TECHNIQUES BIOLOGIE MOLÉCULAIRE

Transcription

1 TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLÉCULAIRE Instabilité des Extrémités des Chromosomes Humains (I.E.C.H.) Institut de Génétique et Microbiologie Université Paris-Sud ORSAY et Laboratoire de Biologie et Génétique Moléculaire Centre d Etudes du Bouchet Livre de protocoles version n 8 (Sept. 1998) SOMMAIRE

2 techniques Biologie Moléculaire BACTÉRIES ÉLECTROCOMPÉTENTES... 6 ÉLECTROPORATION... 7 TRANSFORMATION TYPE PHAGE M13 RECOMBINANT... 9 MESURE DE LA CONCENTRATION D ADN MESURE Problèmes rencontrés PURIFICATION DE PLASMIDES, PREPARATIONS RAPIDES ) PROTOCOLE TRÈS RAPIDE POUR ANALYSE DE RESTRICTION ET SÉQUENCE DOUBLE BRIN ) PROTOCOLE AVEC LYSOZYME ET ÉBULLITION (NAR, 1988, VOL. 16, N 20, P 9878) ) CULTURE 4 À 20H DANS 2ML MILIEU MLS ) EXTRACTION DE PLASMIDE SUR UNE COLONIE ) PRÉPARATION RAPIDE DE COSMIDES PURIFICATION DE PLASMIDES, PREPARATION EN GRAND ) MÉTHODE ALCALINE ET CHLORURE DE LITHIUM ) LES COLONNES KIT MACHEREY-NAGEL ) AUTRE MÉTHODE : EXTRACTION ALCALINE ET COLONNE SÉPHACRYL Caractéristiques et préparation de la colonne PREPARATION DE MATRICES SIMPLE BRIN DÉTERMINATION DE L'ORIENTATION DES CLONES PURIFICATION D ADN DE PHAGES ) PRÉPARATION DE PHAGES ) MINI-PRÉPARATION D'ADN PHAGIQUE a/ méthode b/ méthode c/ méthode PURIFICATION DES ADN GENOMIQUES ) A PARTIR D'UN PRÉLÈVEMENT SANGUIN HUMAIN (MÉTHODE SANS PHÉNOL/CHLOROFORME) ) À PARTIR DE CULTURE DE CELLULES ) À PARTIR D'EXTRAITS VÉGÉTAUX METHODE MATERIEL PROTOCOLE ) À PARTIR DE TISSUS ANIMAUX ) À PARTIR DE CULTURE DE LEVURE Solutions pour l'extraction d'adn génomique EXTRACTION ADN DE LEVURE PURIFICATION DE FRAGMENTS D ADN ) À PARTIR DE GEL LMP ) PAR ÉLECTROÉLUTION ) PAR ÉLECTROÉLUTION SUR PAPIER ) PAR ADSORPTION SUR BILLES DE VERRE a) extraction avec JetSorb b) protocole adapté de Anal. Biochem. (1982) 121, , Marko et al ) billes de verre ) iodure de sodium 6M ) EtOH/lavage ) CENTRIFUGATION SUR LAINE DE VERRE ) GRADIENTS DE SEL solutions et matériel nécessaires : coulage du gradient :... 34

3 techniques Biologie Moléculaire ) RÉPARATION D'EXTRÉMITÉS ) SOUS CLONAGE PREPARATION D ARN ) EXTRACTION DE RNA TOTAUX EN UNE SEULE ÉTAPE ) PRÉPARATION D'ARN À PARTIR DE CULTURES CELLULAIRES ) EXTRACTION ARN PHÉNOL CHAUD NORTHERN GEL DENATURANT AU FORMALDEHYDE ) GEL 1.2% ) TAMPON DE MIGRATION ) TAMPON DE CHARGE TRANSFERT DE COLONIES SUR FILTRES APPLICATION AU CRIBLAGE D'UNE BANQUE DE COSMIDES DEPOT D ADN SUR FILTRE DE TYPE "DOT BLOT" TRANSFERT DE SOUTHERN ) PRÉPARATION DU GEL ) HYDROLYSES DES ÉCHANTILLONS (ADN GÉNOMIQUE) ET DÉPÔTS ) TRANSFERT DE L ADN DU GEL a/ Par le vide b/ Sans vide MARQUAGE RADIOACTIF D'ADN ) PRÉPARATION D'UN KIT DE MARQUAGE PAR 'RANDOM PRIMING': ) PROTOCOLE DE MARQUAGE ) SONDES D'EXTRÉMITÉS DE COSMIDES ) ELIMINATION DES NUCLÉOTIDES NON INCORPORÉS SUR COLONNE G Préparation de la colonne Comptage HYBRIDATIONS (SOUTHERN ET NORTHERN) ) HYBRIDATION DANS UN FOUR ) RENATURATION DE LA SONDE AVEC L'ADN TOTAL ) DÉHYBRIDATION REACTIONS DE SEQUENCE PRÉPARATION DE MATRICES À PARTIR DE PREP. RAPIDES DE PLASMIDE : SEQUENCAGE DE PRODUITS DE PCR ) OBTENTION DE LA MATRICE SIMPLE BRIN ) PRÉPARATION DES GELS DE SÉQUENCE ) prétraitement des plaques de verre ) solutions ) gels gradient (33 x 40cm) a) Gel gradient à 6%...55 b) Simulation d'un gradient ) gels non gradient ) électrophorèse FICHES-PROJETS FICHE "CARTOGRAPHIE INTERNE" CARTOGRAPHIE INTERNE D'ALLÈLES MINISATELLITES I. GÉNÉRALITÉS II. APPLICATION : TYPAGE D'ALLÈLES CEB ) Amplification et séparation des allèles entiers a/ amplification...59 b/ Visualisation des allèles amplifiés...60

4 techniques Biologie Moléculaire c/ Découpage des bandes contenant les allèles ) MVR-PCR sur allèles isolés a/amplification...61 b/ migration et transfert des produits MVR ) Amplification sur dilutions limites FICHE "LOCALISATION DE GÈNE PAR ANALYSE DE SÉGRÉGATION" PROJET TYPE, ESTIMATION DES COÛTS : AMPLIFICATION DES MICROSATELLITES PAR PCR ) Préparation des plaques PCR ) PCR (Hot start PCR) ) Analyse des produits de PCR FICHE RT-PCR FICHE MANIPULATION-PURIFICATION D'OLIGONUCLÉOTIDES, POLYMÉRISATION PURIFICATION SUR GEL DES OLIGONUCLÉOTIDES APRÈS SYNTHÈSE ) préparation du gel d'acrylamide : ) électrophorèse des échantillons : ) phosphorylation des oligonucléotides: ) polymérisation de l'oligonucléotide marqué ) clonage du polymère FICHE "CLONAGE DE MINISATELLITES PAR LES GRANDS FRAGMENTS" INTRODUCTION: I. CULTURES II. ANALYSE DE RESTRICTION, PURIFICATION DES FRAGMENTS, HYBRIDATION SUR MINIBLOTS III. HYBRIDATION SUR LES LIGNEES IV. SAISIE DES DONNEES, ANALYSE DE SEGREGATION ANNEXE 1: BUDGET D'UN PROJET DE CRIBLAGE DE COSMIDES FICHE "PROJET LEVURE : MESURE DES TAUX DE MUTATION DES LEVURES MINISATELLITES" I. ETAT DE LA QUESTION A. Minisatellite hypermutable CEB1: mécanisme des mutations et questions B. Modèle d'étude de l'instabilité: la levure II. PROTOCOLE MELANGES DE LEVURE : CULTURE ET EXTRACTION DE L'ADN A. Cultures B. Extraction de l'adn C. Analyse des ADN FICHE "CARTOGRAPHIE DE COSMIDES PAR HYDROLYSE PARTIELLE" PURIFICATION DE TAQ POLYMÉRASE BUREAUTIQUE PRÉPARATION DES TAMPONS ET SOLVANTS SOLVANTS SOLUTIONS COURANTES (EAU ULTRAPURE) TAMPONS DE PRÉHYBRIDATION ET D HYBRIDATION MILIEUX DE CULTURE POUR BACTÉRIES OU LEVURES SOLUTIONS STOCK D'ANTIBIOTIQUES SOLUTIONS STOCK D'IPTG ET D'X-GAL SOLUTIONS POUR KITS PRÉPARATION DES MINI-COLONNES QUELQUES DONNÉES UTILES... 99

5 techniques Biologie Moléculaire REMARQUE : LES PROTOCOLES PRÉSENTÉS SONT UNE SÉLECTION DE CEUX EN USAGE À IECH, ET ADAPTÉS À L'APPAREILLAGE DISPONIBLE. ILS NE REMPLACENT PAS LA LECTURE RÉGULIÈRE DES CURRENTS PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY ET CURRENT PROTOCOLS IN HUMAN GENETICS (entre autres ; également Nucleic Acids Research, et revues techniques disponibles à la bibliothèque). Annuaire téléphonique laboratoire IECH (1998) et autres personnes qui ont contribué à la compilation de ces protocoles ou sont actuellement les plus à même de conseiller. Yolande Hauck YH Philippe Le Flèche PLF Agnès Prieur AP Elisabeth Petit EP Pascale Schaerly PS Fabienne Giraudeau FG Bernard Le Guen BLG Gilles Vergnaud GV Christine Pourcel CP

6 Bactéries 6 BACTÉRIES ÉLECTROCOMPÉTENTES Différentes méthodes permettent d introduire un fragment d ADN dans une cellule. Des cellules ayant au préalable été rendues compétentes par traitement chimique sont incubées avec l ADN puis un choc thermique est réalisé. L alternative la plus courante est l électroporation. Les cellules doivent être soigneusement lavées (dessalage) pour éviter les arcs (courts-circuits) lors du choc électrique. Les fragments d ADN sont généralement portés par un vecteur contenant un système autonome de réplication et un système de sélection (le plus souvent un gène de résistance à un antibiotique qui permet à partir de culture sur milieu sélectif de sélectionner ensuite les clones qui ont intégré le fragment d ADN, ou un gène supresseur). Les bactéries transformées vont ensuite se multiplier (1 colonie = 10 6 bactéries) lorsqu elle seront mise en culture sur le milieu sélectif. Un des facteurs clés de la préparation des bactéries compétentes est l'état des bactéries qui servent à ensemencer le milieu de culture. Pour avoir une bonne reproductibilité des résultats, Hanahan par exemple, recommande de faire l'étalement de la souche sur boîte à partir d'un stock conservé en glycérol à -80 C, puis de faire l'ensemencement du milieu à partir d'un étalement frais. On obtient des résultats plus variables quand on utilise des étalements repris de boîte en boîte. Seul le protocole d'électroporation sera présenté ici, se référer aux anciens recueils pour des traitements chimiques des bactéries (protocole PEG par exemple). matériel : - eau refroidie (dans la glace), - glycérol 10% refroidi (dans la glace), - à partir de l'étape 3, les bactéries doivent rester à 2 C. 1 - Inoculer 1litre de milieu LB avec 1/100 de volume d'une culture fraîche (i.e. de la nuit) de la souche utilisée. 2 - Incuber à 37 C avec une agitation vigoureuse (300 rpm) jusqu'à DO : 0,5-0,6. note : l'état des bactéries (pleine phase exponentielle) est un paramètre essentiel. 3 - Refroidir dans la glace en agitant. Laisser 15 minutes (étape essentielle : sinon les bactéries risquent encore d'effectuer une division, 20 minutes pour des XL1). 4 - Centrifuger à 4000g, 2 C dans des tubes prérefroidis et un rotor froid pendant 15 minutes. 5 - Vider le surnageant immédiatement (culot peu compact) et suspendre les culots dans un litre au total d'eau (ou milieu faible force ionique tel que Hépès 1 mm ph : 7 le culot est alors plus compact). Centrifuger comme en Refaire un lavage avec 500 ml d H 2 O et centrifuger. 7 - Resuspendre les culots dans 20 ml de glycérol 10% froid ou GYT (tube falcon). Centrifuger comme en Resuspendre l'ensemble des culots dans un volume final de 2 ml de milieu 10% glycérol froid ou GYT. La concentration cellulaire doit être d'environ 3x10 10 cellules/ml.

7 Bactéries Cette suspension peut être utilisée de suite (les fraîches marchent mieux) ou congelée par aliquots (130 µl) dans de la carboglace de préférence ou de l'azote liquide puis stockée à -80 C. Référence : Current Protocols... section Variante : selon addendum Current Protocols, l'utilisation de milieu GYT au lieu de glycérol 10% pour la resuspension finale (étape 8) améliore l'efficacité d'un facteur 4 à 10, en améliorant (peut-être) la survie des colonies. GYT : Glycérol 10% Yeast extract 0.125% (p/v) Tryptone 0.25% (p/v) contact : YH ÉLECTROPORATION Introduction de fragment d ADN dans une cellule hôte. matériel : mettre dans la glace : les cuves à électroporation, tubes Eppendorfs froids, tubes contenant 1 ml de milieu LB (ou ML). 1 - Décongeler en douceur les cellules à T ambiante ou sur de la glace. 2 - Mettre 40 µl de bactéries dans un tube eppendorf pré-refroidi, ajouter 1 à 2 µl d'adn (qui doit être dans une solution de faible force ionique, TE ou eau ; 0,5 µl de produit de ligation ne provoque pas d'arc). 3 - Gene Pulser Biorad réglages standards bactéries et plasmides : voltage = 2,5 kv capacitance = 25 µf résistance = 200 ohms On peut lire dans notes annexes Current Protocols une étude sur l optimisation des paramètres en fonction notamment de la taille de l ADN à introduire. Utilisation de l électroporateur : Mise en marche bouton face avant du module du bas. Capacitance et résistance : boutons en bas à droite et en haut à gauche. Voltage : appuyer (2 fois) simultanément sur les touches «raise» et «lower» module du bas jusqu à affichage du préréglage 2,5 kv.

8 Bactéries Transférer le mélange dans une cuvette d'électroporation froide. La mettre dans la chambre d'électroporation et appliquer une pulsation en appuyant simultanément sur les 2 boutons (rouges) Pulse. (la constante de temps doit approcher le plus possible 5,2 msec). 5 - Ajouter immédiatement 1 ml de milieu froid LB (ou SOC) aux cellules électroporées, et récupérer l'ensemble avec une pipette Pasteur. 6 - Transférer les cellules dans un tube bouchon rouge 10 ml et incuber pendant une heure à 37 C (225 rpm). Entre chaque électroporation, ne pas oublier de remettre à 0 la constante de temps en appuyant sur Set Volt. 7 - Avant étalement, centrifuger la culture bactérienne à 3000 rpm 5 minutes et éliminer le surnageant afin de garder environ 100 µl de culture, reprendre le culot dans le surnageant. 8 - Etaler sur gélose les 100 µl de culture à l aide d une pipette rateau. Note : extemporanément, on peut étaler sur la gélose 40µl X-gal 2% et 40µl IPTG 2%. Contact : YH Réutilisation des cuves : Les cuves peuvent être réutilisées de nombreuses fois dans le cas de nos usages «bactériologie» (entre 10 et 20 fois, opacité pas gênante), ce qui est intéressant vu leur prix (de 20 à 30 F H.T). Celles-ci ont tout de même une durée de vie limitée c est pourquoi il est recommandé de noter le nombre d utilisation des cuves (gestion individuelle) et ne pas hésiter à éliminer les cuves défectueuses. Lavage : Eau du robinet abondamment Eau distillée (avec pissette) Alcool (Avec pissette) - Conserver ouverture vers le bas par exemple dans un pot yaourt en verre (il en rentre 6 ou 7). - Remplir d'alcool jusqu'à mi-hauteur des cuvettes. - Fermer avec un Saran, garder à T ambiante. Avant utilisation, mettre à sécher sous la hotte, ouverture vers le haut. En options, variantes : faire bouillir après nettoyage à l'eau osmosée, puis stocker à sec. voir aussi : à propos du traitement de l'adn ligaturé : Nucleic Acids Res., 1993, vol. 21, n 11 p2782 Contact : YH

9 Bactéries 9 TRANSFORMATION TYPE PHAGE M13 RECOMBINANT ATTENTION : ne pas oublier la préculture. - Ajouter 50 µl de TG1 ou XL1 fraîches par boîte. - Ajouter les bactéries et l'adn à la gélose MGM (3 ml) préalablement maintenue à 45 C + 40 µl IPTG 2%+ 40 µl Xgal 2% (solutions stock conservées à -20 C). - Vortexer rapidement et couler sur boîtes (les sortir à l'avance). Contact : G.V Stockage souches bactéries : Solution glycérol : 65% glycérol 0,1 M Mg SO4 0,025 M Tris ph8 - mélanger 1ml de culture et 1ml de solution glycérol - Conserver à 80 C Contact : G.V

10 Préparation d'adn et d ARN 10 MESURE de la CONCENTRATION d ADN Fluorimètre DyNa Quant 200 (cuve de 2 ml standard) La mesure de la concentration d ADN par fluorimétrie est bien adaptée lorsque l ADN est contaminé par des ARNs ou des nucléotides libres (par rapport à une mesure d absorbance UV, qui ne discrimine pas les acides nucléiques simple brin, double brin, nucléotides libres). HOESCHT (Bisbenzimide) a peu d affinité pour l ADN simple-brin ou les nucléotides libres. Dans le cas de très fortes contaminations cependant, faire une évaluation par comparaison avec un témoin sur gel. MESURE Pour plus de détails, voir classeur mode d'emploi. 1 - Mettre sous tension l'appareil, attendre 15 min (extinction automatique au bout d une heure) 2 - Préparer 20 ml de solution : 18 ml d H 2 O 2 ml de TNE 10x 20 µl de stock H33258 (stock à 1mg/ml, dans eau milliq, conservé à 4 C à l obscurité -bouteille teintée ou tube enveloppé dans papier aluminium- Conservation = 6 mois, peut perdre ses capacités assez brutalement) 3 - Mettre 2 ml de solution dans la cuve (la gravure G face à l utilisateur) 4 - Appuyer sur ZÉRO. 5 - Ajouter 2 µl d'adn de référence (ADN porc = 110 ng/µl) La fluorescence varie en fonction de la concentration de l ADN en GC, et de l accessibilité de l ADN à l intercalant (pureté de l ADN, topologie plasmide vs ADN génomique ; pour une évaluation précise, le témoin devrait donc être choisi en conséquence) 6 - Bien mélanger par brassage pipetman P1000 (éviter les bulles) 7 - Appuyer sur CALIB 8 - Saisir la valeur de la concentration du standard (110 ng/µl) 9 - Appuyer sur ENTER 10 - Ensuite pour les mesures : rajouter séquentiellement 2µl d échantillon et vider la cuve lorsque l affichage dépasse 2000 en cumulé A la fin, rincer la cuve à l eau, la sécher, et la ranger dans la boîte dédiée. Faire attention lors des manipulations avec des gants, la cuve mouillée est alors glissante (coût : 600 FHT).

11 Préparation d'adn et d ARN 11 Problèmes rencontrés Les problèmes qui peuvent être rencontrés sur cet appareil viennent de : - stock Hoescht trop ancien, - échantillon d ADN trop concentré ou non homogène, - échantillon mal mélangé. Voir aussi le «trouble shooting guide» à la fin du manuel. Pour pouvoir ajouter séquentiellement les échantillons sans refaire le zéro à chaque mesure, il faut être en «prompt mode off». Le cas échéant choisir mode «off» à partir du menu «Set up». Nous avons aussi le kit cuvette pour microvolume (10 à 100 µl) qui permet la récupération de l échantillon (voir notice dans classeur du fluorimètre). Lorsque l on a de façon fréquente, une grande série d échantillons à mesurer, il peut-être intéressant d utiliser le Biolumin-960 (voir avec Ph. Bouloc). Cependant, les filtres actuellement disponibles ne sont pas adaptés.

12 Préparation d'adn et d ARN 12 PURIFICATION DE PLASMIDES, PREPARATIONS RAPIDES Antibiotiques, concentration finale d usage : Tétracycline :10 mg/l (500 µl d un stock à 20 mg/ml par litre de milieu) Ampicilline : - pour les plasmides 50 à 150 mg/l (entre 0,5 et 1,5 ml d un stock à 100 mg/ml par litre de milieu) - pour les cosmides 50 à 80 mg/l kanamycine : 20 mg/l (1 ml d un stock à 20 mg/ml par litre de milieu) 1) protocole très rapide pour analyse de restriction et séquence double brin références: Zhou et al., Biotechniques vol. 8, n 2, (1990) également Jones et Schofield, NAR vol. 18 n 24, p Faire pousser les clones dans 2 ml de milieu LB 2 - Centrifuger la culture 10 secondes en tube Eppendorf 3 - Eliminer le surnageant en gardant µl de milieu 4 - Resuspendre en agitant (Vortex) 5 - Ajouter 300 µl de solution B (soude) 6 - bien agiter par retournement 7 - Ajouter 150 µl de solution C (acétate de potassium ou de sodium) 8 - Bien agiter par retournement 9 - Centrifuger 2 minutes à rpm 10 - Verser le surnageant dans des tubes eppendorf neufs et ajouter 0.9 ml (remplir les tubes) d'ethanol (gardé à -20 C) Centrifuger 2 minutes à rpm 12 - Eliminer le surnageant et remplir les tubes avec éthanol 70% froid 13 - Vider les tubes en égouttant et laisser sécher (ou Speed-vac 2 minutes) 14 - Reprendre dans 40 µl de TE (ou TE+ RNase). Remarques : ne pas s'arrêter au cours des étapes 1 à 11 (il est commode d'extraire les échantillons par douzaine). étape 12 : il peut être préférable de resuspendre les ADN dans 40µl de TE et de reprécipiter avec 100 µl d'etoh, plutôt que de rincer à l'etoh 70%. Congeler les ADN (déprotéinisation minime, risques de dégradation à 4 C) *option : étape 14 : reprendre dans 40 µl de TE + 0,5 µl de RNase à 10 mg/ml. Laisser 10' à 37 C Ajouter 23 µl de PEG %- NaCl 2,5M. Centrifuger 15 à rpm Faire un rinçage à l'etoh 70% froid. Centrifuger 5 à rpm Vider les tubes en égouttant et laisser sécher Reprendre dans 40 µl de TE.

13 Préparation d'adn et d ARN 13 Solution A glucose 50mM sola x 10 4,5g EDTA 10mM 10ml (0,5 M) Tris-HCl ph : 8,0 25mM 6,25ml (2 M) H 2 O qsp 50ml. Filtrer 0,2 micron Solution B (extemporanément) NaOH 0,1M 0,5 ml (10 M) SDS 0,5% 1,25 ml (20%) H 2 O qsp 50 ml (Pour obtenir 10 ml de solution 1, ajouter 100 µl de soude 10M et 250 µl de SDS 20% à 9,7 ml de T.E.) (2.5 ml de soude 0,4M et 250 µl de SDS 20% à 7,3 ml de T.E.) Solution C acétate de potassium (3M final) H 2 O acide acétique solution finale ph g 167 ml qsp 500ml RNase A pour 1ml, peser 10 mg de RNase A (10 mg/ml) faire bouillir 10 min au bain-marie Le rendement est de 2 à 5 µg environ. Ce protocole donne de très bons résultats en séquençage double brin manuel (non testé sur séquenceur). Si les cultures sont faites en milieu tamponné type MLS, il est préférable de l'éliminer complètement et de reprendre le culot bactérien dans du GET (glucose-edta-tris, solution A annexes) puis de procéder comme décrit par Jones et Schofield. 2) protocole avec lysozyme et ébullition (NAR, 1988, vol. 16, n 20, p 9878) avantages : préparation en un seul tube ; pas de solvants 1 - Verser 1,5 ml de culture de la nuit dans un tube eppendorf et centrifuger 4 à 4 C. 2 - Reprendre le culot en 200 µl de STET ( 8% m/vol sacharose, 0,1 % vol/vol Triton X-100, 50 mm EDTA, 50 mm Tris HCl ph 8). 3 - Ajouter 4 µl de lysozyme (solution fraîche à 50 mg/ml ; stock en poudre conservé à 4 C ou -20 C). 4 - Incuber 5 minutes à température ambiante. 5 - Laisser 45 sec. dans un cristallisoir d'eau bouillante, centrifuger 10 min à rpm. 6 - Enlever le culot avec un cure-dent, ajouter 8 µl de CTAB (Serva ; solution fraîche à 50 mg/ml), centrifuger 5 min. à température ambiante. 7 - Le culot est repris dans 300 µl de NaCl 1,2 M par vortexage intensif et reprécipité par addition de 750 µl d'éthanol 100% froid et centrifugation 10 min. 8 - Le culot final est rincé en 70% éthanol froid, séché 3 min. au dessiccateur ou laissé sur la paillasse, et resuspendu dans 40 µl de T.E. Le rendement usuel pour des plasmides type puc est de l'ordre de 5 µg. 1/2 préparation suffit à faire la séquence. G.V

14 Préparation d'adn et d ARN 14 3) Culture 4 à 20h dans 2ml milieu MLS 1 - centrifuger 2 ml dans un tube Eppendorf 8K 4min à 4 C 2 - reprendre 200 µl sol. A ; 3 - ajouter 200 µl de sol. B ; mélanger doucement par rotations multiples ; une fois que la solution est devenue visqueuse, vortexer à pleine puissance ; la solution doit être limpide (s'il reste un trouble, c'est que les bactéries ne sont pas toutes lysées) 4 - ajouter 150 µl sol. C ; bien mélanger ; vortexer ; 5 - centrifuger rpm 5 min. 6 - surnageant µl phénol ; centrifuger rpm 5min 7 - surnageant µl isopropanol (Eppendorf de 1,5 ml) ; centrifuger 14K 10 min 8 - rincer le précipité avec 400 µl d éthanol à 70%. 9 - précipité repris dans 200 µl TE; analyser 1 à 5 µl Note : pour des cosmides reprendre le précipité dans 50 µl et analyser 5 µl. Solution A glucose 50mM sola x 10 4,5g EDTA 10mM 10ml (0,5 M) Tris-HCl ph : 8,0 25mM 6,25ml (2 M) H 2 O qsp 50ml. Filtrer 0,2 micron Solution B (extemporanément) NaOH 0,1M 0,5 ml (10 M) SDS 0,5% 1,25 ml (20%) H 2 O qsp 50 ml (Pour obtenir 10 ml de solution B, ajouter 200 µl de soude 10M et 500 µl de SDS 20% à 9.5 ml de T.E.) Solution C acétate de potassium (3M final) H 2 O acide acétique solution finale ph g 167 ml qsp 500ml RNase A pour 1ml, peser 10 mg de RNase A (10 mg/ml) faire bouillir 10 min au bain-marie

15 Préparation d'adn et d ARN 15 4) Extraction de plasmide sur une colonie Suffisante pour une digestion 1 - Récupérer (au cure-dent ou à l'anse de platine) la colonie (penser à la numéroter) et la resuspendre dans 100 µl de solution A ( voir au paragraphe 3) puis vortexer. 2 - Ajouter 200 µl de sol. B (voir au paragraphe 3), mélanger par retournement puis rajouter 150 µl de NaOAc 3M ph 5.2 et vortexer vigoureusement environ 10 sec. 3 - Centrifuger 5 min en eppendorf et récupérer le surnageant sur lequel on peut éventuellement faire un phénol avant de le précipiter à l'alcool. 4 - Digérer la totalité de la préparation, repérer les clones positifs que l'on remettra en culture pour en faire des maxi-préparations. 5) Préparation rapide de cosmides 1 - Faire une culture de 24h et 8ml de ML avec antibiotique en tube bouchon rouge de 10ml (bouchon percé) à 37 C avec agitation. 2 - Centrifuger les tubes 10 minutes à 3000 rpm (Jouan) 3 - Reprendre les culots dans 110 µl de solution A et transférer en tubes Eppendorf. 4 - Ajouter 220 µl de solution B et bien agiter par retournement. 5 - Ajouter 165 µl de solution C et bien agiter par retournement. 6 - Centrifuger 5 minutes rpm. 7 - verser le surnageant dans un nouveau tube. 8 - Ajouter un volume (450 µl) de phénol /chloroforme et bien agiter. 9 - Centrifuger 2 minutes à rpm Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube et précipiter avec deux volumes d'éthanol 100% froid Mélanger par retournements et centrifuger 3 minutes à rpm Eliminer le surnageant et rincer le culot en remplissant le tube avec 1ml d'éthanol à 70% froid. Laisser 2 minutes et éliminer le surnageant Bien égoutter les tubes et laisser sécher les culots sur la paillasse Resuspendre dans 20 µl de TE (ou TE+RNase 1mg/ml).

16 Préparation d'adn et d ARN 16 PURIFICATION DE PLASMIDES, PREPARATION EN GRAND Solution A glucose 50mM sola x 10 4,5g EDTA 10mM 10ml (0,5 M) Tris-HCl ph : 8,0 25mM 6,25ml (2 M) H 2 O qsp 50ml. Filtrer 0,2 micron Solution B (extemporanément) NaOH 0,2M 1 ml (10 M) SDS 1% 2,5 ml (20%) H 2 O qsp 50 ml (Pour obtenir 10 ml de solution B, ajouter 200 µl de soude 10M et 500 µl de SDS 20% à 9.5 ml de T.E.) Solution C acétate de potassium (3M final) H 2 O acide acétique solution finale ph g 167 ml qsp 500ml RNase A pour 1ml, peser 10 mg de RNase A (10 mg/ml) faire bouillir 10 min au bain-marie 1) Méthode alcaline et chlorure de lithium Partir d'une boîte et de colonies fraîchement étalées : Selon Flint, préparations adaptées à cultures de PACs, bon pour in situ. Rajout de extractions phénol-chloroforme pour nos besoins (hydrolyses de restriction, migrations sur gel). Quantités pour 200 ml de culture milieu 2YT. 1 - Piquer une colonie isolée. Inoculer milieu "Super" (MLS) ou 2YT + antibiotique adéquat dans un Erlen de volume égal à 5 fois le volume de culture (Erlen de 1 litre pour 200 ml de milieu 2YT). Cultiver sous agitation rpm la nuit à 37ºC. 2 - Centrifuger la culture 10 min 4000 rpm. 3 - Resuspendre avec 10 ml sol. A (pipetter et vortexer vigoureusement) et transférer en tube Falcon 50 ml ml sol. B (fraîche) ; agiter doucement (mélanger par huit retournements, selon flint) ; la solution doit se prendre en gel. 5 minutes à température ambiante ml sol. C ; agiter doucement (huit retournements). 4 - Centrifuger 4000 rpm, 4ºC, 10min. 5 - Ajouter au surnageant (éventuellement filtré sur de la gaze jetable- ou nylon type drain pour hybridation récupérable-) 20 ml iso-propanol (propane-2-ol). Mélanger par retournements et centrifuger 4000 rpm 10min ( on peut récupérer un peu plus d'adn si on laisse précipiter 1h à -20 C avant de centrifuger). Laisser sécher le culot.

17 Préparation d'adn et d ARN Rincer le culot avec Ethanol 70% froid, puis reprendre le culot dans 1ml TE ; transférer en tubes Eppendorf de 2 ml (réf , de préférence à ceux de 2,2 ml qui ont tendance à fuire) ; ajouter 5 µl RNaseA 10mg/ml ; 15min à 37 C. 7 - Extraire avec 1 ml phénol, puis 1 ml phénol/chloroforme/alcool isoamylique Recommencer jusqu à ce qu il n y ait plus d interface (souvent trois extractions au total). 8 - Précipiter la phase aqueuse avec 0,3 ml NH 4 Ac (7,5M) et 2,5 ml éthanol 100% froid dans un tube 10 ml bouchon rouge. Mélanger par retournements et centrifuger 10 minutes à 4 C et 3000 rpm. 9 - Eliminer le surnageant et dissoudre le culot dans 1ml TE. Précipiter à nouveau avec 0,1ml NaAc 3M ph : 5,2 et 2,5 ml éthanol 70% froid et centrifuger. Dissoudre le culot dans du TE stérile (300 µl) Estimer la concentration par migration sur gel d un aliquote de 5 µl digéré par EcoRI (dans un volume total de 10 µl). Remarque : pour les PAC, dissoudre dans seulement 100 µl de TE. 2) les colonnes Kit Macherey-Nagel - semblent également bien adaptées au moins pour : - séquençage - transfections de cellules - se présentent en trois formats : mini, 100 et suivre protocole. Remarque : faire parfois une deuxième élution Contact : YH 3) Autre méthode : extraction alcaline et colonne séphacryl Le milieu LS permet d'obtenir des rendements de l'ordre de 10 à 15 mg/litre pour des plasmides de type puc et des souches de type TG1, JM Ensemencer 250 ml de milieu avec antibiotique avec une colonie de bactéries. 2 - Après 24 heures de culture pour des souches type TG1, 36 heures pour des souches type DH5 ou HB101, les bactéries sont centrifugées à environ 5000 rpm pendant 10 à15 min. 3 - Le culot est resuspendu dans 5 ml de T.E. et laissé dans la glace 10 min. 4 - Ajouter 12 ml d'un mélange de soude 0.2 N ; SDS 1% fait le jour même (sol. B). Mélanger doucement et laisser dans la glace 20 minutes environ.

18 Préparation d'adn et d ARN Ajouter 6 ml d'acétate de potassium 5M ph : 4.8 (sol. C) et agiter fortement puis laisser 30 min. dans la glace. 6 - Centrifuger pendant 15 min. à 5000 rpm. 7 - Récupérer le surnageant en le filtrant sur de la gaze, ajouter 20 ml de chloroforme, agiter, laisser décanter ou centrifuger 5 min. à 3000 rpm. 8 - Récupérer la phase aqueuse, ajouter 15 ml de propanol 2 et centrifuger à rpm pendant Eliminer le surnageant, égoutter, laisser sécher et rependre le culot dans 2 ml de T.E Ajouter 20 µl de RNAse à 10 mg/ml et incuber pendant 30 minutes à 37 C Ajouter 100 µl d'une solution de SDS à 10% et 20 µl d'une solution de protéinase K à 10 mg/ml et incuber à 50 C pendant 1 heure Ajouter 1 ml de phénol, agiter, ajouter 1 ml de chloroforme : alcool isoamylique, agiter et centrifuger brièvement. Commentaire : jusque-là, protocole classique lyse alkaline, avec légères variantes Prélever la phase aqueuse, ajouter 200 µl de bleu de dépôt et déposer sur la colonne Après environ 1 heure d'élution (premier bleu ayant parcouru le tiers de la colonne), prélever une quinzaine de fractions de 100 gouttes (3 à 5 ml) Déposer 10 µl de chaque fraction sur un gel d'agarose. Habituellement, le plasmide est obtenu dans un volume d'une quinzaine de millilitres Précipiter avec propanol 2, rincer le culot à l'éthanol à 70% froid, laisser bien sécher, resuspendre dans 1 ml de T.E. et mesurer la concentration au fluorimètre. Caractéristiques et préparation de la colonne. Utiliser, par exemple, une colonne d'un diamètre de 1 cm et d'une longueur de 50 cm. L'élution se fait par gravité avec un tampon Tris 20mM ph : 8 ; E.D.T.A. 1mM ; NaCl 1 M. Dégazer le Séphacryl S-1000 pendant 30 min. avant le chargement. L'ADN chromosomique passe avant le plasmide, l'arn après. Dans les conditions utilisées, les premières fractions de plasmide sont contaminées par de l'adn chromosomique. La colonne commence apparemment à saturer au delà d'une quantité de 2 mg de plasmide environ. Contact : GV

19 Préparation d'adn et d ARN 19 PREPARATION DE MATRICES SIMPLE BRIN 1 - Inoculer 5 ml de milieu LB avec une colonie de JM101 (reca + ) ou JM109 (reca - ) cultivée sur milieu minimum (milieu M9 glucose de Maniatis et al. avec thiamine (vitamine B1)) et incuber à 37 C jusqu'en fin de phase exponentielle (D.0.1 environ). Cette préculture peut être conservée quelques jours au froid. 2 - Diluer les cellules au 1/100 en milieu YT, et répartir 2 ml dans des tubes. 3 - Piquer les colonies M13 (colonies bien séparées à partir de boites incubées moins de 12 heures à 37 C), et incuber avec agitation à 37 C pendant 5 à 8 heures 4 - Transférer les cultures en tubes Eppendorf de 1.5 ml, centrifuger 5 min., verser le surnageant dans des tubes contenant 250 µl de PEG (20% PEG 6000, 2.5 M NaCl), mélanger, laisser 10 min. à température ambiante, centrifuger 5 min. 5 - Le culot de phages doit être visible. Eliminer le surnageant avec une pipette Pasteur effilée et une trompe à eau, centrifuger 30 secondes, éliminer le surnageant résiduel. 6 - Suspendre le culot dans 100 µl de T.E., ajouter 50 µl de phénol, agiter, ajouter 50 µl de chloroforme-isoamylalcool, agiter, centrifuger 5 min. 7 - Prélever soigneusement la phase aqueuse (90-95 µl), ajouter 3 µl de chlorure de sodium 5 M et 250 µl d'éthanol, mélanger et laisser 30 min. dans la glace. 8 - Centrifuger 10 min., éliminer le surnageant, laver avec de l'éthanol à 70% (remplir le tube, le laisser à température ambiante pendant 5-10 min., enlever l'éthanol). Laisser sécher pendant la nuit ou sous vide. 9 - Suspendre dans 30 µl de T.E., et garder à -20 C. NAR 1987 vol. 15, n 23 p propose un protocole très rapide avec CTAB et sans phénol. A essayer avec une solution fraîche de CTAB. Détermination de l'orientation des clones - mélanger 1/20 de préparation de chacun des deux clones 0,5 µl de NaCl 5M. H 2 O q.s.p 10 µl - incuber 10 min. à 60 C - déposer sur gel (avec un témoin) G.V

20 Préparation d'adn et d ARN 20 PURIFICATION D ADN DE PHAGES 1) Préparation de phages 1 - Cultiver les bactéries LA 101 jusqu à environ 1 O.D. (5x10 8 bact/ml) suspendre dans 30 µl de T.E., et garder à -20 C. 2 - Infecter 10 bactéries par 1 phage pendant 15 min à 37 C pour 1litre, il faut environ 10 9 phages et bactéries 3 - Transférer dans 1litre de ML contenant 10mM MgCl 2 et 0,2% de maltose 4 - Incuber 7 heures au moins ou la nuit à 37 C 5 - Ajouter 4 ml de chloroforme et agiter pendant 5 min 6 - Centrifuger à 6000 rpm pendant 15 min à 4 C 7 - Ajouter PEG g/10ml NaCl 0,584g/10ml 8 - Précipiter à 4 C au moins une heure 9 - Centrifuger à 2000 rpm pendant 30 min à 4 C 10 - Suspendre le culot dans 8ml de tampon phage (Tris 10mM PH : 7.4, MgCl 2 10mM) 11 - Faire une extraction au chloroforme 12 - Préparer 2 gradients de césium : 2ml de 1,7 ;1,5 ; 1,3 (Césium BRL ultrapur) CsCl Tampon de phage 1,3 10g 22,3 ml 1,5 20g 25,2 ml 1,7 20g 15,8 ml 13 - Centrifuger 3heures à rpm ou 2heures rpm 14 - Prélever la bande et ajouter du CsCl 1,5 jusqu à 3ml 15 - Centrifuger dans le rotor SW 50-1 pendant 20 heures 16 - Dialyser contre du Tris 10 mm, MgCl 2 10 mm Ph : 7,4

21 Préparation d'adn et d ARN 21 2) Mini-préparation d'adn phagique a/ méthode Inoculer 20 ml de milieu LB + 0,2% maltose avec une colonie de la souche bactérienne "phage spécifique" fraîchement étalée, et incuber la nuit à 37 C sous agitation. 2 - Mesurer la DO à 600 nm (1UDO = bactéries/ml, cependant la densité cellulaire en fonction de la DO varie selon les souches, cf. Sambrook 1.82), centrifuger à 4K 5min et reprendre le culot dans du milieu SM de façon à obtenir bactéries/ml. 3 - Etaler une boite avec le clone phagique à purifier, prélever 20 plages de lyse et les mettre à diffuser au moins 4h dans 200 µl de milieu SM. 4 - Réaliser l'infection en incubant 15 min à 37 C 100 µl de bactéries, soit bactéries, et 20 µl de l'inoculum phagique, soit pfu). 5 - Inoculer ces 120 µl dans 20ml de LB + 0,1% glucose + 10mM MgCl 2 et incuber à 37 C sous agitation pendant 4 à 8H. 6 - Lorsque la lyse est suffisante, ajouter 2 ml de CHCL 3 et incuber encore 10min à 37 C sous agitation. A cette étape l'erlen peut être conservé une nuit à 4 C. 7 - Centrifuger 10 min à 12K et récupérer le surnageant. 8 - Ajouter 10 µg/ml de RNAse DNAse free ainsi que 10 µg/ml de DNAse et incuber 30 min à 37 C. 9 - Ajouter 4 ml de solution de lyse (EDTA 0,25M - Tris HCl ph : 8 ; 0,5M - SDS 2,5%), homogénéiser, et incuber 30min à 70 C Ajouter 6 ml d'acétate de K (8M), homogénéiser, et incuber 15min à 4 C Centrifuger 30min à 10K et à 4 C. Conserver le surnageant auquel on ajoute 20ml d'isopropanol et incuber le tube 10 min à température ambiante Centrifuger 15 min à 10K et à 20 C. Réaliser trois lavages du culot avec 5 ml d'éthanol 70% sans centrifugation en faisant très attention au culot d'adn Reprendre le culot dans 500 µl de TE 20:5 + 0,3M NaAc ph : 8, et transvaser l'échantillon dans un tube Eppendorf Extraire deux fois avec du phénol/chloroforme, puis deux fois avec un volume de chloroforme seul Précipiter l'adn avec 2/3 de volume d'isopropanol, faire un lavage avec de l'éthanol 70%, sécher le culot et le reprendre dans environ 400 µl de TE 20:1. On obtient environ 100 µg d'adn phagique pur.

22 Préparation d'adn et d ARN 22 b/ méthode Inoculer 20ml de milieu LB + 0,2% maltose avec une colonie de LA101 fraîchement étalée. 2 - Lorsque la DO600 est d'environ 1 (5 à 7h; /ml), centrifuger 2000 rpm 10 min, reprendre dans 5ml SM 3 - Ajouter à 1,5ml bactéries indicatrices pfu de phage. Incuber 30 à 37 C. 4 - Ajouter à 250 ml milieu LB + MgSO 4 10mM préchauffé à 37 C dans un Erlenmeyer de 2litres. Cultiver 8 à 12 h sous agitation rapide (i.e. jusqu'à la lyse). 5 - Ajouter 5 ml chloroforme. Incuber encore 30 min à 37 C sous agitation. 6 - Refroidir à température ambiante sous un robinet d'eau froide. 7 - Ajouter 250 µl DNAse I 1mg/ml (frais) 250 µl RNAse 1mg/ml (frais). Incuber 30 min à température ambiante. 8 - Ajouter 14,6 g NaCl. Dissoudre 5min sous agitation magnétique douce. Laisser 1h dans la glace. 9 - Centrifuger 10 min 4 C 9000 rpm (Sorvall 6 x 500ml). Transférer le surnageant (en évitant le chloroforme du fond) dans une fiole propre et ajouter 25g PEG Dissoudre 5 min sous agitation magnétique douce. Laisser de 1h à la nuit dans la glace Centrifuger 10 min 4 C 9000 rpm (Sorvall 6 x 500ml). Bien ôter le surnageant (éventuellement centrifuger de nouveau). Reprendre le précipité dans 4ml SM. Extraire avec 4ml chloroforme Centrifuger rpm 2h ou rpm 1h (godets oscillants) Reprendre le culot de phage dans 2 ml SM Ajouter EDTA 0,5M 80 µl protéinase K 50mg/ml 40 µl SDS 10 % 200 µl incuber à 65 C 30 min Extraire au phénol puis au phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25:24:1) Dialyser contre 3 x 2 litres TE Solutions SM NaCl 100 mm pour 1 litre 5,8g MgSO 4,7 H 2 O 8 mm 2g Tris-HCl ph : 7,5 50 mm 50ml 1M gélatine 0,1 mg/ml 5ml 2%

23 Préparation d'adn et d ARN 23 c/ méthode 3 (Grossberger, NAR Vol 15, 1987 p 6737) 1 - Choisir la plage désirée avec une pipette Pasteur stérile et la verser dans une tube de 18 ml contenant 0,3 ml de tampon d'adsorption et 0,2 ml d'une culture exponentielle de bactéries en milieu ML 0,4% maltose. Tampon d'adsorption (10mM Mg Cl 2 et 10mM Ca Cl 2 ) : Dans 5 ml : 1ml 50 mm CaCl 2 50 µl 1 M Mg Cl Incuber le tube pendant 10 minutes à 37 C. 3 - Ajouter 10 ml milieu ML contenant Mg Cl 2 10mM et 0,1% glucose. Dans 10 ml : 50 µl 20% glucose 100 µl 1M Mg Cl Incuber la nuit à 37 C avec agitation en inclinant à 45. Les bactéries doivent être lysées. 5 - Centrifuger les tubes à 5000 rpm pendant 10 minutes pour culotter les bactéries. 6 - Centrifuger le surnageant à rpm pendant 30 minutes. 7 - Suspendre le culot dans 200 µl de milieu 63B1 dilué 10 fois, et le transférer dans un tube Eppendorf de 1,5 ml. Le milieu 63B1 1/10 peut-être remplacé par Tris 10mM ph 7.4, Mg Cl 2 10mM 8 - Préparer immédiatement avant usage une solution de protéinase K, 1 mg/ml, en milieu 63B1, et en ajouter 200 µl à chaque tube. Incuber à 37 C pendant 2 heures. 9 - faire une extraction phénol, suivie d'une extraction chloroforme Précipiter l'adn avec NaCl 0,2M et 2 vol. d'éthanol 100% Centrifuger et suspendre le culot en 100 µl TE µl sont utilisés pour une digestion de vérification. C.P

24 Préparation d'adn et d ARN 24 PURIFICATION DES ADN GENOMIQUES. 1) A partir d'un prélèvement sanguin humain (Méthode sans phénol/chloroforme) Note : selon l espèce considérée, la concentration en lymphocytes est variable (par exemple, plus élevée chez le porc). Dans d autres cas (oiseaux, chameau), les globules rouges sont nucléés, et d autres protocoles seront mieux adaptés. Travailler sur glace avec des gants. 1 - Congeler le prélèvement sanguin (sur EDTA) à 20 C dès réception (en général tube en verre de 5 ml). 2 - Le jour de l'extraction, décongeler dans la glace. Si le prélèvement est encore dans le tube en verre, mettre le tube dans un tube 50 ml par précaution. En tout cas, éviter les chocs thermiques lors de la sortie du tube hors congélateur (le tenir par le bouchon caoutchouc, le mettre tout de suite dans la glace). 3 - Laisser décongeler doucement et complètement, en tournant de temps en temps le(s) tube(s) posé (s) sur la glace. 4 - Diluer avec environ 4 volumes de TE 20:5 froid (bouteille préalablement refroidie dans la glace). 5 - Incuber dans la glace 15 min pour que la lyse des hématies ait lieu. 6 - Centrifuger (godets oscillants) 20 min, à 4 C et 4000rpm. Eliminer doucement le surnageant. 7 - Remettre en suspension les cellules avec 15 ml de TE 20:5 en vortexant et agitant si nécessaire. Le culot doit être complètement dissocié. Centrifuger 15 min à 4 C et 4000rpm. 8 - Faire au minimum 2 lavages (jusqu'à ce que le culot soit translucide). 9 - Reprendre le culot dans 1/2 volume de sang de départ de TE 20:5 (2,5 ml). 10 Ajouter : Sarcosyl (ou SDS) à 1% final, Protéinase K à 200 µg/ml final. (250 µl Sarcosyl ou SDS 10%, 25 µl de protéinase K à 20 mg/ml) 11 - Incuber sous agitation (300 rpm) toute la nuit à 37 C ou 2h à 65 C. par exemple, la nuit à 37 C, sur balancelle dans étuve, en ayant bien pris soin de mettre un parafilm autour du bouchon, pour éviter les fuites Ajouter 1/3 volume d'acétate d'ammonium 7,5M (2,5 M final) et 2 volumes d'éthanol absolu froid Mélanger doucement par retournements jusqu'à apparition d'un flocon.

25 Préparation d'adn et d ARN Récupérer l'adn avec une pipette Pasteur boutonnée flambée et recourbée en hameçon ou centrifuger à 3000 rpm 4 C 10 min pour récupérer le culot Transférer le flocon dans 1ml de Tris 20mM ph : 8, EDTA 5mM, NaCl 0,2M Incuber à 37 C sous agitation très douce jusqu'à dissolution de l'adn (balancelle une nuit) Ajouter 2 volumes d'éthanol absolu, mélanger par retournements, récupérer l ADN avec pipette (flocon) ou par centrifugation comme à l étape 14, rincer dans de l'éthanol 70%, bien égoutter le flocon (au besoin centrifuger et éliminer l'éthanol résiduel) Reprendre dans 1ml de TE 20:1 ph : Mesurer la concentration au fluorimètre (voir p.10). Contact : GV 2) à partir de culture de cellules 1 - Des cellules (quelques dizaines de millions) seront centrifugées et reprises dans 1 ml de PBS (Tampon Phosphate Salin). 2 - Rajouter 5 ml de tampon S.E. (75 mm NaCl, 25 mm EDTA ph : 8), puis ajouter 125 µl de SDS 20% et 50 µl de protéinase K 20 mg/ml, et incuber une nuit à 37 C. 3 - Ajouter 5 ml de phénol saturé neutralisé, agiter doucement pendant 5 min. 4 - Ajouter 5 ml de chloroforme isoamylalcool, agiter doucement pendant 5 min, centrifuger à 4000 rpm pendant 10 min. 5 - Prélever la phase aqueuse (supérieure) et recommencer une extraction phénolchloroforme. 6 - Ajouter 150 µl de chlorure de sodium 5 M (concentration finale de 150 mm) et 2 vol d'éthanol. Mélanger doucement. L'ADN doit précipiter en un long filament. Récupérer directement le filament avec une pipette pasteur, le rincer dans de l'éthanol 70 %, le laisser sécher avant de le suspendre dans 1 ml de T.E. 7 - Mesurer la concentration au spectrophotomètre. Le rendement est habituellement de l'ordre de 400 µg.

26 Préparation d'adn et d ARN 26 3) à partir d'extraits végétaux METHODE - Série de traitements avec le CTAB (Bromure de Cétyl Triméhyl ammonium), détergent non ionique, pour lyser les cellules et purifier les Acides nucléiques (AN). - L AN est récupéré par précipitation à l éthanol ou à l isopropanol inclus dans la dernière solution de CTAB. Remarque : Le CTAB libère les AN cellulaires totaux et forme un complexe insoluble avec eux quand la concentration initiale en NaCl est < à,0,5 M. On élimine ainsi la majorité des contaminants cellulaires. Le complexe CTAB-AN est seulement soluble en présence de fortes concentrations en sel. Le détergent est alors éliminé et l AN est récupéré par précipitation. Le CTAB résiduel est lavé par l éthanol 80%. Pour diminuer l activité nucléasique, le tissu pourra être congelé rapidement et décongelé seulement en présence du tampon d extraction qui contient le détergent et une forte concentration en EDTA. Le rendement est de l ordre de : 100 à 500 µg d ADN par gramme de tissu frais de plantes. 2 à 6 heures de purification selon la quantité de départ en matériel et la pureté et le rendement désiré. La méthode décrite ci-dessous peut s appliquer à tous types de tissus végétaux. Quelques mg de tissus suffisent. MATERIEL Solution d extraction CTAB Conservation à t ambiante, plusieurs années 2%(w/v) CTAB 100 mm Tris HCl ph : 8,0 20 mm EDTA ph : 8,0 1,4 M NaCl Solution de CTAB/NaCl 10% de CTAB dans 0,7 M de NaCl Dissoudre 4,1 g de NaCl dans 20 ml d eau Ajouter lentement 10 g de CTAB, en chauffant et en remuant Si nécessaire chauffer à 65 C pour dissoudre Ajuster à 100 ml avec de l eau Solution de précipitation CTAB Conservation à t ambiante, plusieurs années. 1%(w/v) CTAB 50 mm Tris HCl ph : 8,0 10 mm EDTA ph : 8,0 2% (v/v) β-mercaptoéthanol (β-me) Tampon TE high salt Conservation à t ambiante, plusieurs années. 100 mm Tris HCl ph : 8,0 0,1 mm EDTA ph : 8,0 1 M NaCl 24:1 (v/v) chloroform/alcool isoamyl Ethanol 80% ou isopropanol Mixeur ou pilon et mortier ou moulin à café

27 Préparation d'adn et d ARN 27 PROTOCOLE Extraction de l ADN 1 Ajouter le β-me à la solution d extraction CTAB pour obtenir une concentration finale de 2% (v/v). Environ 4 ml de solution d extraction CTAB-β-Me par gramme de tissu frais. Dilution 1:1 de cette solution avec de l eau stérile pour des tissus déshydratés. Utiliser le β-me sous hotte chimique. 2 Chauffer cette solution et la solution de CTAB-NaCl à 65 C (0,4 à 0,5 ml par gramme de tissu frais). 3 Si possible, refroidir le broyeur (-80 C ou azote liquide). 4 Broyer le tissu de plante en une fine poudre et transférer dans tube résistant aux solvants organiques. Utiliser du tissu jeune et éviter les pédoncules et les veines les plus larges pour un rendement en ADN et une faible contamination en polysaccharides. 5 Ajouter la solution d extraction CTAB-β-Me chaude sur le tissu broyé et mélanger. 6 Incuber 10 à 60 min à 65 C en mélangeant de temps en temps. Le rendement est fonction du temps d incubation. 7 Extraire l homogénat avec un volume égal de 24:1 chloroforme/alcool isoamyl. 8 Bien mélanger par retournement. Centrifuger 5 min à 4 C 7500 g rpm en microcentrifugeuse pour des petits échantillons < à 150 mg de tissu de départ. 9 Récupérer la phase aqueuse (phase supérieure). 10 Ajouter 1/10 vol. de la solution CTAB-Nacl à 65 C à la phase aqueuse récupérée. 11 Bien mélanger par retournement. Ajouter 1 vol. égal de chlroforme/alcool isoamyl pour extraire. 12 Mélanger. Centrifuger 5 min à 4 C à 7500g (ou rpm si microcentrifugation) et récupérer la phase aqueuse (phase supérieure). Précipitation des ADN 13 Ajouter exactement 1 vol. de solution de précipitation CTAB. 14 Bien mélanger par retournement. Si la précipitation est visible passer à l étape suivante. Sinon incuber 30 min à 65 c. 15 Centrifuger 5 min à 500g 4 C (2700 rpm si microcentifugation). En absence de culot, rajouter de la solution de précipitation CTAB (jusqu à 1/10 du vol. total), incuber entre 1 h et la nuit à 37 C. Centrifuger 5 min à 500g à 4 C. 16 Enlever mais ne pas jeter le surnageant. Resuspendre le culot dans du tampon TE high-salt (0,5 à 1 ml de TE-high salt par gramme de matériel de départ). Si le

28 Préparation d'adn et d ARN 28 culot est difficile à suspendre, incuber 30 min à 65 C. Répéter jusqu à dissolution. Lecture au fluorimètre du surnageant et jeter le culot si les AN sont dans le surnageant. 17 Ajouter 0,6 vol. éthanol 100% pour précipiter. Bien mélanger. Centrifuger 15 min 7500g 4 C 18 Laver le culot avec l éthanol 80%. 19 Sécher et resuspendre dans un volume min de TE (0,1 à 0,5 ml de TE par gramme de matériel de départ. Purification plus approfondie?? 20 Protéinase K ou RNase A. 4) à partir de tissus animaux 1 - L'échantillon, congelé dans l'azote, est broyé (marteau ou pistolet), puis repris dans du tampon de digestion à raison de 1g pour 6 ml, pour être incubé à 56 C pendant 12 à 18 heures. Tampon de digestion : Tris HCl ph : 8 10 mm EDTA 25 mm NaCl 100 mm SDS 0,5% Protéinase K 0,1 mg/ml 2 - Faire ensuite une extraction au phénol et deux extractions au chloroforme. 3 - Prélever la phase aqueuse et précipiter l'adn. Les rendements obtenus sont de l'ordre de plusieurs centaines de µg par gramme de tissu. Également recommandé : tampon à l'urée. Tris 10 mm EDTA 10 mm NaCl 10 mm Urée 8M puis protéinase K : 150 µg/ml faire des extractions phénol + chloroforme (pas phénol seul)

29 Préparation d'adn et d ARN 29 5) à partir de culture de levure Culture durée de préparation au moins 2h30 Dans des plaques 24 puits, mettre 2,5 ml de YPG. Inoculer avec un rotofil en prélevant les cellules bien au centre de la colonie (1 colonie = 10 6 cellules). Incuber 48 h à 30 C ( souches ORD thermosensibles) avec agitation de 230 rpm. Prélèvement de 1 ml pour extraction d'adn en tubes repérés n 1 à 96 de 1,5 ml puis centrifugation 3000 rpm 10 min. Conservation des souches dans les plaques avec 1 ml de glycérol 60% mettre à -80 C Solutions pour l'extraction d'adn génomique Solution de Lyse 5 ml pour 100 preparations Sorbitol 3 ml de sol. 2M à 4 C 1,2 M final EDTA 1 ml sol. 0,5 M 0,1 M final ß mercapto éthanol 50 µl sous hotte 1% final Zymoliase 10 mg à 20 U/mg 2 mg/ml final H 2 O milliq 950 µl (qsp 5 ml) EDTA 5 ml à 50 mm : 500 µl sol 0,5 M avec 4,5 ml H 2 O SDS 10 % : 1,5 ml Protéinase K 2 mg/ml : 500 µl Acétate de potassium 5 M mis à 4 C : 2 ml Isopropanol : 25 ml Tampon TE 5,5 ml : Tris 10 mm ph : 8 -EDTA 1 mm Tampon TEN : Tris 150 µl sol 1 M ph : 8 10 mm EDTA 30 µl sol 0,5 M 1 mm NaCl 600 µl sol 5M 0,2 M H 2 O 14,220 ml (qsp 15 ml) RNAse A 250 à 1 mg/ml : dilution au dixième sol.10 mg/ml Mélange Phénol/Chloroforme 15 ml : Phénol Chloroforme 24 vol / Alcool Isoamilique 1 vol 7,5 ml 7,5 ml

30 Préparation d'adn et d ARN 30 EXTRACTION ADN DE LEVURE 1 - Suspendre le culot dans 50 µl sol. de lyse. 2 - Incuber 2 h à 37 C sur un agitateur à vibration. Centrifuger 8000 rpm 2 min. 3 - Resuspendre le culot dans : 50 µl EDTA 50 mm 1,5 µl SDS 10 % bien mélanger 5 µl protéinase K 20 mg/ml bien mélanger 4 - Incuber 30 min à 65 C en homogénéisant toutes les 5 min. 5 - Ajouter 20 µl d'acétate K froid bien mélanger. 6 - Incuber 30 min (minimum) dans la glace. Centrifuger rpm 15 min 4 C. 7 - Transvaser sans pipeter le surnageant dans un autre tube. Ajouter 75 µl d'isopropanol, mélanger doucement jusqu'à formation complète du précipité et placer à 5 min - 80 C. 8 - Centrifuger rpm à 4 C 10 min. 9 - Suspendre le culot dans 25 µl de TE (Option OVN 4 C) 10 - Ajouter 2,5 µl de RNAse A à 1 mg/ml. Incuber 1H à 37 C (agiter toutes les 5 ) 11 - Ajouter 50 µl Isopropanol, mélanger doucement jusqu'à formation complète du précipité. Placer à - 80 C pendant 5 min. Centrifuger rpm à 4 C 10 min Suspendre dans 100 µl de TEN. (Option OVN 4 C) 13 - Ajouter sous hotte 100 µl de phénol/chloroforme, agiter, centrifuger rpm 10 min Prélever la phase supérieure aqueuse et ajouter 200 µl d Ethanol 100 %, placer 5 min à - 80 C Centrifuger rpm à 4 C 10 min Laver le culot avec 200 µl d Ethanol 70 %. Centrifuger rpm 4 C 10 min Vider le surnageant et sécher le culot sur paillasse Suspendre le culot dans 30 µl de TE (Option à 56 C 1 H puis vortex) Hydrolyse sur 10 µl d'adn par HinfI (nuit à 37 C) PURIFICATION DE FRAGMENTS D ADN

31 Préparation d'adn et d ARN 31 Pour préparer des fragments de taille allant de quelques centaines à quelques milliers de nucléotides, des gels à 1% conviennent bien ; pour Nusieve GTG, 1,5% minimum. Un puits d'une vingtaine de microlitres permet de séparer des quantités d'adn de l'ordre de quelques centaines de nanogrammes par bande. On colore au Bromure d'ethidium après électrophorèse (évite de contaminer les cuves) NB : pour tous ces protocoles d'extraction, il est important d'utiliser de l'agarose très pur; l'agarose Seakem GTG (FMC; distribué par Tébu) donne de bons résultats de ligature. 1) à partir de gel LMP 1- Visualiser les bandes sur une rampe ultra-violet (de préférence à 300 nm ou plus de longueur d'onde afin de réduire la photolyse de l'adn), et les découper. 2 - Compléter le volume à 500 µl environ avec du T.E. si nécessaire et laisser le tube Eppendorf 5 min. dans un bain marie à 65 C. 3 - Extraire deux fois au phénol, deux fois au chloroforme. 4 - Précipiter l'adn avec 150 mm NaCl final, deux volumes d'éthanol 100% et laisser 30 min dans la glace. 5 - Centrifuger 20 min. 6 - Eliminer le surnageant et laver le culot en ajoutant 1ml d'éthanol à 70%. Laisser 5 min. à température ambiante, centrifuger 5 min, éliminer le surnageant, laisser sécher le culot, suspendre l'adn dans du T.E. Les rendements d'extraction sont de l'ordre de 50 à 70%. Contact YH 2) par électroélution 1 - Découper la bande d'agarose contenant le fragment comme précédemment puis le mettre dans un boudin de dialyse avec un volume de tampon d'électrophorèse suffisant (200 à 500 µl). 2 - Fermer avec des pinces à dialyse, et déposer le boudin dans un bac à électrophorèse. 3 - Faire migrer à 200 volts pendant 1/2 heure, inverser le courant 15 secondes, pipeter le tampon dans le boudin, rincer le boudin avec du T.E. 4 - Précipiter l'adn avec 0,15 M final de NaCl et 2,5 vol. d'éthanol 1/2 heure à - 70 C (avec entraîneur acrylamide, cf annexe, si nécessaire). Cf annexe pour préparation boudin de dialyse. Contact CP 3) par électroélution sur papier

32 Préparation d'adn et d ARN Découper avec une lame de rasoir neuve une fente dans le gel, juste en dessous de la bande ; y insérer un carré de papier (e.g. Whatmann 3MM) imbibé de TAE et adossé à un carré de membrane de dialyse, lui aussi imbibé de TAE (la membrane du côté de l'anode) 2 - Remettre à migrer après avoir ôté un peu de tampon dans la cuve, afin que le gel ne soit pas submergé. Le temps de migration dépend de la concentration d'agarose; typiquement, pour un gel à 1%, il faut migrer 3 à 4 min à 100V (cuve Jewel Box). 3 - Vérifier sous UV que tout l'adn est rentré dans le papier. Retirer le papier et la membrane, et les introduire dans un tube Starstedt 0,5ml percé d'un trou d'aiguille (25G; 0,5mm). Introduire ce tube dans un Eppendorf 1,5ml sans bouchon. 4 - Eluer avec 2 x 100 µl tampon d'élution, en centrifugeant 3min 5000rpm et 1min 14000rpm. Rassembler les éluats, éventuellement ajouter 10 µg ARNt, phénoler et précipiter avec 600 µl éthanol (sans rajouter de sel). 5 - Reprendre dans 20 µl TE, et reprécipiter avec 2 µl NaAc 3M ph : 5,2 et 60 µl éthanol. Reprendre dans 10 à 100 µl TE. Tampon d'élution : acétate de sodium 0,3M ph : 7,0 EDTA 1mM SDS 0,1 % 4) par adsorption sur billes de verre a) extraction avec JetSorb Suivre le protocole du kit, éventuellement en augmentant les temps de contact avec les billes de verre (1 heure). Pour le rendement, le volume final d élution est important, ainsi que le nombre de rinçages, puisque il y a un volume mort de liquide en fonction de la quantité de billes de silice utilisée (i.e. comme du sable). b) protocole adapté de Anal. Biochem. (1982) 121, , Marko et al. 1 - Gel TAE ou TPE, pas TBE 2 - Visualiser la bande sous UV ; la découper et ajouter 2,5 à 3 vol. NaI ; 55 C 3min (si la bande n'est pas complètement fondue remettre à 45 C). 3 - Ajouter 10 µl billes de verre ; laisser à 4 C au moins une heure (ou la nuit), de préférence sous rotation pour éviter la sédimentation. 4 - Centrifuger 15 sec. Rejeter le surnageant. Rincer 3 x 0,5ml EtOH/lavage. Après le dernier rinçage, recentrifuger 5sec pour éliminer les dernières traces d'éthanol. 5 - Eluer 2 x 25 µl TE, 2 x 10min à 37 C.

33 Préparation d'adn et d ARN 33 Réactifs Note : Ceci explique la fabrication d un kit de type Jetsorb. Notre consommation annuelle (environ un kit) n est pas suffisante pour qu il soit rentable de faire nos kits nous-même. 1) billes de verre - Broyer en poudre la plus fine possible au mortier 20 filtres en fibre de verre Whatmann GF/A Ø47mm (1,80g). Reprendre 10 ml eau milli-q. Centrifuger 3000rpm 10 min. Rejeter le surnageant. - Reprendre 10 ml eau m-q et transférer dans une fiole de 50 ml. Sous la hotte, ajouter 10 ml HNO 3 65%, et amener à 90 C sur une plaque chauffante. Laisser refroidir et centrifuger 5min 5000rpm (tubes Corex). - Rincer avec 30 ml eau m-q en centrifugeant 5 min 5000rpm autant de fois que nécessaire pour amener le ph à celui de l'eau (au moins quatre fois) - Reprendre dans 3 ml de TE stérile (final : 4,5ml) 10 µl de cette préparation adsorbent de 5 à 10 µg d'adn. 2) iodure de sodium 6M NaI Na 2 SO 3 eau qsp 90,8 g (dissoudre le NaI petit à petit dans l'eau, sinon il se prend en masse) 1,5 g 100 ml filtrer; ajouter 0,5 g Na 2 SO 3 et garder à 4 C dans le noir. 3) EtOH/lavage éthanol 50% pour 100 ml 50 ml éthanol absolu (bouteille neuve) NaCl 100 mm 2 ml NaCl 5M Tris ph mM 1ml Tris 1M EDTA 1mM 0.2 ml EDTA 0.5M 46.8ml eau Cf TIG fevrier 89 (technical tips) : digestion de l'agarose LMP avec de l'agarase (TEBU). Pas essayé. 5) Centrifugation sur laine de verre D'après Heery et al (1990) Trends in Genetics vol.6, n 6 p173. Après migration sur agarose, colorer le gel au BET et découper la bande intéressante dans un tube Eppendorf préalablement percé au fond et où on a disposé un peu de laine de verre siliconée sur

34 Préparation d'adn et d ARN 34 une épaisseur de 2 à 3 mm (on rince la laine de verre au préalable avec 100 µl de TE et centrifugation 10 secondes). On coupe ensuite le bouchon de ce tube pour le placer dans un second tube Eppendorf et on centrifuge l'ensemble à 6000 rpm pendant 10 minutes. Les fragments ainsi récupérés peuvent être directement marqués par Random Priming ou amplifiés par PCR, mais donnent des résultats peu reproductibles pour les clonages. Ce protocole est clairement le plus rapide de tous, et permet le traitement en parallèle d un grand nombre d inserts. Cependant, son principe pénalise les grands fragments, et il est probablement déconseillé (rendements faibles) pour les fragments au delà de 4-5 kb. 6) Gradients de sel Pour un sous-clonage de type shot-gun notamment, il est commode de fractionner l'adn par sa taille sur un gradient. Cette méthode a l'avantage de ne pas faire perdre de matériel et de ne pas introduire d'inhibiteur de ligation. solutions et matériel nécessaires : solution 1 Acétate de potassium 5%, EDTA 2mM solution 2 Acétate de potassium 20%, EDTA 2mM Filtrer ces solutions stock sur filtres 0.45 µm (bol inox). couleur de gel 2x5ml petit barreau magnétique tube pour rotor SW55, rotor et ultra. aiguille pour perçage tube tubes eppendorf pour collecte coulage du gradient : 1 - Mettre 2.6 ml de solution 20% dans 'la chambre du fond' (la plus éloignée de la sortie) 2 - Ouvrir le robinet de communication et faire naviguer la solution de façon à supprimer l'air dans le passage. 3 - Fermer le robinet. 4 - Mettre 2.5 ml de solution 5% dans la chambre antérieure. Eventuellement s'il reste du liquide du gradient précédent dans le tube de sortie, faire avancer la solution dans le tube pour le chasser (ainsi que toute bulle) puis la faire retourner dans l'appareil à couler. 5 - Mettre le barreau aimanté dans la chambre antérieure, placer l'ensemble sur agitateur magnétique, faire agiter le plus possible, ouvrir la connexion entre les chambres, ouvrir le robinet avant. 6 - Remplir le tube polyalomère SW55 par le fond. Quand le tube est rempli, fermer le robinet (avant l'arrivée de la bulle), et retirer délicatement le tube. 7 - Déposer l'adn dans 100 µl (environ) à la surface.

35 Préparation d'adn et d ARN Centrifuger 3 heures à rpm (ou 4.5 heures à rpm) à 22 C. 9 - Collecter les fractions (par exemple 250 µl par fraction) en perçant à proximité du fond du tube (aiguille gauge approx. 20) Précipiter les fractions à l'éthanol en ajoutant de l'entraîneur (acrylamide linéaire, cf. annexes) à une concentration de 50 µg/ml Déposer un aliquote sur gel (par exemple une partie de 1 fraction sur 2). Note : la taille de l'aiguille est importante : trop grosse, coule trop vite, contamination des fractions par le fond du tube i.e. grand fragments se manifeste par un smear de fragments hauts. Trop fine, temps de collecte élevé ou colmatage de l aiguille. Pour amorcer le coulage du gradient ou la collecte des fractions, on peut faire pression avec le doigt sur l'ouverture de l'appareil à gradient ou du tube. Inversement, en cas de problème, on peut stopper la collecte simplement en mettant le doigt sur le haut du tube. 7) Réparation d'extrémités Remplissage à la Klenow dans le cas d'extrémités 5' débordantes (générées par enzymes de restriction par exemple), remplissage à la T4 polymérase quand il y a des extrémités 3' débordantes (certains enzymes, tels que PstI, ou après sonication). Exemple T4 polymérase (shot-gun) : pour 10 µg d' ADN soniqué dans 90 µl total : - tampon Boehringer L : 10 µl - dntp stock 10 mm : 1 µl de chaque - T4 polymérase (Boehringer) : 10 UI Laisser 15 minutes à température ambiante - Klenow (2.5 UI/µl, Boehringer) : 2,5 µl Laisser 15 minutes à température ambiante Eventuellement chloroforme avant de précipiter. 8) sous clonage Il existe maintenant de nombreux kits de sous clonage. On peut citer les vecteurs Ready-To-Go de Pharmacia (existent en hydrolyse SmaI, EcoRI, BamHI) :

36 Préparation d'adn et d ARN 36 Vecteur (puc, hydrolysé et déphosphorylé, 100 ng/tube), ligase et tampon, sont lyophilisés au fond d un tube. Il suffit de rajouter l insert dilué dans 20 µl d eau. Dans le cas où il faut hydrolyser le produit de ligature avant transformation (pour éliminer une sous population par exemple), précipiter avant l hydrolyse (et reprécipiter avant l électroporation). Pharmacia vend les mêmes vecteurs seuls. Les produits PCR peuvent être sous clonés par kit Promega (disponible au laboratoire) ou Invitrogene, qui tirent parti du rajout par la Taq polymérase classique (mais pas par les polymérases avec activité d édition) d un nucléotide (majoritairement un A) aux deux extrémités des produits synthétisés. D ailleurs, on peut en principe préalablement incuber un fragment d ADN avec Taq et datp afin d utiliser ce kit. PREPARATION D ARN 1) Extraction de RNA totaux en une seule étape Analytical biochemistry 162, (1987), Piotr Chomczynski and Nicoletta Sacchi.

37 Préparation d'adn et d ARN 37 Solution D (conservation 3 mois) Isothiocyanate de guanidium : 4 M Citrate de sodium ph : 7 : 25 mm Sarkosyl : 0.5% - Avant utilisation addition de 0.36ml de ß-mercapthoethanol 0.1M (manipulation sous hotte chimique) pour 50ml. (conservation 1 mois à T ambiante) - Ajuster les volumes en fonction de la quantité de matériel. 100 µl à partir de 10 6 cellules 1 ml à partir de 100 mg de tissus PROTOCOLE POUR 10 millions (10 7 ) DE CELLULES 1. Ajouter 1ml de sol. D. Homogénéiser (passer le lysat plusieurs fois dans une seringue) 2. Ajouter 100 µl d acétate de sodium 2M ph : 4. Agiter par inversion. 3. Ajouter 1 ml de phénol saturé avec de l'eau (conservation 1 mois à 4 C) et 200 µl de chloroforme alcool isoamylique (49/1). Agiter 10s et refroidir sur glace pendant 15 min. 4. Centrifuger 20 min à 8000rpm à 4 C. 5. Transférer la phase aqueuse. Précipiter par 1ml d'isopropanol 100%. Placer à -20 C pendant 1 heure. 6. Centrifuger 20 min à rpm à 4 C. 7. Redissoudre dans 300 µl de sol. D. 8. Précipiter par 1 vol d'isopropanol à - 20 C pendant 1 heure. 9. Centrifuger. Rincer par de l'éthanol 70%. 10. Séchage 15 min sous vide. 11. Dissoudre dans 100 µl de SDS 0.5% à 65 C pendant 10 min. 2) Préparation d'arn à partir de cultures cellulaires Tous les tampons (sauf le Tris) sont traités par 0,1% diéthylpyrocarbonate (DEPC) la nuit puis autoclavés 20 min à 121 C. Pour le traitement au DEPC, porter des gants en butyle ; se placer sous la sorbonne aspirante ; laisser l aspiration en route toute la nuit. Le lendemain décontaminer éventuellement le plan de travail avec de l eau de Javel. Les flacons de DEPC de 5 ml permettent de traiter 5 l de tampon ; une fois le flacon ouvert, l utiliser entièrement; avant l ouverture, percer le

38 Préparation d'adn et d ARN 38 septum en butyle avec une aiguille pour relâcher l éventuelle surpression due à la décomposition du DEPC. La verrerie est passée au four à 200 C 2 heures. Le plastique est autoclavé 30 min 121 C. Porter des gants en permanence. D après Maniatis (2 ème éd.) p Pour une boîte de Pétri de 10 cm ou un flacon de 75 cm 2 (T75) à semi-confluence. 2. Rincer deux fois avec 7 ml PBS froid. 3. Lyser les cellules dans 2 ml tampon A (température ambiante). 4. Gratter les cellules avec un grattoir stérile (très visqueux) ; transférer dans un tube en polypropylène stérile de 15 ml (Falcon). 5. Rincer la boîte avec 2 ml de tampon B. Ajouter à l extrait précédent. 6. Ajouter 4 ml de phénol (cf. infra). Agiter doucement en retournant. L ADN chromosomique doit précipiter en un flocon blanchâtre. S il ne précipite pas, c est que le milieu n est pas assez acide (pas de changement de couleur). Essayer alors de rajouter 50 µl de NaAc 2M ph : 4,0. Une fois que le flocon d ADN est formé, on peut agiter plus fort (vortex). Agiter 2 min. 7. Centrifuger 4000 rpm, 10min, 4 C. 8. Ajouter au surnageant : Tris 1M ph : 8,0 NaCl 5M éthanol 440 µl 180 µl 9 ml 9. Garder à 0 C au moins 30 min. Centrifuger à 4 C, 4000 rpm au moins 30 min. 10. Reprendre dans 200 µl TE. Reprécipiter dans un tube Eppendorf 1,5 ml avec 20 µl NaAc 3M ph : 5,2 ; 600 µl éthanol. 11. Resuspendre le précipité d'arn dans 200 µl TE stérile. Dilution 1/80 et spectre. On obtient en général de 150 à 300 µg d ARN total.(25 DO 260 = 1mg/ml). 12. Ajouter à l'arn 600 µl EtOH et garder à -80 C. Au moment de l emploi, prélever le volume désiré et ajouter 1/40 vol. NaAc 3M ph : 5,2. Centrifuger. Solutions pour 50 ml Tampon A EDTA ph : 8,0 10mM 1 ml 0,5M SDS 0,5% 2,5 ml 10% Tampon B NaAc ph : 5,2 100mM 1,6 ml 3M EDTA ph : 8,0 10mM 1 ml 0,5M

39 Préparation d'adn et d ARN 39 Phénol A partir de phénol (saturé en Tris 1M ph 7,5 ; β-mercaptoéthanol 1%; 8-hydroxyquinoléine 0,1%; gardé à 4 C ; plusieurs mois de conservation), préparer le jour même du phénol saturé en eau en ajoutant au phénol un demi volume d eau et en vortexant (deux fois) ; si le ph final de l extraction n est pas assez acide, i.e. s il reste trop de Tris du phénol original, l ADN ne précipitera pas ; pour plus de sécurité, on peut saturer le phénol avec de l eau une première fois, et avec NaAc ph : 5,2 (0,1M) la deuxième fois. Au moment de l extraction de l ADN, la phase phénol doit virer de l orange vif au jaune verdâtre si les ph sont corrects. 3) Extraction ARN Phénol chaud 1. Broyer les tissus dans l'azote le plus fin possible (broyeur Touzart et Matignon Réf F) 2. Transférer la poudre dans un tube contenant 2ml (ou plus) de tampon de lyse : Na acétate ph 5 10mM NaCl 50mM SDS 0.5% et 2ml de phénol BRL saturé avec de l'eau (le ph est acide). 3. Agiter dans un bain marie à 65 pendant 5min. 4. Refroidir dans la glace. 5. Centrifuger min à 3000 rpm. 6. Prélever la phase aqueuse et extraire par 1 volume phénol/chloroforme. 7. Centrifuger, prélever la phase aqueuse. 8. Extraire par 1 volume de chloroforme. 9. Précipiter avec 2 volumes d'éthanol et 200 mm de NaCl. 10. Resuspendre dans l'eau. Optionnel: un inhibiteur de RNase l'aurintricarboxylic acid (ATA) peut être ajouté dans la solution de lyse à 50 mm. Note : RNASOL, de Bioprobe Systems, est également apprécié. C.P NORTHERN GEL DENATURANT AU FORMALDEHYDE Porter des gants. Faire tremper au préalable les cuves dans NaOH 0,1M. 1) Gel 1.2% agarose eau : 2,4 g : 170 ml

40 Préparation d'adn et d ARN 40 Dissoudre sur plaque chauffante et sous agitation magnétique. Laisser refroidir à 50 C (barreau). Ajouter : formaldéhyde 37% : 16,2 ml MOPS x 10 : 20 ml 2) Tampon de migration MOPS x 10 eau formaldéhyde 37% : 150 ml : 1,3 l : 81 ml 3) Tampon de charge formamide désionisée : 1000 µl MOPS x 10 : 200 µl formaldéhyde 37% : 400 µl BET 10 mg/ml : 8 µl BBP saturé : 100 µl filtrer 0,2 micron Echantillon 10 µl + tampon de charge 30 µl. Chauffer 5 min à 65 C. Glace 5 min. Migrer 100V, 2 à 4h selon la taille, en recirculant le tampon. ATTENTION: gel fragile. Photographier. Transférer sur membrane Nylon (Hybond N + ; Amersham) dans 20 mm NaOH, par transfert capillaire la nuit. Solutions MOPS x 10 MOPS ph 7,0 200mM pour 1litre MOPS 41,8 g Na Acétate 50mM NaAc,3H 2 O 6,8 g EDTA 10mM EDTA 0,5M 20 ml NaOH ajuster ph : 7,0

41 Fixation d'adn sur membrane 41 TRANSFERT DE COLONIES SUR FILTRES (NAR 1989, vol 17, n 1, p. 452) 1. Marquer le filtre nylon (identification, repérage), le poser sur l'agar 30 sec, repérer sa position et le retirer. On peut remettre les colonies à pousser. 2. Poser le filtre sur papier Whatman imbibé de 2xSSC/5%SDS et laisser 2 minutes ATTENTION à la précipitation du SDS en dessous de 20 C. 3. Transférer les filtres sur le plateau dans un four micro-ondes (plateau tournant, 650Watts) et traiter pendant 2,5 min. à puissance maximum 4. Mouiller les filtres pour les décoller. Une hybridation de 4 heures peut suffire avec une exposition de quelques heures. D'après les auteurs, c'est aussi applicable pour les phages. Ne pas utiliser de nitrocellulose. On peut aussi traiter les filtres par : Pose 2 minutes sur papier type Whatman imbibé de Soude 0,2M, SDS 1% Puis 2 minutes au micro-ondes puissance maximum. Puis membrane rincée 2 fois en TE Non optimisé Contact : GV Application au criblage d'une banque de cosmides On utilise des boîtes 245x245 mm (Nunc réf ). Compter 400 ml de milieu agar par boîte, avec 50 µg ampicilline/ml. Les clones sont étalés à une concentration de quelques dizaines de milliers de clones par boîte selon l'objectif recherché. L'étalement se fait directement sur membrane (Hybond N +, colonies diluées dans 1 ml de milieu LB) et la boîte est mise à incuber à 37 C pendant 8 à 14 heures. Ensuite des répliques peuvent être obtenues par superposition d'une autre membrane (manipulations en dehors de la boîte ; repérer avec trous d'aiguille, et un trou au centre) et une incubation supplémentaire de quelques heures. Les membranes destinées à l'hybridation peuvent avoir été générées à partir de boites plastiques usagées. La première réplique, si elle doit être conservée, doit être faite à partir de boîtes neuves stériles. Contact : GV

42 Fixation d'adn sur membrane 42 DEPOT D ADN SUR FILTRE DE TYPE "DOT BLOT" Ce protocole permet de fixer de l'adn sur membrane nitrocellulose ou nylon (genescreen, Hybond...), sans séparation de taille, avec un appareil à filtrer (Schleicher et Schull) branché sur trompe à eau. Dans une tache circulaire de 3 mm de diamètre de Nytran chargé par exemple, il est possible de fixer jusqu'à 2 µg d'adn. Au delà, il y a saturation de la membrane. Il n'est pas nécessaire d'utiliser de l'adn complètement purifié : un lysat après incubation d'une nuit avec protéinase K à 37 C suffit. (Volume maxi par puit = 500 µl). Pour les membranes nitrocellulose : 1. A 50µl d ADN (1 vol), ajouter 100 µl de NaOH 0,5 M, NaCl 1,5 M (2vol) min à 0 C 3. Ajouter 150 µl de Tris 0,5 M, NaCl 3M ph : 8,0 (1 vol) 4. Imbiber la membrane dans 6xSSC 5. Rincer les puits avec Tris 0,5 m, NaCl 3M ph : 8,0 6. Filtrer l ADN (300 µl) 7. 2 heures à 80 C 8. Hybrider comme indiqué dans le paragraphe hybridation Pour les membranes nylon : 1. Diluer l ADN dans NaOH 0,4 M 2. Imbiber la membrane de TE 1x 3. Rincer les puits avec TE 1x 4. Filtrer l ADN 5. Rincer les puits avec TE 1x 6. Laisser sécher la membrane sur la paillasse en la protégeant dans du papier filtre 7. Fixer l ADN aux U.V. (facultatif) 8. Hybrider comme indiqué dans le paragraphe hybridation Contact : AP

43 Fixation d'adn sur membrane 43 TRANSFERT DE SOUTHERN 1) préparation du gel Les gels d'agarose sont réalisés à des concentrations pouvant varier de 0,4% à 1,5%. Des concentrations de 0,8% à 1,2% conviennent bien pour les usages courants, et permettent de bons transferts de l'adn. Le tampon d'électrophorèse est le Tris-acétate (TAE) ou TBE (voir annexe). L'électrophorèse est réalisée sans bromure d'éthidium dans le gel à un voltage de 3volts/cm environ (le voltage peut être porté à 10 volts/cm pour des migrations courtes, à condition de contrôler qu'un gradient de ph ne s'établisse pas entre les deux électrodes). Ici, l exemple pris est la fabrication d un blot d ADN génomique à partir d une migration sur gel 40 cm transféré sur membrane de 30 cm, dans des conditions de migration permettant de conserver les fragments de taille allant de 450 paires de base à 25 kb. Ces conditions sont celles choisies par le laboratoire pour les projets type étude de population et retard mental. Le protocole peut être adapté à des situations plus simples (gels plus courts, quantité de matériel à détecter moindre). Dans le cas d un ADN génomique humain, le dépôt de 5 µg d ADN dans une loge équivaut au contenu en ADN de 1 million de cellules. Chaque fragment copie unique de 1 kilobase du génome est représenté par 1 picogramme d ADN. L agarose utilisé est IDna de FMC (10 FHT le gramme). Pour tous les usages courants, utiliser l agarose Gibco ou bioprobe (2 FHT le gramme). 1. Gel 400ml 0,8% (3,2 g d agarose) TBE 0,5x (TBE préparé en eau milliq) 2. Fondre le gel sur plaque chauffante dans Erlen de 1 litre 3. Laisser refroidir (avec agitation, sur une plaque chauffante froide) jusqu à 68 C (entre 55 et 60 C pour des gels de plus petite taille). 4. Couler dans un moule mis à niveau, avec peigne 40 dents (orienté de façon à créer le rang de loge le plus près possible du début du gel). 5. Laisser refroidir au moins une heure avant démoulage du peigne. Il est indispensable de réaliser une recirculation du tampon pour éviter un gradient de ph et des distorsions de migration. 2) hydrolyses des échantillons (ADN génomique) et dépôts (à titre indicatif) pour deux dépôts : 1. Hydrolyser 10 µg d'adn dans 200 µl total (dans le cas d'échantillons de départ difficile à prélever (viscosité d'adn génomique par exemple), il est recommandé de diluer les échantillons au préalable ou bien de mesurer la concentration au fluorimètre après hydrolyse). 2. Utiliser 2,5 unité d'enzyme par µg d'adn

44 Fixation d'adn sur membrane Incuber 24 heures. 4. Rajouter NaCl (Genapex) 5M de façon à ce que la concentration finale (compte-tenu du tampon d'hydrolyse) soit de 0,15 M NaCl (par exemple 6 µl de NaCl 5M pour une hydrolyse en 200 µl de tampon A de Boehringer (hydrolyses AluI, tampon sans NaCl)) et 2,5 volumes (500 µl) EtOH 100% 5. Mélanger par retournement. 6. Laisser 30 minutes dans la glace. 7. Centrifuger 20 min. en rotor horizontal (Sigma) rpm 4 C (attention : certains tubes Eppendorf de mauvaise qualité cassent à partir de rpm, dans ce cas centrifuger à 11500). 8. Eliminer le surnageant et bien égoutter (essuyer avec un papier absorbant sans toucher les culots). 9. Laisser sécher sur la paillasse la nuit et reprendre dans 10 µl de TE. 10. Laisser dissoudre plusieurs heures (éventuellement 2 heures à 56 C). 11. Vortexer, centrifuger brièvement, ajouter 2 µl de bleu (en laissant les tubes dans la centrifugeuse et déposant le bleu en haut de tube avec la P10), centrifuger et déposer 6 µl (5 µg) par piste (2 gels) avec P10. L'ADN migre vers le pôle positif. Dans les grandes cuves de migration : 3) Transfert de l ADN du gel 2,3 litres de tampon TBE 0,5X (retourner la cuve entre chaque migration) déposer 15 µl de bleu bromophénol seul très concentré dans la dernière loge. Voltage :110 Volts Temps : 16 h 30 (par exemple de 17h30 à 10 heures le lendemain) Le milieu de la tache de BBP (bleu de bromophénol) doit être à 7,5 cm du bas du gel. En général, l ADN fractionné sur le gel est transféré sur un support manipulable sur lequel l ADN soit accessible. Pour des raisons essentiellement d économie, les gels peuvent également être séchés, ils deviennent alors robuste et se conservent comme des feuilles. Cependant lors d une hybridation par exemple, l ADN piégé dans l agarose n est accessible qu à de petites molécules (oligonucléotides). En outre l argument financier perd de son importance lorsque on recycle les membranes.

45 Fixation d'adn sur membrane 45 Le recyclage s effectue simplement en traitant une membrane usagée une nuit avec HCl 0,12 M, à température ambiante (par exemple dans le four Hybaid). Les membranes sont ensuite neutralisées au TE et conservées à 4 C jusqu à utilisation. a/ Par le vide Habituellement, on souhaite prendre une photographie de la migration (après la migration, colorer le gel pendant 20 min. dans une solution à 0.5 µg/ml de bromure d'éthidium). C est le cas par exemple pour un gel d hydrolyse de cosmides, plasmides, Pacs etc. C est d un moindre intérêt pour un ADN génomique car l exposition aux UV fractionne l ADN. Dans le cas présent (blots génomiques humains destinés à de nombreuses réhybridations) la photographie est à proscrire. De même, et tout particulièrement pour nos usages, l étape classique de traitement HCl (dont l objectif est de faciliter le transfert des fragments de grande taille en les cassant en morceaux) est à bannir car elle pénalise les hybridations hétérologues nécessaires par exemple à la mise en évidence de profils multilocus avec des sondes minisatellites, sans améliorer pour autant l hybridation avec des sondes monolocus. Préparer la cuve de transfert Pharmacia : Membrane 20x30 cm mouillée en eau milliq mise en place sous le masque, bouteille piège vidée placée en contrebas de façon à ce que les tuyaux puissent se vider pendant le temps du transfert. 1. Recouvrir le gel d'une solution soude 0,4 M. Laisser 1 à 2 heures en rajoutant de temps en temps du tampon. Ne pas laisser le gel sécher et ne pas laisser de soude autour du gel. 2. Couper le gel à 8 cm du bord supérieur et mettre le gel en place directement. Positionner la partie supérieure du blotteur avec ses clips, mettre la pompe en route, le vide doit s établir, le fixer à 50 (après quelques minutes, vérifier par pincement du tuyau entre blotteur et bouteille qu il n y a pas de fuite de vide (l aiguille ne doit pratiquement pas bouger). Souvent la fuite vient du blotteur lui-même, utiliser une pince de potence ; répéter ce contrôle du vide de temps en temps). 3. Recouvrir le gel d'une solution soude 0,4 M. Laisser 1 à 2 heures en rajoutant de temps en temps du tampon. Ne pas laisser le gel sécher et ne pas laisser de soude autour du gel. Essuyer la soude, enlever le gel et marquer la membrane (au crayon, côté face portant l ADN) 4. Rincer la membrane dans du 2xSSC puis du TE. 5. Fixer aux U.V. avec le stratalinker Equipe Silar : poser la membrane dans l appareil face ADN vers le haut (lampes UV) bien à plat. Fermer la porte, appuyer sur autocrosslink, puis start. Le temps d exposition réglé automatiquement et mesuré par la petite cellule noire au fond de l appareil est de l ordre de 30 secondes.

46 Fixation d'adn sur membrane 46 NOTE : en principe, la fixation UV est inutile pour une membrane chargée. Elle ne semble pas gênante, mais nous n avons pas fait les tests nécessaires. 6. Conserver la membrane au sec à température ambiante jusqu à la première hybridation, protégée par du papier filtre. Avant la première hybridation plonger la membrane dans un bain de soude et de TE Après transfert, bien rincer la plaque poreuse blanche, l'appareil et la bouteille pour éviter la formation de cristaux (et laisser sécher et égoutter la plaque poreuse sur un portoir bleu à piques). Contact : GV. b/ Sans vide Ceci est l ancienne méthode plus traditionnelle, qui peut parfois présenter un intérêt (transfert sur membranes non chargées par exemple?) 1. Après la migration, colorer le gel pendant 20 min avec agitation dans une solution à 0,5 µg/ml de bromure d'éthidium puis le photographier. Note : Pour faciliter le cas échéant le transfert des fragments de haut poids moléculaire, immerger le gel pendant 10 min. avec agitation dans une solution 0,12 M d'acide chlorhydrique. 2. Transférer le gel dans un bain dénaturant de soude 0,5 M, chlorure de sodium 1,5 M, pendant deux fois 20 min. avec agitation. 3. Neutraliser le gel en deux fois 20 min. avec agitation dans un bain de Tris Nacl (Tris Cl ph : 8, NaCl 1.5 M). 4. Réaliser un pont au dessus d'un bac contenant une solution de 10 à 20xSSC (voir annexe), à l'aide d'une plaque de verre. Couper une feuille de papier 3MM chevauchant la plaque de verre et baignant des deux côtés dans la solution de SSC. Bien imbiber la feuille de SSC, éliminer les bulles, déposer le gel, le recouvrir de la membrane préalablement trempée dans l'eau, couvrir la membrane d'une feuille de papier 3MM puis de papier absorbant et d'un poids (environ 0,5 kg pour un gel à 1% de 15 x 20 cm). Laisser transférer pendant la nuit à température ambiante. Note : il faut s'assurer qu'il n'y a pas de communication directe entre le papier absorbant au-dessus du gel et le pont au dessous. Le cas échéant, isoler avec du parafilm ou du papier aluminium. Après une ou deux heures de transfert, il peut être utile de remplacer le papier absorbant déjà mouillé. 5. Après le transfert, enlever le papier absorbant, marquer le filtre( numéro, face portant l'adn, orientation des dépôts) avec un marqueur noir à l'encre indélébile, rincer le filtre dans une solution de 2xSSC. 6. Fixer l'adn aux ultra-violets (254 nm) pendant une minute à 10 cm de la lampe (selon le type de lampe utilisée : le signal peut décroître très rapidement, il est donc nécessaire de déterminer empiriquement le temps d'exposition minimum). 7. Rincer le filtre dans du TE avant de le laisser sécher sur du papier absorbant. Contact : PS

47 Sondes marquées ; Hybridations 47 MARQUAGE RADIOACTIF D'ADN Le marquage est souvent réalisé par initiation au hasard et synthèse avec la Klenow pour les marquages de routine. L'ADN est porté à ébullition pendant 5 minutes afin de le dénaturer avant le marquage, puis placé dans de la glace pour éviter sa renaturation. 10 microci (1microl.) et 20 ng d'adn permettent d'obtenir une sonde de l'ordre de cpm. La séparation des nucléotides non incorporés se fait sur colonne Sephadex G75 et le comptage par dépôt de 1/100 ou 1/200 de la sonde sur filtre et estimation par compteur Geiger. Avant l utilisation de la sonde, il est nécessaire de dénaturer une nouvelle fois l ADN marqué (Ebullition + glace). 1) préparation d'un kit de marquage par 'random priming': Les kits du commerce coûtent environ 1500 FHT pour une cinquantaine de réactions. Il est très facile de les constituer soi-même à partir de Klenow (Boehringer, labelling grade ou Euromedex MBI), d'oligonucléotides (Pharmacia Ref ), pour un prix de environ 500F par kit. Resuspendre les oligonucléotides dans 100 µl de T.E. Mix x10 : pour 1 ml (permet de faire 10 kits) Tris-HCl ph 7.2 0,5 M 500 µl stock 1M MgCl 2 0,1 M 100 µl stock 1M Dithioerythritol 1 mm 1 µl stock 1M BSA 2mg/ml 100 µl stock 20 mg/ml (pharmacia ou tubes donnés par NEB avec tampons, solutions à 10mg/ml) H 2 O 200 µl oligonucléotides 100 µl 100 µl de mix complet correspondant à 50 réactions faites dans 20 µl. aliquotes de 100 µl, étiquettes marquées en rouge MixRP x10. Nucléotides : pour marquage avec déoxycytidine: Faire un mélange 'GAT' datp 100 mm 1,5 µl dttp 100 mm 1,5 µl dgtp 100 mm 1,5 µl H 2 O 900 µl 5 aliquotes de 180 µl, étiquette écrite en bleu GAT Marqueur de taille : faire une dilution à 100 pg/µl de 1kb ladder et 1 ng/µl de lambda HindIII par exemple. Le kit est alors constitué de un tube de mix (100 µl), un tube GAT (180 µl), un tube de marqueur de taille, et un tube de Klenow à 2 u/µl. 2) Protocole de marquage

48 Sondes marquées ; Hybridations 48 La réaction est faite dans 20 µl final (ou 10 µl, diviser par 2), avec l'adn à marquer, 1 µl de marqueur, 2 µl de mixrp, 3 µl de 'GAT', 1 ou 2 µl de [ 32 P]dCTP (10-20 µci), 1 µl de Klenow (2 u), et H 2 O. 1. Mélanger l'adn, le marqueur et l'eau et faire bouillir 5 minutes au bain marie. 2. Mettre dans la glace et centrifuger 5 secondes. 3. Ajouter 2 µl Mix x10, 3 µl nucléotides GAT, 2µl radioactivité, 1 µl Klenow. 4. Incuber 30 minutes (minimum ; 2 heures si possible) à 37 C dans le petit bain-marie derrière l écran (vérifier la température). 5. Passer sur colonne G75 pour éliminer les nucléotides non incorporés. 6. Compter 3 µl de sonde déposée sur un papier filtre avec le compteur Geiger (à calibrer; pour le compteur jaune multiplier par 150) 7. Faire bouillir la sonde 5 minutes au bain-marie avant l'hybridation. 3) Sondes d'extrémités de cosmides Pour cosmides en pwe15 ou Supercos1, utiliser les primers T3 et T7. Pour Lawrist utiliser les primers PL1 et PL2. La réaction se compose de : ADN cosmide environ 500 à 1µg un primer 10 µm : 1 µl Mix (Jeffreys)x10 : 2 µl GAT (idem kit RP) : 2 µl C 15µM : 1 µl Taq (type eurobio) : 0.5 µl ou moins H 2 O : qsp 20µl dctp 32 P : 3µl PL1 ATACGACTCACTATAGGGAG Tm 58 C PL2 ACATACGATTTAGGTGACAC Tm 56 C Le rendement de marquage (pour cette amplification linéaire) est linéairement proportionnel au nombre de cycles et à la quantité de matrice de départ. Programme indicatif : 94 C 20 secondes, 55 C 30 secondes 72 C 20 secondes ou moins. Finir à 10 C ou se débrouiller pour ne pas laisser un allongement long se faire en fin de cycle, car on veut des extensions très courtes ( nucléotides). L'amplification se fait en pièce radioactive, tubes 0.5 ml, sous huile. Mettre un plomb ou couvercle plexiglas sur le tube.

49 Sondes marquées ; Hybridations 49 Après l'amplification, récupérer la sonde en rajoutant 130 µl de TE, et pipetant 150 µl. Il n'est pas gênant de prendre un peu d'huile en même temps. Passer sur colonne G75 et compter comme pour une sonde RP. Il n'est pas nécessaire de faire bouillir ensuite puisque la sonde est simple brin. 4) Elimination des nucléotides non incorporés sur colonne G75 Préparation de la colonne 1. Faire un stock de confettis à partir de filtres fibre de verre de type GF/C, à l'aide d'une perforeuse (prendre le classeur dédié en pièce radioactivité) 2. Prendre une seringue 1ml (type insuline) et retirer le piston, et introduire au fond de la seringue un confetti GF/C, à l'aide du piston par exemple. 3. Mettre la colonne sur portoir et la remplir de G75 (Pharmacia, préparée comme recommandé en TE). La colonne doit être remplie de G75 jusqu à 1 ml (graduation), laisser le TE s écouler. 4. Déposer la sonde dans 300 µl de TE (par commodité, la reprendre dans 150 µl final, déposer, et rincer le tube avec 150 µl de TE) 5. Laisser le TE s écouler. Mettre un tube Eppendorf à bouchon à vis sous la colonne afin de réceptionner la sonde radioactive 6. Recharger 300 µl de TE (en deux fois 150 µl).la sonde passe avec les 300 µl. Laisser le TE s écouler puis jeter la colonne, avec nucléotides non incorporés, dans la poubelle à déchets [ 32 P]. Comptage 1. Déposer 1/100 de la sonde, soit 3 µl sur un papier absorbant (type benchcoat) 2. Poser le papier sur le parafilm sur la sonde du compteur Geiger au compteur = 1.5 millions dpm dans la sonde. Par exemple, si 1/100 de la sonde donne 300 au compteur, on a 4.5 millions de dpm au total. Contact : G.V HYBRIDATIONS (Southern et Northern)

50 Sondes marquées ; Hybridations 50 La sonde radioactive, dénaturée à la chaleur lorsque elle est double brin, est utilisée à une concentration finale de l'ordre de 10 6 cpm/ml (10 5 cpm/ml pour les minisatellites). Avant toute utilisation, les filtres sont déhybridés à la soude 0.4 N deux fois 20 min., puis neutralisés en T.E. Ils sont ensuite mis en tubes à hybridation deux par deux dos à dos et entre deux drains (sinon la sonde radioactive ne passera pas entre les deux filtres). Il est nécessaire de préincuber les filtres au moins 15 minutes avant d'ajouter la sonde (préhybridation). Pour la préparation du tampon de préhybridation et d'hybridation voir "Préparation des solvants et milieux" (ADN: 2% SDS; ARN: 5% SDS) Pour un tube, prévoir entre 3ml (un filtre) 20 ml (8 à 10 filtres 20x30 dans tubes 35 cm) et 30 ml (30 ou 40 filtres taille Eurogem) de tampon. Les températures d'hybridation, préhybridation, lavages sont fonctions des stringences cherchées. La formule empirique permettant d'estimer la stabilité d'un duplex ADN:ADN en fonction de la longueur (L) des fragments, la composition en nucléotides, la concentration en ions Na + (en M) et formamide (en %) du milieu d'hybridation est la suivante : Tm = (%G+C) log (Na + ) (%form) - ( (Na + ))/L Temps de préhybridation : 15 min. minimum Temps d'hybridation : la nuit Pour des séquences parfaitement homologues, l'hybridation se fait à 65 C. Conditions stringentes de lavage: 68 C- 0,1 SSC (0,1% SDS) Les filtres sont ensuite mis en sac plastique soudable, et exposés avec un film Kodak XAR5 ou Fuji RX avec écrans amplificateurs (nécessite alors une exposition à -70 C) ou sans écran amplificateur. 1) Hybridation dans un four Cette méthode apporte une nette amélioration par rapport à l'hybridation en sac, dès lors que les lavages sont effectués classiquement dans un bain-marie. Les membranes sont interposées entre des drains, qui sont nécessaires à la bonne circulation du tampon d'hybridation, l'ensemble est ensuite enroulé sur lui-même et disposé dans le tube. Remarque : dans le four Robins, à axe désaxé, en principe les drains sont inutiles. Il n'est pas nécessaire de renouveler le tampon après la préhybridation. Dans certains cas, les sondes utilisées contiennent des séquences répétées en plus de séquences uniques. Il est alors nécessaire (et pas toujours suffisant), lors d'une hybridation sur filtre d'adn génomique humain, par exemple, de neutraliser les séquences répétées. Une méthode utilisée consiste à ajouter un large excès (2000 fois) G.V

51 Sondes marquées ; Hybridations 51 d'adn génomique total soniqué. (Nous avons utilisé, avec un succès variable selon les sondes, le protocole décrit par Blonden et al., dans NAR vol. 17, n 14, p ). Deux choses changent par rapport au protocole habituel : 1- après marquage de la sonde, de l'adn total est ajouté, le mélange est dénaturé puis préincubé à 65 C avant l'hybridation. 2- le tampon d'hybridation peut être différent. 2) Renaturation de la sonde avec l'adn total Après marquage et séparation sur sephadex G 75, ajouter 100 µg d'adn de placenta (Sigma; soniqué à une taille de pb ou cassé par autoclavage 110 C, 10 minutes) en 6xSSC final, dénaturer 10 min. dans l'eau bouillante et laisser 1h30 min. à 65 C. Le tampon d'hybridation est par exemple 0,125 M Na 2 HPO 4 (ph : 7,2), 0,25 M NaCl, 1 mm EDTA, 2% SDS, 10% PEG ) Déhybridation A faire juste avant l'hybridation. Les membranes se conservent mieux à 4 C en sac d'exposition soudé, le SDS de la solution de lavage empêche le développement de champignons. 1 ou 2 bains NaOH 0,4 N (20 minutes) 2 ou trois bains TE 10:1 ph : 8 ou 7.5 (20 minutes) Changer les membranes de bain en les transférant une par une. En particulier dans le cas de membranes neuves, éviter que des membranes se touchent sous peine de "décalcomanies". Dans le cas de signaux récalcitrants sur blots de type hydrolyses de plasmides on peut faire le bains de soude à 42 C, ou plonger la membrane dans SDS 0.5% 100 C et laisser refroidir, puis 2 bains de TE. Ce traitement endommage la membrane. Pour un blot précieux, il sera préférable d attendre que la radioactivité fixée se soit atténuée (qq semaines ou qq mois)

52 Séquençage 52 REACTIONS DE SEQUENCE préparation de matrices à partir de prep. rapides de plasmide : Référence.: Wong et al., NAR (1990) 18, Ajouter 15 µl de soude 0,4 N à 15 µl de préparation rapide. Incuber à température ambiante 5 min. 2. Ajouter 120 µl d'éthanol froid, puis 15 µl d'acétate de potassium 1M ph : Mélanger et laisser 5 min à température ambiante. 4. Centrifuger 20 min. à 4 C et sécher le culot 5. Ajouter 10 ng de primer puis le tampon d'annealing et incuber 45 min (et plus) à 37 C. 6. Procéder comme indiqué dans les kits de séquençage, USB ou Pharmacia. Le protocole et les réactifs proposés dans les kits du type"sequanase" (néanmoins tendance à donner des "stop") ou pharmacia sont simples d'usage et donnent de bons résultats. C'est un aménagement du protocole initialement décrit par Sanger qui utilisait comme DNA polymérase l'enzyme Klenow. Le kit "séquanase" utilise la DNA polymérase de T7. Les réactions finales peuvent être effectuées dans des plaques à micropuits (non traitées culture de cellules) maintenues à 37 C sur un bloc chauffant. En fin de réaction et après 10 min. de dénaturation à 65 C en tampon formamide, les réactions sont dans un volume de 3 µl. Modifications : - l'annealing peut être fait en incubant les tubes eppendorf 5 min à l'étuve à 65 C sur les portoirs gris puis 30 min sur la paillasse à température ambiante. C'est recommandé pour la séquence double brin et marche très bien pour le M13. - on peut utiliser la moitié des volumes indiqués dans le kit sequanase. Actuellement, la technique préférée est : -marquage du primer en 5' par la polynucléotide kinase et gammaatp p33 -kit delta-taq ou équivalent. Marquage de primer en 5 par la polynucléotide kinase et [ 32 P] gamma ATP : Par matrice il faut prévoir 0,5 pmole de primer marqué. Pour marquer 10 pmoles : Tampon x10 : 2 µl Primer (si 10µM, i.e. 10pM/µl) : : 1 µl Enzyme T4 polynucléotide kinase : 1 µl Gamma ATP[ 33 P] : 3 µl H 2 O : 13 µl Volume total : 20 µl

53 Séquençage 53 L enzyme Biolabs convient bien. Cette réaction est robuste, certains la font même à 95 C en quelques minutes. On peut vérifier le marquage par chromatographie élémentaire sur une chute de membrane nylon (bandelette 3x10 cm) comme suit : Déposer un dot de bleu + 0,2 µl de réaction à par exemple 2cm d un bout de la bandelette. Faire migrer en trempant le bas de la membrane dans soude 0,4N (bandelette posée sur plaque inclinée) Compter sur compteur Geiger migré et non migré. Penser à inclure témoin gamma ATP. Reconstitution d un kit type delta taq pour séquençage manuel : Ce kit est bien adapté au séquençage manuel quand on a peu de matériel (quelques dizaines de nanogrammes de produit PCR, ou séquençage direct sur cosmide par exemple). Sa reconstitution nécessite une polymérase spéciale (delta taq) commercialisée par Bioprobe systems sous le nom de biotaq. Négocier avec Bioprobe un conditionnement à 30 unités/µl. Ensuite le kit se compose de tubes : 1-Tampon (Reaction buffer ) 300 µl par kit pour 1 ml : Tris HCl ph : 9,5 260 mm 260 µl de stock 1M MgCl 2 65 mm 65 µl de stock 1M H 2 O 685 µl 2-Enzyme dilution buffer (200µl par kit) pour 1 ml : Tris HCl ph : 8 10mM 10 µl stock 1M Béta mercaptoéthanol 1mM 1µl de dilution1/14 Tween % 50 µl Nonidet P40 0.5% 50 µl H 2 O 890 µl 3-Termination mixes (500 µl par kit) : Mix dntp* ddntp (5mM) H 2 O ddg 150 µl 5 µl 845 µl dda 150 µl 60 µl 790 µl ddt 150 µl 90 µl 760 µl ddc 150 µl 30 µl 820 µl mix dntp* : 1 µl de chaque dntp 100 mm dans 1 ml total Le coût des tampons est essentiellement celui des didéoxy. Au moins certains lots de ceux vendus par Euromedex/MBI fonctionnent bien, le prix est très intéressant et amène le coût des tampons à environ 100 FHT par kit. Le coût de l enzyme est de 85 centimes par unité chez Bioprobe. Pour 1000 unités par kit, le kit fabriqué revient à moitié prix, ce qui n est intéressant qu en période de séquençage intensif. Contact : GV.

54 Séquençage 54 SEQUENCAGE DE PRODUITS DE PCR 1) Obtention de la matrice simple brin Le fragment d'adn double brin amplifié par PCR doit être purifié pour éliminer les dntp, les amorces,... Ceci est réalisé après migration sur un gel d'agarose NuSieve fait et migré dans le tampon TA (Tris-HCl 40 mm ph : 7,4, acétate de sodium 30 mm). Le gel est coulé avec au préalable 1 µg/ml de BET (car le NuSieve se colore mal au BET). A titre d'exemples : un fragment de pb peut être déposé sur un gel 2% un fragment de pb peut être déposé sur un gel 4% Après migration, la bande d'agarose contenant le fragment d'adn (100 ng ou plus) est découpée sous UV. On ajoute 100 µl à 200 µl d'eau (selon le pourcentage d'agarose du gel) et on fait fondre l'agarose à 65 C pendant au moins 10 min, en vortexant de temps en temps. 1 µl de cette solution d'adn peut servir de matrice pour une PCR asymétrique. Cette PCR simple brin se déroule dans les mêmes conditions que la première amplification, exception faite pour la concentration d'un des primers dit "primer limitant". Ce primer doit être dilué dans des proportions allant de 1/30ème au 1/100ème (conditions à tester selon les primers) par rapport à la PCR double brin. Une fraction aliquote (1/10) de la PCR asymétrique est analysée par électrophorèse sur gel d'agarose 2% (pour un fragment de 300 pb) ou sur gel d'acrylamide 6% (pour un fragment de 150 pb) afin de visualiser la quantité et la qualité de l'adn amplifié. Le simple brin donne une bande de taille apparemment inférieure au double brin. Si l'amplification semble correcte, l'adn simple brin doit ensuite être purifié par microcon (produit Amicon, vendu par Grace S.A. à Epernon, Tél , ou millipore, équivalent). Le type de microcon est choisi en fonction de la taille de l'adn à purifier : Taille supérieure à 300 bases : centricon 100 Taille inférieure à 300 bases : centricon 30. Se conformer aux instructions du fabricant. Bien laver (au moins trois fois avec 400 µl d'eau). L'ADN est prêt à être séquencé. 2) Préparation des gels de séquence Les gels avec échantillons marqués au soufre [ 35 S] ou [ 33 P] doivent être séchés avant d'être exposés. 1) prétraitement des plaques de verre Nettoyer chacune des plaques avec une solution de SDS 1% en imbibant un kleenex et en frottant vigoureusement. Opérer assez vite de façon à ce que le SDS ne sèche pas sur la plaque. Sécher la plaque avec des kleenex propres. On peut éventuellement optimiser le séchage en utilisant de l'alcool. Après chaque utilisation, bien nettoyer les plaques à l'eau courante, en éliminant toute trace d'acrylamide résiduelle avec une éponge douce.

55 Séquençage 55 Avec des plaques suffisamment neuves, et surtout non rayées, il n'est pas nécessaire de siliconer les faces. En cas de problèmes de démoulages, et/ou de coulage, siliconer une ou les deux faces, avec un produit type Sigma coat ou analogue. Exemple : Repelcoat /Dichlordiméthylsilane. Etaler le produit à la main (gantée), laisser sécher la plaque sous hotte et laver une fois avec de l'éthanol et des Kleenex, repasser une couche de silicone et laver 2-3 fois à l'éthanol. Cette plaque peut-être utilisée pour 2 ou 3 gels. Repérer la face siliconée. Note : il est sans doute moins coûteux et moins toxique de racheter un jeu de plaques (et de faire attention à ne pas le rayer avec des détergents ou éponges abrasives). 2) solutions 5x TBE (pour 10 litres) : Tris base : 605 g Acide borique : 275 g Na-EDTA : 37 g ajuster à ph : 8.3 avec de l'acide borique Acrylamide 38:2 Acrylamide (Biorad) Bis-Acrylamide (Biorad) pour 100 ml : 38 g : 2 g Conserver le TBE en bouteilles de verre, et surveiller que l'acide borique n'a pas cristallisé. L'acrylamide se conserve très bien à 4 C dans le noir. Manipuler avec des gants. On utilise désormais les solutions d'acrylamides déjà faites : en général stock 40%, en proportion 29:1 acryl./bisacryl. 3) gels gradient (33 x 40cm) L'intérêt du gel gradient est de ralentir la migration des petits fragments d'adn en fin de migration et ainsi de pouvoir lire plus de bases pour une même longueur de gel. Le principe du gradient est de diminuer le voltage dans la partie basse du gel, ce qui ralentis la migration. Cette baisse de voltage est réalisée par une augmentation de la concentration saline dans la partie basse (baisse de la résistance). a) Gel gradient à 6% - pour 100 ml de solution à forte concentration saline (2.5 x TBE) (bas de gel) : urée 48 g sucrose 5 g bleu de bromophénol 5 mg 10x TBE 25 ml acrylamide 38:2 15 ml eau 19 ml Filtrer à travers un papier filtre. Cette solution peut être gardée à 4 C dans le noir pendant environ 10 jours. Dégazer avant usage.

56 Séquençage 56 - pour 200 ml de solution à faible concentration saline (0.5 x TBE) : urée 96 g 10 x TBE 10 ml acrylamide 29:1 30 ml eau 88 ml Filtrer et dégazer avant usage. Couler les gels un par un : 12 ml mélange 2.5 x TBE 24 µl TEMED 24 µl 10% persulfate d'ammonium (frais) 50 ml mélange 0.5 x TBE 100 µl TEMED 100 µl 10% persulfate d'ammonium (conservation de15 jours environ) L'acrylamide prend en 5 min. environ si les solutions sont à température ambiante. Mettre les solutions dans la glace quelques minutes avant d'ajouter Temed et Persulfate permet de ralentir la polymérisation (mais les solutions trop froides risquent de cristalliser). Utiliser une pipette de 25 ml avec une "propipette", aspirer 10 ml de mélange incolore 0.5 x TBE, puis les 12 ml de mélange bleu à 2.5 x TBE et établir un gradient en laissant monter quelques bulles d'air. Verser le gel entre les plaques légèrement inclinées, en commençant par le coté. Finir avec le reste de mélange 0.5 x TBE en versant par le milieu et en contrôlant que des bulles ne se forment pas. Introduire le peigne, le bloquer avec une pince à dessin. Laisser le gel polymériser à l'horizontale pendant au moins 30 min. Dès l'enlèvement du peigne, penser à bien rincer les loges une fois avec du tampon. b) Simulation d'un gradient Par cette technique, le gradient se forme au cours de la migration et permet une meilleure séparation des grands fragments. Mettre 150 ml d'une solution d'acétate de sodium 3M dans 350 ml de tampon TBE 1x, dans la cuve du bas. Cette solution sert de tampon de migration au niveau de la cathode (pôle négatif). Pour lire au delà de 400 pb, n'ajouter l'acétate de sodium qu après 2 à 3 heures de migration. Penser à surveiller la température des plaques, baisser la puissance si nécessaire. La formation du gradient provoque une augmentation de l'ampérage en cours de migration, il faut alors réguler l'intensité débitée par le générateur.

57 Séquençage 57 4) gels non gradient Pour 500 ml de solution gel 6% (5 gels 30 x 40 cm) : urée : 225 g TBE 5x : 100 ml acrylamide 40% : 75 ml eau qsp500 : 145 ml - Pour couler le gel, il est pratique d'écarter légèrement les plaques avec une pointe de spatule, et d'utiliser une grosse seringue 50 ml. Pour un gel de 60 ml : APS 10% : 450 µl, TEMED : 45 µl - pratique de couler le gel horizontal (pas de spacer en bas) 5) électrophorèse Le tampon d'électrophorèse est 0.5 x TBE en haut, 1xTBE en bas. La migration se fait en limitant à 60 Watts. Préchauffer le gel en le mettant sous tension min. avant de déposer les échantillons. Déposer les échantillons juste après leur dénaturation à 65 C, avec un pipetman P20 et un cône spécial effilé. Après la migration (environ 2 heures 30, 15 min. après la sortie du premier bleu), séparer les deux plaques. Transférer le gel sur un papier type Whatmann, couvrir la face avec une feuille de Saran Wrap et sécher sur le sécheur : température maximale. Le séchage doit durer de l'ordre de 20 à 30 minutes. Le gel ne doit plus être collant. Ne pas laisser trop longtemps sous risque d'aspiration du signal (le cas échéant laisser sécher sur la paillasse). Contact : GV

58 58 FICHES-PROJETS cartographie interne p 53 projets de génotypage, évaluation des coûts p 59 RT-PCR p 65 polymérisation d'oligonucléotides p 67 recherche de minisatellites par les grands fragments p 71 stabilité des minisatellites dans la levure p 78 cartographie de cosmides par hydrolyse partielle p 82 purification de Taq polymérase p 83

59 Projet génotypages 59 Cartographie interne d'allèles minisatellites Fiche "cartographie interne" I. Généralités Le "mapping interne" d'un minisatellite repose sur l'existence de variations nucléotidiques entre les motifs de la structure répétée. Sa mise au point, pour un minisatellite donné passe donc, dans un tout premier temps par le séquençage de plusieurs motifs (au moins 10) et des parties flanquantes (au moins 30 nucléotides de chaque côté). Des oligonucléotides flanquants et d'autres internes sont alors choisis. Plusieurs primers internes testent 1 variation entre motifs, chacun d'entre eux ayant à son extrémité 3' le nucléotide qui correspond à un des statuts de la variation. L'amplification PCR entre un primer flanquant et un primer interne X doit alors produire une série de fragments correspondants aux motifs X. Migrés côte à côte, les produits d'amplification obtenus avec les différents primers internes du même polymorphisme génèrent des "échelles" complémentaires qu'on peut lire comme une séquence dont le pas n'est pas 1 nucléotide mais 1 motif. Pour éviter le raccourcissement progressif des produits d'amplification lors du PCR, on rajoute à l'extrémité 5' du primer interne une queue d'une vingtaine de nucléotides : le primer interne est alors utilisé en faible concentration (de l'ordre de 10 nm), le relais étant pris après quelques cycles par le primer queue qui est à la même concentration (de l'ordre de 1 µm) que le primer flanquant. II. Application : typage d'allèles CEB1 On peut, pour certains minisatellites, typer les 2 allèles d'un individu simultanément et reconstituer la structure de chaque allèle en comparant les codes diploïdes des individus de la famille où ségrègent ces deux allèles. Ce n'est pas possible pour CEB1 car 2 polymorphismes d'insertions/délétions entre motifs empêchent la superposition nette des 2 échelles produites à partir des 2 allèles et rendent impossible la lecture. On doit donc dans ce cas séparer les deux allèles amplifiés d'un individu avant de les typer par MVR-PCR. 1) Amplification et séparation des allèles entiers a/ amplification Typiquement, pour une amplification on mélange : H 2 O : 8.84 µl Tampon 10X : 1.5 µl Tampon "Jeffreys" ref: Jeffreys et al. Cell, 60: ,1990, voir composition à la fin du chapitre. Le tampon Boehringer décrit dans le kit long range PCR est meilleur que le tampon Jeffreys. Nucléotides 10X : 1.5 µl 10X = mélange de 2mM chaque. soit Perkin-Elmer, soit Pharmacia ref: voir chapitre marquage par random priming. Taq polymérase 5U/ml : 0.1 µl AmpliTaq de Perkin-Elmer P1 (28microM) : 0.53 µl soit 1µM final P6 ou P8 (28microM) : 0.53 µl soit 1µM final ADN (10 µg/ml) : 2 µl ---- Volume total : 15 µl

60 Projet génotypages 60 Paramètres d'amplification : Dans un Perkin Elmer GeneAmp PCR system 9600 : 25 cycles de 10 sec. à 96 C, 15 sec. à 68 C, 6 min.à 70 C puis 2 cycles de 15 sec. à 68 C et 10 min. à 70 C. b/ Visualisation des allèles amplifiés 1 Faire migrer (environ 3 heures à 200 V dans cuve Pharmacia) dans un gel d'agarose 1% (Seakem LE) de 20 cm de long 1 µl du produit d'amplification mélangé à 0.5 µl de tampon de dépôt Xylène cyanol seul (0.4% xylène cyanol). Le marqueur de taille (1 kb ladder ref: BRL 5615SA) doit migrer à proximité (à déposer au moins 5 fois dans un gel 30 puits). 2 Colorer le gel au BET, photographier puis transférer sur membrane de nylon recyclée soit par le vide 1heure au moins, soit à sec toute la nuit (en ayant dans ce cas plongé au préalable le gel dans 0.4M NaOH, 2 fois 20 min.). 3 Hybrider en four dans du CHURCH modifié au moins 2 heures à 65 C avec la sonde CEB1 (fragment HinfI de 3.6 Kb du cosmide 53) et 100 pg de marqueur de taille marqués par random priming. Laver en 1x SSC, 0.1 % SDS à 65 C. 4 Estimer sur l'autoradiographie les tailles des 2 allèles et les quantités en comparant les intensités à celle produite par une quantité connue de l'allèle du cosmide (déposer par exemple 10 ng, 1 ng et 100 pg du cosmide hydrolysé par HinfI sur le même gel que les échantillons). c/ Découpage des bandes contenant les allèles 1 Déposer alors les 14 µl restants de l'amplification avec 1 µl de xylène cyanol 0.4% dans une loge (peignes 30 dents Pharmacia, position haute) d'un gel de 20 cm 1% agarose (Seakem LE) à côté de 1.5 µl de marqueur 1 kb ladder (100 ng/µl) (déposer marqueur, échantillon1, loge vide, marqueur, éch.2, loge vide...). 2 - Migrer jusqu'à ce que le bleu de bromophénol (premier bleu, mettre du tampon de dépôt BBP+XC dans les loges vides) soit à 3-4 cm de l'extrémité du gel. Colorer le gel au BET. Photographier aux UV. 3 - Préparer des minicolonnes avec des tubes 0.5ml percés et de la laine de verre comme décrit précédemment. Rincer la minicolonne avec 70 µl de TE 10:1 puis centrifuger 6000tr/min 6min dans un rotor tambour (tubes horizontaux) ou incliné. 4 - Découper le gel de haut en bas au niveau de la première loge vide, enlever le reste du gel de la plaque UV puis s'occuper du découpage des allèles du premier échantillon. Recommencer pour le 2 ème échantillon. 5 - Découper avec une lame de scalpel ou de rasoir, pour chaque allèle, la plus petite bande d'agarose possible à la taille estimée (le plus souvent, l'allèle n'est pas visible en

61 Projet génotypages 61 BET) et la déposer dans la minicolonne. Changer de lame ou la laver à l'eau distillée entre chaque découpage. 6 - Centrifuger 6000tr/min 6min dans un rotor tambour. L'allèle est alors dans un volume de moins de 50 µl (et on a une estimation de la concentration). 2) MVR-PCR sur allèles isolés a/amplification Pour un allèle CEB1 on aura 6 amplifications correspondant à 2 statuts possibles des 3 variations nucléotidiques (v4, v17 et v28) testées. Pour v4, 2 primers internes testent le même nucléotide en leur extrémité 3'. Typiquement, pour une amplification MVR à partir de la flanquante P1, on mélange: H 2 O : 3,1 µl Tampon 10X : 0,7 µl Tampon "Jeffreys" ref: Jeffreys et al. Cell, 60: ,1990, voir composition à la fin du chapitre. Nucléotides 10X : 0,7 µl 10X = mélange de 2mM chaque. soit Perkin-Elmer, soit Pharmacia. Taq polymérase 5U/ml : 0,05 µl AmpliTaq de Perkin-Elmer P1 (28microM) : 0,25 µl soit 1µM final Q (28microM) : 0,25 µl primer queue 1µM final Primer interne 7X : 1 µl entre 1nM et 50nM final (voir tableau ci dessous) ADN : 1 µl dilution de l'allèle découpé à pg/ µl ---- Volume total : 7 µl Paramètres d'amplification : dans un Perkin Elmer GeneAmp PCR system 9600 : 20 cycles de: 10 sec. à 96 C, 15 sec. à 68 C, 6 min.à 70 C puis 2 cycles de 15 sec. à 68 C et 10 min. à 70 C. Nom primer Concentration finale (nm) Officiel d origine TAG 1000 P P v4-g(11g) (=b1) 4 v4-g(11a) (=b3) 1 v4-a(11g) (=b2) 5 v4-a(11a) (=b4) 5 v17-c (=-G) 5 v17-t (=-A) 5 v28-c (=f1) 10 v28-c (=f3) 20

62 Projet génotypages 62 b/ migration et transfert des produits MVR La totalité de l'amplification (7 µl) mélangée à 1 µl de xylène cyanol est déposée dans 1 loge (peigne 30 dents,1mm d'épaisseur) d'un gel 1% agarose (Seakem LE ou I.D NA agarose) de 40 cm de long (cuve Econosubmarine, modèle SGE 040). Déposer également 1 µl de marqueur. Pour couler ce grand gel, faire fondre 4 g d'agarose dans 400 ml de TAE frais au micro-ondes après avoir pesé l'ensemble (Erlen+ TAE +agarose). Corriger avec de l'eau chaude la perte due à l'évaporation (mesurée à la balance) pendant l'ébullition. Couler le gel lorsqu'il est entre 65 et 68 C. La migration se fait à V en 1x TAE avec recirculation du tampon (pompe Appligène) et refroidissement par circulation d'eau froide dans le compartiment à eau jusqu'à ce que le bleu de bromophénol (déposé dans des loges vides) soit à 7-8 cm de l'extrémité du gel (environ 4 heures ). Transférer alors comme décrit au paragraphe II 1 b. Pour faciliter les manipulations, il est conseillé de couper et de jeter les 13 cm supérieurs du gel (un peu au dessus du xylène cyanol). Hybrider avec CEB1 + marqueur puis laver comme décrit paragraphe II 1 b. Exposer quelques heures. Note : pourra être adapté à migration TBE 0,5x ; modifier le voltage. 2) Amplification sur dilutions limites (ref: Jeffreys, Nature Genetics, début 1994) L'isolement et le typage d'allèles peuvent être effectués, comme décrit précédemment, à partir de 200 ng d'adn génomique (équivalent à environ cellules diploïdes) mais on peut aussi les mener à bien à partir de 3 pg (équivalent à 1 génome haploïde). Il faut dans ce cas, minimiser les risques de contamination en faisant les dilutions des ADN et des autres réactifs utilisés pour l'amplification sous hotte à flux laminaire. Typiquement, pour une amplification sur dilutions limites, on mélange : H 2 O : 4.26 µl Tampon 10X : 0.7 µl Tampon "Jeffreys" ref: Jeffreys et al. Cell, 60: ,1990, voir composition à la fin du chapitre. Nucléotides 10X : 0.7 µl 10X=mélange de 2mM chaque. soit Perkin-Elmer, soit Pharmacia Taq polymérase 5U/ml : 0.14 µl AmpliTaq de Perkin-Elmer P1 (28microM) : 0.1 µl 0.4 µm final P8 (28microM) : 0.1 µl 0.4 µm final ADN : 1 µl dilution à 5.14 pg/µl Volume total : 7 µl

63 Projet génotypages 63 Paramètres d'amplification (ici, pour 2 allèles de 0.9 et 2 Kb, adapter à des allèles plus grands en augmentant la durée d'élongation): Dans un Perkin Elmer GeneAmp PCR system 9600 : 45 sec. à 96 C puis 32 cycles de 45 sec. à 96 C, 45 sec. à 68 C, 3 minutes à 70 C puis 2 cycles de 15 sec. à 67 C et 6 minutes à 70 C. Procéder comme décrit dans le paragraphe II pour les migrations et les transferts. On peut, quand on a amplifié un seul allèle, typer directement par MVR-PCR sans passer par l'étape de découpage dans le gel. Le MVR-PCR se fait dans les mêmes conditions d'amplifications que celles décrites au paragraphe II 2 a. Composition du tampon PCR 10X :Tampon Jeffreys modifié (MgCl 2 rajouté à 15mM dans le 10X) : J.B. STOCK VOL pour 10X 1X Tris ph : 8,8 2 M 2,25 ml 45 mm Sulfate ammonium 2 M 550 µl 11 mm ph : 8,8 MgCl 2 1 M 150 µl 1.5 mm ß-mercaptoEthanol 14.3 M 46,8 µl 6,7 mm EDTA 50 mm 9 µl 4,5 µm H 2 O 7 ml

64 Projet génotypages 64 Fiche "localisation de gène par analyse de ségrégation" Projet type, estimation des coûts : 1 personne plein temps, 1 à 2 ans matériel (aspect génétique moléculaire, hors animalerie, etc...) Immobilisations à prévoir pour la durée du projet : congélateur -20 C 4 tiroirs potence de séquence 2 générateur de séquence 1 (ou alternativement accès à séquenceur de type Pharmacia ou Applied, mais prévoir le surcoût primers fluorescents). 1 jeu de pipetman 5 cassettes pour exposition films Coût à l'achat environ FTTC Le reste du matériel (machine PCR pour microplaques, informatique) est actuellement disponible sans risque d'induire une saturation. consommables : préparation des ADN (une centaine d'échantillons) : protéinase K, phénol, chloroforme, plastiques etc... : environ 3000 FTTC marqueurs microsatellites : probablement accessibles sans frais sur une base de collaboration. Sinon, compter FTTC pour un jeu de 200 locus (Research Genetics). Pour un locus (amplification 100 échantillons): Taq polymérase 40 unités à 2 FTTC unité = 80 FTTC 1 gel de séquence 20FTTC (acrylamide, urée, tampon d'électrophorèse) 20x30 cm de membrane 100 FTTC 1 film 20 FTTC 1 plaque amplification 30FTTC Total Environ 250 F de consommables par locus 200 loci = FTTC (en outre participation frais marquage et radioactivité10000 FTTC/projet) Compter également sur un taux d'échec (environ 10 à 20%) Total 200 locus x 100 animaux environ Francs Les coûts peuvent varier selon les approches, amplification froide puis transfert et hybridation (cas présenté ici) ou amplification avec primer marqué 33p puis exposition après séchage du

65 Projet génotypages 65 gel. Une autre façon de réduire les coûts de membrane est le multiplexage (co-dépôt de plusieurs marqueurs, révélation par sondes spécifiques). marqueurs minisatellites : Chez le rat notamment, les minisatellites sont répartis largement dans le génome. Ces marqueurs représentent alors un complément intéressant des microsatellites. En effet, leur typage est plus simple et moins coûteux. Une fois quelques jeux de Southern constitués, les hybridations sont un travail de routine. Prévoir les films, réactifs de marquage (kits et radioactivité), membranes nylon, enzymes de restriction pour préparer les Southern et les sondes. 100 animaux = 4 southerns X 30 dépôts (contrôles, marqueurs de taille etc...) 4 jeux de blots = 16 filtres 50 sondes membranes 1 rouleau environ 2000 FTTC enzymes (HinfI, HaeIII, 10centimes/unité) 2000 FTTC pour les blots et la préparation des inserts Films (Kodak XAR5 35x43) 4000 FTTC participation aux frais radioactivité et kits marquage 3000 FTTC divers (agarose, tampon d'électrophorèse, etc...) 1000 FTTC Total 50 sondes x 100 animaux : environ FTTC. Ces 50 sondes détecteront plus de 50 locus. Dans un travail antérieur du laboratoire, les sondes utilisées ont détecté environ 200 locus couvrant une large part du génome. Remarque : selon le type de projet considéré, il ne sera pas nécessaire de couvrir l'ensemble du génome. Une liaison simple (en cas de caractère monogénique par exemple) peut être obtenue dès les premiers typages. Enfin, l'ensemble des coûts de fonctionnement se répartit sur toute la durée du projet. Amplification des microsatellites par PCR. La technique décrite ci-dessous est plus particulièrement adaptée à l'amplification d'adn génomique en plaque 96 puits (par exemple sur machine Techne PHC 3). 1) Préparation des plaques PCR. -5 µl d'une solution d'adn à 8 ng/µl sont réparties en plaque 96 puits (type Techne HI Temp ou Costar Thermowell 6512 model T en PC) et recouvert de 40 µl d'huile minérale (2 gouttes). Les plaques sont alors recouvertes d'un couvercle Falcon microtest III et peuvent être conservées à -20 C.

66 Projet génotypages 66 2) PCR (Hot start PCR) La technique du Hot Start consiste à rajouter la Taq DNA polymérase après avoir dénaturé l'adn. Elle assure une bonne dénaturation de l'adn sans inactiver la Taq. Les réactions se font dans un volume final de 20 µl. a/ Addition des primers (pour une plaque : 520 µl (8x65µl)) Les primers sont dilués dans de l'eau à 2 µm (4X) afin qu'ils soient 0.5 µm final (souvent 0.25 marche aussi) par puits. Pour une plaque on ajoute 4 µl d'une solution de jaune tatrazine (Aldrich REF 20#195.2) à 10 mg /ml. Ceci donne une légère coloration jaune qui facilite la répartition des primers dans la microplaque. Dans la pratique on répartit 65 µl de primers 4X dans chaque puits de la première colonne d une microplaque Falcon (microtest III). On distribue 5 µl de primers dans chaque puits de la plaque PCR à l'aide d'une pipette multicanaux. Une brève centrifugation assure une bonne sédimentation des primers à travers l'huile (1000 rpm pendant 10 secondes). D'une manière générale on veillera à ne jamais toucher l'huile avec les cônes. Les plaques sont prêtes à l'emploi ou peuvent être congelées. b/ Hot-start. La plaque est dénaturée à 96 C pendant 4 minutes, puis on ajoute le mélange contenant le tampon, les dntps et la Taq. *Composition du HOT START pour une plaque PCR : H 2 O : 360 µl Rouge 5X : 420 µl Tp PCR 10X* : 210 µl dntps : 55 µl Taq polym(5 u/µl.) : 8 µl total 1050 µl Ce mélange peut être préparé à l'avance et conservé à -20 C. La Taq est ajoutée avant emploi. *Tampon Jeffreys modifié (MgCl 2 rajouté à 15mM dans le 10X) STOCK VOL pour 10X 1X Tris ph : 8,8 2 M 2,25 ml 45 mm Sulfate ammonium 2 M 550 µl 11 mm ph : 8,8 MgCl 2 1 M 150 µl 1.5 mm ß-mercaptoEthanol 14.3 M 46,8 µl 6,7 mm EDTA 50 mm 9 µl 4,5 µm H 2 O qsp 10 ml 7 ml * dntps. Le stock de dntps est à 2.5 mm pour chaque nucléotide. Leur concentration finale par puits est de 65.5 microm.

67 Projet génotypages 67 *Rouge 5X Cette solution est en option ; elle peut être substituée par de l'eau mais améliore sensiblement les réactions de PCR. Composition: 65 % saccharose, 200 µg /ml de rouge de crésol (ALDRICH Ref#11,448.0). Le saccharose par sa densité accélère le passage du mélange à travers l'huile et permet en fin de PCR de charger directement un aliquote sur gel d'agarose sans addition de bleu. Le rouge crésol permet de bien suivre la phase du HOT START et facilite les opérations de pipetage de l'adn amplifié. * Réalisation de la PCR. Classiquement on utilise les conditions suivants: Dénaturation 1mn 94 C Hybridation 1mn 55 C* Elongation 1sec.72 C * selon le Tm des primers. ( Tm des primers AFM=55 C) - 30 cycles suffisent pour l'analyse en gel de polyacrylamide cycles sont quelquefois nécessaires. Les extensions en fin de réactions sont inutiles 3) Analyse des produits de PCR a/ Analyse sur gel d'agarose 3% (1% Nusieve+2% ordinaire, TBE). Cette étape permet de vérifier le rendement de la PCR. Cinq µl de produit d'amplification sont déposés sur gel. Si le rendement de la PCR est trop faible il est possible d'effectuer 5 à 10 cycles supplémentaires sans rajouter d'enzyme. b/ Analyse du polymorphisme sur gel de polyacrylamide La séparation se fait sur gel dénaturant (6% acrylamide, 8 M urée). Pour la préparation des gels voir le protocole de séquence. *Stratégies Pour analyser un grand nombre de marqueurs il est indispensable de regrouper (multiplexer) des marqueurs sur un même gel. Il existe deux méthodes différentes: -Association par taille croissante. Dans ce cas il faut s'assurer que deux marqueurs sont séparés par 50 bases. La révélation ce fait en une seule étape par une sonde commune à tous les marqueurs (sonde CA 30 mer) -association par taille identique. Cette technique permet de regrouper davantage de marqueurs sur un même gel. La révélation se fait par hybridations successives par des sondes spécifiques pour chaque marqueur. *Dépôt Un ou plusieurs aliquotes de 5 µl de produit de PCR selon la stratégie utilisée sont mélangés à du bleu formamide dans une microplaque et dénaturés à 94 C pendant 3 minutes sur un bloc chauffant puis placés sur la glace. 3 à 8 µl sont déposés sur gel (selon le type de peigne utilisé).

68 Projet génotypages 68 *Migration Elle se fait en tampon TBE 1X à 40 ma par gel. Le temps de migration est directement fonction de la taille des produits à séparer. -exemple pour une bonne séparation des allèles dans le quart inférieur du gel taille du produit niveau du bleu cyanol dans le gel 90 bases 3/4 35 bleu sortant mn après la sortie 270 et plus 1 heure après la sortie *Transfert Il se fait par capillarité en appliquant sur le gel une membrane chargée recyclée (N+ ou Pall) préalablement trempée dans du TBE 1X. Deux feuilles de papier filtre assurent un bon transfert. Un léger poids est placé sur le gel pendant les 30 minutes du transfert. *Fixation. L'ADN est fixé par immersion du blot dans une solution de NaOH 0.4 N pendant 20 minutes. Les blots sont alors neutralisés dans deux bains de SSC 2X. *Hybridation. -Marquage de la sonde. Une des amorces de PCR est marquée à la terminale transférase (Kit BOEHRINGER Ref# ). On peut également marquer un oligonucléotide dont la séquence dérive du motif répété du microsatellite. Chez l'homme la plupart des microsatellites sont des répétitions de CA. -Protocole de marquage : Mélanger dans l'ordre H 2 O 24,5 µl Primer (20 µm) 2 µl Tampon 5X 7,5 µl dctp* 2 µl Terminale transf (10u/µl) 0.5 µl Cobalt 1 µl Le marquage se fait à 37 C pendant 30 minutes -Hybridation en four Le milieu d'hybridation se compose de 35 ml de PEG/SDS(7% /10%). L'hybridation se fait à 42 C pendant au moins 2 heures. En fin d'hybridation, les membranes sont lavées dans du 2X SSC % SDS à température ambiante puis exposées en cassette. Le temps d'exposition varie de quelques heures à 24 heures selon l'activité de la sonde. Tester : tampon hybridation Church, membranes recyclées. Contact :BLG

69 RT-PCR 69 Fiche RT-PCR Perkin Elmer Cetus protocol with modifications 1) RT step Reaction volume: 20 microl. Composition: - 5mM MgCl 2-50 mm KCL, 10 mm Tris-Hcl ph 8,3 (2 microl. 10X-PCR buffer) - 1mM of each nucleotide dgtp, datp, dttp, dctp - 2,5 microm oligo T-primer (or Hexamer) or 0,75 microm downstream primer - 1 microl. (=20 units) RNasin per sample - 1 microl. (= 50 units) Reverse Transcriptase per sample - 1 microg. or less of total RNA The mix can be prepared at room temperature, the RT-step is done without oil overlay. Cycle: - 20 minutes at 42 C - 5 minutes at 99 C 1 cycle - 5 minutes at 5 C RNA denaturation at 65 C has shown to be not necessary. All manipulations should be done on RNA-level: gloves...etc. 2) PCR step Reaction volume:100 microl., all components are directly added to the PCR tube from step 1, using master-mixes if possible. Centrifuge the PCR tubes after step 1 briefly. Add 8 microl. of 10 X PCR-buffer to ajust to the a concentration of 50 mm KCL and 10 mm Tris, and complete to 100 microl. with H 2 0, primers and MgCl 2. It has been shown that low concentrations of MgCl2 increases the specificity of the amplification. 1,0 to1,5 mm MgCL 2 (final concentration) turned out to be the good choice for most applications. Other components: - 0,5 microl. AmpliTaq-Polymerase (= 2,5 units) - 0,15 microm final concentration of each primer. If a specific primer was already used in the RT step, only the second one is added.

70 RT-PCR 70 Overlay with mineral oil (100 microl.) an centrifuge for some seconds. Cycles: - 3 at 94 C 1 cycle - 1 at 94 C - 1 at C* cycles** - 1 at 72 C - 10 at 72 C 1 cycle * The annealing temperature depends of course from the primers... most often the suitable annealing temperature is on the range of 52 C to 56 C. ** cycles for semi-quantitative RT-PCR Subsequently to RT-PCR samples are purified from the mineral oil by chloroform extraction, DNA is precipitated using a carrier, f.i. glycogen, and analyzed on an agarose gel.

71 Sondes STRs 71 Fiche manipulation-purification d'oligonucléotides, polymérisation purification sur gel des oligonucléotides après synthèse. L'oligonucléotide tel qu'il est fourni par le fabricant est contaminé par tous les intermédiaires de synthèse et des sels. Pour l'usage présent, il est préférable de le purifier. Ceci est fait par migration sur gel dénaturant d'acrylamide à 9%. 1) préparation du gel d'acrylamide : Le gel fait 1.5 mm d'épaisseur et est coulé entre des plaques de verre de 15 cm x 16.5 cm environ. L appareil Hoeffer permet de migrer deux gels simultanément. composition du gel: acrylamide 38:2 : 9 ml (gel à 9%) TBE x10 : 4 ml urée : 19.4 g H 2 O qsp 40 ml Pour démarrer la polymérisation, ajouter 300 µl de persulfate d'ammonium 10% et 30 µl de TEMED, mélanger et couler le gel. Mettre le peigne, laisser polymériser. Rincer les loges après avoir enlevé le peigne. 2) électrophorèse des échantillons : 1 - Le gel est vertical. Le tampon d'électrophorèse est 1 x TBE. Le voltage appliqué peut aller jusqu'à 250 volt sans refroidissement. Dans des loges de 1cm de large et 1,5 mm d'épaisseur, il est possible de déposer plusieurs centaines de microgrammes d'oligonucléotides. 2 - Ajouter aux échantillons lyophilisés 1 µl de tampon de dépôt de séquence (formamide + bleus) par unité DO. Arrêter la migration lorsque le bleu de bromophénol a parcouru la moitié du gel. Dans un gel à 9%, ce bleu migre à la même vitesse qu'un fragment de 14 nucléotides. 3 - Démouler le gel dans du Saran Wrap, en visualiser l'adn sur une plaque chromatographie fluorescente (ou du papier parafilm, ou un écran pour autoradiographie) éclairée avec une lampe U. V. à 254 nm. 4 - Découper le gel à l'endroit correspondant (tache noire). Deux protocoles ont été testés. Le second est plus simple mais nécessite l'utilisation d'une ultracentrifugeuse avec rotor à godets oscillants. a/ précipitation avec éthanol, en corex à tpm 1 - Laisser l'adn éluer pendant 2 heures environ à 50 C ou une nuit à 37 C en mettant le fragment d'acrylamide dans un tube sous agitation avec deux ml de tampon d'élution (On peut éluer en TE pour des petits oligos).prélever les deux ml, remettre 1 ml de tampon, laisser éluer une ou deux heures.

72 Sondes STRs Regrouper les 3 ml dans un tube corex siliconé, ajouter 200 µl d'acétate de sodium et 7 ml d'éthanol 100%, mélanger et laisser précipiter une nuit à -20 C ou 1 heure dans la glace. 3 - Centrifuger les échantillons à 9000 rpm pendant 20 min. à 4 C en rotor SW, éliminer le surnageant, laisser sécher et reprendre dans 100 µl de T.E. 4 - Mesurer la concentration (1 µl dans 500 µl) au spectrophotomètre UV et conserver à - 20 C (on compte que 1 unité de densité optique 1DO- correspond à une concentration de 37 µg d oligonucléotide par ml). Les rendements sont de l'ordre de 50 à 70%. Tampon d'élution : Ac NH 4 0,5 M MgCl 2 10mM EDTA 1mM SDS 0.1% Dextran T microg/ml b/ précipitation CTAB à g NAR, vol. 17 n p éluer en T.E. (2 x 750 µl). 2 - ajouter 100 µm final de CTAB et 15 mm final de sulfate d'ammonium. 3 - mélanger et laisser 20 min. dans la glace. 4 - centrifuger 10 min. à g en rotor à godets oscillants et égoutter. 5 - rincer le culot en remplissant le tube de EtOH 80%, AcoNa 0,15 M. 6 - laisser 5 min. à température ambiante et centrifuger (min. dans l ultracentrifugeuse). 7 - laisser sécher le culot, reprendre dans 100 µl (par exemple) de T.E. 8 - mesurer la DO. ATTENTION : Problème pour les oligos ne contenant que des C et T. CTAB: 100 mm=36 mg/1ml (Pour 1,5 ml d'élution, on ajoute 25 µl de (NH 4 ) 2 SO 4 1M et 2 µl de CTAB 36 mg/ml) 3) phosphorylation des oligonucléotides: Les oligonucléotides tels qu'ils sont fabriqués n'ont pas de groupement phosphate en 5'. Il n'est donc pas possible de les ligaturer tels quels. Mélanger : 2 µg de chacun des deux oligos complémentaires 3 µl d'atp 10 mm (stock 10mM : 6 mg/ml, aliquotes à conserver à 20 C) 5 µl tampon kinase x10 H 2 O jusqu'à 50 µl 1 µl (10 unités) de polynucléotide kinase incuber à 37 C pendant 30 min. Tampon kinase x10 : 0.7M Tris-Cl (ph 8) 0.1M MgCl 2 50mM dithiothréitol 1mM spermidine

73 Sondes STRs 73 4) polymérisation de l'oligonucléotide marqué 1 - A l'issue de la phosphorylation, ajouter 50 µl de T. E. N. 0,3 M NaCl et 250 µl d'éthanol, mélanger, laisser 1 heure à -70 C ou une nuit à -20 C, centrifuger 20 min. à rpm en horizontal. 2 - Après avoir laissé sécher le culot, le reprendre dans 3 µl d'une solution 10 mm Tris ph 7.8, 1 mm EDTA, 100 mm NaCl, chauffer pendant 20 min. à 65 C dans un pot en plomb par exemple et laisser refroidir à 4 C pendant quelques heures. 3 - La ligation du brin phosphorylé s'effectue à 4 C pendant plusieurs heures par addition de 50 µl d'une solution 50 mm Tris ph 7.8, 10 mm MgCl 2, 10 mm DTT, 0,1 mm ATP (tampon ligase) et 10 unités de T4 DNA ligase (Amersham).Ce tampon de ligature est préalablement refroidi dans la glace. 4 - Après ligature, déposer sur un gel d'acrylamide à 5%, et après migration découper la région du gel correspondant à des fragments de plus de 400 nucléotides. Electroéluer en 2 heures en TBE entre 100 et 200 volts dans un boudin de dialyse avec 750 µl de tampon et 1 min. à 100 volts en sens inverse pour décoller l ADN de la paroi. 5 - Récupérer le tampon en tube eppendorf, rincer avec 750 µl de TEN 0,3 M NaCl, répartir dans 3 tubes Eppendorf, remplir d'éthanol 100%, mélanger, précipiter pendant 1 heure à -20 C, centrifuger 20 min. à 4 C et vitesse maximum. Laisser sécher le culot et le reprendre dans 100 µl de T.E. Note : au cours de l'électroélution, orienter le morceau d'acrylamide de façon à ce que l'adn reparte en sens inverse de l'électrophorèse. 5) clonage du polymère Cette étape est loin d'être optimisée mais marche à peu près ainsi. 1. Remplissage des extrémités à la Klenow: incuber 10 µl de concatémère en 50 µl total (5 µl tampon Klenow 10x, 5 µl chaque nucléotide froid, stocks 0,5 mm, 2 u de klenow) à 37 C pendant 30 min. 2. Phosphorylation des extrémités: rajouter 50 µl d'une solution contenant 5 µl de tampon kinase 10x, 2 µl ATP 10 mm, 2 µl de kinase, et H 2 O qsp 50, incuber 30 min. à 37 C. 3. Inactiver l'enzyme en 5 min. à 70 C (ou chloroforme) et précipiter( NaCl, EtOH; 1 heure, -70 C). 4. Rincer le culot 1 fois à EtOH 70%, laisser sécher. 5. Reprendre le culot dans 5 µl de solution contenant: 10 ng de vecteur Sma I déphosphorylé 0,5 µl tampon ligase 10x, 0,5 µl ligase, 3 µl H 2 O. Incuber une nuit (ou plus) à température ambiante. 6. Etaler 40 µl Xgal 2% et IPTG 2% sur des boites ampicilline.

74 Sondes STRs Transformer (TG1 ou DH5æ) avec 1/2 ligature. 8. Repiquer les clones blancs en double sur filtre quadrillé et boite ou faire une réplique et cribler avec du polymère marqué. 9. Regarder par préparation rapide et hydrolyse la taille des inserts des deux clones donnant le plus fort signal. G.V

75 Grands Fragments 75 Fiche "clonage de minisatellites par les grands fragments" Introduction: Les répétitions en tandem de type minisatellite sont les séquences d'adn les plus polymorphes rencontrées dans le génome des mammifères (en particulier). Une fraction d'entre elles sont en outre hypermutables (10-15% ; classement arbitraire hypermutable : taux moyen supérieur à 1% dans l'une ou l'autre des lignées germinales). Chez l'homme au moins, où ces structures ont été le mieux étudiées, cette hypermutabilité peut-être différente en méiose mâle et en méiose femelle : les deux cas les plus remarquables sont LMS1 (chr01) avec un taux de mutation de 6% en méiose mâle et femelle, et CEB1 (chr02) avec un taux de 15% en méiose mâle et pratiquement 0% en méiose femelle. A présent, environ une dizaine de locus hypermutables ont été isolés, pour lesquels le taux de mutation est suffisamment élevé pour avoir une estimation significative du biais éventuel : environ 4 chez Alec Jeffreys, 6 au CEB (CEB1(13% mâle), CEB15 (2% male), CEB25 (2.5% en moyenne), CEB36 (1.5 % en moyenne, CEB42 (1% mâle), CEB72 (1.5% en moyenne)), peut-être 3 chez Ray White. Le nombre de ces séquences minisatellites polymorphes dans le génome humain est élevé : au moins 1500, peut-être Parmi celles-ci, on peut donc penser que 150 à 300 sont en outre hypermutables avec ou sans biais parental. Leur isolement permettra d'établir une carte de type épigénétique de ce comportement. Si ce comportement a une signification biologique, et reflète un mécanisme fondamental du génome, alors cette carte épigénétique devra être conservée entre différentes espèces. Les études que nous avons réalisées précédemment grâce à l'utilisation des sondes synthétiques ont montré que les locus détectés par ces sondes sont très télomériques chez l'homme (comme le sont les minisatellites qui ont été clonés) mais apparemment répartis sur tout le génome chez la Souris. Il apparaît donc intéressant de tenter d'élucider d'une part de cette apparente différence de répartition, d'autre part de comparer les cartes de biais qui pourront être établies dans différents types de génomes. Il est alors nécessaire de résoudre deux problèmes : le premier est de faciliter l'isolement de locus minisatellites. 10% seulement seront hypermutables ; les autres seront cependant utiles comme marqueurs génétiques pour la communauté des cartographes, ainsi que pour nous, d'une part pour étudier la génétique des locus hypermutables voisins, d'autre part pour connaître les fréquences de recombinaison en méiose mâle et femelle dans ces régions. Le second problème est, quand on a isolé un locus hypermutable chez l'homme par exemple, de savoir obtenir le locus correspondant dans l'autre génome. Il n'est pas possible d'utiliser le minisatellite luimême : une hybridation croisée ne sera pas nécessairement significative ; par ailleurs, les cartes de synthénie sont encore mal adaptées à l'identification de la région correspondant chez la Souris à une région télomérique humaine : il faut au moins connaître deux gènes conservés placés de part et d'autre du locus, ce qui n'est en général pas le cas pour le coté télomérique. Une approche envisageable est la recherche de séquences conservées directement dans le cosmide dont est issu le locus hypermutable. Le protocole qui suit tente de répondre au premier problème, la simplification de l'isolement de locus minisatellites. Il tire parti de la structure caractéristique des minisatellites, et ne fait pas appel à une reconnaissance par hybridation. C'est un prolongement du travail de clonage de grands fragments qui avait conduit à l'isolement de la sonde détectant CEB8 et CEB9. Néanmoins, la stratégie utilisée à l'époque, de clonage direct de grands fragments, avait été un échec, d'une part en raison de problèmes techniques d'efficacité de clonage, mais d'autre part et

76 Grands Fragments 76 surtout d'instabilité des minisatellites en petits plasmides (par rapport à une relative stabilité en cosmides). I. CULTURES Etalement de clones sur boîtes de Pétri ML+ agar + ampicilline 80µg/ml pour les banques porc, rat et homme commerciales en pwe15: titre =10 8 colonies/ml diluer 1µl dans 1ml de milieu L (i.e clones) diluer 10 µl dans 1 ml de milieu L (i.e clones) étaler 100µl par boîte (i.e. 100 clones) Ces boîtes se gardent 3-4 semaines à 4 C avec parafilm. Repiquage : Matériel : cure-dents alimentaires coupés en morceaux (environ 7 mm) ou tronçon de fil à couper (tondeuses de jardin, fil jaune) stériles ; boîte 96 puits stérile fond plat préférable ; milieu LS (=TB1) sans le phosphate avec 80µg/ml d'ampicilline ; milieu LS complet (=TB1+TB2) avec 80µg/ml d'ampicilline ; 96 tubes stériles. 1 - Répartir 100 µl de milieu sans phosphate par puits et 2 ml de milieu complet par tube. 2 - Piquer les clones bien isolés avec un morceau de cure-dents tenu avec une pince et déposer le morceau dans un puits. 3 - Après avoir repiqué 96 clones, transférer chaque morceau dans un tube. stériliser la pince (flamme bec Bunsen) entre chaque transfert. Les rangées A et B constituent le 1 er quart, etc. 4 - Incuber les tubes à 37 C 300 rpm pendant 24 heures. 5 Incuber la boîte 96 puits à 37 C une nuit. Archivage de la réplique 96 puits: matériel: boîte carrée avec milieu NZY + ampicilline. membrane hybond N+ format 10cm x 11.5cm 1 - Poser la membrane sur l'agar ; 2 - Ajouter 100µl de glycérol 50% par puits.

77 Grands Fragments Stériliser le peigne 96 dents (flamber à l'alcool après l'avoir trempé dans l'alcool et accroché sur une potence) 4 - Tremper dans la plaque, remuer, et poser sur la membrane; 5 - Coller une feuille plastique autocollante sur la microplaque et congeler à -80 C 6 - Mettre à incuber la membrane sur boîte une nuit à 37 C 7 - le lendemain, dénaturer la membrane en la posant 2 minutes sur un papier absorbant imbibé de 5xSSC, 2%SDS et mettre 2.5 minutes au micro-ondes puissance maximum (four 600W) Extraction cosmides : - Regrouper les minicultures par 24 en tube plastique 50ml - Extraire comme décrit dans le protocole 'extraction de préparation en grand': -mesurer la concentration en ADN avec le fluorimètre: II. ANALYSE DE RESTRICTION, PURIFICATION DES FRAGMENTS, HYBRIDATION SUR MINIBLOTS Hydrolyser entre 20 et 40µg par AluI + HinfI, par AluI + HaeIII et par HinfI + HaeIII. Diluer les ADN avec de l'eau milliq pour qu'ils soient à environ 30 µg/150µl ADN: 150 µl Mix tampon x10: 20 µl enzyme 20 unités de AluI, et 30 u de HaeIII ou HinfI H 2 O 30 µl Utiliser Tampon A (Boehringer) ou tampon 1 (Biolabs) pour AluI+HinfI et AluI+ HaeIII, tampon M ou tampon 2 pour HinfI+HaeIII. On a interêt à faire un mélange tampon + eau + enzymes, distribuer 50 µl par tube, ajouter 150 µl d'adn, mettre à incuber à 37 C une nuit. 1. Incuber une nuit à 37 C 2. Précipiter en rajoutant NaCl 5M et 500 µl Ethanol absolu tubes tampon A ou 1 : NaCl 6 µl tubes tampon M ou 2 : NaCl 4 µl 3. Mélanger, laisser 30 minutes dans la glace 4. Centrifuger 20 minutes rpm en rotor tambour (tubes horizontaux) 5. Eliminer le surnageant, bien égoutter 6. Laisser sécher le culot ou mettre 2 minutes au speed-vac.

78 Grands Fragments Resuspendre dans 5µl de TE ph8 8. Laisser bien dissoudre (au moins 2 heures) 9. Déposer sur un gel d'agarose 1% avec TAE 1x ou TBE 0.5x (gel 280 ml pour 20x20 cm) 10. Migrer à 250 volts jusqu'à ce que le bleu le plus avancé (bromophénol) ait avancé de 7 cm environ. 11. Colorer au BET (solution 0.25µg/ml; 10µl solution 10mg/ml dans 500ml d'eau milliq) pendant 20 minutes 12. Photographier aux UV 13. Découper les bandes > 1.5 kb. En principe, pour un mélange donné, éviter de tester plusieurs fois des fragments identiques, repérer les bandes susceptibles de correspondre au même fragment (critères = taille voisine, et surtout intensité comparable). Soit un minisatellite ne contient de site pour aucun des trois enzymes, et alors il apparaît dans les trois hydrolyses, soit il contient un site pour l'un des enzymes, et alors il n'apparaît que dans l'un des mélanges, soit il contient un site pour 2 ou les trois enzymes, et alors il ne sera pas accessible par notre approche. Découper au plus près de la zone d'agarose colorée au BET pour minimiser le volume d'élution. Centrifuger le fragment sur laine de verre (cf. protocoles) Si le découpage est suffisamment précis, on obtient en général un volume de 10 à 20 µl. Ce volume est proportionnel à la quantité d'adn présente (épaisseur de la bande). Marquer 2 µl par random priming dans un volume total de 10µl avec 5 µci (0.5 µl) de dctp. INCLURE 100 pg DE MARQUEUR DE TAILLE 1KB LADDER DANS LA SONDE. Eliminer les nucléotides libres sur colonne G75 (cf chapitre consacré) - Utiliser la totalité de la sonde (1 à dpm) pour hybrider un miniblot 3 hydrolyses dans un tube L'hybridation du miniblot se fait à 65 C dans 3ml de tampon dérivé de Church. Le lavage se fait d'abord en 1xSSC, 65 C, puis exposition 2 à 5 heures, puis relavage 0.1xSSC, 65 C, réexposition la nuit. Les lavages se font en quelques minutes en tampon préchauffé en plat Pyrex ou boîte type Tupperware au micro-ondes. L'hybridation sur les miniblots permet d'identifier les fragments correspondant à un minisatellite (polymorphe ou non), de savoir si le minisatellite a déjà été obtenu précédemment ou non, de sélectionner l'hydrolyse la mieux adaptée (HaeIII ou HinfI; en principe, celle qui donne le fragment le plus petit pour une sonde monolocus, ou le profil le plus clair et polymorphe pour une multilocus), enfin de choisir la meilleure stringence de lavage: parfois les deux stringences sont utiles (multilocus à faible stringence, monolocus à forte stringence), mais quand le profil est identique dans les deux cas, choisir la stringence la plus faible (1xSSC) pour avoir un signal plus fort et ménager les membranes. A l'issue de cette étape, un numéro est attribué à la sonde.

79 Grands Fragments 79 III. HYBRIDATION SUR LES LIGNEES Paragraphe particulièrement axé projet Rat Quand ces choix sont faits, prendre les deux blots de lignées de l'hydrolyse désirée, ainsi que la réplique de la boîte dont est issu le fragment (voir Pb numérotation blots par exemple impairs-pairs : Proposition : les hydrolyses Hinf1, n 1, 3, 5, 7, 9 pour la grande partie de la famille, 2, 4, 6, 8, 10 pour la petite partie ; les hydrolyses HaeIII, 101, 103, 105 etc. pour la grande partie, 102, 104, etc. pour la petite..) NE PAS OUBLIER D'INCORPORER LE MARQUEUR DE TAILLE AU MOMENT DE FAIRE LA SONDE Le résultat de ces hybridations (un grand blot,un blot étroit, une réplique) doivent pouvoir tenir sur un seul film. Ce film comporte un numéro, la date, le numéro de la sonde, la stringence de lavage, le temps d'exposition, l'enzyme de digestion (HinfI ou HaeIII). L'inscrire dans la table des matières. IV. SAISIE DES DONNEES, ANALYSE DE SEGREGATION Paragraphe particulièrement axé projet Rat Pour chaque sonde, les données de ségrégation obtenues portent sur un ou plusieurs locus simultanément. On remplira les feuilles de ségrégation du type donné en annexe. Ces fiches comportent le numéro du film d'origine, le N du blot utilisé, l'enzyme, le N de la sonde, le numéro de la bande (de 1 à...), et sa taille estimée en Kb. Pour chaque individu, on indique si la bande est présente (2), absente, (1), ou illisible (0). Chaque feuille aura un numéro et une date, et on devrait pouvoir rentrer 30 systèmes par feuille environ. 1 est le "père" (BN), 14 la "mère" (SHR), les enfants sont dans l'ordre des dépôts. Les feuilles remplies pourront être saisies dans la base de données. Elles seront également conservées. En résumé : une sonde intéressante apparemment nouvelle : L'inscrire dans le tableau des sondes donne le numéro de la sonde Hybrider sur les lignées + réplique donne film, n Entrer dans table des matières films Entrer coordonnées clone cosmide dans tableau sondes Remplir la feuille de ségrégations Quand une feuille est remplie, saisir les données dans la banque, puis la mettre dans le classeur des feuilles, avec un numéro. Ensuite, ce fichier de données peut être converti en fichier pour analyse par LINKAGE. L'archivage comprend donc : 1- une boite 96 puits stockée à -80 C 2- un classeur avec les miniblots et le tableau des sondes (comporte n sonde, référence clone, n feuille de ségrégation) 3- un film hybridation sur lignées et réplique, dans une boîte avec table des matières. 4- un classeur (ou dossier) feuilles de ségrégation.

80 Grands Fragments une boîte commune d'inserts, portant la numérotation finale de la sonde.(tubes marqués en bleu) 6- une boîte commune de mélanges (tubes marqués en vert). ANNEXE 1: BUDGET D'UN PROJET DE CRIBLAGE DE COSMIDES ESTIMATION TTC Quantité Prix unitaire prix total Banque de cosmide: 1 existant dans le commerce: francs sur mesure: francs tubes stériles: ,2 F F ou microplaques 24 loges 8 FTTC 3000 F ou tubes en verre lavables sans frais mais intendance lourde plaques 96 ou 400 puits avec couvercle: F F films adhésifs 100 3,50 F 350 F boites carrées: 100 (ou 50) 2 F 200 F Combitip Biopur 2,5ml F 1400 F cure-dents ou rotofil F milieu: 25 litres MLS 500 ml glycérol pur Extraction : 10 litres d'isopropanol 100 F/l 1000 F 5 litres d'éthanol 800 tubes 50 ml 1 F 800 F tubes eppendorfs 2 ml et ordinaires (0.20 F pièce) 300 ml de phénol 300 ml de chloroforme 2 M de LiCl 20 mg de RNase A

81 Grands Fragments 81 Membranes: 100x10cmx11,5cm= environ 1 rouleau et demi 30cmx3m= environ 2300 F hydrolyses: HinfI: unités F HaeIII: unités F AluI unités F Analyses, marquages: 200 g agarose 1500 F 400 sondes testées (en comptant 1 par mélange): seringues 1 ml: radioactivité: 200 µl G75 tampon d'hybridation films Kodak 2 boites 35x43 Kits de marquage: 4 kits maison 400 F 2x F F Evaluer coût des 80 préparations de cosmides isolés, réhydrolyse, réhybridation, etc. enzyme, milieu, agarose, sondes compris dans estimations antérieures conclusions: principaux postes: tubes, enzymes. BUDGET TOTAL ENVIRON FTTC (en consommables uniquement)

82 Projet Levure 82 Fiche "projet levure : mesure des taux de mutation des levures minisatellites" DÉTERMINATION DU DEGRÉ DE STABILITÉ DU MINISATELLITE HYPERMUTABLE HUMAIN CEB1 INTRODUIT DANS LA LEVURE I. ETAT DE LA QUESTION A. Minisatellite hypermutable CEB1: mécanisme des mutations et questions Le minisatellite humain CEB1 présente un taux de mutation (gains et de pertes de motifs) de 13% en lignée germinale mâle et 0,4 % en lignée germinale femelle. Dans le soma, ce taux est inférieur à 0,7%. Deux tiers des mutations sont des gains de motifs contre un tiers pour les pertes. La nature de certains réarrangements (des expansions et des contractions) a été précisément déterminée: 3/4 des expansions sont dues à des duplications intra alléliques et 1/4 à des échanges inter alléliques. Ces "échanges" consistent en fait en des insertions d'une portion d'un allèle dans l'allèle homologue et font penser à un mécanisme de type "conversion génique non conservative". Nous avons proposé un modèle de mécanisme dans lequel la mutation est initiée par une cassure double brin décalée. Des prédictions de ce modèle restent à tester et des questions restent en suspens: - peut on préciser le mécanisme en caractérisant les 4 réarrangements des 4 produits de la même méiose? - quel est l'effet d'une identité entre les deux allèles (homozygotes)? - quels sont les gènes impliqués dans ces mécanismes? B. Modèle d'étude de l'instabilité: la levure La levure est l'organisme eucaryote pour lequel les mécanismes de la recombinaison homologue sont les mieux connus. On connaît en particulier de nombreux gènes impliqués dans les différentes étapes de ce processus. L'intégration d'adn étranger dans le génome de levure par recombinaison homologue est une technique connue depuis longtemps et effectuée en routine par les équipes qui travaillent sur cet organisme. Après la méiose, les 4 cellules produites (spores) restent groupées (tétrade) et il est possible de les isoler et de les cultiver. De plus, un minisatellite humain instable a déjà été transféré dans le génome de levure: le taux de mutation était augmenté d'environ 10 fois et des gains et des pertes de motifs ont été observés à peu près dans les mêmes proportions que chez l'homme. Parce qu'il semble le mieux adapté pour répondre aux questions en suspens, nous avons choisi cet organisme pour établir un modèle d'étude de l'instabilité de CEB1. Deux allèles ont été utilisés : un contenant 13 motifs (0,6 Kb) et l'autre environ 40 motifs (1,8 Kb). Ils ont été intégrés au même locus dans la même orientation par recombinaison homologue. Les deux souches haploïdes contenant chacune un des deux allèles ont été croisées : des souches diploïdes homozygotes (0,6/0,6 et 1,8/1,8) et hétérozygote (0,6/1,8) ont été obtenues. On les a fait entrer en méiose : les spores résultantes vont être analysées à partir des tétrades (Hélène Debrauwere, I. Curie) après qu'on ait estimé le taux de mutation après la méiose. Ceci va être réalisé au laboratoire de Génétique des Espèces par le dénombrement des allèles mutants observés à partir d'un nombre déterminé de spores. Les spores, ayant poussé sur une boite sous forme de colonies, vont être cultivées séparément. Les cultures seront regroupées par 20 ou 10,

83 Projet Levure 83 l'adn de ce mélange sera extrait et analysé par Southern blot (hydrolyse Hinf1 qui rajoute 260 pb d'adn levure flanquant = début de Arg4 et hydrolyse Rsa1 qui rajoute 300 pb) avec la sonde CEB1. II. PROTOCOLE MELANGES DE LEVURE : CULTURE ET EXTRACTION DE L'ADN A. Cultures 1. Ensemencer 2.4 ml de milieu YPD dans une cupule de microplaque avec environ la moitié d'une colonie isolée de environ 2mm de diamètre. Les cellules se dispersent grâce au morceau de rotofil et avec l'agitation de l'incubateur (230 rpm). 2. Laisser pousser au moins 24 heures à 30 C, 230 rpm dans l'incubateur agitant. (un agrégat de cellules doit s'être formé dans le fond du tube). 3. Réunir 24 ou 12 cultures (selon que la souche diploïde de départ est hétérozygote ou homozygote pour le minisatellite) en transvasant les cultures de 2 ml dans un tube falcon 50 ml. 4. Prélèvement de 1 ml dans chaque loge à l'issue de la culture (utiliser la multicanaux eppendorf avec 4 embouts; on peut disposer les embouts -bleu- sur un portoir à embouts d'origine eppendorf). Regrouper ces prélèvements dans une barquette avant transfert dans un tube. Par exemple : -Ensemencer 24 plaques de 24 (576 clones) -(distribuer le milieux avec la seringue de distribution. Compter 2 heures pour l'ensemble). -Mettre à agiter dans l'incubateur en maintenant les plaques (4 piles de 6) avec des tiges filetées et des élastiques. -Entourer l'ensemble avec un carton par exemple, pour éviter les courants d'air (et donc évaporation) particulièrement importante pour les cupules de bord. -Regrouper après culture par rangées de 24 (24 rangées) et par colonnes (24 colonnes) en prélevant 0.9 ml à chaque fois avec l'eppendorf multicanaux. -Rincer les embouts de la multicanaux une fois dans trois bechers d'eau successifs. -Faire attention à l'homogénéité de la culture : avant prélèvement dans une série de boites, agiter 10 minutes à 220 rpm sur le plateau du bain-marie New Brunswick. Le regroupement de l'ensemble (48 mélanges) prend 3 heures. Il reste environ 200 µl de milieu + levures par cupule. -Rajouter 600 µl de glycérol 40% en YPD par puits (final en glycérol : 30%). -Mettre à agiter 10 minutes sur le plateau du New Brunswick avant de congeler (-80 C) 5. OPTIONNEL: Si on n'a pas le temps d'extraire l'adn des mélanges aussitôt après ce regroupement, rajouter 1 volume d'alcool technique plus 1/20 ième de volume d'edta 0,5 M (soit 20 ml d'éthanol et 1 ml EDTA pour 20 ml de culture et stocker à -20 c.

84 Projet Levure 84 Pour chaque croisement : 1000 spores 1000 diploïdes 500 chaque haploïde B. Extraction de l'adn Voir fiche. C. Analyse des ADN Southern blots : Hydrolyses des échantillons 1- Avant tout prélèvement d'adn de la rpm 1 ou 2 minutes. 2- Hydrolyser 1200 ng (pour les hétérozygotes, mélanges de 24) ou 600 ng (pour les homozygotes, mélanges de 12) d'adn par Hinf1 (5U soit 0,5 µl par hydrolyse) et, d'autre part, par Rsa1 dans 20 µl total. 3- Incuber au moins 4 h à 37 c (ou la nuit si çà tombe bien). 4- Déposer 10 µl (2µl de bleu) sur un petit gel 1% pour contrôler l'hydrolyse. Alternative : hydrolyse HinfI seule. Gel 1% agarose de 40 cm Si l'hydrolyse semble correcte couler un grand gel pour faire le Southern blot : 1- Mettre dans un erlenmeyer de 1l : 4g d'agarose et 400 ml de TAE MilliQ 2- Remuer pour homogénéiser. Peser l'ensemble et noter le poids. 3- Chauffer jusqu'à ébullition (environ 3 min) au micro-ondes (puissance max). 4- Peser, déduire la perte d'eau due à l'évaporation et remplacer par autant d'eau MilliQ. 5- Mettre un barreau aimanté et laisser refroidir sur agitateur magnétique jusqu'à 68 c. 6- Couler le gel avec peigne 40, 30 ou 20 dents. Dépôt et migration Rincer les loges avant le dépôt. Déposer les échantillons. Ne pas oublier le marqueur de taille (100 ng de 1 Kb ladder) à déposer dans plusieurs loges. Migrer avec recirculation 130 V OVN. Le lendemain enlever le quart supérieur du gel et mettre le reste à colorer dans le bain de BET (25 µl de BET 10mg/ml dans 500 ml d'eau osmosée) au moins 30 min. Photographier avec règle.

85 Projet Levure 85 Transfert par le vide Voir Fiche p.45 BUDGET : pour 576 clones analysés : 24 plaques 6FHT 150 FHT 50 Falcon +100 eppendorf 70 FHT zymoliase 75 mg 150 FHT HinfI 250 u 25 FHT Membrane 120 FHT 2 films Fugi (une réexpo) 10 FHT divers agarose, microplaque pour hydrolyse etc 50 FHT TOTAL Prévision pour clones 580 FHT FHT

86 Cartographie de cosmides par hydrolyse partielle 86 Fiche "cartographie de cosmides par hydrolyse partielle" DIGESTION PARTIELLE DES COSMIDES POUR LA CARTOGRAPHIE DE RESTRICTION Pour des cosmides construits avec le vecteur PWE15 ou SuperCos1 Digestion par EcoR1 Digérer 5µg du cosmide par NotI en tampon3 + BSA (Biolabs) dans 100µl. Répartir les 100µl dans 5 tubes Eppendorf 1,5 ml de la façon suivante : 30µl dans le 1 er, 20 dans les trois suivants et 10 dans le dernier. Mettre dans la glace. Ajouter 10 unités d'enzyme EcoR1 (biolabs) dans le 1 er tube. Mélanger puis transvaser rapidement 10µl du 1 er tube dans le 2 ème, 10 du 2 ème dans le 3 ème et ainsi de suite en changeant de cône à chaque fois. Laisser 15 minutes dans un bain-marie à 37 C puis mettre dans la glace. Ajouter 2µl d'edta 0,5 mm. Faire migrer dans un gel d'agarose 0,8% de 40 cm. Digestion par BamH1, BglII ou HindIII : Même protocole mais digérer par NotI dans 85µl répartis de la façon suivante : 30, 20, 20, 20 et 10µl. Transvaser 5µl de tube en tube. Faire également une digestion complète avec l'enzyme seule. Le transfert sur membrane de nitrocellulose et l'hybridation des hydrolyses partielles avec les oligonucléotides T3 et T7 séparément permettent de déterminer l'ordre des fragments de restriction pour chaque enzyme à partir du vecteur. T3 et T7 hybrident entre les sites Not1 et EcoR1 aux deux extrémités du vecteur de clonage. Marquage des oligonucléotides à la terminale transférase : mettre dans l'ordre : oligo : 50 pmoles Tampon Tdt 5X (Boehringer) : 7,5 µl dctp 32 : 2µl H 2 O : qsp 50µl Tdt : 1µl CoCl 2 (décongeler extemporanément) : 1µl Incuber 30 minutes à 37 C. Hybrider en PEG/SDS 7%/10% à 42 C pendant la nuit. Laver en 1SSC/0,1%SDS à 42 C. Exposer la journée à -80 C.

87 Purification de Taq polymérase 87 Purification de Taq polymérase Stage Fabienne Compilé par GV le 11/4/97 Références : nos références endnote #1672 (protocole détaillé), #1584 (article d'origine Engelke et al.), #1599 (article avec utilisation de la souche BL21, sensible à congélation-décongélation), #1718 (Abstract Barnes montrant l'interêt de la délétion de la région N-terminale de la protéine). Voir également le rapport de stage de Benoît Corbrejaud, ref # Objectif : remplacement de nos commandes Biotaq (budget annuel Francs pour l'équipe, et approvisionnement peu fiable). Cette polymérase sans activité 5'--3' exonucléase est adaptée à la séquence type Sanger, avec incorporation de didéoxynucléotides comme terminateurs. La délétion a été réalisée par Claude Gazin (Hop. St Louis, Paris) à partir du sous clone qui nous a été fourni par Jörn Walter (MPIMG, Berlin). Protocole à partir de la souche BL21 : (D'après #1599, diffère de #1672 par concentration ampicilline, 100 au lieu de 50 µg/ml, chloramphénicol, pour cette souche, et DO avant IPTG, 0,4 au lieu de 0,2. Rajout de 0.005% de gélatine, comme dans #1672) 1- Inoculer 50 ml de milieu 2xYT µg/ml ampicilline + 35 µg/ml chloramphénicol dans un erlen de 250 ml ou 500 ml, avec une colonie isolée, et incuber sous agitation 200 rpm, la nuit à 37 C (1 ml de solution stock chaque antibiotique pour 1 litre de culture) 2- Inoculer 10 ml de cette culture dans un litre de milieu 2xYT avec ampicilline et chloramphénicol, comme précédemment, et continuer l'incubation jusqu'à une DO 600 de 0,4. 3- Ajouter IPTG à une concentration de 0.5 mm final. (500 µl d'une solution stérile 1 M pour 1 litre de culture) 4- Continuer la culture la nuit. 5- Centrifuger et reprendre le culot dans 1/20 de volume (50ml pour un litre) de solution A (50 mm Tris ph 7.9, Glucose 50 mm, EDTA 1mM). 6- Congeler le culot à -80 C 7- Décongeler dans bain-marie à 75 C 8- Recommencer une fois le cycle congélation-décongélation. 9- Centrifuger rotor swinging rpm tubes polypropylène 30 minutes. 10- Titrer l'enzyme dans le surnageant par extension de primer sur une gamme et par PCR CEB1 levure et comparaison avec Taq Benoît et Biotaq. 11- Dialyser OVN à 4 C contre (20mM HEPES ph 7.9, 100mM KCl, 0.1 mm EDTA, 0.5 mm PMSF, 1mM DTT, 50% glycérol) avant stockage à -20 C (ou -80 C). 12- Titrer produit de dialyse. Le protocole #1672 contient passage sur Biorex70 A prévoir également : miniprep sur sous clones XL1 pour conservation long terme et électroporation DH5.

88 Bureautique 88 Bureautique Comparée à notre installation Nantaise, nous bénéficions maintenant d un environnement et d assistance beaucoup plus importante : cellule Bioinfo, courrier sur vax, genbase sur station sun, maintenance storm, matériel commun photologie, imprimantes communes, scanners. A échéance automne 98, troisième PC et graveur de CD. Nous abandonnerons alors les Mac, qui pourraient par exemple être installés dans la pièce bureau pour servir aux étudiants en phase de rédaction de thèse (ceci sous réserve d acceptation par l ensemble du bâtiment bien entendu). L essentiel de nos ressources locales et besoins seront alors couverts par : Pack office pro (word, excel, powerpoint, access) Imagequant, Iqtools, Fragment NT (pour Storm) Genbase (implanté sur SUN et accessible par pc iech2) Endnote (bibliographie) En ressources extérieures, infobiogen fournit énormément de logiciels sous UNIX. L ouverture d un compte est gratuite.

89 Annexe tampons solvants 89 préparation des tampons et solvants couramment utilisés. appareillage PCR

90 Annexe tampons solvants 90 Préparation des tampons et solvants SOLVANTS Phénol : Il est liquéfié à 65 C, bouchon débloqué, puis saturé et neutralisé tout d'abord avec une solution Tris ph 8 1 M (mélanger, laisser reposer, éliminer la phase aqueuse, recommencer une fois). Pour finir, remplacer la phase aqueuse par une solution Tris ph : 8 ;10 mm, EDTA 1 mm (T.E.). Vérifier que le ph obtenu pour la phase aqueuse est supérieur à 7.6. Conserver le phénol dans des bouteilles de verre marron, à 4 C. Il est commode de colorer la phase phénolique (utiliser 0.1% de 8-hydroxyquinoline). Ce colorant jaune est un antioxydant et inhibe partiellement les RNases. Toujours manipuler le phénol sous hotte chimique avec des gants et des lunettes (en cas de contact avec la peau, laver abondamment à l'eau puis rincer à l'éthanol). Remarque : un grand nombre de fournisseurs vendent désormais le phénol déjà saturé. Chloroforme-isoamylalcool : cette solution est obtenue directement par mélange de 24 volumes de chloroforme avec 1 volume d'isoamylalcool. Elle est conservée en bouteille fermée à température ambiante. Butanol (1 ou 2) : le butanol peut être utilisé tel quel pour réduire les volumes de phase aqueuse (concentrer une solution d'adn). Lorsqu'il est utilisé pour extraire le bromure d'éthidium d'une solution de chlorure de césium, il faut éviter de concentrer les sels. Pour ceci le butanol est préalablement saturé avec une solution de T.E. La solution saturée est conservée à température ambiante (armoire située sur le pallier). SOLUTIONS COURANTES (eau ultrapure) Tris Acétate (TAE) 50 x: Tris base 242 g acide acétique 57.1 ml EDTA 0.5 M 100 ml H 2 O qsp 1 litre Tris-Borate (TBE) 5 x: Tris base 540 g acide borique 275 g EDTA Na 2 37 g H 2 0 qsp 10 litre Donne ph 8.3 (sinon ajuster avec de l'acide borique) Tris-Phosphate (TPE) 10 x: Tris base 108 g acide phosphorique 15,5 ml Na 2 EDTA 7,4 g H 2 O qsp 1 litre 20 x SSC: NaCl 174 g citrate de sodium 88.2 g H ml ajuster le ph à 7.0 avec de la soude puis compléter le volume à 1 litre.

91 Annexe tampons solvants 91 tampon de dépôt d'adn (10x) : d'après Sambrook et al. 0.25% bleu de bromophénol 0.25% xylène cyanol 50% glycérol complément en TE pour 20 ml : dissoudre 50 mg de xylène et 50 mg de bleu de bromophénol dans 10 ml de TE et compléter à 20 ml avec du glycérol (en versant directement) tampon Ficoll pour Southern génomique entraineur acrylamide Plusieurs types d'entraîneurs existent, les plus connus sont le glycogène, dextran T40, et acrylamide. Ce dernier est le moins coûteux. Il est constitué par polymérisation d'acrylamide sans le bisacrylamide. solution d'acrylamide 5% rajouter TEMED et APS (ammonium persulfate) comme pour un gel d'acrylamide exemple : 0,5 g acrylamide ultrapure 10 ml H 2 O 20 µl temed 20 µl APS 10% Laisser polymériser. L'entraîneur s'utilise à concentration de l'ordre de 50 µg/ml de phase aqueuse à précipiter (ou qté suffisante pour voir un culot). Le stock 5% est donc 1000x concentré. 20% SDS Sodium Dodécyl Sulfate 400 g H litre Chauffer à 68 C H 2 0 qsp 2 litres Manipuler sous hotte! En pratique : flacon de 250 g, ajouter 1,025 l eau milliq préchauffée laisser dissoudre avec barreau magnétique et agitation la nuit. Acétate d'ammonium 7,5 M Acétate d'ammonium 289 g H ml Filtrer à la pompe à vide PH : 7.5 EDTA 0.5 M ph 8 EDTA di Sodium g H ml Agiter fortement la solution (ne se dissous qu'à partir de ph : 8) Ajuster le ph à 8 avec NaOH puis compléter le volume à 1 litre.

92 Annexe tampons solvants 92 MgCl 2 1M MgCl 2, 6 H ,33 g H 2 O qsp 100 ml Autoclaver la solution 20 min. à 120 C MgSO4 1M MgSO 4, 7H 2 O 24,6 g H 2 O qsp 100ml Autoclaver la solution 20 min. à 120 C Glucose 2M 36g/100 ml filtrer 0.22 µm NaCl 5M NaCl (Genapex) g H litre Autoclaver la solution 20 min. à 120 C Tris-NaCl ph 7.5 Tris g NaCl 87 g H ml Ajuster le ph à 7.5 puis compléter le volume à 1 litre. Autoclaver la solution 20 min à 120 C. SOLUTIONS A B C ET RNase POUR EXTRACTION DE PLASMIDES ET COSMIDES Solution A glucose 50mM sola x 10 4,5g EDTA 10mM 10ml 0,5M Tris-HCl ph 8,0 25mM 6,25ml 2M H 2 O qsp 50ml. Filtrer 0,2micron Solution B NaOH 0,2M 1ml 10M (à faire le jour même) SDS 1% 2.5ml 20% H2O qsp 50ml (Pour obtenir 10 ml de solution B, ajouter 100 microl. de soude 10M et 250 microl. de SDS 20% à 9.5 ml de T.E.) Solution C acétate de potassium (5M final) 150g H 2 O 167 ml acide acétique qsp 500ml solution finale ph 4.8 RNAse A pour 1ml, peser 10 mg de RNAse A (10 mg/ml) faire bouillir 10 min au bain-marie

93 Annexe tampons solvants 93 Tampons de préhybridation et d hybridation CHURCH (d'après Church et Gilbert, PNAS 1984, vol. 81, p ) 2% SDS (ADN) ou 5% SDS (ARN) 0.45 M Na 2 HPO 4 ph 7,2 0.5% lait écrémé 1 mm EDTA Pour 1 litre: SDS 20% 100 ml ou 250 ml Na 2 HPO 4 1M 450 ml Lait 5 g (le dissoudre préalablement dans de l eau) EDTA O.5M. 2 ml H 2 0 qsp 1 litre BLONDEN (NAR volume 17 n 14) Na 2 HPO M NaCL 0.25M SDS 2% PEG % EDTA 1mM Pour 1 litre: Na 2 HPO 4 1M 125 ml NaCL 5M 50 ml SDS 20% 100 ml PEG g EDTA 1M 2 ml H 2 O qsp 1 litre Solution de Na 2 HP0 4 -ph ; 7,3-1M Pour 1 litre Na 2 HPO 4, 12 H 2 O 358 g dissoudre dans 800 ml d'eau en chauffant puis amener à ph : 7,3 avec de l'acide phosphorique (environ 10 ml) puis qsp 1 litre avec H 2 O

94 Annexe tampons solvants 94 Milieux de culture pour bactéries ou levures milieu minimum M9 glucose avec thiamine: Ce milieu permet la propagation de bactéries TG1 (ou JM101) sans perte du pilus sexuel nécessaire à l'infection par M13. Na 2 HPO 4, 6H 20 14,3 g (si 2 H 2 O, 10.2 g) KH 2 PO 4 3 g NaCl (Genapex) 0.5 g NH 4 Cl 1 g agarose 15 g H 2 O qsp 1 litre ajuster le ph à 7.4, passer à l'autoclave (15 minutes à 110 C), laisser refroidir, et ajouter MgSO 4 1M 2 ml glucose 20% 10 ml CaCl 2 1 M 0.1 ml Thiamine 0.01% (vitamine B1) solutions stériles milieu riche (LB): tryptone 10 g extrait de levure 5 g NaCl (Genapex) 10 g H 2 O 800 ml ajuster le ph à 7.5 avec de la soude et compléter le volume à 1 litre Autoclaver 30 min à 120 C milieu "super" (MLS ou TB) : Pour une préparation de 2 litres solution I tryptone 24g yeast extract 48g glycerol 10 ml H 2 O qsp 1800 ml solution II K 2 HPO 4 25g KH 2 PO 4 4,6 g H 2 O qsp 200 ml Stériliser à l'autoclave dans des bouteilles séparées. Pour un flacon contenant 900 ml de solution I en faire un contenant 100 ml de solution II, etc. on obtient alors par exemple 500 ml de milieu en mélangeant une bouteille de 450 ml de solution I et une de 50 ml de solution II. Pour couler des boites de Petri, ajouter à ces milieux, avant de passer à l'autoclave, 16 g/l d'agar. Pour de la gélose molle (étalement de phage M13), n'utiliser que 7 g/l d'agar.

95 Annexe tampons solvants 95 Milieu SOB Bacto-tryptone 20 g xtrait de levure 5 g NaCl 5M (Genapex) 2 ml KCl 1M 2.5 ml H 2 O qsp 800 ml Ajuster à un ph : 6.9 Autoclaver la solution 30 min à 120 C, puis ajouter: MgCl 2 1M 10 ml MgSO 4 1M 10 ml H 2 O qsp 1 litre Ces solutions sont stériles Milieu SOC Tryptone Extrait de levure NaCl 5M H 2 O pour 160 ml KCl 250 mm NaOH pour ph : 7 H 2 O qsp 200 ml 4 g 1g 0.1 ml 2 ml Milieu YT Bacto- tryptone 8 g Extrait de levure 5 g NaCl 5 g H 2 O qsp 1 litre Autoclaver 20 min à 120 C Milieu 2YT Bacto- tryptone 16 g Extrait de levure 10 g NaCl 5 g H 2 O qsp 1 litre Autoclaver 20 min à 120 C Gélose MGM Bacto-tryptone 10 g Extrait de levure 5 g NaCl 10 g Agar 7 g H 2 O 800 ml Ajuster le ph à 7.5 et compléter le volume à 1 litre. Milieu YPD (Levure) pour 500 ml: 5 g yeast extract 10 g bacto peptone 10 g glucose 500 ml H 2 O MilliQ Ajouter d'abord un peu des 500 ml d'eau, bien mélanger jusqu'à homogénéisation, puis ajouter le reste des 500 ml. Autoclaver 30 min à 120 c. Pour couler environ 25 boites YPD, rajouter 10 g d'agar pour 500 ml.

96 Annexe tampons solvants 96 SOLUTIONS STOCK D'ANTIBIOTIQUES SOLUTIONS STOCK D'IPTG ET D'X- GAL Ampicilline: 100 mg/ml à dissoudre dans l'eau. utilisé à des concentrations finales variant de 50 µg/ml (cosmides) à 150 µg/ml (Blue Scribe). Tetracycline: 20 mg/ml à dissoudre dans l eau additionnée d éthanol ou d'acide chlorhydrique. La tétracycline est sensible à la lumière, conserver les stocks ou les boites à l'obscurité. utilisé à des concentrations finales allant de 7.5 µg/ml à 15 µg/ml. Kanamycine : 25 mg/ml à dissoudre dans l'eau. Utiliser à concentration de 10 à 35 µg/ml. (Pour les PACs : 35µg /ml final) Les solutions Xgal et IPTG s'utilisent avec certains plasmides et phages M13 et permettent de distinguer les clones porteurs du vecteur seul de ceux qui contiennent un insert. Le vecteur seul donne des colonies bleus. IPTG (isopropylthiogalactoside): stock 2 % dans l'eau X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside): stock 2% (20mg/ml) en diméthylformamide (tube en verre). Ces solutions stock peuvent être conservées plusieurs semaines à -20 C dans l'obscurité. Utiliser 40 µl. de chaque solution pour une boite ou un étalement M13. SOLUTIONS POUR KITS Référence des nucléotides pour préparer kit de séquence et kit de random priming et RT- PCR. Nucléotides Pharmacia dntp set ddntp set Ribonucléotides Pharmacia

97 Annexe tampons solvants 97 Préparation des mini-colonnes SEPHACRYL S300 (Elimination de l'arn) Préparation de la colonne: - Retirer le piston de la seringue, et l'utiliser pour placer un tampon de coton de verre siliconé au fond - Remplir la seringue de Séphacryl S300, centrifuger à 2000 rpm pendant 2 min. en centrifugeuse à portoirs balançant. - Compléter à 0,5 ml et conserver la colonne à +4 C en la bouchant avec la partie en caoutchouc du piston. - Centrifuger, par exemple, dans des tubes Falcon 2059 de 15 ml. Utilisation: - Retirer le bouchon - Laver 2 à 3 fois la seringue avec de l'eau en centrifugeant à 2000 rpm pendant 2 min. - Centrifuger une dernière fois à 2000 rpm pendant 2 min pour vider la colonne. - Déposer 40 µl de TE dans la seringue, centrifuger 2 min. à 2000 rpm - Vérifier que le volume élué est de l'ordre de 40 µl., sinon recommencer. - Déposer les 40 µl de préparation. rapide, après avoir fait une RNAse (40 µl d'adn + 1µl de RNAse à 10 mg/ml et incuber 15 min. à 37 C), et mettre au fond du tube falcon un tube eppendorf après en avoir coupé le bouchon. - Centrifuger 2 min. à 2000 rpm. Eventuellement, recommencer l'opération sur une 2 ème seringue. SEPHADEX préparation du séphadex : - Peser 10 g de poudre séphadex G75 et la verser dans 300 à 400 ml du tampon souhaité (T.E., eau...) -Laisser le séphadex gonfler selon les instructions du fournisseur: (G25, G50: 3 heures à 20 C, 1 heure à 90 C; G100: 72 heures à 20 C, 5 heures à 90 C). Quand on veut de manière plus générale utiliser un sephadex pour un dessalage, et si la quantité de sels est importante, il peut être nécessaire de dégazer le séphadex. préparation d'une colonne pour centrifugation - Retirer le piston de la seringue, et l'utiliser pour placer un tampon de coton de verre siliconé au fond. - Remplir la seringue de G50, centrifuger à 2000 tpm pendant 2 min. en centrifugeuse à portoirs balançants, compléter de nouveau avec du G50 et recommencer jusqu'à ce que le G50 arrive à 5 mm environ du haut de la seringue après centrifugation. Conserver la colonne à 4 C en la bouchant avec la partie en caoutchouc du piston. centrifuger par exemple dans des tubes Falcon 2059 de 15 ml.

98 Annexe tampons solvants 98 utilisation: - Retirer le bouchon, déposer 100 µl. de tampon dans la seringue, centrifuger 2 min. à 2000 rpm, vérifier que le volume élué est de l'ordre de 100 µl. sinon recommencer. - Déposer la sonde marquée diluée à 100 µl. au haut de la seringue, et mettre au fond du tube Falcon un tube eppendorf après en avoir coupé le bouchon. Centrifuger 2 min. à 2000 rpm. Les nucléotides libres restent dans la colonne Il peut arriver des problèmes de lot de G75 (se manifeste par non coulage de la colonne). Boudins de dialyse : 10 mm bicarbonate de sodium (ou Tris 10mM, EDTA 10 mm). laisser hydrater 1 heure 60 C ou bouillir. rincer conserver en 10 mm EDTA à 4 C TNE x10 pour fluorimètre : TNE 10x est : tris 0.1 M, EDTA 10 mm, NaCl 2 M, ph 7.4 (ph avec HCl). Filtrer, et garder à 4 C jusqu'à 3 mois. Pour 1 litre Tris 1M ph7.4 EDTA 0.5M NaCl 5M H2O qsp 1 litre 100 ml 2ml 400 ml

99 Quelques données utiles Taille de Génomes (paires de bases/génome haploide) : Lambda Drosophila m E. coli Souris Saccharomyces c Homme Résolution des gels Agarose Acrylamide (non dénaturant) Acrylamide (dénaturant) (%) séparation (kb) % taille (bp) migration bbp % taille (bp) Xylène cyanol à à bp bp à à à à à à à à * 0.01 à 0.5 *mélange Nusieve+agarose Radioactivité : Quantités d'adn 1 Becquerel (Bq) = 1 désintégration/seconde 1 Ci (Curie) = Bq = dpm 1µCi = Bq = dpm 1µl dctp 3000Ci/mMole = 3,3 pmole 1 paire de bases : 649 Da (moyenne) 1 µmol pbr322 (4363bp) : 2.83 g 1pmol d'extrémités 5' de pbr322 linéarisé : 1.4 µg 1 picomole d'oligonucléotide = longueur/3 ng (1 picomole de 24 mer = 24/3 = 8 ng) 100 fmoles (10-12 ) d ADN double brin = 66x (taille en kb) ng (100 fmol puc = 66x2.7 = 178 ng) 1 génome humain haploïde = daltons