Dossier : réceptologie

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1 Hétérodimères de récepteurs à sept domaines transmembranaires : enfin la démonstration de leur implication dans une pathologie V. Contesse* vitro sur des modèles de cellules transfectées révèlent notamment que la dimérisation s accompagne d une modification importante des mécanismes de transduction ainsi que d une pharmacologie originale, différente de la pharmacologie des deux récepteurs impliqués dans la formation du complexe (3). L importance physiologique des dimères de RCPGs restait cependant à démontrer. La signification fonctionnelle de ce phénomène est donc restée longtemps au centre des débats jusqu à l illustration récente de l existence d hétérodimères in vivo et de leur rôle dans une pathologie. L es récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G (RCPGs) jouent un rôle central dans la communication intercellulaire. Ils constituent une vaste famille de molécules qui sont capables de reconnaître pléthore de stimuli, allant de la lumière aux protéines, en passant par les ions ou encore les lipides. De ce fait, les RCPGs sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques et sont des cibles pharmacologiques privilégiées pour le développement de différentes classes de médicaments. * Institut fédératif de recherches multidisciplinaires sur les peptides (IFRMP 23), laboratoire de neuroendocrinologie cellulaire et moléculaire, INSERM U413, UA CNRS, université de Rouen. De nombreuses études réalisées in vitro suggèrent l existence et la fonctionnalité de récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) sous la forme de dimères (homodimères ou hétérodimères). Différentes techniques permettent l étude des dimères de RCPGs par des approches biochimiques (coimmunoprécipitation), biophysiques (BRET ou FRET) et de complémentations fonctionnelles (récepteurs chimères). Pour la première fois, un dimère de RCPGs, le complexe, a été identifié comme étant impliqué dans une pathologie. Chez les femmes enceintes prééclamptiques, une augmentation du nombre de dimères contribue à l hypertension artérielle associée à cette pathologie. Selon le modèle classique des propriétés fonctionnelles des RCPGs, la signalisation se fait grâce à trois partenaires moléculaires : un récepteur activé par son ligand spécifique, une protéine G et un effecteur. Nous savons maintenant que l existence de différentes isoformes pour les RCPGs, la diversité des protéines G et des systèmes enzymatiques intracellulaires effecteurs rendent plus complexes, mais aussi plus spécifiques, les réponses cellulaires à un ligand donné. Pour ajouter à cette diversité, de nombreuses études in vitro très récentes suggèrent l existence et la fonctionnalité de RCPGs sous la forme de dimères (1). Depuis le travail princeps de Maggio et al. (1993) concernant la dimérisation des récepteurs muscarinique M 3 /α 2 -adrénergiques (2), il ne fait maintenant plus aucun doute que la dimérisation est un mécanisme impliqué dans l activation et la régulation de plusieurs RCPGs. Les travaux réalisés in Mise en évidence de l existence de dimères de RCPGs Les modèles décrivant les interactions RCPGs-protéines G sont généralement fondés sur l existence d une stœchiométrie de type 1:1, i.e. un récepteur pour une protéine G. Cependant, de nombreuses études suggèrent que ces interactions peuvent impliquer plusieurs RCPGs, qu ils soient identiques formant ainsi un homodimère, ou encore, différents formant ainsi un hétérodimère. Face à la difficulté de l interprétation des résultats de ces expériences, l existence même et la signification pharmacologique des dimères de RCPGs sont longtemps restées sujettes à controverse. L utilisation des ADN complémentaires (ADNc) codant les différents RCPGs, couplée à des techniques récentes de biochimie et/ou de biophysique, a permis de lever une partie du voile sur l existence de ces dimères (tableau I). Techniques biochimiques Le principe de l immunoprécipitation sélective est la base de ces techniques biochimiques (4). Dans ce cas, l expérimentateur doit disposer d anticorps dirigés contre les deux RCPGs à l étude. Après avoir cotransfecté les deux ADNc codant les deux RCPGs (R-A et R-B) dans une lignée cellulaire hôte qui n exprime ni R-A ni R-B, l anticorps dirigé contre R-A est utilisé pour 114

2 isoler le complexe R-A/R-B par immunoprécipitation. Le second anticorps, dirigé contre R-B, sert à visualiser (à révéler) le complexe. Cette technique de co-immunoprécipitation peut cependant générer de nombreux faux positifs et doit être validée par la mise en place de contrôles de spécificité stricts (4). Cette approche a été employée avec succès pour la démonstration de l existence de nombreux hétérodimères de RCPGs (tableau I), dont celle du complexe (5). Techniques biophysiques Les approches biophysiques, telles que le FRET (Fluorescence Resonance Energy Tranfer) ou le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) (figure 1), sont complémentaires des techniques biochimiques et ont été développées dans le but de visualiser les dimères de RCPGs dans des cellules vivantes. Le principe repose sur le transfert d énergie entre un donneur (YFP, Yellow Fluorescent Protein pour le FRET ; luciférase pour le BRET), couplé au premier récepteur, et un accepteur (GFP, Green Fluorescent Protein pour le FRET et le BRET), couplé au second récepteur. Le transfert d énergie entre le donneur et l accepteur ne sera effectif que si les deux RCPGs sont suffisamment proches (distance inférieure à 50 Å). Le principe de la technique de BRET est présenté schématiquement sur la figure 1. Le développement de ces techniques a permis de démontrer formellement l existence d hétérodimères dans les cellules vivantes (1). Complémentations fonctionnelles Cette autre technique d étude des dimères de RCPGs consiste à produire des récepteurs chimères, comme cela a été initialement effectué pour les récepteurs muscariniques M 3 et adrénergique α 2 (2). Dans ce travail, les auteurs ont construit un récepteur M 3 /α 2 et un récepteur α 2 /M 3. Lorsqu ils sont transfectés séparément, aucun des deux récepteurs ne possède la capacité de lier ses ligands. En revanche, la cotransfection des récepteurs s accompagne d une liaison des ligands spécifiques et d une transduction du signal, suggérant ainsi l existence de la formation d un dimère des deux récepteurs chimères. La limite de cette technique réside dans le fait qu elle ne démontre pas directement l existence d un dimère mais prouve simplement qu une complémentation fonctionnelle est possible entre deux RCPGs. A substrat B Luc bleu GFP Tableau I. Exemples d hétérodimérisation de récepteurs couplés aux protéines G et modulation de leurs propriétés fonctionnelles. La colonne Techniques désigne la technique utilisée pour la mise en évidence de l existence du dimère (voir le texte). Bioch. : biochimique ; Biophys. : biophysique. Dimères de récepteurs Techniques Modulation de l activité Références GABA B(1a) GABA B(2) Bioch. Existence d une liaison avec les agonistes Jones et al. Nature et d un couplage fonctionnel 1998 ; 396 : 674 récepteur κ récepteur δ Bioch. Baisse de l affinité et de la puissance Jordan et al. Nature des agonistes 1999 ; 399 : 697 récepteur µ récepteur δ Bioch. Baisse de l affinité des agonistes ; George et al. J Biol Chem couplage à une protéine G insensible 2000 ; 275 : à la PTX sst 1 sst 5 Biophys. Augmentation de la puissance Rocheville et al. J Biol et de l efficacité des agonistes Chem 2000 ; 275 : 7862 sst 2a sst 3 Bioch. Baisse de l affinité et de la puissance Pfeiffer et al. J Biol Chem des agonistes 2001 ; 276 : α 2 M 3 Chimères Augmente l affinité des agonistes Maggio et al. PNAS 1993 ; 90 : 3103 sst 5 D 2 Biophys. Augmente l affinité et la puissance Rocheville et al. J Biol des ligands Chem 2000 ; 275 : 7862 AT 1 B 2 Bioch. Augmente l efficacité et la puissance Abdalla et al. Nature des agonistes 2000 ; 407 : 94 récepteur δ β 2 Bioch. Augmente l efficacité des agonistes Jordan et al. PNAS 2001 ; 98 : 343 récepteur κ β 2 Bioch. Baisse de l efficacité des agonistes Jordan et al. PNAS 2001 ; 98 : 343 substrat Luc bleu GFP Transfert d énergie vert Figure 1. Représentation schématique du principe de la technique BRET pour la mesure des interactions protéine-protéine. L un des récepteurs est couplé à une enzyme, la luciférase (Luc) et l autre à une protéine GFP (Green Fluorescence Protein). Luc, en présence d un substrat spécifique, va émettre une lumière dont la longueur d onde est située dans le bleu. Si les deux récepteurs sont relativement éloignés, d une distance > 50 Å, le signal mesuré est simplement bleu (A). En revanche, si les deux récepteurs sont associés, autrement dit dimérisés, la GFP va alors absorber l énergie bleue en provenance de Luc, et ré-émettre une lumière verte (B). Le signal est alors mesuré sous la forme d un ratio : lumière verte émise par la GFP/lumière bleue émise par Luc. 115

3 Assemblage des dimères de RCPGs Les mécanismes précis à l origine de la formation des dimères de RCPGs sont encore mal connus et diffèrent suivant le dimère considéré. Le compartiment cellulaire dans lequel la dimérisation se fait reste encore à identifier formellement. Les dimères de RCPGs pourraient être assemblés dans le réticulum endoplasmique et être transportés à la membrane sous forme de complexe ; dans ce cas, la présence de l agoniste n affecte pas la quantité de dimères présents à la surface membranaire. Les RCPGs pourraient également être transportés à la membrane sous forme de monomères puis assemblés sur place (3). Au niveau moléculaire, plusieurs domaines sont potentiellement impliqués dans la formation des complexes. Dans une étude récente publiée à la fin de l année 2001 (6), l alignement de 700 séquences de RCPGs a permis de mettre en évidence, par une approche statistique (dite Monte Carlo ), l existence de séquences conservées sur les faces externes des hélices alpha des domaines transmembranaires 5 et 6, ainsi que 2 et 3. Ces séquences pourraient être impliquées dans la formation des dimères. Les interactions entre RCPGs peuvent être covalentes, via la formation de ponts disulfures, et/ou non-covalentes, via des liaisons ioniques ou hydrophobes des régions N-terminales et/ou les régions intracellulaires (3). Les études de cristallographie permettront de mieux comprendre l ensemble des phénomènes impliqués. L hétérodimère récepteur de l angiotensine II AT 1 /récepteur bradykininergique B 2 Abdalla et al. (5) ont initialement démontré l existence d hétérodimères formés par l association de récepteurs AT 1 (récepteur de l angiotensine II, Ang II, peptide vasoconstricteur) avec le récepteur d un peptide vasodilatateur, la bradykinine (R-B 2 ). Ces auteurs ont pu mettre en évidence que les effets de l Ang II sur le dimère sont largement augmentés (tableau I) par rapport aux effets de l Ang II observés sur le R-AT 1 seul (5). Les mêmes auteurs viennent très récemment de démontrer dans un très bel article publié dans Nature Medicine que le dimère contribue à l apparition de l hypertension chez les femmes enceintes pré-éclamptiques (7). Cette pathologie est donc la seule, à ce jour, pour laquelle un dimère de RCPGs est impliqué, validant ainsi la notion même de l existence de dimères de RCPGs in vivo et de leurs rôles en physio(patho)logie. Détection des hétérodimères sur les plaquettes et les vaisseaux omentaux Si l hypersensibilité à l Ang II est connue depuis longtemps comme étant l un des facteurs prédictifs de cette pathologie, les mécanismes responsables de la potentialisation des effets vasoconstricteurs de l Ang II chez les femmes pré-éclamptiques restaient inconnus. Des études antérieures ont en A Stress oxydatif effet démontré que ni les concentrations d Ang II, ni le nombre de R-AT 1 ne sont modifiés chez ces patientes. En revanche, les auteurs du travail (7) ont clairement démontré que le nombre de récepteurs bradykininergiques R-B 2 est fortement augmenté (environ cinq fois) sur les plaquettes et sur les vaisseaux omentaux des femmes enceintes pré-éclamptiques par rapport à des femmes enceintes normotendues (figure 2). Bien que le nombre de R-AT 1 soit constant, l augmentation du nombre de R-B 2 s accompagne d une augmentation du nombre d hétérodimères, détectés par des méthodes biochimiques de co-immunoprécipitation (décrites ci-dessus). Les causes probables de l augmentation du nombre de R-B 2 sont l ischémie utéroplacentaire, le relargage de cytokines pro-inflammatoires ou encore, l activation sympathique (7) (figure 2). Effets de l Ang II sur l hétérodimère Il a également été montré par Abdalla et al. (7) que, lorsque les R-AT 1 et R-B 2 sont cotransfectés dans des cellules hôtes, les effets de l Ang II sur les concentrations de calcium intracellulaires ([Ca 2+ ] i ) sont supé- Ang II Bk Ang II R-AT 1 R-B 2 vasodilatation vasoconstriction Figure 2. (A) Chez les femmes enceintes normotendues, les effets vasodilatateurs de la bradykinine (Bk), relayés par le récepteur B 2 (R-B 2 ), sont équilibrés et les effets vasoconstricteurs de l Ang II, relayés par une faible quantité de dimères. Les effets vasoconstricteurs de l Ang II, via le monomère R-AT 1, sont inhibés par les signaux de stress oxydatif. L ensemble de ces mécanismes concourt à un équilibre de la pression artérielle. 116

4 rieurs aux effets de l Ang II observés lorsque seul le R-AT 1 est transfecté. Parallèlement, l Ang II est sans effet sur la [Ca 2+ ] i sur des cellules n exprimant que le R-B 2. Enfin, les effets de l Ang II sur le dimère sont bloqués par le losartan, un antagoniste des récepteurs R-AT 1, suggérant que, sur le complexe, l Ang II va se lier à son récepteur. De la même manière, les effets de l Ang II sur la [Ca 2+ ] i des plaquettes contenant de nombreux dimères (patientes pré-éclamptiques) sont potentialisés par rapport aux effets observés sur des plaquettes contenant moins de complexes (femmes enceintes normotendues). Notons également que si l Ang II favorise l homodimérisation de R-AT 1,le peptide est sans effet sur la formation, et donc sur le nombre, des complexes (7). B Les dimères sont insensibles au stress oxydatif La formation d ions superoxyde contribue de manière importante à la régulation de la pression artérielle (8). Par ailleurs, la grossesse est caractérisée par une augmentation des marqueurs de stress oxydatif. Abdalla et al. ont donc étudié les effets de l H 2 O 2 sur les propriétés fonctionnelles des récepteurs R-AT 1 seuls ou dimérisés (7). Les auteurs ont observé que l H 2 O 2 diminue de façon importante les effets de l Ang II, relayé par le R-AT 1 seul. En revanche, les effets stimulateurs de l Ang II sur la [Ca 2+ ] i via le complexe ne sont pas affectés par l H 2 O 2 (figure 2). De plus, le nombre de dimères formés reste inchangé après ce traitement. Des résultats similaires ont été obtenus en utilisant comme modèle expérimental des cellules A10, une lignée Ischémie utéroplacentaire Cytokines pro-inflammatoires Activation sympathique R-AT 1 R-AT 1 Bk R-B 2 vasodilatation R-B 2 Ang II Ang II Stress oxydatif vasoconstriction hypertension Figure 2. (B) Chez les femmes enceintes pré-éclamptiques, le nombre de R-B2 est augmenté d environ cinq fois. Les causes présumées de cette augmentation sont notées sur le schéma. L augmentation du nombre de R-B2 a pour conséquence une augmentation du nombre de dimères R-AT1/R-B2. Les effets de l Ang II sur le dimère sont potentialisés et, de plus, ils ne sont pas régulés négativement par le stress oxydatif. de cellules musculaires lisses riches en dimères (5, 7). Ces résultats permettent vraisemblablement d expliquer l absence de contrôle de la pression artérielle par les mécanismes oxydatifs. Cette insensibilité serait à l origine de l hypertension chez les femmes pré-éclamptiques (figure 2). Conclusion L implication du complexe R-AT 1 / R-B 2 dans l hypersensibilité à l Ang II chez les femmes enceintes pré-éclamptiques constitue à ce jour le premier argument physio(patho)logique en faveur de l existence des dimères de RCPGs. Compte tenu du fait que la dimérisation s accompagne souvent de modifications importantes des propriétés fonctionnelles des RCPGs impliqués, ces interactions protéines-protéines introduisent un niveau supplémentaire de complexité dans de nombreuses boucles physiologiques et/ou physiopathologiques. Le développement d autres outils (ligands fluorescents, ligands et anticorps sélectifs des dimères) associés à l essor des nouvelles technologies (imagerie microscopique, cristallographie) doivent contribuer à des avancées significatives dans ce nouveau champ d investigation. Références 1. Bouvier M. Oligomerization of G-proteincoupled transmitter receptors. Nature Rev Neurosci 2001 ; 2 : Maggio R, Vogel Z, Wess J. Coexpression studies with mutant muscarinic/adrenergic receptors provide evidence for intermolecular cross-talk between G-protein-linked receptors. Proc Natl Acad Sci USA 1993 ; 90 : Devi LA. Heterodimerization of G-proteincoupled receptors : pharmacology, signaling and trafficking. TiPS 2001 ; 22 : Jordan DA, Levi LA. G-protein-coupled receptor heterodimerization modulates receptor function. Nature 1999 ; 399 :

5 5. Abdalla S, Lother H, Quitterer U. AT 1 receptor heterodimers show enhanced G-protein activation and altered receptor sequestration. Nature 2000 ; 407 : Dean MK, Higgs C, Smith RE et al. Dimerization of G-protein-coupled receptors. J Med Chem 2001; 44 : Abdalla S, Lother H, El Massiery A, Quitterer U. Increased AT 1 receptor heterodimers in preeclampsia mediate enhanced angiotensin II responsiveness. Nat Med 2001 ; 7 : Zalba G, San Jose G, Moreno Mu et al. Oxidative stress in arterial hypertension : role of NAD(P)H oxidase. Hypertension 2001 ; 38 : O UI, JE M ABONNE AU BIMESTRIEL Merci d écrire nom et adresse en lettres majuscules Collectivité... à l attention de... Particulier ou étudiant M., Mme, Mlle... Prénom... Pratique : hospitalière libérale autre... Adresse ... Adresse postale Code postal...ville Pays... Tél... Merci de joindre votre dernière étiquette-adresse en cas de réabonnement, changement d adresse ou demande de renseignements. Métabolismes-Hormones-Nutrition ABONNEMENT : 1 an FRANCE/DOM-TOM/EUROPE 74 collectivités 59 particuliers 37 étudiants* *joindre la photocopie de la carte + À découper ou à photocopier ÉTRANGER (AUTRE QU EUROPE) 94 collectivités 79 particuliers 57 étudiants* *joindre la photocopie de la carte ET POUR 10 DE PLUS! 10, accès illimité aux 26 revues de notre groupe de presse disponibles sur notre site vivactis-media.com (adresse gratuite) + R ELIURE 10 avec un abonnement ou un réabonnement MODE DE PAIEMENT Total à régler... À remplir par le souscripteur carte Visa, Eurocard Mastercard N Signature : Date d expiration chèque (à établir à l'ordre de Métabolismes-Hormones-Nutrition) virement bancaire à réception de facture (réservé aux collectivités) ALJAC , rue Jean-Jaurès Puteaux Tél. : Fax : contacts@vivactis-media.com MHN vol. VI - N o 3 118