Ionisation Chimique à Pression Atmosphérique

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1 UNIVERSITE D ANGERS Institut Supérieur de la Santé et des Bioproduits d Angers 16, Bd Daviers, ANGERS Cedex L2 Ingénierie et Management de la Santé Spectrométrie de masse Ionisation Chimique à Pression Atmosphérique & Quadrupole detector Colonier Thomas Domen Robin Guérin Nathan Année le 5 Juin

2 I. Principes d une spectrométrie de masse... 1 A. Spectrométrie de masse... 1 B. Spectromètre de masse... 1 II. Eléments particuliers du système APCI... 3 A. Source d ionisation APCI... 3 B. Les analyseurs quadrupoles... 4 C. Détecteur... 5 III. Application... 6 IV. Résumé de la source APCI et comparaisons... 7

3 I. Principes d une spectrométrie de masse A. Spectrométrie de masse C est une balance moléculaire : elle mesure des rapports masse-sur charges (m/z) de molécules ionisées à l état gazeux et de leurs produits de fragmentations (1). On peut récupérer plusieurs informations grâce aux spectres de masse générés par un spectromètre de masse : La masse moléculaire grâce à la valeur du rapport m/z du pic moléculaire (Fig 1 et 3) Informations sur la structure grâce aux pics de fragmentation (Fig 1) Information sur la composition élémentaire grâce à la précision de mesure (Fig 2) Figure 1 : Spectre type obtenu à l issue d une spectrométrie de masse ; en rouge : pics fragments informant sur la structure du composé ; en bleu : pic informant la masse moléculaire moyenne du composé. Figure 3 : Spectre de masse ; La masse monoisotopique correspond au premier pic P. Le composé s y trouvant est constitué des atomes les plus stables ( 12 C, 1 H, 16 O, 32 S, 14 N, 35 Cl, ). Figure 2 : Spectre de masse ; la masse moyenne est représentative du profil isotopique du composé. B. Spectromètre de masse 1. Complexe général d un spectromètre de masse Le spectromètre de masse aura des performances différentes en fonction du but recherché. Ainsi, on fera varier le mode d ionisation, le type d analyseur et/ou le genre de détecteur (Fig 4). 1 P a g e

4 Figure 4 : Schéma d un Spectromètre de masse ; Composé d une source d ionisation, d un analyseur, d un détecteur traitant les données perçues et d un enregistreur. 2. Principe d Ionisation : exemple avec la Ionisation Chimique L ionisation chimique (CI) est basée sur les mêmes principes que l impact électronique (EI). Il s y ajoute cependant une étape intermédiaire. L enceinte étant sous vide dans le cas de l EI, elle est remplie d un gaz réactif (réactant) dans le cas du CI (Fig 5). La source d ionisation a deux objectifs dans un système de spectrométrie de masse : Volatiliser : la source doit permettre le passage de l état de matière condensée à un état gazeux (système où les composés sont liquides ou semi-solide). Ioniser : Transformer les molécules en ions, produire des espèces chargées car l analyseur fonctionne grâce à des champs électriques. Figure 5 : Schéma représentatif du complexe de source d ionisation d un système CI ; l échantillon est déposé et va être ionisé par le faisceau d électron pareillement aux gaz réactant. Les ions ainsi produits vont être ensuite pris en charge par un analyseur. Figure 6 : Exemple de spectre de masse de la benzophénone obtenu par ionisation chimique. 2 P a g e

5 II. Eléments particuliers du système APCI A. Source d ionisation APCI Les composés, ou analytes, sont en phase liquide et sont introduits dans un nébuliseur pneumatique à azote par biais d une sonde à admission directe, ou par le couplage de la méthode APCI avec un système HPLC. Le nébuliseur va permettre la transformation du composé sous forme aérosol dans une chambre appelée «vaporiseur». Cette chambre est chauffée à des températures importantes (entre 350 C et 500 C). Si le système APCI est couplé à une chromatographie en phase liquide, l effluent de la colonne de chromatographie (solvants+analytes) est évaporé dans le vaporiseur. Il se combine avec le gaz nébuliseur (gaz de transport) pour transférer les composés vers l électrode à décharge couronne faite d une aiguille et d une chambre de nébulisation servant de contre-électrode. Une différence de potentiel important (entre ±3 et ±6 kv) est exercée sur cette électrode corona. Une décharge couronne (décharge électrique lumineuse) de ~2-3 μa est ainsi provoquée (Fig 7). Cette décharge électrique procure une source continue d électrons pour le processus d ionisation en APCI. L air ambiant est ionisé créant un plasma, autrement dit un gaz ionisé, autour de la pointe de l aiguille de l électrode. Les ions radicalaires dégagés du plasma (H3O + ou MH + ), permettent les réactions chimiques qui ionisent les molécules des analytes (2). Figure 7 : Phase d ionisation de l APCI ; une première étape consistant à vaporiser le liquide, une deuxième pour ioniser les analytes, et une dernière pour transférer les ions à l analyseur. Figure 8 : Source APCI ; l électrode corona est identifiable 3 P a g e

6 B. Les analyseurs quadrupoles 1. Quadrupole mass Detector a) Principe Le quadrupole mass detector ou analyseur quadripolaire est un analyseur de masse utilisé en spectrométrie de masse, particulièrement en APCI. Il est constitué de quatre électrodes métalliques parallèles raccordées électriquement deux à deux (deux chargées positivement et deux chargées négativement). La stabilité des ions circulant dans le quadrupole dépend des amplitudes du voltage (U) et du voltage (V0) (fig 9 et 10). Figure 9 : Lois mathématiques définissant le fonctionnement d un quadrupole mass detector ; RF : Radiofréquence Figure 10 : Balayage des ions dans l analyseur Figure 11 : Détecteur Quadripolaire à échelle humaine b) Caractéristiques d un quadrupole : Résolution: faible (1000 max) Gamme m/z: limité (0-4000) Vitesse de balayage: 5000 Da/s max Deux modes de détection: - fullscan : Balayage d une gamme de masse (de 50 à 500 Da par exemple). On observe la totalité des ions formés dans cette gamme. - SIM ou SIR (Single Ion Monitoring ou Recording) : Le quadripôle fonctionne en filtre de masse réglé pour ne laisser passer que les ions d un rapport m/z donné. Méthode plus sélective et plus sensible que le fullscan. C est le mode utilisé pour la quantification. c) Avantages/désavantages Avantage: - Analyseur simple, peu couteux - Peu encombrant - Analyse ciblée (SIM / SIR) Inconvénients: - Faible résolution - Limité en gamme de masse 4 P a g e

7 2. Le piège ionique quadripolaire : appliqué en APCI Le piège à ion est également utilisé en APCI. Ce détecteur est composé de 3 électrode : une «annulaire», et deux dits «chapeau». Cet analyseur a la capacité de faire une analyse tridimensionnelle en variant les tensions en radiofréquence, et les tensions continues entre les électrodes (Fig 12). C. Détecteur Figure 12 : Schéma de la trajectoire des ions dans un piège ionique (en vert) Le détecteur sert à mesurer le nombre d électrons et à amplifier le signal pour obtenir une bonne sensibilité. Le plus fréquemment utilisé est un multiplicateur d électrons (tubes en verre dopés au plomb) (Fig 13). Ensuite le signal est enregistré et un spectre de masse est produit (1). Figure 13 : Principe schématique du multiplicateur d électrons 5 P a g e

8 III. Application Analyse de composés liées aux préoccupations environnementales, pharmaceutiques (pesticides, hydrocarbures polyaromatiques, médicaments, etc.).nous prendrons l exemple de la détection en LC- APCI-MS, couplage d un HPLC, d une source APCI et d un spectromètre de masse, de la molécule de β-estradiol et de ses métabolites dans l urine humaine. L estradiol est hormone utilisée dans le traitement des troubles de la ménopause (4). Colonne C18 (250 x 4.6mm). Solvants: A: eau; B: acétonitrile; 0 à 7 : 2%B; 7 à 40 : 2 à 100%B ; 1 ml/min; 25 μl injecté (Fig 14, 15 et 16) Figure 14 : Chromatographe de l élution de l estradiol et de ses métabolites Figure 15 : tableau récapitulatif des analytes sortant de la colonne C18 en fonction du temps ; L epiestriol est détecté par exemple à 23.6 min, on fait une analyse de spectrométrie de masse par APCI pour déterminer précisément sa masse m/z. Figure 16 : Le graphique obtenu par spectrométrie de masse donne la masse moyenne de l epiestriol M=288 m/z. 6 P a g e

9 IV. Résumé de la source APCI et comparaisons Méthode d ionisation idéale pour les composés moyennement polaires non volatile, de masse < 2000 Da (composés ni acides, ni basiques: alcools, aldéhydes, esters, cétones, hydrocarbures aromatiques ) (Fig 17) Méthode parfaitement compatible avec un couplage avec la chromatographie liquide (phase normale/inverse) avec des débits 200uL/min à 2mL/min Couplage direct possible avec des colonnes HPLC 2.1mm et 4.6mm Limite de détection < 1 à 500 pmol/ml Méthode complémentaire de l electrospray (ESI) car elle est mieux adaptée aux composés peu polaires (contrairement à l electrospray) (Tab 1) Possibilité de ions produits : [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, [M-H]- Figure 17 : Caractéristique d APCI en termes de polarité et de Pw des analytes vis-à-vis des autres méthodes APCI Nébulisation de la solution Pneumatique + chauffage Sous l action d un champ électrique Production des ions 1. Transfert d espèces neutres en phase gazeuse 2. Réactions ions-molécules en phase gazeuse initiées par une décharge Corona 1. Microgouttelettes chargés 2. Evaporation du solvant Explosions en cascade 3. Evaporation ionique ou Ion résiduel Type d ions Ions Monochargés Ions Multichargés Tableau 1 : Comparaison des méthodes APCI et ESI ESI 7 P a g e

10 1. Technologies disponibles. Valette, Gilles. s.l. : Université Montpellier. 2. Ionisation chimique à pression atmosphérique (APCI). [En ligne] 14 mars [Citation : 2014 juin 03.] 3. FICHE TECHNIQUE 27 : Spectrométrie de masse (MS et MS/MS). Catherine Zimmermann, André Deom, Dagmar Kessele. Chêne-Bourg : CSCQ, LES TECHNIQUES D IONISATION A PRESSION ATMOSPHERIQUE APCI, APPI, DESI, DART ET QUELQUES VARIANTES. BUCHMANN, William. La Bresse : Université d Evry, CJSM BUCHMANN. 5. Spectrométrie de masse. [En ligne] 11 mars [Citation : 03 juin 2014.] 6. Mass Spectrometry Introduction. [En ligne] [Citation : 2014 juin 03.] 7. Atmospheric Pressure Ionization (API). [En ligne] 8 P a g e

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