- Solutions for gene and drug delivery -
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- Julien Bastien
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2 Atelier 17 Transfert non viral de gènes dans les cellules en culture : Revue des technologies d électroporation et perspectives de transfection de cellules en osmolarité extrême Plate-forme Biogenouest IBiSA «SynNanoVect» Pascal LYER, Inserm UMR991, Hôpital Pontchaillou, Rennes - Solutions for gene and drug delivery -
3 Plate-forme «Production de vecteurs de synthèse et vectorisation de bio-molécules» 2 villes et 4 laboratoires : Brest Rennes Inserm U1078 (T. Montier) Responsable UMR CNRS 6521 (P-A. Jaffres) UMR CNRS 6226 (T. Benvegnu) ENSCR Inserm UMR991 (P. Loyer)
4 Plate-forme «Production de vecteurs de synthèse et vectorisation de bio-molécules» Vectorisation : technologies/vecteurs permettant d'améliorer l'efficacité d'un principe actif en augmentant sa biodisponibilité. Principes actifs : molécules bioactives incluant médicaments, acides nucléiques (ADN, sirna), protéines, etc... Vecteur : structure macromoléculaire capable de véhiculer le principe actif en modifiant sa distribution tissulaire, sa biodisponibilité et/ou ses interactions avec des cellules cibles. Biodisponibilité (propriété pharmacocinétique) des principes actifs : fraction d un principe actif qui : 1) atteint la circulation sanguine et qui est potentiellement active sur l organe cible (in vivo), 2) pénètre dans les cellules en culture. Ciblage : l adressage «spécifique» d un principe actif vers un organe choisi par une vectorisation présentant un tropisme pour cet organe.
5 Index thérapeutique La Vectorisation et nanovecteurs 3 ème actuelle 2 ème Principes actifs - acides nucléiques - médicaments 1 ère Encapsulation Encapsulation + Furtivité Encapsulation + Furtivité + Ciblage cellulaire Génération, etc. Liposomes nanoparticules nanocapsules Virus
6 ffre de prestations et de services : Production de vecteurs de synthèse (lipides cationiques et neutres) Formulation et caractérisation physico-chimique de nanoparticules Vectorisation/Transfection d acides nucléiques et de peptides (lipofection, électroporation) et imagerie in vitro et in vivo Recherche & Développement : Nouveaux vecteurs de synthèse (lipides et polymères) pour la vectorisation d acides nucléiques, peptides et de xénobiotiques Vectorisations optimisées in vitro et in vivo (cellules normales et transformées) et ciblage cellulaire/tissulaire CNTACT : Responsable de la plateforme : Tristan.Montier@univ-brest.fr
7 Les prestations : Synthèse de vecteurs de synthèse (lipides et polymères cationiques et neutres) Structure moléculaire du vecteur Caractérisations des Propriétés physico-chimiques Formulation Efficacité du vecteur Conception et synthèse de lipides cationiques et neutres Ciblage Passif: caractéristiques physico-chimiques Actif : Interactions ligands-récepteurs
8 % in class Les prestations : Formulation et caractérisation de nanovecteurs Caractérisation des propriétés physico-chimiques Size distribution(s) Diameter (nm) SAXS HPTLC DLS - Zétamétrie TEM (cryofracture) MP
9 Nos vecteurs lipidiques pour la transfection : Vecteurs Applications Molécules délivrées Références GLB-73 In vitro (A549, Hela, 16HBE, CFBE41o-, Hep G2 ) In vivo (Intra Veineuse) pdna Guillaume-Gable C. et coll, Hum Gene Ther Floch V. et coll Biochim Biophys Acta KLN-5 In vitro (K562, Daudi, Jurkatt) Ex vivo (Cellules dendritiques, Cellules hématopoïétiques CD34+) pdna Montier T. et coll, Biochim Biophys Acta Le Gallo M. et coll, J Gene Med KLN-47 In vitro (A549, Hela, 16HBE, CFBE41o-, SK-Mel28, A375, Hepa RG, Hep G2 ) Ex vivo (cellules épithéliales humaines, hépatocytes humains ) In vivo (Intra Veineuse) pdna GCV (> 100kb) sirna Montier T. et coll, Mol Biotechnol Picquet E. et coll, Bioconjug Chem Laurent V. et coll. Biotechnology J Delépine P. et coll, En préparation BSV-4 (EP8e) In vitro (A549, Hela, 16HBE, CFBE41o-, SK-Mel28, A375, Hepa RG, Hep G2 ) In vivo (Intra Veineuse) pdna sirna Picquet E. et coll, Bioconjug Chem Le Gall T. et coll, J. Med Chem 2010 Laurent V. et coll Biotechnology J 2010 MM18-DPE In vitro (A549, Hela, 16HBE, CFBE41o-, SK-Mel28, A375, Hepa RG, Hep G2 ) pdna sirna Réthoré G. et coll, Chem Commun 2007 Laurent V. et coll, Biotech J
10 Lipofectamine 2000 FuGENE 6 TransIT TransFectin jetpei Lipofectamine jetpei- Hepatocyte Lipofectin PromoFectin Exgen500 NT GFP positive cells (%) Viability (%) GFP positive cells (%) Viability (%) Nos vecteurs lipidiques pour la transfection : KLN47 KLN 47 Lipophosphoramidate AS P N H As I NT Cellules HepaRG (Floch, Loisel et al. 2000; Guenin, Herve et al. 2000) Cellules HepaRG : rhodamine-siarn
11 Les prestations : Vectorisation et imagerie in vivo (Inserm U1085, Brest) associées à l évaluation de paramètres cellulaires et biochimiques (robot d analyse du sang et plasma : énumération cellulaire, enzymes hépatiques, ionogrammes)
12 Les prestations : L électroporation (Inserm UMR991, Rennes) Méthode d'introduction de molécules bioactives dans des cellules par l application d un champ électrique de haut voltage pendant quelques millisecondes sur les cellules vivantes (en suspension). Les membranes cellulaires sont transitoirement «déstabilisées» et les molécules à vectoriser, présentes dans l'espace extracellulaire, pénètrent par diffusion et sous l effet du champ électrique dans les cellules (ex: ADN chargé négativement). Voltage : > 1000 volts. Temps : 10 à 40 millisecondes. 1 à 3 pulses. Tampons de resuspension cellulaire pré-définis
13 L électroporation : La seule méthode non virale de transfert de gènes permettant une expression significative d un vecteur d expression dans des cellules peu ou pas proliférantes (primaires) Cellules HepaRG progénitrices (proliférantes) ou différenciées (quiescentes) : lipofection KLN47 HepaRG progénitrices: Cellules proliférantes HepaRG différenciées «Hepatocyte-like Cells» : Cellules quiescent es
14 GFP positive cells (%) Fluorescence ratio L électroporation : Transfert d ADN «nu» versus l encapsulation pour la lipofection/polyfection ADN Lipofection vs Electroporation Liposome-ligand ADN Liposome-ligand EP Contraste plasmide protéine GFP Lipoplexe Lipoplexe Noyau Noyau Liposome Endocytose Import nucléaire Endocytose Import nucléaire Sortie des endosomes Sortie des endosomes EP BSV10/DPE R1 GLB43/DPE R1 MM18/Chol R2 0 V. Laurent, A. Fraix, T. Montier, S. Cammas-Marion, C. Ribault, T. Benvengu, PA. Jaffres, P. Loyer. Biotechnol J, 2010, 5,
15 L électroporation : Inserm UMR991 : deux technologies d électroporation. Système «microporator MP100» (Digital Bio, LabTech France, 2007) Disponible sous le nom de système Neon (Invitrogen/Life Sciences)
16 GFP positive cells (%) Viability (%) GFP positive cells (%) Viability (%) Electroporation (Microporator MP100) : Transfection de cellules HepaRG progénitrices ou différenciées par électroporation (24 tests 0,5 µg pegfp pour 10 5 cellules) NT NT V. Laurent, A. Fraix, T. Montier, S. Cammas-Marion, C. Ribault, T. Benvengu, PA. Jaffres, P. Loyer. Biotechnol J, 2010, 5, J. Dumont, R. Jossé, C. Lambert, S. Anthérieu, V. Laurent, P. Loyer, MA Robin, A. Guillouzo. Toxicol Appl Pharmacol., 2010, 249,
17 L électroporation : Système «4D-Nucleofector» (Amaxa/Lonza, 2011) Nucleofector II: «Amaxa System» (2002) 96-well Shuttle Core unit X unit HT-Nucleofector Y unit 384-well plate nucleofector device V. Laurent, Glaise D, Nübel T, Gilot D, Corlu A, Loyer P. Methods In Mol Biol, 2012, sous presse.
18 L électroporation : Système «4D-Nucleofector» (Amaxa/Lonza, 2011) X unit: 2 options Cuvette strip (20 l, 10 5 cells or «regular» cuvette (100 l, 10 6 cells) V well plate Shuttle Cuvette strip (20 l, 10 5 cells) Analyses In situ Analyses ARN-Protéines Criblages banques siarns («in situ reading out»)
19 L électroporation : Système «4D-Nucleofector» (Amaxa/Lonza, 2011) Y unit: For adherent cells Cells cultured in regular 24-well plates and electroporation performed using «dipping electrodes» Phase contrast HepaRG cells GFP Program ED142
20 R&D de la plate-forme SynNanoVect : Synthèse de nouveaux vecteurs : Lipides d Archébactéries (T. Benvegnu, ENSCR) Cheminées hydrothermales Marais salants Diéther Tétraéther Halophiles H 2 N H H Thermophiles diester ou diéther tétraéther LIPSME rganisation des lipides en bicouche INNVATIN (Brard, Richter et al. 2004; Brard, Laine et al. 2007; Rethore, Montier et al. 2007; (Benvegnu, Rethore et al. 2005; Laine, Mornet et al. 2008; Brevet 2006, ENSCR-CNRS) ARCHAESME rganisation des lipides en monocouche
21 R&D : Lipides d archéobactéries ou archéolipides (T. Benvegnu, ENSCR) Etudes de stabilité des archaeosomes : relargage de sonde fluorescente H H Diol MB Sonde fluorescente : 4(5)-carboxyfluorescéine M e 3 N + ( C H 2 ) 2 dipc P - P - ( C H 2 ) 2 N + M e 3 Conditions EPC Diol MB dipc Tensioactif, t = 5s 100 % 30 % 80 % lipoprotéines, t = 15h 70 % 80 % 30 % ph = 2, t = 5 min ph = 2, t = 10 min 95 % 95 % 85 % - 20 % 20 % 20 % 1 brevet (2006, co-propriété) avec licence d exploitation ; Chem. Commun. 2005, (44),
22 R&D : Les applications des archaeosomes (T. Benvegnu, ENSCR) Transfection d acides nucléiques vers les cellules en osmolarité extrême :. Cellules d organismes marins L administration par voie orale de liposomes véhiculant des médicaments:. Ciblage hépatique après absorption intestinale
23 R&D : Synthèse et évaluation de mono- et copolymères de polyesters/polycarbonates (S. Cammas-Marion, ENSCR). PMLA : poly(acide malique) Nanocapsule Nanosphère. Nanoparticules plus petites, plus furtives que les liposomes. biocompatibles et (bio)dégradables capables de s auto-assembler en architectures macromoléculaires originales. Structures «cargo» pour des médicaments. Groupements latéraux permettant le greffage d agents de ciblage (peptides hépatotropes) Z.W. Huang, V. Laurent, G. Chetouani, T. Benvegnu, P. Loyer, S. Cammas-Marion, Int. J.Pharm. 2012, 423, 84-92
24 Procédure pour accéder aux services : Prendre contact avec un responsable de site ( Définir le projet étudier la faisabilité (rédaction d une fiche projet) Etablir un devis Réalisation du projet cas du prêt de matériel (électroporation):. Formation d une ou plusieurs personnes, autonomie d utilisation avec suivi de consommation (réactifs) Clôture du projet rendu de résultats Facturation Fiche de satisfaction
25 Comité de pilotage, de gauche à droite : Thierry Benvegnu, Pascal Loyer, Tristan Montier (Directeur de la plateforme), Paul-Alain Jaffrès Inserm U1078 (T.Montier, MCU, Directeur). Nathalie Carmoy (IE). Tony Le Gall (IR). Yann Sibrill (AI). Caroline Denis (TR). Véronique Laurent (CM) UMR CNRS6226, ENSCR (T.Benvegnu, PU). Jean-Paul Guegan (AI). Sandrine Cammas-Marion (CR). Loïc Lemiègre (MCU). Jelena Jeftic (PU). Thomas Vives (AI) UMR CNRS6521 (PA.Jaffres, PU). Hélène Couthon-Gourvès (MCU) Inserm UMR991 (P.Loyer, CR). Catherine Ribault (TRE). Véronique Laurent (CM)
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