Critères de qualité et pièges de l'immuno-analyse

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1 Critères de qualité et pièges de l'immuno-analyse Immuno-analyse = outil quotidien du biologiste Dans tous les domaines de la biologie médicale (biochimie, hématologie, bactériovirologie, immunologie,...) La qualité en immuno-analyse Le choix d'un automate Le GBEA L'interprétation des résultats

2 Immuno-analyse et routine 1970! RIA " Législation # Faible nombre de laboratoires # pas d'automatisation 1980! traceurs froids généralisation des méthodes de dosage # automatisation Problème de la réaction Ag - Ac Nombreuses interférences

3 Définition des critères de qualité Qualité = "zéro défaut" Erreur : Connaître pour s'en protéger! Erreurs de mesure : définitions Erreur = différence entre valeur mesurée et valeur vraie (que l'on cherche à estimer) Erreur totale se décompose en 2 termes Erreur systématique Erreur aléatoire

4 Erreur systématique Définition Écarts toujours de même signe entre un résultat et sa valeur vraie ou sa meilleure estimation. Méthodes d'approche Répétition des mesures Calcul de la moyenne des résultats Analyse de la distribution des valeurs expérimentales et la valeur vraie. (Problème = détermination de la valeur vraie dans le cadre des immunodosages). Origines Le comportement des solutions de calibrage (différent de celui des échantillons à doser) Étalon : nature, titre stabilité au cours de la conservation. Acs : spécificité du système de dosage ph, présence de composés modifiant la réaction Ag - Ac (anticoagulants, hémoglobine,...) Destruction de l'analyte au cours des étapes précédant le dosage (prélèvement, transport, centrifugation, décantation) Liaison de l'ag aux parois du tube, à des protéines de transport, à des Acs circulants (auto-immunisation, traitement). Méthode de mesure ou de calcul

5 Définition Erreur aléatoire Écarts de signe et de grandeur imprévisibles, entre un résultat et sa valeur vraie (ou sa meilleure estimation) Méthodes d'approche Distribution normale (= gaussienne) Moyenne nulle (les erreurs sont nombreuses et du même ordre de grandeur, en "+" et en "-" elles s'annulent). Quantifiée par l'écart type de cette distribution. S = Σ(Xn-Xi)² N Dépend étroitement de la concentration Cet écart type $ avec la concentration. Origines Opérations de distribution des volumes (échantillons ou réactifs). Méthodes de séparation des formes libre et liée. Erreurs de mesure.

6 Erreurs aléatoire et systématique Erreur aléatoire Valeur réelle Valeur mesurée Erreur systématique

7 Les critères qui aident au choix d'un automate : Définition 1) Précision Qualité de l'accord entre des mesures répétées (effectuées dans des conditions déterminées, dans une zone définie de concentration). Méthodes d'approche Mesure de l'écart type ou coefficient de variation (CV = écart type / moyenne) de la distribution des valeurs de concentration obtenues lors de la répétition des mesures sur le même échantillon. Répétabilité intra série Mêmes conditions de réalisation (réactifs : standards, tampons, diluants,..., température, manipulateur,...) Objectif CV < 5-6% Reproductibilité inter séries Mesures effectuées sur le même échantillon dans des conditions totalement différentes (différents lots de standards, ) Objectif CV < 10%

8 Remarques La précision est meilleure quand l'erreur aléatoire est faible. La précision d'une méthode peut varier en fonction de la concentration de l'analyte " Cibler la zone des valeurs à fortes valeurs ajoutées (décision médicale +++) " choisir différentes concentrations d'échantillons représentatifs

9 Les critères qui aident au choix d'un automate : 2) Sensibilité et détectabilité Définition Aptitude de la méthode à différencier les signaux fournis par 2 échantillons de concentrations voisines. Ne pas confondre Sensibilité : s'intéresse à toutes les concentrations différentes de zéro. Détectabilité : s'intéresse au domaine des concentrations faibles ou nulles.! Limite de détection analytique = la plus petite concentration fournissant un signal significativement différent du blanc. Méthodes d'approche Méthode des "dilutions limites" = diluer progressivement un échantillon de faible concentration afin de déterminer le moment où la réponse devient incohérente.

10 Les critères qui aident au choix d'un automate : Définition 3) Justesse Qualité de l'accord entre valeur mesurée et valeur vraie (ou sa meilleure estimation) en dehors des erreurs aléatoires. Problème = disposer de la valeur vraie de la concentration (méthode de référence?) Méthodes d'approche Comparaison de la technique à une méthode de référence droite de régression (nécessite un large éventail de valeurs). Épreuve de dilution (dans le diluant ad hoc), d'un sérum de forte concentration. Idéalement : une droite passant par l'origine. Si une erreur systématique ordonnée à l'origine non nulle, ou relation non linéaire.

11 Appréciation de la justesse d'une mesure par l'épreuve de dilution Signal IDEAL } INEXACTE Mesure x x x x x x x Précis mais inexact Exact mais imprécis x x x x x x x x x Précis et exact

12 Les critères qui aident au choix d'un automate : Définition 4) Spécificité Aptitude à mesurer l'analyte désiré et seulement celui-ci même en présence de substances dont la structure est proche. Liée à la nature de l'immun sérum et des Ac utilisés Méthodes d'approche Détermination des pourcentages de réactions croisées : Indice d'abraham. Ne s'applique qu'aux dosages par compétition repose sur l'évaluation de la concentration déplaçant 50% du traceur. Établissement de courbe de calibration avec tous les composés susceptibles d'interférer dans le dosage Détermination de la plus petite concentration de substance interférente fournissant un signal non nul.

13 Indice d'abraham B0/T Pourcentages de réaction croisée de la désoxicorticostérone et du cortisol dans un immunodosage de progestérone Cortisol 50% DOC Progestérone // // 4, C(µg/l) Indice d'abraham (Cortisol) = (4/ 2000)x100 = 0,022% Indice d'abraham (DOC) = (4/ 70)x100 = 6,3%

14 Ne pas confondre Sensibilité analytique et "sensibilité "statistique" : Aptitude d'un dosage à détecter une perturbation biologique quand un sujet présente une pathologie Test positifs Tests négatifs Malades VP FN Témoins FP VN Sensibilité = VP/ (VP+FN) : Probabilité que le test soit positif quand le sujet est malade Spécificité = VN /(VN+FP) (Probabilité que le test soit négatif quand le sujet n'est pas malade) VPP = VP/ (VP + FP) : Probabilité que le sujet soit malade quand le test est positif VPN = VN/ (VN + FN) : Probabilité que le sujet ne soit pas malade quand le test est négatif

15 Courbe de ROC (Receiver Operating Characteritics) Valeur intrinsèque des examens : Exprime la sensibilité (VP) en fonction des FP (1-sp), pour différentes positions du seuil. Déplacement de la valeur seuil vers les valeurs élevées ($ de la spécificité), le nombre de malades détectés diminue (% de la sensibilité). Répartition des valeurs dans la population normale Répartition des valeurs dans la population malade Bonne sensibilité Faible spécificité Sensibilité 100% x ROC Faible sensibilité Bonne spécificité 1-Sp 1

16 Les pièges de l'immuno-analyse Tout ce à quoi il faut penser avant d'interpréter un résultat A toutes les étapes Étapes pré-analytiques Aspects macroscopiques du sérum Conservation des échantillons Problèmes inhérents à l'échantillon lui même " " au protocole expérimental Utilisation des standards Les Ac monoclonaux, polyclonaux Composition du milieu réactionnel " " au traitement des données

17 Recueil des échantillons : 1) Quel type de contenant? Anticoagulants Héparine perturbe la réaction Ag - Ac EDTA, fluorure de sodium, citrate dissociation du chélate d'europium, EDTA inhibe la phosphatase alcaline. " Utiliser des tubes sans anti-coagulants Gel séparateur Éviter lors de dosages d'hormones libres Conservateurs Azide de sodium : inhibe la peroxydase Centrifugation Le plus rapidement possible après le prélèvement Suffisante pour éliminer les GR et toutes particules en suspension pouvant perturber les différentes réactions

18 Hémolyse 2) Aspect macroscopique du sérum L'hémoglobine peut perturber la réaction Ag - Ac, ou altérer la qualité du signal mesuré. Sérum hyperlipidémique Néfaste pour la réaction Ag - Ac. Modifie les conditions de pipetage par $ de la viscosité du milieu. Modifie les coefficients d'extraction de certains stéroïdes. " Sujets à jeun depuis 8 heures Sérum ictérique Perturbation des lectures de DO Notice du fabricant

19 3) Conservation des échantillons Centrifugation Le plus rapidement possible Non dosés dans les 24 heures Conserver congelés à -20 C Pas de congélation - décongélation successives. L'étape de décongélation doit être très lente, homogénéiser (Vortex) et centrifuger si particules en suspension. Prélèvements à expédier Sur EDTA (sauf contre indication) Addition d'un agent anti-protéolytique au plasma (Zymofren, Iniprol : conservation 48 heures à T ambiante de la plupart des hormones). Envoyer centrifugés, congelés, et maintenir la congélation durant le transport.

20 4) Problèmes liés à l'échantillon 1) Particularités des dosages hormonaux ATTENTION! Stress et rythme circadien 2) Ac hétérophiles Définition Risque Ac présents dans le sérum dirigés contre les Ig animales du réactif Interférence au cours des différentes étapes immunologiques (techniques immunométriques : surestimations; techniques par compétition : encombrement stérique sous estimation) Caractéristiques Origine FR!!! Ac dirigés contre différents motifs antigéniques de l'ig (isotype, allotype, idiotype). Ac (IgG, ou IgM) anti-isotype dirigés contre le Fc des Ig Immunisation avec des vaccins préparés sur tissu animaux. Contacts avec les animaux. Maladies Auto Immunes (Facteur Rhumatoïde). Immuno-scintigraphies, immunothérapies. Solutions Addition de sérum animal provenant de la même espèce (neutralisation, mais difficile de neutraliser complètement les IgM). Utilisation de fragment F(ab')2 comme Ac de capture ou comme traceur (problème avec les Ac anti-idiotypes). Intérêts des techniques en 2 temps (les Ac hétérophiles fixés sur l'ac de capture ne sont plus disponibles pour l'ac traceur). Traitement par le 2-mercaptoéthanol.

21 Problèmes liés à l'échantillon 3) Auto-Acs Anti-T3, anti-t4 ou Anti-TSH Interférences : En "plus ou moins" selon les méthodes de dosage ou de séparation. Origine : Basedow, myxoedème, ou sujets normaux. Fréquence = 1/ Les autres Auto-Ac maladies auto-immunes ATTENTION! CRYOGLOBULINES

22 5) Problèmes liés aux réactifs et au protocole expérimental 1) Préparation des étalons La production des étalons est confiée à des organismes spéciaux (National Institute For Biological standard and Controls) à la demande de l'oms. " Validité d'un immuno-dosage # absolue identité entre la molécule étalon et la molécule à doser Différents étalons selon la structure de l'analyte Faible masse molaire structure chimique bien définie (Hormones stéroïdiennes ou thyroïdiennes). Masse molaire élevée, structure complexe Étalons = extraction de milieux biologiques, de tissus sains ou pathologiques (Hormones glycoprotéiques, marqueurs tumoraux). " Ne correspondent pas toujours à l'analyte à doser (variants génétiques, isoformes, formes circulantes). "Variations inter-laboratoires

23 6) Problèmes liés aux réactifs et au protocole expérimental 2) Anticorps Avantages des monoclonaux Obtention de réactifs homogènes de lots à lots. Spécificité +++ Distinction entre molécules de structures proches (HCG, et FSH, LH, TSH) Limite de détection très basse Distinction entre sujets euthyroïdiens et hyperthyroïdiens (TSH US). Découverte et dosages de marqueurs tumoraux CA 19-9, 15-3, 125). Inconvénients Manque d'affinité (avidité) Inférieure à celle des polyclonaux Problème pour les dosages par compétition ( sandwich) Sur-spécificité Un Ac monoclonal est spécifique d'un épitope et non de la molécule elle-même. Surestimation ou sous-estimation Réactions croisées importantes si l'épitope est présent sur une molécule différente. Sous estimation si l'épitope n'est plus exprimé CA-19.9 CA-50

24 Effets crochet Définition Chute paradoxale du signal mesuré en présence d'une forte concentration de l'ag à doser et obtention d'une courbe en cloche. Même valeur du signal # 2 valeurs différentes de la concentration en analyte (risque = rendre une valeur normale ou très sous estimée). Caractéristiques L'effet crochet concerne les molécules possédant au moins 2 sites antigéniques (n'est décrit que pour les techniques immunométriques = sandwich). Origines Effet pro-zone techniques immunométriques en "1 temps" Lavage incomplet Ac marqué en quantité insuffisante Fixation d'ac hétérogènes sur le support (forte et faible affinité) Mise en évidence et solutions Dilution du sérum jusqu'à l'obtention de résultats cohérents Intérêt des méthodes en 2 temps et de la dilution systématique pour le dosage des marqueurs tumoraux La législation impose une double détermination (pur et dilué éventuellement) pour le PSA (l'ace, les CA19.9, -125, dans le cadre de suivis thérapeutiques).

25 Mise en évidence d'une interférence Test de dilution ( non linéaire) Mise en évidence d'un effet crochet Dilution de la substance interférente > dilution de l'ag (Ac) spécifique # mode de révélation. Test de surcharge Mélange de l'échantillon et de l'étalon le plus élevé : l'obtention d'une valeur plus faible que celle attendue fait suspecter une substance interférente. Rappels

26 7) Composition du milieu réactionnel Conditions de ph Force ionique Concentrations en protéines Présence d'agents tensioactifs Perturbation de la réaction Ag - Ac. Le milieu de dilution de la gamme étalon et échantillon doivent avoir des compositions aussi proches que possible. Une trousse adaptée aux dosages sériques ne le sera peut-être pas pour d'autres milieux biologiques (urines, LCR )

27 8) Problèmes liés au marqueur et à son signal La liaison chimique (Ac - traceur) doit perturber le moins possible la formation du complexe Ag - Ac Le signal émis par unité de concentration de marqueur, doit avoir une intensité élevée. Spécificité du signal = propriété essentielle garantissant un faible bruit de fond contribue à la bonne détectabilité. Détection quantitative sur une large gamme de concentrations (le signal possède une grande dynamique) Propriété liée à la fois à la nature du signal physique et à l'appareil de mesure du signal lui même (saturation).

28 9) Traitements des données En immuno-analyse, il n'existe pas de relation linéaire entre intensité du signal et concentration de l'analyte. Selon les différents modèles mathématiques utilisés pour l'établissement de la courbe de calibration, les résultats pourront être différents (écarts inter techniques).

29 Critères res de jugement pour adopter un automate Performances analytiques élevées Grande linéarité Haute sensibilité Bonne reproductibilité Faible incidence des lots de réactifs Intégration dans le laboratoire Facilité de manipulation : connexion informatique, Chargement continu Gestion par patient et non par analyse Disponibilité rapide des résultats Faible délai de réponse Cadence élevée Accessibilité à l'urgence Menu des paramètres, étendu Gestion des contrôles (graphique, alarmes ) Coût.

30 Gérer la qualité au quotidien Les Contrôles de qualité et les Lois de Westgard GBEA : Les contrôles de qualité externes (CQE) et contrôles de qualité internes (CQI) sont obligatoires : CQE : la législation impose la participation aux contrôles de qualité externes nationaux et incitent à participer aux contrôles de qualité externes inter laboratoires. CQI : Définition : contrôle = toutes les mesures qui permettent de vérifier les différentes phases de l'activité permettant l'obtention des résultats

31 Contrôles de Qualité Qu'est ce qu'un contrôle? En pratique : un "échantillon" qui contient l'analyte à doser mais dont on connaît la concentration (la fourchette de valeurs cibles) "Échantillon" = même comportement que les échantillons à doser Donc d'un standard : solution dans laquelle l'introduction d'une substance en concentration connue permet d'établir une courbe d'étalonnage ("contenu trafiqué")

32 Règles d'utilisation Il existe différents niveaux de contrôle bas moyen haut Règles minimales : Intérêt d'utiliser au moins 2 niveaux de contrôle Choix des niveaux : Limites de linéarité (fortes concentrations ou faibles) : en fonction des performances de l'appareil Valeur décisionnelle (seuil de positivité) Décision médicale Pourquoi? Intégration dans le système de "qualité totale " : permet de s'assurer du bon déroulement d'une analyse. Comment? Intégration statistique des contrôles (définition plus précise de bornes d'acceptabilité ou de rejet d'une série d'analyse) Démarche prospective et non rétrospective

33 Définition de règles r d'utilisation des contrôles des qualité Définition : Combinaison de critères de décision permettant de décider si la série analytique est sous-, ou hors, contrôle. Différentes règles Schewhart Levey-Jennings Westgard. Buts (en théorie) Saisie simple et pratique, visualisation des contrôles (traçabilité/ GBEA). Adaptation simple et intégration au sein des pratiques de contrôle de chaque laboratoire. Bas niveau de fausses alarmes et de rejet de séries. Bon niveau de détection des erreurs analytiques. Indication du type d'erreur (aléatoire / systématique) Aide à la solution du problème.

34 Les différentes étapes 1) Caractérisation de la méthode analytique Définition des performances Établir les règles de contrôle d'une méthode analyse Postulat : disposer d'un matériel de contrôle stable Pas de variation entre les aliquotes En quantité suffisante pour une durée d'exploitation minimale de 1 an. Définir la précision (erreurs aléatoires) de la méthode Distribution normale de type gaussien, définie par la moyenne et la déviation standard (écart type) 2) Méthode Répétition des mesures sur une durée de 20 jours, une mesure par type de contrôle par série et par jour Définition de la moyenne et de l'écart type. Reporter sur un graphique : En abscisse : les jours du mois En ordonnée : l'échelle des concentrations avec une série de droites parallèles à l'axe des "X" passant - par la valeur moyenne des contrôles = x - par la valeur correspondant à la somme x +/- 1 DS - par la valeur correspondant à la somme x +/- 2 DS - par la valeur correspondant à la somme x +/- 3 DS Diagramme de Levey Jenning x Jours + 3DS + 2DS + 1DS - 1DS - 2DS -3DS

35 Les règles r de contrôle Le diagramme de LJ permet de définir des règles de contrôle adaptées à chaque niveau de contrôle. Ces règles permettront de définir un critère de jugement de la performance (bonne ou mauvaise) du déroulement de la série analytique. Buts : signaler à partir de quand le contrôle ne suit plus la distribution normale (ou la distribution précédemment observée) Il est intéressant d'associer (de combiner) les différentes règles de contrôle afin d'augmenter la valeur de la procédure de contrôle Intérêt de la combinaison de règles cernant les erreurs aléatoires et les erreurs systématiques : on peut ainsi approcher la cause d'erreur (et la solution).

36 Les lois de Westgard Qu'est ce qu'une bonne règle de contrôle Faible probabilité de "fausses alarmes" Fort rendement de détection des "erreurs vraies" signal de rejet. Toute procédure de contrôle est associée à de fausses alarmes mais en choisissant correctement les règles de contrôle en les associant on peut limiter la proportion à moins de 5% Quand une règle de contrôle est violée Rejet de la série A l'inverse une série n'est validée que si aucune règle de contrôle n'est transgressée

37 Méthode Passer les contrôles tous les jours et les reporter sur le graphe approprié, en fonction de la moyenne et des écart-types. On peut alors intégrer les résultats en fonction des 6 règles de Westgard >2DS La valeur du contrôle dépasse x + 2 DS ou x - 2DS Toute valeur supérieure à +/- 2 DS doit attirer l'attention vérifier les autres niveaux de contrôle. Règle "d'attention! " n'implique pas le rejet de la série x + 3DS + 2DS + 1DS - 1DS - 2DS -3DS

38 >3DS La série est considérée hors limite lorsqu'une des valeurs de contrôle dépasse la moyenne x +/- 3DS. Cette règle détecte les erreurs aléatoires Erreur de pipetage, de lavage, etc. Cette règle ne s'applique qu'à l'intérieur de la série Vérifier les autres niveaux de contrôle Conséquence = Rejet de la série R.4s >3DS Cette règle n'est pas respectée lorsque la différence entre 2 valeurs successives de contrôles dépassent 4 DS. Cette règle détecte les erreurs aléatoires. Elle doit être appliquée à l'intérieur d'une série. Cette règle peut être intégrée entre 2 niveaux différents de contrôle (exemple "niveau bas" = x - 2 DS et niveau haut = x + 2 DS) Rejeter la série. x >3DS R.4s + 3DS + 2DS + 1DS - 1DS - 2DS -3DS

39 2.2s Cette règle est transgressée lorsque 2 valeurs consécutives dépassent la même limite : x + 2 DS ou x - 2 DS. Cette règle détecte les erreurs systématiques Erreur calibration, automate, mesure, blanc réactif Cette règle peut être intégrée entre 2 niveaux différents de contrôle (exemple "niveau bas" = x - 2 DS et niveau haut = x - 2 DS) Elle doit être appliquée à l'intérieur d'une série, ou d'une série à l'autre. 4.1s Cette règle est transgressée lorsque 4 valeurs consécutives dépassent la même limite x + 1 DS ou x - 1 DS Cette règle détecte les erreurs systématiques Elle doit être appliquée à l'intérieur d'une série ou d'une série à l'autre. Cette règle peut être intégrée entre 2 niveaux différents de contrôle : il suffira alors deux 2 séries pour transgresser la loi. Avec 3 niveaux de contrôle, 1 seule série suffit : Les valeurs des 3 niveaux de contrôle sont toutes trois > à x + 1DS ou x - 1 DS Rejeter la série

40 10.x Cette règle est transgressée lorsque 10 valeurs consécutives du même contrôle se trouvent du même côté de la moyenne. Cette règle détecte les erreurs systématiques Elle doit être appliquée d'une série à l'autre. Cette règle n'implique pas le rejet de la série mais peut indiquer l'opportunité d'une maintenance ou d'un étalonnage. 2.2s x + 3DS + 2DS + 1DS - 1DS - 2DS -3DS 4.1s x + 3DS + 2DS + 1DS - 1DS - 2DS -3DS 10.x x + 3DS + 2DS + 1DS - 1DS - 2DS -3DS

41 Synopsis Contrôle 1x2s Non OK Accepter 1x3s Non 2x2s Non R4s Non 4x1s Non 10x Oui Oui Oui Oui Hors contrôle Rejeter

42 Questions et problèmes La qualité du contrôle... Disposer un contrôle stable (un an au minimum) Conservation +++ Disposer d'une quantité suffisante pour définir un bon contrôle (20-30 mesures pour déterminer la moyenne et l'écart type!). Idéalement un produit inoffensif (ATTENTION! pool de sérum) Établir la moyenne et l'écart type dans certaines conditions de réalisation technique Quelles sont les variations entraînées par les changements de lot (étalons, réactifs) sur la valeur des contrôles de qualité. Intérêt des "contrôles limites" Appréciation en fonction du seuil de la méthode Fluctuation en fonction des lots au dessus ou en dessous du seuil quelles sont les conséquences sur la décision médicale. Réciproquement retentissement sur le choix de la méthode! éviter les variations inter lots. Un contrôle hors limite ne doit pas être pris en compte dans le calcul de la moyenne. Méthode de calcul : Passer fois le même contrôle dans des séries différentes Calculer moyenne et écart type Éliminer tous les points supérieurs à (x ± 3DS) Retourner à l'étape 2 jusqu'à ce que moyenne et écart type restent stables

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