixé. Après le lavage, les anticorps IgG et/ou IgM spécifiques sont détectés avec le conjugué anti-igg humaines (ou anti-igm respectivement) lié à la peroxydase. L'addition de la solution substrat conduit à une réaction colorée qui est proportionnelle aux anticorps spécifiquement liés. L'absorbance est alors mesurée spectrophotométriquement. 4. PRECAUTIONS D EMPLOI 1. Seulement prévu au diagnostic in-vitro et à l usage professionnel. 2. Lire les instructions complètement et avec attention avant de commencer le test. Utiliser la version valide de la fiche technique incluse dans le kit. S assurer que tout a été bien compris. 3. Dans le cas de dommages importants de l emballage du kit, veuillez contacter IBL ou votre fournisseur sous forme écrite, une semaine au plus tard après avoir reçu le kit. N utilisez pas les composants abîmés pour un test, mettez-les de côté et en sécurité pour les besoins éventuels liés à la plainte. 4. Suivez le numéro du lot et la date de péremption. Ne pas mélanger les réactifs de différents lots. Ne pas utiliser de réactifs périmés. 5. Suivre les bonnes pratiques de laboratoire et les directives de sécurité. Porter des blouses de laboratoire, gants en latex à usage unique et lunettes de protection si nécessaire. 6. Les réactifs de ce kit contiennent du matériel dangereux pouvant irriter les yeux et la peau. Consulter le MATERIEL FOURNI et les étiquettes pour les détails. Les Fiches de Données de Sécurité pour ce produit sont disponibles sur le site internet IBL ou sur demande particulière à IBL. 7. Les réactifs chimiques préparés ou utilisés doivent être traités comme matériel dangereux en accord avec les directives et règlements nationaux de sécurité pour tout matériel à risque. 8. Le personnel de nettoyage doit être formé par des professionnels en ce qui concerne les risques potentiels et la manipulation des produits. 9. Eviter tout contact avec la solution d arrêt. Elle peut provoquer des irritations et brûlures cutanées. 10. Tous les réactifs de ce kit contenant des sérums ou plasma humains ont été testés et confirmés négatifs à anti-hiv I/II, HbsAg et anti-hcv. Tous les réactifs doivent être considérés comme potentiellement contaminants et utilisés en tant que tel. Version / 7
3 5. STOCKAGE ET STABILITE Le kit est envoyé à température ambiante et doit être stocké à 2-8 C. À conserver à l abri de la chaleur ou de la lumière directe. Avant ouverture, les réactifs sont stables jusqu'à la date d'expiration indiquée. Le stockage et la stabilité des échantillons et réactifs préparés sont indiqués dans les chapitres correspondants. Les barrettes de la microplaque sont stables jusqu à la date de péremption du kit en étant stockées entre 2 C et 8 C dans le sachet déjà ouvert, mais hermétiquement refermé. 6. COLLECTE ET STOCKAGE DES ECHANTILLONS Sérum humain Observer les précautions habituelles de prises de sang. Il est important de préserver l intégrité chimique d un échantillon sanguin, de sa collecte jusqu à son analyse. Ne pas utiliser d échantillons fortement hémolysés, ictériques ou lipémiques. Les échantillons d apparence turbide doivent être centrifugés avant analyse pour éliminer toutes particules gênantes. Le sérum humain doit être utilisé comme échantillon pour le test Hantavirus (Puumala) IgG/IgM ELISA. Stockage: 2-8 C -20 C (Aliquots) À conserver à l abri de la chaleur ou de la lumière directe. Stabilité: 5 jours 12 mois Eviter tout cycles de congélation / décongélation répétés. 7. MATERIEL FOURNI Quantité Symbole Composant 1 x 12 x 8 MTP 1 x 0.75 ml ANTI IgG CONJ CONC 1 x 0.75 ml ANTI IgM CONJ CONC 1 x 1.5 ml CONTROL + IgG 1 x 1.5 ml REFCONTROL IgG 1 x 1.5 ml CONTROL + IgM 1 x 1.5 ml REFCONTROL IgM 1 x 1.9 ml CONTROL- 1 x 15 ml DILBUF CONC 1 x 100 ml WASHBUF CONC 1 x 1.5 ml RF-AB 1 x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP Microplaque Prêt(e) à l emploi. Cavités sécables. Recouvert de d antigène recombinant Puumala (N120). Conjugué Enzymatique Concentré (20x) Anti-IgG conjugués à de la peroxydase. Conjugué Enzymatique Concentré (20x) Anti-IgM conjugués à de la peroxydase. Contrôle Positif IgG Contrôle de Référence IgG Contrôle Positif IgM Contrôle de Référence IgM Contrôle Négatif IgM Tampon Diluant Concentré (20x) Coloré en rouge. Contient: PBS ph 7.4, 0.01 % (w/v) Thimerosal, détergents. Tampon de Lavage Concentré (10x) Contient: tampon phosphate. Absorbant-FR Prêt(e) à l emploi. Contient: anticorps anti-igg humains, stabilisateurs, conservateurs. Solution Substrat TMB Prêt(e) à l emploi. Contient: TMB (tetramethylbenzidine). Solution d Arrêt TMB Prêt(e) à l emploi. Contient: 0.5 M H 2SO 4. 1 x FOIL Feuille Adhésive Version / 7
4 8. MATERIEL NECESSITE MAIS NON FOURNI 1. Pipettes (Multipette Eppendorf ou matériel similaire, CV < 3 %) Volumes: 5; 20; 50; 100; 200; 1000 µl 2. Vortex 3. Incubateur, 37 C 4. Tubes pour la dilution des échantillons 5. Micropipette à 8-canaux avec réservoirs pour réactifs 6. Bouteille pour lavage, système automatique ou semi-automatique pour le lavage de microplaque 7. Lecteur de microplaque capable de lire l absorbance à 450 nm (longueur d onde de référence nm) 8. Eau bidistillée ou désionisée 9. Papier absorbant, embouts de pipette et chronomètre 9. NOTES POUR LA PROCEDURE 1. Toute manipulation impropre des échantillons ou modification de la procédure du test peut influencer les résultats. Les volumes indiqués pour pipeter, les temps d incubation, températures et étapes de prétraitement doivent être strictement suivis selon les instructions. N utiliser que des pipettes et appareils calibrés. 2. Une fois que le test a commencé, toutes les étapes doivent être suivies sans interruption. S assurer que les réactifs, matériels et appareils nécessaires soient prêts au moment approprié. Amener tous les réactifs et échantillons à température ambiante (18-25 C) et mélanger doucement en tournant chaque flacon de réactif liquide et d échantillon avant emploi. Mélanger les réactifs sans former de mousse. 3. Eviter toute contamination des réactifs, pipettes et puits/tubes. Utiliser des nouveaux embouts de pipette en plastique pour chaque réactif, étalon ou échantillon. Ne pas interchanger les bouchons. Toujours refermer les flacons non utilisés. Ne pas réutiliser les puits/tubes ou réactifs. 4. Il est recommandé de doser les échantillons en double pour pouvoir identifier d éventuelles erreurs de pipetage. 5. Utiliser un schéma de pipetage pour vérifier la répartition appropriée de la plaque. 6. Le temps d incubation affecte les résultats. Tous les puits doivent être manipulés dans le même ordre et au même intervalle de temps. Il est recommandé d utiliser une micropipette à 8-cannaux pour pipeter une même solution dans tous les puits. 7. Le lavage de la microplaque est important. Des puits mal lavés provoqueront des résultats erronés. Il est recommandé d utiliser une pipette multicanaux ou un système de lavage de microplaque automatique. Ne pas laisser sécher les puits entre les incubations. Ne pas gratter les puits coatés pendant le rinçage ou l aspiration. Rincer et ajouter les réactifs avec précaution. Lors du rinçage, vérifier que tous les puits soient régulièrement remplis avec le tampon de lavage, et qu aucun reste ne soit ensuite visible. 8. L humidité affecte les puits/tubes coatés. Ne pas ouvrir le sachet avant que celui-ci n ait atteint la température ambiante. Les puits/tubes inutilisés doivent être rangés immédiatement dans le sachet refermé avec le dessiccateur. Version / 7
5 10. PREPARATIONS PREALABLES AU TEST Laisser le coffret revenir à température ambiante (18-25 C). Les tampons concentrés peuvent contenir des cristaux de sels qui se dissolvent rapidement à 37 C. Laisser les tampons revenir à température ambiante (18-25 C) avant de commencer le test Préparation des composants concentrés (Exemples pour 32 puits) Note: Diluer les volumes requis de réactifs directement avant usage! Diluer / Composant Volumes Diluant Relation Remarques Stockage Stabilité dissoudre Mélanger avec par ex. 3 ml DILBUF CONC 57 ml eau bidist. 1: C 1 semaine précaution Mélanger avec 10 ml WASHBUF CONC 90 ml eau bidist. 1: C 8 semaines précaution 200 µl ANTI IgG CONJ CONC ou ANTI IgM CONJ CONC 3.8 ml Dilution des échantillons de patients IgG IgM Tampon de Lavage 1:20 Mélanger avec précaution - Jetées à la fin du test. doit être dilué avec Relation Remarques Stockage Stabilité en général Tampon Diluant 1:201 par ex. 10 µl Echantillon µl 2-8 C 6 semaines en général Tampon Diluant 1:201 par ex. 10 µl Echantillon µl Ajouter 15 µl de RF-AB à 250 µl de sérum dilué, incuber 30 min à C. Note: Les échantillons non dilués peuvent être stockés à -20 C pendant plusieurs mois. 11. PROCEDURE DU TEST 2 8 C 6 semaines 1. Pipeter 100 µl de contrôles positif, négatif, de référence non dilué et de sérum de patient dilué (éventuellement pré-traités avec RF-AB) dans chaque puits. 2. Couvrir la plaque avec une feuille adhésive. Incuber 45 min à 37 C. 3. Retirer la feuille adhésive. Jeter la solution d incubation. Laver la plaque 4 x avec 300 µl de Tampon de Lavage dilué. Egoutter l excès de solution en frappant la plaque retournée sur du papier absorbant. 4. Pipeter 100 µl de Conjugué Enzymatique dilué (IgG ou IgM) dans chaque puits. 5. Couvrir la plaque avec une feuille adhésive. Incuber 45 min à 37 C. 6. Retirer la feuille adhésive. Jeter la solution d incubation. Laver la plaque 4 x avec 300 µl de Tampon de Lavage dilué. Egoutter l excès de solution en frappant la plaque retournée sur du papier absorbant. 7. Utiliser une micropipette à 8 canaux si possible pour l ajout des Solutions Substrat et d Arrêt. Pipeter ces solutions à la même cadence. Utiliser un déplacement positif et éviter la formation de bulles d air. 8. Pipeter 100 µl de Solution Substrat TMB dans chaque puits. 9. Incuber 10 min à TA (18-25 C). 10. Arrêter la réaction substrat en ajoutant 100 µl de Solution d Arrêt TMB dans chaque puits 11. Mesurer la densité optique avec un photomètre à 450 nm dans les 20 min. (Longueur d onde de référence: nm) Version / 7
6 12. CONTROLE QUALITE Sur le certificat QC. Note : Les résultats du test ne sont valides que si le test a été réalisé en suivant les instructions. De plus, l utilisateur doit strictement se conformer aux règles BPL (bonnes pratiques de laboratoire) ou directives comparables. L utilisateur et/ou le laboratoire doivent disposer d un système validé pour établir un diagnostic conformément aux principes de BPL. Tous les étalons et contrôles du kit doivent être trouvés dans les gammes acceptables indiquées dans le certificat de Contrôle Qualité (QC). Si ces critères ne sont pas remplis, le test est non valide et il doit être répété. Chaque laboratoire devrait utiliser des échantillons connus comme contrôle supplémentaire. Il est recommandé de participer aux programmes de contrôle qualité appropriés. En cas de déviation des résultats, vérifier les origines éventuelles techniques: dates de péremption des réactifs (préparés), conditions de stockage, pipettes, appareils, conditions d incubation et méthodes de lavage. 13. CALCUL DES RESULTATS Pour le calcul des résultats, le rapport entre la densité optique (DO) du patient et le contrôle de référence est déterminé: DO échantillon de patient DO contrôle de référence Et interprété comme suit: a) Pour les anticorps IgG = Q Q < 1 Négatif: Pas d'anticorps IgG spécifiques du virus Puumala détectés. 1 < Q < 1.5 Pas d'interprétation claire possible. Le développement de la maladie doit être suivi après 10 jours. En cas de suspicion d'infection à hantavirus, il est recommandé de tester l'échantillon pour les anticorps IgM et/ou pour les anticorps du sérotype Hantaan. Q > 1.5 Positif: Anticorps IgG spécifiques du virus Puumala détectés. b) Pour les anticorps IgM Q < 1 Négatif: Pas d'anticorps IgM spécifiques du virus Puumala détectés. 1 < Q < 2 Pas d'interprétation claire possible. Le développement de la maladie doit être suivi après 10 jours. En cas de suspicion d'infection à hantavirus, il est recommandé de tester l'échantillon pour les anticorps du sérotype Hantaan. Q > 2 Positif: Anticorps IgM spécifiques du virus Puumala détectés. 14. INTERPRETATION DES RESULTATS a) IgG La sensibilité et la spécificité ont été contrôlés avec 80 sérums de sujets sains et 52 ont été testés positifs pour les anticorps IgG par la méthode de référence des sérums de patients. La sensibilité du virus Puumala était de 100% et la spécificité de 98.75%. b) IgM La sensibilité et la spécificité ont été contrôlés avec 80 sérums de sujets sains et 42 ont été testés positifs pour les anticorps IgM par la méthode de référence des sérums de patients. La sensibilité du virus Puumala était de 100% et la spécificité est également de 100%. 15. LIMITES DE LA PROCEDURE Les substances suivants n ont pas d effets significatifs sur les résultats du test jusqu aux concentrations indiquées ci-dessous: Hémoglobine Bilirubine Triglycérides 1.25 mg/ml 2.5 mg/ml 91 mg/ml Version / 7
7 16. PERFORMANCE Précision Intra-Essai (n = 20) Inter-Essai (n = 10) Inter-Lote (n = 3) Gamme (Q) Moyenne (%) Gamme CV (%) IgG IgM IgG IgM IgG IgM LITTERATURE DE REFERENCE DU PRODUIT 1. Niklasson B., et al. Hemorrhagic fever with renal syndrome: Evaluation of ELISA for detection of Puumala-virus-specific IgG and IgM. Res. Virol. (1990) 141: Settergren P., Juto P., Trollfors B., Wadell G. and Norrby S.R. Clinical characteristics of Nephropathia epidemica in Sweden: Prospective study of 74 cases. Reviews of Infectious Diseases Vol. 11 (1989) 3. Grcveska K., Polenakovic M., Oncevski A., Zografski Dj. and Gligic A.. Different pathohistological presentations of acute renal involvement in Puumala virus infection: report of two cases. Clinical Nephrology (1990) 34: Gött P., Zöller L., Yang S., Stohwasser R., Bautz E. K. F., Darai G.. Antigenicity of Hantavirus nucleocapsid proteins expressed in E. coli. Virus Res. (1991) 19: Zöller L., Yang S., Gött P., Bautz E.K.F., Darai G.. Use of recombinant nucleocapsid proteins of the Puumala and Nephropathia epidemica serotypes of Hantaviruses as immunodiagnostic antigens. J. Med. Virol. (1993) 39: Zöller L., Yang S., Gött P., Bautz E. K. F., Darai G.. A novel µ-capture ELISA based on recombinant proteins allows sensitive and specific diagnosis of hemorrhagic fever with renal syndrome. J. Clin. Microbiol.(1993) 31: Gött, P., Zöller, L., Darai, G., Bautz, E. K. F.: A major antigenic domain of hantaviruses is located on the aminoproximal site of the viral nucleocapsid protein. Virus Genes, 14 (1):31-40 (1997) 8. Clement J, Heyman P, McKenna P, Colson P, and Avsic-Zupanc T. The Hantaviruses in Europe: from the Bedside to the Bench. Emerging Infectious Diseases Vol. 3 No. 2 (April-June 1997). ncidod/ EID/ vol3no2/ clement.htm 9. Togni, G. u. a.: Präanalytik. Schweiz. Med. Forum (2002) 10. Wagner, B., Forslund T., Nephropathia Epidemica - Ein tückisches Souvenir aus Nordeuropa, Deutsches Ärzteblatt 96(21), S. A1414-A Alexeyev OA, Morozov VG: Neurological manifestations of hemorrhagic fever with renal syndrome caused by Puumala virus; review of 811 cases. Clin Infect Dis 20: , Maes P, Keyaerts E, Clement J, Bonnet V, Robert A, Van Ranst M., Detection of Puumala hantavirus antibody with ELISA using a recombinant truncated nucleocapsid protein expressed in Escherichia coli., Viral Immunol. 17(2): , 2004 Version / 7
8 18. PROTOCOLE RESUME PREPARATIONS PREALABLES AU TEST Dilution Volumes eau bidist. Tampon de Lavage Relation Remarques WASHBUF CONC 10 ml 90 ml 1:10 DILBUF CONC 3 ml 57 ml 1:20 ANTI IgG CONJ CONC ou ANTI IgM CONJ CONC 200 µl 3.8 ml 1:20 Exemple pour 32 puits DILUTION DES ÉCHANTILLONS Volumes Tampon Diluant Relation Sérum (IgG) 10 µl 2000 µl 1:201 Sérum (IgM) 10 µl 2000 µl 1:201 Remarques Ajouter 15 µl de RF-AB à 250 µl de sérum dilué, incuber 30 min à température ambiante (18-25 C). PROCEDURE DU TEST CONTROL+ IgG ou CONTROL+ IgM, REF CONTROL IgG ou REF CONTROL IgM, CONTROL- / Echantillons 100 µl Incuber 45 min à 37 C. Aspirer le contenu de chaque puits. Laver 4 fois avec 300 µl de WASHBUF et aspirer. Conjugué Enzymatique IgG ou IgM 100 µl Incuber 45 min à 37 C. Aspirer le contenu de chaque puits. Laver 4 fois avec 300 µl de WASHBUF et aspirer. TMB SUBS 100 µl Incuber 10 min à C. TMB STOP 100 µl Mesurer la densité optique avec un photomètre à 450 nm (longueur d onde de référence: nm). Version / 7
9 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /
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