TECHNIQUES BIOLOGIE MOLÉCULAIRE

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1 TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE Instabilité des Extrémités des Chromosomes Humains (I.E.C.H.) Institut de Génétique et Microbiologie Université Paris-Sud ORSAY et Laboratoire de Biologie et Génétique Moléculaire Centre d Etudes du Bouchet Livre de protocoles version n 8 (Sept. 1998) SOMMAIRE

2 techniques Biologie Moléculaire BACTÉRIES ÉLECTROCOMPÉTENTES... 6 ÉLECTROPORATION... 7 TRANSFORMATION TYPE PHAGE M13 RECOMBINANT... 9 MESURE DE LA CONCENTRATION D ADN MESURE Problèmes rencontrés PURIFICATION DE PLASMIDES, PREPARATIONS RAPIDES ) PROTOCOLE TRÈS RAPIDE POUR ANALYSE DE RESTRICTION ET SÉQUENCE DOUBLE BRIN ) PROTOCOLE AVEC LYSOZYME ET ÉBULLITION (NAR, 1988, VOL. 16, N 20, P 9878) ) CULTURE 4 À 20H DANS 2ML MILIEU MLS ) EXTRACTION DE PLASMIDE SUR UNE COLONIE ) PRÉPARATION RAPIDE DE COSMIDES PURIFICATION DE PLASMIDES, PREPARATION EN GRAND ) MÉTHODE ALCALINE ET CHLORURE DE LITHIUM ) LES COLONNES KIT MACHEREY-NAGEL ) AUTRE MÉTHODE : EXTRACTION ALCALINE ET COLONNE SÉPHACRYL Caractéristiques et préparation de la colonne PREPARATION DE MATRICES SIMPLE BRIN DÉTERMINATION DE L'ORIENTATION DES CLONES PURIFICATION D ADN DE PHAGES ) PRÉPARATION DE PHAGES ) MINI-PRÉPARATION D'ADN PHAGIQUE a/ méthode b/ méthode c/ méthode PURIFICATION DES ADN GENOMIQUES ) A PARTIR D'UN PRÉLÈVEMENT SANGUIN HUMAIN (MÉTHODE SANS PHÉNOL/CHLOROFORME) ) À PARTIR DE CULTURE DE CELLULES ) À PARTIR D'EXTRAITS VÉGÉTAUX METHODE MATERIEL PROTOCOLE ) À PARTIR DE TISSUS ANIMAUX ) À PARTIR DE CULTURE DE LEVURE Solutions pour l'extraction d'adn génomique EXTRACTION ADN DE LEVURE PURIFICATION DE FRAGMENTS D ADN ) À PARTIR DE GEL LMP ) PAR ÉLECTROÉLUTION ) PAR ÉLECTROÉLUTION SUR PAPIER ) PAR ADSORPTION SUR BILLES DE VERRE a) extraction avec JetSorb b) protocole adapté de Anal. Biochem. (1982) 121, , Marko et al ) billes de verre ) iodure de sodium 6M ) EtOH/lavage ) CENTRIFUGATION SUR LAINE DE VERRE ) GRADIENTS DE SEL solutions et matériel nécessaires : coulage du gradient :... 34

3 techniques Biologie Moléculaire ) RÉPARATION D'EXTRÉMITÉS ) SOUS CLONAGE PREPARATION D ARN ) EXTRACTION DE RNA TOTAUX EN UNE SEULE ÉTAPE ) PRÉPARATION D'ARN À PARTIR DE CULTURES CELLULAIRES ) EXTRACTION ARN PHÉNOL CHAUD NORTHERN GEL DENATURANT AU FORMALDEHYDE ) GEL 1.2% ) TAMPON DE MIGRATION ) TAMPON DE CHARGE TRANSFERT DE COLONIES SUR FILTRES APPLICATION AU CRIBLAGE D'UNE BANQUE DE COSMIDES DEPOT D ADN SUR FILTRE DE TYPE "DOT BLOT" TRANSFERT DE SOUTHERN ) PRÉPARATION DU GEL ) HYDROLYSES DES ÉCHANTILLONS (ADN GÉNOMIQUE) ET DÉPÔTS ) TRANSFERT DE L ADN DU GEL a/ Par le vide b/ Sans vide MARQUAGE RADIOACTIF D'ADN ) PRÉPARATION D'UN KIT DE MARQUAGE PAR 'RANDOM PRIMING': ) PROTOCOLE DE MARQUAGE ) SONDES D'EXTRÉMITÉS DE COSMIDES ) ELIMINATION DES NUCLÉOTIDES NON INCORPORÉS SUR COLONNE G Préparation de la colonne Comptage HYBRIDATIONS (SOUTHERN ET NORTHERN) ) HYBRIDATION DANS UN FOUR ) RENATURATION DE LA SONDE AVEC L'ADN TOTAL ) DÉHYBRIDATION REACTIONS DE SEQUENCE PRÉPARATION DE MATRICES À PARTIR DE PREP. RAPIDES DE PLASMIDE : SEQUENCAGE DE PRODUITS DE PCR ) OBTENTION DE LA MATRICE SIMPLE BRIN ) PRÉPARATION DES GELS DE SÉQUENCE ) prétraitement des plaques de verre ) solutions ) gels gradient (33 x 40cm) a) Gel gradient à 6%...55 b) Simulation d'un gradient ) gels non gradient ) électrophorèse FICHES-PROJETS FICHE "CARTOGRAPHIE INTERNE" CARTOGRAPHIE INTERNE D'ALLÈLES MINISATELLITES I. GÉNÉRALITÉS II. APPLICATION : TYPAGE D'ALLÈLES CEB ) Amplification et séparation des allèles entiers a/ amplification...59 b/ Visualisation des allèles amplifiés...60

4 techniques Biologie Moléculaire c/ Découpage des bandes contenant les allèles ) MVR-PCR sur allèles isolés a/amplification...61 b/ migration et transfert des produits MVR ) Amplification sur dilutions limites FICHE "LOCALISATION DE GÈNE PAR ANALYSE DE SÉGRÉGATION" PROJET TYPE, ESTIMATION DES COÛTS : AMPLIFICATION DES MICROSATELLITES PAR PCR ) Préparation des plaques PCR ) PCR (Hot start PCR) ) Analyse des produits de PCR FICHE RT-PCR FICHE MANIPULATION-PURIFICATION D'OLIGONUCLÉOTIDES, POLYMÉRISATION PURIFICATION SUR GEL DES OLIGONUCLÉOTIDES APRÈS SYNTHÈSE ) préparation du gel d'acrylamide : ) électrophorèse des échantillons : ) phosphorylation des oligonucléotides: ) polymérisation de l'oligonucléotide marqué ) clonage du polymère FICHE "CLONAGE DE MINISATELLITES PAR LES GRANDS FRAGMENTS" INTRODUCTION: I. CULTURES II. ANALYSE DE RESTRICTION, PURIFICATION DES FRAGMENTS, HYBRIDATION SUR MINIBLOTS III. HYBRIDATION SUR LES LIGNEES IV. SAISIE DES DONNEES, ANALYSE DE SEGREGATION ANNEXE 1: BUDGET D'UN PROJET DE CRIBLAGE DE COSMIDES FICHE "PROJET LEVURE : MESURE DES TAUX DE MUTATION DES LEVURES MINISATELLITES" I. ETAT DE LA QUESTION A. Minisatellite hypermutable CEB1: mécanisme des mutations et questions B. Modèle d'étude de l'instabilité: la levure II. PROTOCOLE MELANGES DE LEVURE : CULTURE ET EXTRACTION DE L'ADN A. Cultures B. Extraction de l'adn C. Analyse des ADN FICHE "CARTOGRAPHIE DE COSMIDES PAR HYDROLYSE PARTIELLE" PURIFICATION DE TAQ POLYMÉRASE BUREAUTIQUE PRÉPARATION DES TAMPONS ET SOLVANTS SOLVANTS SOLUTIONS COURANTES (EAU ULTRAPURE) TAMPONS DE PRÉHYBRIDATION ET D HYBRIDATION MILIEUX DE CULTURE POUR BACTÉRIES OU LEVURES SOLUTIONS STOCK D'ANTIBIOTIQUES SOLUTIONS STOCK D'IPTG ET D'X-GAL SOLUTIONS POUR KITS PRÉPARATION DES MINI-COLONNES QUELQUES DONNÉES UTILES... 99

5 techniques Biologie Moléculaire REMARQUE : LES PROTOCOLES PRÉSENTÉS SONT UNE SÉLECTION DE CEUX EN USAGE À IECH, ET ADAPTÉS À L'APPAREILLAGE DISPONIBLE. ILS NE REMPLACENT PAS LA LECTURE RÉGULIÈRE DES CURRENTS PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY ET CURRENT PROTOCOLS IN HUMAN GENETICS (entre autres ; également Nucleic Acids Research, et revues techniques disponibles à la bibliothèque). Annuaire téléphonique laboratoire IECH (1998) et autres personnes qui ont contribué à la compilation de ces protocoles ou sont actuellement les plus à même de conseiller. Yolande Hauck YH Philippe Le Flèche PLF Agnès Prieur AP Elisabeth Petit EP Pascale Schaerly PS Fabienne Giraudeau FG Bernard Le Guen BLG Gilles Vergnaud GV Christine Pourcel CP

6 Bactéries 6 BACTÉRIES ÉLECTROCOMPÉTENTES Différentes méthodes permettent d introduire un fragment d ADN dans une cellule. Des cellules ayant au préalable été rendues compétentes par traitement chimique sont incubées avec l ADN puis un choc thermique est réalisé. L alternative la plus courante est l électroporation. Les cellules doivent être soigneusement lavées (dessalage) pour éviter les arcs (courts-circuits) lors du choc électrique. Les fragments d ADN sont généralement portés par un vecteur contenant un système autonome de réplication et un système de sélection (le plus souvent un gène de résistance à un antibiotique qui permet à partir de culture sur milieu sélectif de sélectionner ensuite les clones qui ont intégré le fragment d ADN, ou un gène supresseur). Les bactéries transformées vont ensuite se multiplier (1 colonie = 10 6 bactéries) lorsqu elle seront mise en culture sur le milieu sélectif. Un des facteurs clés de la préparation des bactéries compétentes est l'état des bactéries qui servent à ensemencer le milieu de culture. Pour avoir une bonne reproductibilité des résultats, Hanahan par exemple, recommande de faire l'étalement de la souche sur boîte à partir d'un stock conservé en glycérol à -80 C, puis de faire l'ensemencement du milieu à partir d'un étalement frais. On obtient des résultats plus variables quand on utilise des étalements repris de boîte en boîte. Seul le protocole d'électroporation sera présenté ici, se référer aux anciens recueils pour des traitements chimiques des bactéries (protocole PEG par exemple). matériel : - eau refroidie (dans la glace), - glycérol 10% refroidi (dans la glace), - à partir de l'étape 3, les bactéries doivent rester à 2 C. 1 - Inoculer 1litre de milieu LB avec 1/100 de volume d'une culture fraîche (i.e. de la nuit) de la souche utilisée. 2 - Incuber à 37 C avec une agitation vigoureuse (300 rpm) jusqu'à DO : 0,5-0,6. note : l'état des bactéries (pleine phase exponentielle) est un paramètre essentiel. 3 - Refroidir dans la glace en agitant. Laisser 15 minutes (étape essentielle : sinon les bactéries risquent encore d'effectuer une division, 20 minutes pour des XL1). 4 - Centrifuger à 4000g, 2 C dans des tubes prérefroidis et un rotor froid pendant 15 minutes. 5 - Vider le surnageant immédiatement (culot peu compact) et suspendre les culots dans un litre au total d'eau (ou milieu faible force ionique tel que Hépès 1 mm ph : 7 le culot est alors plus compact). Centrifuger comme en Refaire un lavage avec 500 ml d H 2 O et centrifuger. 7 - Resuspendre les culots dans 20 ml de glycérol 10% froid ou GYT (tube falcon). Centrifuger comme en Resuspendre l'ensemble des culots dans un volume final de 2 ml de milieu 10% glycérol froid ou GYT. La concentration cellulaire doit être d'environ 3x10 10 cellules/ml.

7 Bactéries Cette suspension peut être utilisée de suite (les fraîches marchent mieux) ou congelée par aliquots (130 µl) dans de la carboglace de préférence ou de l'azote liquide puis stockée à -80 C. Référence : Current Protocols... section Variante : selon addendum Current Protocols, l'utilisation de milieu GYT au lieu de glycérol 10% pour la resuspension finale (étape 8) améliore l'efficacité d'un facteur 4 à 10, en améliorant (peut-être) la survie des colonies. GYT : Glycérol 10% Yeast extract 0.125% (p/v) Tryptone 0.25% (p/v) contact : YH ÉLECTROPORATION Introduction de fragment d ADN dans une cellule hôte. matériel : mettre dans la glace : les cuves à électroporation, tubes Eppendorfs froids, tubes contenant 1 ml de milieu LB (ou ML). 1 - Décongeler en douceur les cellules à T ambiante ou sur de la glace. 2 - Mettre 40 µl de bactéries dans un tube eppendorf pré-refroidi, ajouter 1 à 2 µl d'adn (qui doit être dans une solution de faible force ionique, TE ou eau ; 0,5 µl de produit de ligation ne provoque pas d'arc). 3 - Gene Pulser Biorad réglages standards bactéries et plasmides : voltage = 2,5 kv capacitance = 25 µf résistance = 200 ohms On peut lire dans notes annexes Current Protocols une étude sur l optimisation des paramètres en fonction notamment de la taille de l ADN à introduire. Utilisation de l électroporateur : Mise en marche bouton face avant du module du bas. Capacitance et résistance : boutons en bas à droite et en haut à gauche. Voltage : appuyer (2 fois) simultanément sur les touches «raise» et «lower» module du bas jusqu à affichage du préréglage 2,5 kv.

8 Bactéries Transférer le mélange dans une cuvette d'électroporation froide. La mettre dans la chambre d'électroporation et appliquer une pulsation en appuyant simultanément sur les 2 boutons (rouges) Pulse. (la constante de temps doit approcher le plus possible 5,2 msec). 5 - Ajouter immédiatement 1 ml de milieu froid LB (ou SOC) aux cellules électroporées, et récupérer l'ensemble avec une pipette Pasteur. 6 - Transférer les cellules dans un tube bouchon rouge 10 ml et incuber pendant une heure à 37 C (225 rpm). Entre chaque électroporation, ne pas oublier de remettre à 0 la constante de temps en appuyant sur Set Volt. 7 - Avant étalement, centrifuger la culture bactérienne à 3000 rpm 5 minutes et éliminer le surnageant afin de garder environ 100 µl de culture, reprendre le culot dans le surnageant. 8 - Etaler sur gélose les 100 µl de culture à l aide d une pipette rateau. Note : extemporanément, on peut étaler sur la gélose 40µl X-gal 2% et 40µl IPTG 2%. Contact : YH Réutilisation des cuves : Les cuves peuvent être réutilisées de nombreuses fois dans le cas de nos usages «bactériologie» (entre 10 et 20 fois, opacité pas gênante), ce qui est intéressant vu leur prix (de 20 à 30 F H.T). Celles-ci ont tout de même une durée de vie limitée c est pourquoi il est recommandé de noter le nombre d utilisation des cuves (gestion individuelle) et ne pas hésiter à éliminer les cuves défectueuses. Lavage : Eau du robinet abondamment Eau distillée (avec pissette) Alcool (Avec pissette) - Conserver ouverture vers le bas par exemple dans un pot yaourt en verre (il en rentre 6 ou 7). - Remplir d'alcool jusqu'à mi-hauteur des cuvettes. - Fermer avec un Saran, garder à T ambiante. Avant utilisation, mettre à sécher sous la hotte, ouverture vers le haut. En options, variantes : faire bouillir après nettoyage à l'eau osmosée, puis stocker à sec. voir aussi : à propos du traitement de l'adn ligaturé : Nucleic Acids Res., 1993, vol. 21, n 11 p2782 Contact : YH

9 Bactéries 9 TRANSFORMATION TYPE PHAGE M13 RECOMBINANT ATTENTION : ne pas oublier la préculture. - Ajouter 50 µl de TG1 ou XL1 fraîches par boîte. - Ajouter les bactéries et l'adn à la gélose MGM (3 ml) préalablement maintenue à 45 C + 40 µl IPTG 2%+ 40 µl Xgal 2% (solutions stock conservées à -20 C). - Vortexer rapidement et couler sur boîtes (les sortir à l'avance). Contact : G.V Stockage souches bactéries : Solution glycérol : 65% glycérol 0,1 M Mg SO4 0,025 M Tris ph8 - mélanger 1ml de culture et 1ml de solution glycérol - Conserver à 80 C Contact : G.V

10 Préparation d'adn et d ARN 10 MESURE de la CONCENTRATION d ADN Fluorimètre DyNa Quant 200 (cuve de 2 ml standard) La mesure de la concentration d ADN par fluorimétrie est bien adaptée lorsque l ADN est contaminé par des ARNs ou des nucléotides libres (par rapport à une mesure d absorbance UV, qui ne discrimine pas les acides nucléiques simple brin, double brin, nucléotides libres). HOESCHT (Bisbenzimide) a peu d affinité pour l ADN simple-brin ou les nucléotides libres. Dans le cas de très fortes contaminations cependant, faire une évaluation par comparaison avec un témoin sur gel. MESURE Pour plus de détails, voir classeur mode d'emploi. 1 - Mettre sous tension l'appareil, attendre 15 min (extinction automatique au bout d une heure) 2 - Préparer 20 ml de solution : 18 ml d H 2 O 2 ml de TNE 10x 20 µl de stock H33258 (stock à 1mg/ml, dans eau milliq, conservé à 4 C à l obscurité -bouteille teintée ou tube enveloppé dans papier aluminium- Conservation = 6 mois, peut perdre ses capacités assez brutalement) 3 - Mettre 2 ml de solution dans la cuve (la gravure G face à l utilisateur) 4 - Appuyer sur ZÉRO. 5 - Ajouter 2 µl d'adn de référence (ADN porc = 110 ng/µl) La fluorescence varie en fonction de la concentration de l ADN en GC, et de l accessibilité de l ADN à l intercalant (pureté de l ADN, topologie plasmide vs ADN génomique ; pour une évaluation précise, le témoin devrait donc être choisi en conséquence) 6 - Bien mélanger par brassage pipetman P1000 (éviter les bulles) 7 - Appuyer sur CALIB 8 - Saisir la valeur de la concentration du standard (110 ng/µl) 9 - Appuyer sur ENTER 10 - Ensuite pour les mesures : rajouter séquentiellement 2µl d échantillon et vider la cuve lorsque l affichage dépasse 2000 en cumulé A la fin, rincer la cuve à l eau, la sécher, et la ranger dans la boîte dédiée. Faire attention lors des manipulations avec des gants, la cuve mouillée est alors glissante (coût : 600 FHT).

11 Préparation d'adn et d ARN 11 Problèmes rencontrés Les problèmes qui peuvent être rencontrés sur cet appareil viennent de : - stock Hoescht trop ancien, - échantillon d ADN trop concentré ou non homogène, - échantillon mal mélangé. Voir aussi le «trouble shooting guide» à la fin du manuel. Pour pouvoir ajouter séquentiellement les échantillons sans refaire le zéro à chaque mesure, il faut être en «prompt mode off». Le cas échéant choisir mode «off» à partir du menu «Set up». Nous avons aussi le kit cuvette pour microvolume (10 à 100 µl) qui permet la récupération de l échantillon (voir notice dans classeur du fluorimètre). Lorsque l on a de façon fréquente, une grande série d échantillons à mesurer, il peut-être intéressant d utiliser le Biolumin-960 (voir avec Ph. Bouloc). Cependant, les filtres actuellement disponibles ne sont pas adaptés.

12 Préparation d'adn et d ARN 12 PURIFICATION DE PLASMIDES, PREPARATIONS RAPIDES Antibiotiques, concentration finale d usage : Tétracycline :10 mg/l (500 µl d un stock à 20 mg/ml par litre de milieu) Ampicilline : - pour les plasmides 50 à 150 mg/l (entre 0,5 et 1,5 ml d un stock à 100 mg/ml par litre de milieu) - pour les cosmides 50 à 80 mg/l kanamycine : 20 mg/l (1 ml d un stock à 20 mg/ml par litre de milieu) 1) protocole très rapide pour analyse de restriction et séquence double brin références: Zhou et al., Biotechniques vol. 8, n 2, (1990) également Jones et Schofield, NAR vol. 18 n 24, p Faire pousser les clones dans 2 ml de milieu LB 2 - Centrifuger la culture 10 secondes en tube Eppendorf 3 - Eliminer le surnageant en gardant µl de milieu 4 - Resuspendre en agitant (Vortex) 5 - Ajouter 300 µl de solution B (soude) 6 - bien agiter par retournement 7 - Ajouter 150 µl de solution C (acétate de potassium ou de sodium) 8 - Bien agiter par retournement 9 - Centrifuger 2 minutes à rpm 10 - Verser le surnageant dans des tubes eppendorf neufs et ajouter 0.9 ml (remplir les tubes) d'ethanol (gardé à -20 C) Centrifuger 2 minutes à rpm 12 - Eliminer le surnageant et remplir les tubes avec éthanol 70% froid 13 - Vider les tubes en égouttant et laisser sécher (ou Speed-vac 2 minutes) 14 - Reprendre dans 40 µl de TE (ou TE+ RNase). Remarques : ne pas s'arrêter au cours des étapes 1 à 11 (il est commode d'extraire les échantillons par douzaine). étape 12 : il peut être préférable de resuspendre les ADN dans 40µl de TE et de reprécipiter avec 100 µl d'etoh, plutôt que de rincer à l'etoh 70%. Congeler les ADN (déprotéinisation minime, risques de dégradation à 4 C) *option : étape 14 : reprendre dans 40 µl de TE + 0,5 µl de RNase à 10 mg/ml. Laisser 10' à 37 C Ajouter 23 µl de PEG %- NaCl 2,5M. Centrifuger 15 à rpm Faire un rinçage à l'etoh 70% froid. Centrifuger 5 à rpm Vider les tubes en égouttant et laisser sécher Reprendre dans 40 µl de TE.

13 Préparation d'adn et d ARN 13 Solution A glucose 50mM sola x 10 4,5g EDTA 10mM 10ml (0,5 M) Tris-HCl ph : 8,0 25mM 6,25ml (2 M) H 2 O qsp 50ml. Filtrer 0,2 micron Solution B (extemporanément) NaOH 0,1M 0,5 ml (10 M) SDS 0,5% 1,25 ml (20%) H 2 O qsp 50 ml (Pour obtenir 10 ml de solution 1, ajouter 100 µl de soude 10M et 250 µl de SDS 20% à 9,7 ml de T.E.) (2.5 ml de soude 0,4M et 250 µl de SDS 20% à 7,3 ml de T.E.) Solution C acétate de potassium (3M final) H 2 O acide acétique solution finale ph g 167 ml qsp 500ml RNase A pour 1ml, peser 10 mg de RNase A (10 mg/ml) faire bouillir 10 min au bain-marie Le rendement est de 2 à 5 µg environ. Ce protocole donne de très bons résultats en séquençage double brin manuel (non testé sur séquenceur). Si les cultures sont faites en milieu tamponné type MLS, il est préférable de l'éliminer complètement et de reprendre le culot bactérien dans du GET (glucose-edta-tris, solution A annexes) puis de procéder comme décrit par Jones et Schofield. 2) protocole avec lysozyme et ébullition (NAR, 1988, vol. 16, n 20, p 9878) avantages : préparation en un seul tube ; pas de solvants 1 - Verser 1,5 ml de culture de la nuit dans un tube eppendorf et centrifuger 4 à 4 C. 2 - Reprendre le culot en 200 µl de STET ( 8% m/vol sacharose, 0,1 % vol/vol Triton X-100, 50 mm EDTA, 50 mm Tris HCl ph 8). 3 - Ajouter 4 µl de lysozyme (solution fraîche à 50 mg/ml ; stock en poudre conservé à 4 C ou -20 C). 4 - Incuber 5 minutes à température ambiante. 5 - Laisser 45 sec. dans un cristallisoir d'eau bouillante, centrifuger 10 min à rpm. 6 - Enlever le culot avec un cure-dent, ajouter 8 µl de CTAB (Serva ; solution fraîche à 50 mg/ml), centrifuger 5 min. à température ambiante. 7 - Le culot est repris dans 300 µl de NaCl 1,2 M par vortexage intensif et reprécipité par addition de 750 µl d'éthanol 100% froid et centrifugation 10 min. 8 - Le culot final est rincé en 70% éthanol froid, séché 3 min. au dessiccateur ou laissé sur la paillasse, et resuspendu dans 40 µl de T.E. Le rendement usuel pour des plasmides type puc est de l'ordre de 5 µg. 1/2 préparation suffit à faire la séquence. G.V

14 Préparation d'adn et d ARN 14 3) Culture 4 à 20h dans 2ml milieu MLS 1 - centrifuger 2 ml dans un tube Eppendorf 8K 4min à 4 C 2 - reprendre 200 µl sol. A ; 3 - ajouter 200 µl de sol. B ; mélanger doucement par rotations multiples ; une fois que la solution est devenue visqueuse, vortexer à pleine puissance ; la solution doit être limpide (s'il reste un trouble, c'est que les bactéries ne sont pas toutes lysées) 4 - ajouter 150 µl sol. C ; bien mélanger ; vortexer ; 5 - centrifuger rpm 5 min. 6 - surnageant µl phénol ; centrifuger rpm 5min 7 - surnageant µl isopropanol (Eppendorf de 1,5 ml) ; centrifuger 14K 10 min 8 - rincer le précipité avec 400 µl d éthanol à 70%. 9 - précipité repris dans 200 µl TE; analyser 1 à 5 µl Note : pour des cosmides reprendre le précipité dans 50 µl et analyser 5 µl. Solution A glucose 50mM sola x 10 4,5g EDTA 10mM 10ml (0,5 M) Tris-HCl ph : 8,0 25mM 6,25ml (2 M) H 2 O qsp 50ml. Filtrer 0,2 micron Solution B (extemporanément) NaOH 0,1M 0,5 ml (10 M) SDS 0,5% 1,25 ml (20%) H 2 O qsp 50 ml (Pour obtenir 10 ml de solution B, ajouter 200 µl de soude 10M et 500 µl de SDS 20% à 9.5 ml de T.E.) Solution C acétate de potassium (3M final) H 2 O acide acétique solution finale ph g 167 ml qsp 500ml RNase A pour 1ml, peser 10 mg de RNase A (10 mg/ml) faire bouillir 10 min au bain-marie

15 Préparation d'adn et d ARN 15 4) Extraction de plasmide sur une colonie Suffisante pour une digestion 1 - Récupérer (au cure-dent ou à l'anse de platine) la colonie (penser à la numéroter) et la resuspendre dans 100 µl de solution A ( voir au paragraphe 3) puis vortexer. 2 - Ajouter 200 µl de sol. B (voir au paragraphe 3), mélanger par retournement puis rajouter 150 µl de NaOAc 3M ph 5.2 et vortexer vigoureusement environ 10 sec. 3 - Centrifuger 5 min en eppendorf et récupérer le surnageant sur lequel on peut éventuellement faire un phénol avant de le précipiter à l'alcool. 4 - Digérer la totalité de la préparation, repérer les clones positifs que l'on remettra en culture pour en faire des maxi-préparations. 5) Préparation rapide de cosmides 1 - Faire une culture de 24h et 8ml de ML avec antibiotique en tube bouchon rouge de 10ml (bouchon percé) à 37 C avec agitation. 2 - Centrifuger les tubes 10 minutes à 3000 rpm (Jouan) 3 - Reprendre les culots dans 110 µl de solution A et transférer en tubes Eppendorf. 4 - Ajouter 220 µl de solution B et bien agiter par retournement. 5 - Ajouter 165 µl de solution C et bien agiter par retournement. 6 - Centrifuger 5 minutes rpm. 7 - verser le surnageant dans un nouveau tube. 8 - Ajouter un volume (450 µl) de phénol /chloroforme et bien agiter. 9 - Centrifuger 2 minutes à rpm Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube et précipiter avec deux volumes d'éthanol 100% froid Mélanger par retournements et centrifuger 3 minutes à rpm Eliminer le surnageant et rincer le culot en remplissant le tube avec 1ml d'éthanol à 70% froid. Laisser 2 minutes et éliminer le surnageant Bien égoutter les tubes et laisser sécher les culots sur la paillasse Resuspendre dans 20 µl de TE (ou TE+RNase 1mg/ml).

16 Préparation d'adn et d ARN 16 PURIFICATION DE PLASMIDES, PREPARATION EN GRAND Solution A glucose 50mM sola x 10 4,5g EDTA 10mM 10ml (0,5 M) Tris-HCl ph : 8,0 25mM 6,25ml (2 M) H 2 O qsp 50ml. Filtrer 0,2 micron Solution B (extemporanément) NaOH 0,2M 1 ml (10 M) SDS 1% 2,5 ml (20%) H 2 O qsp 50 ml (Pour obtenir 10 ml de solution B, ajouter 200 µl de soude 10M et 500 µl de SDS 20% à 9.5 ml de T.E.) Solution C acétate de potassium (3M final) H 2 O acide acétique solution finale ph g 167 ml qsp 500ml RNase A pour 1ml, peser 10 mg de RNase A (10 mg/ml) faire bouillir 10 min au bain-marie 1) Méthode alcaline et chlorure de lithium Partir d'une boîte et de colonies fraîchement étalées : Selon Flint, préparations adaptées à cultures de PACs, bon pour in situ. Rajout de extractions phénol-chloroforme pour nos besoins (hydrolyses de restriction, migrations sur gel). Quantités pour 200 ml de culture milieu 2YT. 1 - Piquer une colonie isolée. Inoculer milieu "Super" (MLS) ou 2YT + antibiotique adéquat dans un Erlen de volume égal à 5 fois le volume de culture (Erlen de 1 litre pour 200 ml de milieu 2YT). Cultiver sous agitation rpm la nuit à 37ºC. 2 - Centrifuger la culture 10 min 4000 rpm. 3 - Resuspendre avec 10 ml sol. A (pipetter et vortexer vigoureusement) et transférer en tube Falcon 50 ml ml sol. B (fraîche) ; agiter doucement (mélanger par huit retournements, selon flint) ; la solution doit se prendre en gel. 5 minutes à température ambiante ml sol. C ; agiter doucement (huit retournements). 4 - Centrifuger 4000 rpm, 4ºC, 10min. 5 - Ajouter au surnageant (éventuellement filtré sur de la gaze jetable- ou nylon type drain pour hybridation récupérable-) 20 ml iso-propanol (propane-2-ol). Mélanger par retournements et centrifuger 4000 rpm 10min ( on peut récupérer un peu plus d'adn si on laisse précipiter 1h à -20 C avant de centrifuger). Laisser sécher le culot.

17 Préparation d'adn et d ARN Rincer le culot avec Ethanol 70% froid, puis reprendre le culot dans 1ml TE ; transférer en tubes Eppendorf de 2 ml (réf , de préférence à ceux de 2,2 ml qui ont tendance à fuire) ; ajouter 5 µl RNaseA 10mg/ml ; 15min à 37 C. 7 - Extraire avec 1 ml phénol, puis 1 ml phénol/chloroforme/alcool isoamylique Recommencer jusqu à ce qu il n y ait plus d interface (souvent trois extractions au total). 8 - Précipiter la phase aqueuse avec 0,3 ml NH 4 Ac (7,5M) et 2,5 ml éthanol 100% froid dans un tube 10 ml bouchon rouge. Mélanger par retournements et centrifuger 10 minutes à 4 C et 3000 rpm. 9 - Eliminer le surnageant et dissoudre le culot dans 1ml TE. Précipiter à nouveau avec 0,1ml NaAc 3M ph : 5,2 et 2,5 ml éthanol 70% froid et centrifuger. Dissoudre le culot dans du TE stérile (300 µl) Estimer la concentration par migration sur gel d un aliquote de 5 µl digéré par EcoRI (dans un volume total de 10 µl). Remarque : pour les PAC, dissoudre dans seulement 100 µl de TE. 2) les colonnes Kit Macherey-Nagel - semblent également bien adaptées au moins pour : - séquençage - transfections de cellules - se présentent en trois formats : mini, 100 et suivre protocole. Remarque : faire parfois une deuxième élution Contact : YH 3) Autre méthode : extraction alcaline et colonne séphacryl Le milieu LS permet d'obtenir des rendements de l'ordre de 10 à 15 mg/litre pour des plasmides de type puc et des souches de type TG1, JM Ensemencer 250 ml de milieu avec antibiotique avec une colonie de bactéries. 2 - Après 24 heures de culture pour des souches type TG1, 36 heures pour des souches type DH5 ou HB101, les bactéries sont centrifugées à environ 5000 rpm pendant 10 à15 min. 3 - Le culot est resuspendu dans 5 ml de T.E. et laissé dans la glace 10 min. 4 - Ajouter 12 ml d'un mélange de soude 0.2 N ; SDS 1% fait le jour même (sol. B). Mélanger doucement et laisser dans la glace 20 minutes environ.

18 Préparation d'adn et d ARN Ajouter 6 ml d'acétate de potassium 5M ph : 4.8 (sol. C) et agiter fortement puis laisser 30 min. dans la glace. 6 - Centrifuger pendant 15 min. à 5000 rpm. 7 - Récupérer le surnageant en le filtrant sur de la gaze, ajouter 20 ml de chloroforme, agiter, laisser décanter ou centrifuger 5 min. à 3000 rpm. 8 - Récupérer la phase aqueuse, ajouter 15 ml de propanol 2 et centrifuger à rpm pendant Eliminer le surnageant, égoutter, laisser sécher et rependre le culot dans 2 ml de T.E Ajouter 20 µl de RNAse à 10 mg/ml et incuber pendant 30 minutes à 37 C Ajouter 100 µl d'une solution de SDS à 10% et 20 µl d'une solution de protéinase K à 10 mg/ml et incuber à 50 C pendant 1 heure Ajouter 1 ml de phénol, agiter, ajouter 1 ml de chloroforme : alcool isoamylique, agiter et centrifuger brièvement. Commentaire : jusque-là, protocole classique lyse alkaline, avec légères variantes Prélever la phase aqueuse, ajouter 200 µl de bleu de dépôt et déposer sur la colonne Après environ 1 heure d'élution (premier bleu ayant parcouru le tiers de la colonne), prélever une quinzaine de fractions de 100 gouttes (3 à 5 ml) Déposer 10 µl de chaque fraction sur un gel d'agarose. Habituellement, le plasmide est obtenu dans un volume d'une quinzaine de millilitres Précipiter avec propanol 2, rincer le culot à l'éthanol à 70% froid, laisser bien sécher, resuspendre dans 1 ml de T.E. et mesurer la concentration au fluorimètre. Caractéristiques et préparation de la colonne. Utiliser, par exemple, une colonne d'un diamètre de 1 cm et d'une longueur de 50 cm. L'élution se fait par gravité avec un tampon Tris 20mM ph : 8 ; E.D.T.A. 1mM ; NaCl 1 M. Dégazer le Séphacryl S-1000 pendant 30 min. avant le chargement. L'ADN chromosomique passe avant le plasmide, l'arn après. Dans les conditions utilisées, les premières fractions de plasmide sont contaminées par de l'adn chromosomique. La colonne commence apparemment à saturer au delà d'une quantité de 2 mg de plasmide environ. Contact : GV

19 Préparation d'adn et d ARN 19 PREPARATION DE MATRICES SIMPLE BRIN 1 - Inoculer 5 ml de milieu LB avec une colonie de JM101 (reca + ) ou JM109 (reca - ) cultivée sur milieu minimum (milieu M9 glucose de Maniatis et al. avec thiamine (vitamine B1)) et incuber à 37 C jusqu'en fin de phase exponentielle (D.0.1 environ). Cette préculture peut être conservée quelques jours au froid. 2 - Diluer les cellules au 1/100 en milieu YT, et répartir 2 ml dans des tubes. 3 - Piquer les colonies M13 (colonies bien séparées à partir de boites incubées moins de 12 heures à 37 C), et incuber avec agitation à 37 C pendant 5 à 8 heures 4 - Transférer les cultures en tubes Eppendorf de 1.5 ml, centrifuger 5 min., verser le surnageant dans des tubes contenant 250 µl de PEG (20% PEG 6000, 2.5 M NaCl), mélanger, laisser 10 min. à température ambiante, centrifuger 5 min. 5 - Le culot de phages doit être visible. Eliminer le surnageant avec une pipette Pasteur effilée et une trompe à eau, centrifuger 30 secondes, éliminer le surnageant résiduel. 6 - Suspendre le culot dans 100 µl de T.E., ajouter 50 µl de phénol, agiter, ajouter 50 µl de chloroforme-isoamylalcool, agiter, centrifuger 5 min. 7 - Prélever soigneusement la phase aqueuse (90-95 µl), ajouter 3 µl de chlorure de sodium 5 M et 250 µl d'éthanol, mélanger et laisser 30 min. dans la glace. 8 - Centrifuger 10 min., éliminer le surnageant, laver avec de l'éthanol à 70% (remplir le tube, le laisser à température ambiante pendant 5-10 min., enlever l'éthanol). Laisser sécher pendant la nuit ou sous vide. 9 - Suspendre dans 30 µl de T.E., et garder à -20 C. NAR 1987 vol. 15, n 23 p propose un protocole très rapide avec CTAB et sans phénol. A essayer avec une solution fraîche de CTAB. Détermination de l'orientation des clones - mélanger 1/20 de préparation de chacun des deux clones 0,5 µl de NaCl 5M. H 2 O q.s.p 10 µl - incuber 10 min. à 60 C - déposer sur gel (avec un témoin) G.V

20 Préparation d'adn et d ARN 20 PURIFICATION D ADN DE PHAGES 1) Préparation de phages 1 - Cultiver les bactéries LA 101 jusqu à environ 1 O.D. (5x10 8 bact/ml) suspendre dans 30 µl de T.E., et garder à -20 C. 2 - Infecter 10 bactéries par 1 phage pendant 15 min à 37 C pour 1litre, il faut environ 10 9 phages et bactéries 3 - Transférer dans 1litre de ML contenant 10mM MgCl 2 et 0,2% de maltose 4 - Incuber 7 heures au moins ou la nuit à 37 C 5 - Ajouter 4 ml de chloroforme et agiter pendant 5 min 6 - Centrifuger à 6000 rpm pendant 15 min à 4 C 7 - Ajouter PEG g/10ml NaCl 0,584g/10ml 8 - Précipiter à 4 C au moins une heure 9 - Centrifuger à 2000 rpm pendant 30 min à 4 C 10 - Suspendre le culot dans 8ml de tampon phage (Tris 10mM PH : 7.4, MgCl 2 10mM) 11 - Faire une extraction au chloroforme 12 - Préparer 2 gradients de césium : 2ml de 1,7 ;1,5 ; 1,3 (Césium BRL ultrapur) CsCl Tampon de phage 1,3 10g 22,3 ml 1,5 20g 25,2 ml 1,7 20g 15,8 ml 13 - Centrifuger 3heures à rpm ou 2heures rpm 14 - Prélever la bande et ajouter du CsCl 1,5 jusqu à 3ml 15 - Centrifuger dans le rotor SW 50-1 pendant 20 heures 16 - Dialyser contre du Tris 10 mm, MgCl 2 10 mm Ph : 7,4

21 Préparation d'adn et d ARN 21 2) Mini-préparation d'adn phagique a/ méthode Inoculer 20 ml de milieu LB + 0,2% maltose avec une colonie de la souche bactérienne "phage spécifique" fraîchement étalée, et incuber la nuit à 37 C sous agitation. 2 - Mesurer la DO à 600 nm (1UDO = bactéries/ml, cependant la densité cellulaire en fonction de la DO varie selon les souches, cf. Sambrook 1.82), centrifuger à 4K 5min et reprendre le culot dans du milieu SM de façon à obtenir bactéries/ml. 3 - Etaler une boite avec le clone phagique à purifier, prélever 20 plages de lyse et les mettre à diffuser au moins 4h dans 200 µl de milieu SM. 4 - Réaliser l'infection en incubant 15 min à 37 C 100 µl de bactéries, soit bactéries, et 20 µl de l'inoculum phagique, soit pfu). 5 - Inoculer ces 120 µl dans 20ml de LB + 0,1% glucose + 10mM MgCl 2 et incuber à 37 C sous agitation pendant 4 à 8H. 6 - Lorsque la lyse est suffisante, ajouter 2 ml de CHCL 3 et incuber encore 10min à 37 C sous agitation. A cette étape l'erlen peut être conservé une nuit à 4 C. 7 - Centrifuger 10 min à 12K et récupérer le surnageant. 8 - Ajouter 10 µg/ml de RNAse DNAse free ainsi que 10 µg/ml de DNAse et incuber 30 min à 37 C. 9 - Ajouter 4 ml de solution de lyse (EDTA 0,25M - Tris HCl ph : 8 ; 0,5M - SDS 2,5%), homogénéiser, et incuber 30min à 70 C Ajouter 6 ml d'acétate de K (8M), homogénéiser, et incuber 15min à 4 C Centrifuger 30min à 10K et à 4 C. Conserver le surnageant auquel on ajoute 20ml d'isopropanol et incuber le tube 10 min à température ambiante Centrifuger 15 min à 10K et à 20 C. Réaliser trois lavages du culot avec 5 ml d'éthanol 70% sans centrifugation en faisant très attention au culot d'adn Reprendre le culot dans 500 µl de TE 20:5 + 0,3M NaAc ph : 8, et transvaser l'échantillon dans un tube Eppendorf Extraire deux fois avec du phénol/chloroforme, puis deux fois avec un volume de chloroforme seul Précipiter l'adn avec 2/3 de volume d'isopropanol, faire un lavage avec de l'éthanol 70%, sécher le culot et le reprendre dans environ 400 µl de TE 20:1. On obtient environ 100 µg d'adn phagique pur.

22 Préparation d'adn et d ARN 22 b/ méthode Inoculer 20ml de milieu LB + 0,2% maltose avec une colonie de LA101 fraîchement étalée. 2 - Lorsque la DO600 est d'environ 1 (5 à 7h; /ml), centrifuger 2000 rpm 10 min, reprendre dans 5ml SM 3 - Ajouter à 1,5ml bactéries indicatrices pfu de phage. Incuber 30 à 37 C. 4 - Ajouter à 250 ml milieu LB + MgSO 4 10mM préchauffé à 37 C dans un Erlenmeyer de 2litres. Cultiver 8 à 12 h sous agitation rapide (i.e. jusqu'à la lyse). 5 - Ajouter 5 ml chloroforme. Incuber encore 30 min à 37 C sous agitation. 6 - Refroidir à température ambiante sous un robinet d'eau froide. 7 - Ajouter 250 µl DNAse I 1mg/ml (frais) 250 µl RNAse 1mg/ml (frais). Incuber 30 min à température ambiante. 8 - Ajouter 14,6 g NaCl. Dissoudre 5min sous agitation magnétique douce. Laisser 1h dans la glace. 9 - Centrifuger 10 min 4 C 9000 rpm (Sorvall 6 x 500ml). Transférer le surnageant (en évitant le chloroforme du fond) dans une fiole propre et ajouter 25g PEG Dissoudre 5 min sous agitation magnétique douce. Laisser de 1h à la nuit dans la glace Centrifuger 10 min 4 C 9000 rpm (Sorvall 6 x 500ml). Bien ôter le surnageant (éventuellement centrifuger de nouveau). Reprendre le précipité dans 4ml SM. Extraire avec 4ml chloroforme Centrifuger rpm 2h ou rpm 1h (godets oscillants) Reprendre le culot de phage dans 2 ml SM Ajouter EDTA 0,5M 80 µl protéinase K 50mg/ml 40 µl SDS 10 % 200 µl incuber à 65 C 30 min Extraire au phénol puis au phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25:24:1) Dialyser contre 3 x 2 litres TE Solutions SM NaCl 100 mm pour 1 litre 5,8g MgSO 4,7 H 2 O 8 mm 2g Tris-HCl ph : 7,5 50 mm 50ml 1M gélatine 0,1 mg/ml 5ml 2%

23 Préparation d'adn et d ARN 23 c/ méthode 3 (Grossberger, NAR Vol 15, 1987 p 6737) 1 - Choisir la plage désirée avec une pipette Pasteur stérile et la verser dans une tube de 18 ml contenant 0,3 ml de tampon d'adsorption et 0,2 ml d'une culture exponentielle de bactéries en milieu ML 0,4% maltose. Tampon d'adsorption (10mM Mg Cl 2 et 10mM Ca Cl 2 ) : Dans 5 ml : 1ml 50 mm CaCl 2 50 µl 1 M Mg Cl Incuber le tube pendant 10 minutes à 37 C. 3 - Ajouter 10 ml milieu ML contenant Mg Cl 2 10mM et 0,1% glucose. Dans 10 ml : 50 µl 20% glucose 100 µl 1M Mg Cl Incuber la nuit à 37 C avec agitation en inclinant à 45. Les bactéries doivent être lysées. 5 - Centrifuger les tubes à 5000 rpm pendant 10 minutes pour culotter les bactéries. 6 - Centrifuger le surnageant à rpm pendant 30 minutes. 7 - Suspendre le culot dans 200 µl de milieu 63B1 dilué 10 fois, et le transférer dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Le milieu 63B1 1/10 peut-être remplacé par Tris 10mM ph 7.4, Mg Cl 2 10mM 8 - Préparer immédiatement avant usage une solution de protéinase K, 1 mg/ml, en milieu 63B1, et en ajouter 200 µl à chaque tube. Incuber à 37 C pendant 2 heures. 9 - faire une extraction phénol, suivie d'une extraction chloroforme Précipiter l'adn avec NaCl 0,2M et 2 vol. d'éthanol 100% Centrifuger et suspendre le culot en 100 µl TE µl sont utilisés pour une digestion de vérification. C.P

24 Préparation d'adn et d ARN 24 PURIFICATION DES ADN GENOMIQUES. 1) A partir d'un prélèvement sanguin humain (Méthode sans phénol/chloroforme) Note : selon l espèce considérée, la concentration en lymphocytes est variable (par exemple, plus élevée chez le porc). Dans d autres cas (oiseaux, chameau), les globules rouges sont nucléés, et d autres protocoles seront mieux adaptés. Travailler sur glace avec des gants. 1 - Congeler le prélèvement sanguin (sur EDTA) à 20 C dès réception (en général tube en verre de 5 ml). 2 - Le jour de l'extraction, décongeler dans la glace. Si le prélèvement est encore dans le tube en verre, mettre le tube dans un tube 50 ml par précaution. En tout cas, éviter les chocs thermiques lors de la sortie du tube hors congélateur (le tenir par le bouchon caoutchouc, le mettre tout de suite dans la glace). 3 - Laisser décongeler doucement et complètement, en tournant de temps en temps le(s) tube(s) posé (s) sur la glace. 4 - Diluer avec environ 4 volumes de TE 20:5 froid (bouteille préalablement refroidie dans la glace). 5 - Incuber dans la glace 15 min pour que la lyse des hématies ait lieu. 6 - Centrifuger (godets oscillants) 20 min, à 4 C et 4000rpm. Eliminer doucement le surnageant. 7 - Remettre en suspension les cellules avec 15 ml de TE 20:5 en vortexant et agitant si nécessaire. Le culot doit être complètement dissocié. Centrifuger 15 min à 4 C et 4000rpm. 8 - Faire au minimum 2 lavages (jusqu'à ce que le culot soit translucide). 9 - Reprendre le culot dans 1/2 volume de sang de départ de TE 20:5 (2,5 ml). 10 Ajouter : Sarcosyl (ou SDS) à 1% final, Protéinase K à 200 µg/ml final. (250 µl Sarcosyl ou SDS 10%, 25 µl de protéinase K à 20 mg/ml) 11 - Incuber sous agitation (300 rpm) toute la nuit à 37 C ou 2h à 65 C. par exemple, la nuit à 37 C, sur balancelle dans étuve, en ayant bien pris soin de mettre un parafilm autour du bouchon, pour éviter les fuites Ajouter 1/3 volume d'acétate d'ammonium 7,5M (2,5 M final) et 2 volumes d'éthanol absolu froid Mélanger doucement par retournements jusqu'à apparition d'un flocon.

25 Préparation d'adn et d ARN Récupérer l'adn avec une pipette Pasteur boutonnée flambée et recourbée en hameçon ou centrifuger à 3000 rpm 4 C 10 min pour récupérer le culot Transférer le flocon dans 1ml de Tris 20mM ph : 8, EDTA 5mM, NaCl 0,2M Incuber à 37 C sous agitation très douce jusqu'à dissolution de l'adn (balancelle une nuit) Ajouter 2 volumes d'éthanol absolu, mélanger par retournements, récupérer l ADN avec pipette (flocon) ou par centrifugation comme à l étape 14, rincer dans de l'éthanol 70%, bien égoutter le flocon (au besoin centrifuger et éliminer l'éthanol résiduel) Reprendre dans 1ml de TE 20:1 ph : Mesurer la concentration au fluorimètre (voir p.10). Contact : GV 2) à partir de culture de cellules 1 - Des cellules (quelques dizaines de millions) seront centrifugées et reprises dans 1 ml de PBS (Tampon Phosphate Salin). 2 - Rajouter 5 ml de tampon S.E. (75 mm NaCl, 25 mm EDTA ph : 8), puis ajouter 125 µl de SDS 20% et 50 µl de protéinase K 20 mg/ml, et incuber une nuit à 37 C. 3 - Ajouter 5 ml de phénol saturé neutralisé, agiter doucement pendant 5 min. 4 - Ajouter 5 ml de chloroforme isoamylalcool, agiter doucement pendant 5 min, centrifuger à 4000 rpm pendant 10 min. 5 - Prélever la phase aqueuse (supérieure) et recommencer une extraction phénolchloroforme. 6 - Ajouter 150 µl de chlorure de sodium 5 M (concentration finale de 150 mm) et 2 vol d'éthanol. Mélanger doucement. L'ADN doit précipiter en un long filament. Récupérer directement le filament avec une pipette pasteur, le rincer dans de l'éthanol 70 %, le laisser sécher avant de le suspendre dans 1 ml de T.E. 7 - Mesurer la concentration au spectrophotomètre. Le rendement est habituellement de l'ordre de 400 µg.

26 Préparation d'adn et d ARN 26 3) à partir d'extraits végétaux METHODE - Série de traitements avec le CTAB (Bromure de Cétyl Triméhyl ammonium), détergent non ionique, pour lyser les cellules et purifier les Acides nucléiques (AN). - L AN est récupéré par précipitation à l éthanol ou à l isopropanol inclus dans la dernière solution de CTAB. Remarque : Le CTAB libère les AN cellulaires totaux et forme un complexe insoluble avec eux quand la concentration initiale en NaCl est < à,0,5 M. On élimine ainsi la majorité des contaminants cellulaires. Le complexe CTAB-AN est seulement soluble en présence de fortes concentrations en sel. Le détergent est alors éliminé et l AN est récupéré par précipitation. Le CTAB résiduel est lavé par l éthanol 80%. Pour diminuer l activité nucléasique, le tissu pourra être congelé rapidement et décongelé seulement en présence du tampon d extraction qui contient le détergent et une forte concentration en EDTA. Le rendement est de l ordre de : 100 à 500 µg d ADN par gramme de tissu frais de plantes. 2 à 6 heures de purification selon la quantité de départ en matériel et la pureté et le rendement désiré. La méthode décrite ci-dessous peut s appliquer à tous types de tissus végétaux. Quelques mg de tissus suffisent. MATERIEL Solution d extraction CTAB Conservation à t ambiante, plusieurs années 2%(w/v) CTAB 100 mm Tris HCl ph : 8,0 20 mm EDTA ph : 8,0 1,4 M NaCl Solution de CTAB/NaCl 10% de CTAB dans 0,7 M de NaCl Dissoudre 4,1 g de NaCl dans 20 ml d eau Ajouter lentement 10 g de CTAB, en chauffant et en remuant Si nécessaire chauffer à 65 C pour dissoudre Ajuster à 100 ml avec de l eau Solution de précipitation CTAB Conservation à t ambiante, plusieurs années. 1%(w/v) CTAB 50 mm Tris HCl ph : 8,0 10 mm EDTA ph : 8,0 2% (v/v) β-mercaptoéthanol (β-me) Tampon TE high salt Conservation à t ambiante, plusieurs années. 100 mm Tris HCl ph : 8,0 0,1 mm EDTA ph : 8,0 1 M NaCl 24:1 (v/v) chloroform/alcool isoamyl Ethanol 80% ou isopropanol Mixeur ou pilon et mortier ou moulin à café

27 Préparation d'adn et d ARN 27 PROTOCOLE Extraction de l ADN 1 Ajouter le β-me à la solution d extraction CTAB pour obtenir une concentration finale de 2% (v/v). Environ 4 ml de solution d extraction CTAB-β-Me par gramme de tissu frais. Dilution 1:1 de cette solution avec de l eau stérile pour des tissus déshydratés. Utiliser le β-me sous hotte chimique. 2 Chauffer cette solution et la solution de CTAB-NaCl à 65 C (0,4 à 0,5 ml par gramme de tissu frais). 3 Si possible, refroidir le broyeur (-80 C ou azote liquide). 4 Broyer le tissu de plante en une fine poudre et transférer dans tube résistant aux solvants organiques. Utiliser du tissu jeune et éviter les pédoncules et les veines les plus larges pour un rendement en ADN et une faible contamination en polysaccharides. 5 Ajouter la solution d extraction CTAB-β-Me chaude sur le tissu broyé et mélanger. 6 Incuber 10 à 60 min à 65 C en mélangeant de temps en temps. Le rendement est fonction du temps d incubation. 7 Extraire l homogénat avec un volume égal de 24:1 chloroforme/alcool isoamyl. 8 Bien mélanger par retournement. Centrifuger 5 min à 4 C 7500 g rpm en microcentrifugeuse pour des petits échantillons < à 150 mg de tissu de départ. 9 Récupérer la phase aqueuse (phase supérieure). 10 Ajouter 1/10 vol. de la solution CTAB-Nacl à 65 C à la phase aqueuse récupérée. 11 Bien mélanger par retournement. Ajouter 1 vol. égal de chlroforme/alcool isoamyl pour extraire. 12 Mélanger. Centrifuger 5 min à 4 C à 7500g (ou rpm si microcentrifugation) et récupérer la phase aqueuse (phase supérieure). Précipitation des ADN 13 Ajouter exactement 1 vol. de solution de précipitation CTAB. 14 Bien mélanger par retournement. Si la précipitation est visible passer à l étape suivante. Sinon incuber 30 min à 65 c. 15 Centrifuger 5 min à 500g 4 C (2700 rpm si microcentifugation). En absence de culot, rajouter de la solution de précipitation CTAB (jusqu à 1/10 du vol. total), incuber entre 1 h et la nuit à 37 C. Centrifuger 5 min à 500g à 4 C. 16 Enlever mais ne pas jeter le surnageant. Resuspendre le culot dans du tampon TE high-salt (0,5 à 1 ml de TE-high salt par gramme de matériel de départ). Si le

28 Préparation d'adn et d ARN 28 culot est difficile à suspendre, incuber 30 min à 65 C. Répéter jusqu à dissolution. Lecture au fluorimètre du surnageant et jeter le culot si les AN sont dans le surnageant. 17 Ajouter 0,6 vol. éthanol 100% pour précipiter. Bien mélanger. Centrifuger 15 min 7500g 4 C 18 Laver le culot avec l éthanol 80%. 19 Sécher et resuspendre dans un volume min de TE (0,1 à 0,5 ml de TE par gramme de matériel de départ. Purification plus approfondie?? 20 Protéinase K ou RNase A. 4) à partir de tissus animaux 1 - L'échantillon, congelé dans l'azote, est broyé (marteau ou pistolet), puis repris dans du tampon de digestion à raison de 1g pour 6 ml, pour être incubé à 56 C pendant 12 à 18 heures. Tampon de digestion : Tris HCl ph : 8 10 mm EDTA 25 mm NaCl 100 mm SDS 0,5% Protéinase K 0,1 mg/ml 2 - Faire ensuite une extraction au phénol et deux extractions au chloroforme. 3 - Prélever la phase aqueuse et précipiter l'adn. Les rendements obtenus sont de l'ordre de plusieurs centaines de µg par gramme de tissu. Également recommandé : tampon à l'urée. Tris 10 mm EDTA 10 mm NaCl 10 mm Urée 8M puis protéinase K : 150 µg/ml faire des extractions phénol + chloroforme (pas phénol seul)

29 Préparation d'adn et d ARN 29 5) à partir de culture de levure Culture durée de préparation au moins 2h30 Dans des plaques 24 puits, mettre 2,5 ml de YPG. Inoculer avec un rotofil en prélevant les cellules bien au centre de la colonie (1 colonie = 10 6 cellules). Incuber 48 h à 30 C ( souches ORD thermosensibles) avec agitation de 230 rpm. Prélèvement de 1 ml pour extraction d'adn en tubes repérés n 1 à 96 de 1,5 ml puis centrifugation 3000 rpm 10 min. Conservation des souches dans les plaques avec 1 ml de glycérol 60% mettre à -80 C Solutions pour l'extraction d'adn génomique Solution de Lyse 5 ml pour 100 preparations Sorbitol 3 ml de sol. 2M à 4 C 1,2 M final EDTA 1 ml sol. 0,5 M 0,1 M final ß mercapto éthanol 50 µl sous hotte 1% final Zymoliase 10 mg à 20 U/mg 2 mg/ml final H 2 O milliq 950 µl (qsp 5 ml) EDTA 5 ml à 50 mm : 500 µl sol 0,5 M avec 4,5 ml H 2 O SDS 10 % : 1,5 ml Protéinase K 2 mg/ml : 500 µl Acétate de potassium 5 M mis à 4 C : 2 ml Isopropanol : 25 ml Tampon TE 5,5 ml : Tris 10 mm ph : 8 -EDTA 1 mm Tampon TEN : Tris 150 µl sol 1 M ph : 8 10 mm EDTA 30 µl sol 0,5 M 1 mm NaCl 600 µl sol 5M 0,2 M H 2 O 14,220 ml (qsp 15 ml) RNAse A 250 à 1 mg/ml : dilution au dixième sol.10 mg/ml Mélange Phénol/Chloroforme 15 ml : Phénol Chloroforme 24 vol / Alcool Isoamilique 1 vol 7,5 ml 7,5 ml

30 Préparation d'adn et d ARN 30 EXTRACTION ADN DE LEVURE 1 - Suspendre le culot dans 50 µl sol. de lyse. 2 - Incuber 2 h à 37 C sur un agitateur à vibration. Centrifuger 8000 rpm 2 min. 3 - Resuspendre le culot dans : 50 µl EDTA 50 mm 1,5 µl SDS 10 % bien mélanger 5 µl protéinase K 20 mg/ml bien mélanger 4 - Incuber 30 min à 65 C en homogénéisant toutes les 5 min. 5 - Ajouter 20 µl d'acétate K froid bien mélanger. 6 - Incuber 30 min (minimum) dans la glace. Centrifuger rpm 15 min 4 C. 7 - Transvaser sans pipeter le surnageant dans un autre tube. Ajouter 75 µl d'isopropanol, mélanger doucement jusqu'à formation complète du précipité et placer à 5 min - 80 C. 8 - Centrifuger rpm à 4 C 10 min. 9 - Suspendre le culot dans 25 µl de TE (Option OVN 4 C) 10 - Ajouter 2,5 µl de RNAse A à 1 mg/ml. Incuber 1H à 37 C (agiter toutes les 5 ) 11 - Ajouter 50 µl Isopropanol, mélanger doucement jusqu'à formation complète du précipité. Placer à - 80 C pendant 5 min. Centrifuger rpm à 4 C 10 min Suspendre dans 100 µl de TEN. (Option OVN 4 C) 13 - Ajouter sous hotte 100 µl de phénol/chloroforme, agiter, centrifuger rpm 10 min Prélever la phase supérieure aqueuse et ajouter 200 µl d Ethanol 100 %, placer 5 min à - 80 C Centrifuger rpm à 4 C 10 min Laver le culot avec 200 µl d Ethanol 70 %. Centrifuger rpm 4 C 10 min Vider le surnageant et sécher le culot sur paillasse Suspendre le culot dans 30 µl de TE (Option à 56 C 1 H puis vortex) Hydrolyse sur 10 µl d'adn par HinfI (nuit à 37 C) PURIFICATION DE FRAGMENTS D ADN