CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE
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- Flore Albert
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1 CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE
2 Tranchant J., 1995, Manuel pratique de chromatographie en phase gazeuse, Masson, Paris, 700 pages. Grob K., 1986, Classical split and splitless injection in capillary GC, Huethig, Heidelberg, 324 pages
3 Introduction Chromatographie sur colonne de silice Chromatographie sur papier 1940 Chromatographie sur plaque 1950 Chromatographie d exclusion 1960 Chromatographie en phase gazeuse 1960 Chromatographie liquide haute pression 1970 Les points communs : une phase fixe une phase mobile
4 Introduction Chromatographie en phase gazeuse : l idée : premiers résultats : 40 publications : publications
5 Principe
6 Grandeurs chromatographiques tr t r l σ Injection Air (méthane) ω
7 Grandeurs chromatographiques Temps de rétention réduit Volume de rétention : Vr = tr x D Volume de rétention Absolu, Spécifique
8 Grandeurs chromatographiques Temps de rétention Indépendant, dans la limite des concentrations faibles - de la quantité injectée - de la nature et abondance des autres constituants Dépendant - du couple composé-phase - du volume mort - du débit de gaz - de la masse de phase stationnaire - de la température
9 Grandeurs chromatographiques Indices de Kovats i d La position du composé n est pas donné en temps ou distance (d), mais par rapport aux 2 hydrocarbures qui l entourent (i)
10 Grandeurs chromatographiques Indices de Kovats x t T X = t 100 T X = t.100/t i = 800+(t.100/T )
11 Grandeurs chromatographiques Indices de Kovats si : Chromatographie isotherme et isobare, [ t'rpic - t'rhc(n) ] 100 log log i pic =i hc(n) + log t'rhc(n + 1) - log t'r hc(n) t r : temps de rétention réduit
12 Grandeurs chromatographiques Indices linéaires de rétention si : - Programmation linéaire de la température du four - vitesse du gaz vecteur proche de l optimum, i pic =i hc(n) tr [ pic hc(n) ] tr hc(n + 1) - tr - tr hc(n) Mais il faut : Gradient t. Lcolonne. Ephase Colonne. VitesseGaz = cst
13 Grandeurs chromatographiques tr t r l σ Injection Air (méthane) ω
14 Grandeurs chromatographiques Efficacité Nombre de plateau théorique : N = temps de rétention σ 2 Si le pic est gaussien : N = 5,54 temps de rétention Largeur pic à mi - hauteur 2 Hauteur équivalente à un plateau théorique : Hept = longueur de colonne/n
15 Grandeurs chromatographiques Efficacité Trennzahl, ou SN (separation number) :
16 Grandeurs chromatographiques Efficacité Influence du type et de la vitesse du gaz vecteur Courbe de Van Deemter
17 Colonne Open tubular column W.C.O.T. C.O.T. S.C.O.T. (à support imprégné) P.L.O.T. ( à couche poreuse) Capillaire remplie Micropacked
18 Colonne Propriétés de la silice : - Souplesse - Poli parfait - Inertie chimique - Groupements silanol en surface modifiables - Prix relativement élevé - Revêtement polyimide limité à 370 C - Diamètre et longueur imposés
19 Colonne p = r 2 /8 (Loi de Darcy) Perméabilité : décrit la facilité à laquelle le gaz traverse la colonne. Unité=cm 2 Colonne remplie: 2 m Colonne capillaire: 30 m Perméabilité Pression gaz 0, cm 2 2 bar cm 2 0,4 bar
20 Colonne Perméabilité, conséquence en chromatographie capillaire : - Peu de décompression le long de la colonne - Vitesse du gaz optimum tout le long de la colonne - Vitesse du gaz très rapide Analyse courte Composés peu volatils seront élués plus facilement Chauffage modéré de la colonne
21 Colonne Rapport de phase β : Volume phase gaz Volume de phase liquide Colonne remplie : 20 Colonne capillaire : En capillaire : - Analyse plus rapide - Faible quantité injectée sinon saturation
22 Colonne Tester une colonne : mélange de Grob Grob K., Grob G. et K. Grob., 1978, "Comprehensive, standartized quality test for glass capillary columns", Journal of Chromatography, Vol: 156, p
23 Ordre de sortie des composés du mélange de Grob sur quelques phases chromatographiques
24 Phase Propriétés - Inertie chimique - Affinité différente pour les composés à séparer - Limites inférieure et supérieure de température - En film stable, fin et régulier
25 Phase Polysiloxanes : -Si-O-Si-O-Si-O-Si-O- 100% méthyl OV1, SE30, DB1 5% phényl OV5, SE52, DB5 Apolaire 20 / /325 Apolaire 50 / /325 5% phényl 1% vinyl SE54 Apolaire 50 /220 7% phényl 7% Cyanoprop. OV1701, DB1701 Intermed. 20 / /260
26 Phase Polyethyleneglycol: HO-CH 2 -CH 2 -O-CH 2 -CH 2 -O-... Carboxax 20M Carboxax 20M + acide 2- nitrotéréphtalique C20M, Superox, DBwax SP1000, FFAP, DBFFAP Polaire 20 / /225 Polaire 50 / /250
27 Phase Phase chirale : Importance en biologie, herbicides, pesticides, arômes Comportant souvent des cyclodextrines perméthylées ou persylilées Parfois en mélange ou greffée avec des polysiloxanes (OV1701)
28 Phase Greffage (bounded phase) : -Si-O-Si-O-Si-O-Si-O-H H-O
29 Réticulation (crosslinked phase) : CH 3 CH 3 CH 3 -Si-O CH 3 Phase -Si-O-Si-O-Si-O-Si-O- -Si-O-Si-O-Si-O-Si-O- CH 3 CH 3
30 Injection Le problème de l injection : - Vaporiser l échantillon, donc chauffer - Dans un volume suffisamment grand 0.5 ml, pour ne pas «retro-polluer» le tube d arrivée du gaz vecteur - Le transporter à l entrée de la colonne avec un débit faible, 2 ml/min - Temps de dépôt sur la colonne 15 secondes - Déposer une faible quantité sur la colonne pour éviter la saturation de la phase - Diluer l échantillon
31 Injection Injection split : Gaz vecteur Split de 50 ml/min Théoriquement 0.6 secondes pour transporter l échantillon Colonne 2 ml/min
32 Injection Injection split : - Pics fins, bien résolus, de faible surface mais de grande hauteur Largeur pic en secondes : débit vers le split, ml/min :
33 Injection Injection split : Echantillon liquide A demi évaporé Haut point de fusion Composés évaporés Présence possible d aérosol ou de gouttelettes liquides de composés à haut point d ébullition!
34 Injection Injection split : - Les composés évaporés se répartiront entre split et colonne en fonction du débit vers le split et vers la colonne - Les composés liquides se répartiront en fonction de la surface de l entrée de la colonne et de la surface du fond de l injecteur Discrimination entre composés à haut et bas point de fusion Analyse quantitative peu fiable Précaution : - Chauffer suffisamment, - Distance suffisante entre aiguille et colonne pour évaporation complète - Insert avec chicane, laine de verre, etc
35 Injection Injection splitless : Injection Transfert Purge Temps de transfert vers la colonne trop long Effectuer en tête de colonne un piégeage à froid ou l effet solvant
36 Injection Injection splitless : effet solvant
37 Injection Injection splitless : effet solvant Plusieurs paramètres influenceront la qualité de l effet : - Durée de fermeture du split - Débit de gaz dans la colonne - Polarité et point ébullition du solvant - Volume d échantillon liquide injecté
38 Injection Mode d utilisation de la seringue : Aiguille froide Aiguille chaude
39 Injection Injection on-column : Aiguille L échantillon est déposé liquide dans la colonne Colonne
40 Injection Comparaison des 3 types d injection Split Splitless On column - Supporte impuretés peu volatils - Supporte impuretés peu volatils - Quantification fiable - Evite les dégradations thermiques -Echantillon concentré - Risque de discrimination composés lourds/légers - Pgm température du four obligatoire - Temps de rétention peu reproductibles en début de chromato. - Ne supporte pas les impuretés peu volatils - Pgm température du four obligatoire
41 Détection Détecteur répondant en concentration de soluté : l influence du débit du gaz vecteur est nulle (catharomètre). Si le débit double, la hauteur du pic ne change pas - Mais sa largeur diminue de moitié - Donc sa surface diminue de moitié Détecteur répondant en débit de soluté : la réponse est proportionnelle au débit du gaz vecteur (FID). Si le débit double, la hauteur du pic est doublée - Mais sa largeur diminue de moitié - Donc sa surface ne change pas
42 Détection Détecteur à ionisation de flamme (FID) Electrode : - de collecte -de polarisation Electromètre Enregistreur Hydrogène Gaz vecteur
43 Détection Détecteur à ionisation de flamme Cracking dans la zone centrale : CH, CH 2, CH 3 Oxydation en périphérie : CH + O = CHO + + e - Réaction avec l eau : CHO + + H2O = H3O + + CO
44 Détection Bruit de fond : détecteur en équilibre Perturbations dues : - aux irrégularités du gaz vecteur, - aux parasites électroniques - aux molécules de phases dégradées -etc Bruit de fond Bruit de fond + autre perturbation
45 Détection Sensibilité : Rapport- signal électrique/concentration ou - signal électrique/débit massique Quantité minimale détectable : Quantité injectée qui donne un signal double du bruit de fond, dans des conditions définies - FID : 2-4 pg carbone dans conditions optimum
46 Détection Lorsque des quantités croissantes sont injectées, au delà d un plafond, la réponse du détecteur n est plus linéaire. Réponse = Minimum détectable Quantité injectée
47 Détection Zone de linéarité : Domaine de concentration dans lequel la réponse du détecteur est proportionnelle à la concentration FID : 10 7
48 Détection Détecteurs universels : ionisation de flamme, catharomètre, Spectromètre (masse ou infra-rouge) Détecteurs spécifiques: capture d électron, thermoionique Détecteurs sélectifs :photomètrie de flamme, olfactomètre
49 Détection Olfactomètrie (sniffing) : montage chromatographique
50 Détection Olfactomètrie et détection F.I.D.
51 Détection Olfactomètrie : Comparaison d extraits de vin
52 Analyse quantitative La relation fondamentale :? Surface du pic = k. Quantité injectée k coefficient de réponse est : - Dépendant du composé - Dépendant du détecteur - Dépendant du système chromatographique
53 Analyse quantitative Normalisation interne : Surface : Total : 400 En % :
54 Analyse quantitative Normalisation interne : - Le résultat n est pas en poids/poids - Si un composé augmente, les autres diminuent -Tous les composés doivent être élués de la colonne - Utilisé pour quantifier les proportions des composés d une même famille (acides gras), pour suivre l évolution d une réaction... - Le volume injecté n a aucune importance
55 Analyse quantitative Normalisation interne avec facteur de réponse: 1 2 Référence Masse mg : Surface : D après la référence, 1 unité de surface = 7/440 mg Donc le pic 2 correspond à 7/440 x 285 = 4,53 mg Pour retrouver 5 mg, il faut appliquer un facteur de réponse qui est : k = 5/4,53 = 1,1
56 Analyse quantitative Normalisation interne avec facteur de réponse: Surface : Fact. Rép. k : 0.9 1,1 1 Surface corrigé : Total = 390 En % :
57 Analyse quantitative Normalisation interne avec facteur de réponse: - Le résultat n est pas en poids/poids - Si un composé augmente, les autres diminuent - Tous les composés doivent être élués de la colonne - Utilisé pour quantifier les proportions des composés d une même famille (acides gras), pour suivre l évolution d une réaction - Le volume injecté n a aucune importance - k, coefficient de réponse, corrige les distorsions entre composés dues à l appareillage mais seulement par rapport à un composé référence
58 Analyse quantitative Etalonnage externe : Etablissement d une droite d étalonnage Surface S = k Q Quantité
59 Analyse quantitative Etalonnage externe : - Très dépendant du volume injecté - Ne tient pas compte de la préparation de l échantillon - Résultats en poids/poids - Résultat pour un composé indépendant des autres composés
60 Analyse quantitative Etalonnage interne : 1 3 Etalon 2 Choix de l étalon : - Etre élué seul - Etre proche chimiquement des composés à doser - Etre inerte
61 Analyse quantitative Etalonnage interne : Masse mg : 6 Surface : unité de surface correspond à 6/190 mg Le pic 3 correspond donc à 6/190 x 220 = 6,9 mg
62 Analyse quantitative Etalonnage interne : - Suppose que, lors de la préparation de l échantillon, l étalon réagit de la même façon que les composés à doser - Résultats en poids/poids, exprimés en équivalent étalon/poids d échantillon - Peut être corrigé par un facteur de réponse - Indépendant du volume injecté - Résultat pour un composé indépendant des autres composés - l étalon informe de l état du système chromatographique
63 Analyse quantitative Ajouts dosés : 1 3 Etalon 2 L augmentation de surface du pic 2 est due au rajout de ce composé
64 Analyse quantitative Ajout dosés : SurfaceCom posé SurfaceEta lon QuantitéComposé QuantitéEtalon
65 Analyse quantitative Ajout dosés : - Relativement long à mettre en œuvre - Suppose que le composé rajouté réagit comme le (même) composé à l origine dans le milieu à doser - Indépendant du volume injecté - Résultats en poids/poids
66 Analyse quantitative Isotope stable : Plutôt que le composé lui-même, un isotope stable du composé (contenant un atome plus lourd : D, C 14 ) est ajouté - Suppose que le composé isotope rajouté réagit comme le composé à l origine dans le milieu à doser - Suppose un spectre de masse - Indépendant du volume injecté - Résultats en poids/poids
67 Analyse quantitative Traitement du signal : Détection de début et fin de pic Localisation de la ligne de base Mode d intégration Conversion analogique-digitale Identification du composé Calcul avec étalon Edition de rapport
68 Fast chromatography
69 GC2D et GCxGC Colonne 1 Colonne 2
70 GC2D et GCxGC CO2 1 er injection CO2 CO2 Etc. Colonne 1 Colonne 2
71 GC2D et GCxGC Rétention, minutes, colonne 1
72 Saturés Mono-aromatiques Rétention, minutes, colonne 1 Di-aromatiques GC2D et GCxGC Rétention, secondes, colonne 2
73 Conclusion - Pouvoir de séparation très important - Faible quantité d échantillon - Applicable à de nombreux composés - Technique simple et fiable - Résultats qualitatifs et quantitatifs précis, d interprétation simple - Equipement peu coûteux, à durée de vie longue - Automatisation possible
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