Mise en évidence des agents infectieux par Biologie Moléculaire

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1 UE de l agent infectieux à l hôte Février 2015 Mise en évidence des agents infectieux par Biologie Moléculaire Dr Isabelle GARRIGUE UMR CNRS MFP Microbiologie Fondamentale et Pathogénicité isabelle.garrigue@chu-bordeaux.fr

2 DIAGNOSTIC INDIRECT DIAGNOSTIC DIRECT détection AC sérologies western-blot agent pathogène complet à l oeil nu (parasites) au microscope (optique, électronique) après culture (colonies, ECP, spectrométrie de masse) recherche de protéines détection d antigènes diagnostic moléculaire ADN, ARN

3 Echantillons pour le diagnostic moléculaire Directement à partir des prélèvements de patients écouvillons : plvts cutanéo-muqueux, orifices, sécrétions.. tube ou flacon stérile contenant urines selles liquide céphalo-rachidien, gastrique, broncho-alvéolaire amniotique, pleural biopsies.. sang sur tube sec ou EDTA* (jamais d'héparine) sérum sang total cellules plasma A partir d agents pathogènes déjà cultivés au laboratoire culture sur gélose (bactéries, champignons) culture cellulaire (virus) *EDTA : acide éthylène diamine tétra acétique

4 qualité du prélèvement transport rapide au laboratoire (+/- milieu de transport) extraction de tous les acides nucléiques (ADN et/ou ARN, humains, pathogènes) = libérer les ac. nucléiques de leur environnement Méthode manuelle ou automatisée «extrait d acides nucléiques» ½ h à qq heures diagnostic moléculaire détection / caractérisation des ac.nucléiques de l agent infectieux 1 h à qq jours

5 Diagnostic moléculaire détecter ou caractériser le génome de l agent infectieux repose sur la capacité d une séquence monocaténaire d ac. nucléiques (ADN ou ARN) à se lier spécifiquement avec une séquence complémentaire. Hybridation (sondes) Amplification génique : PCR (amorces) Séquençage nucléotidique

6 Diagnostic moléculaire détecter ou caractériser le génome de l agent infectieux repose sur la capacité d une séquence monocaténaire d ac. nucléiques (ADN ou ARN) à se lier spécifiquement avec une séquence complémentaire. Hybridation : - en milieu liquide (ex : capture d hybrides) - avec amplification du signal d hybridation (ex de l ADN branché) - sur membrane ou sur puce Amplification génique : PCR +++ polymerase chain reaction = réaction de polymérisation en chaîne Séquençage nucléotidique

7 Hybridation en milieu liquide Ex : papillomavirus (HPV) hybridation sonde ARN / révélation Ac 2 hybridation / sonde ARN hybrides ADN/ARN 1 dénaturation ADN HPV capture /Ac mc anti-hybride 2 nd Ac mc anti-hybride conjugué à PAL + substrat chemiluminescent émission de lumière si HPV Digene

8 Hybridation : principe de l ADN branché Ex : virus de l hépatite B (VHB) ADN libéré et dénaturé Chiron / Bayer

9 Hybridation : principe de l ADN branché Ex : virus de l hépatite B (VHB) ADN libéré et dénaturé + sondes d hybridation Chiron / Bayer

10 Hybridation : principe de l ADN branché Ex : virus de l hépatite B (VHB) ADN libéré et dénaturé + sondes d hybridation + branches «amplificateur» Chiron / Bayer

11 Hybridation : principe de l ADN branché Ex : virus de l hépatite B (VHB) hybridation et révélation par sondes ADN ADN libéré et dénaturé + sondes d hybridation + branches d amplification + sondes marquées /enzyme + substrat mesure de la chemi luminescence Chiron / Bayer

12 Diagnostic moléculaire détecter ou caractériser le génome de l agent infectieux repose sur la capacité d une séquence monocaténaire d ac. nucléiques (ADN ou ARN) à se lier spécifiquement avec une séquence complémentaire. Hybridation : - en milieu liquide - avec amplification du signal d hybridation (ex de l ADN branché) - sur membrane ou sur puce Amplification génique : PCR +++ polymerase chain reaction = réaction de polymérisation en chaîne Séquençage nucléotidique

13 les nucléotides naturels chaîne d ac.nucléiques Base Base Ppi O Base 3 OH 3 OH R Pour réaliser une PCR : amplification enzymatique in vitro cible ADN présente?? : matrice ADN amorces : oligonucléotides complémentaires enzyme : Taq polymérase nucléotides synthétiques (dntp) MgCl 2+,

14 ADN Transcription inverse ARN PCR Etape 1 Amplification génomique dénaturation 95 C Nucléotides C n cycles 72 C 2 n Amplicons D après B. Pozzetto et JM. Huraux

15 PCR Etape 2 Détection des amplicons Analyse après la fin des cycles d amplification 2 n Amplicons Signal positif Lecture en point final Analyses «traditionnelles» Nombre de cycles d amplification

16 PCR en temps réel : la PCR 2 en 1! Amplification + détection simultanées Analyse pendant les cycles d amplification Signal positif Lecture en phase exponentielle Nombre de cycles d amplification Détection de fluorescence (sondes ou agents se liant à l ADN en cours de synthèse) Système fermé : risque de contaminations Quantification possible Rapide, sensible, automatisé

17 Un exemple de PCR en temps réel : la sonde Taqman amorce «Emetteur» «Suppresseur ou Absorbeur» Hybridation de la sonde doublement marquée intacte : la fluorescence de l émetteur est absorbée par l absorbeur. Début de l élongation nucléotidique par la Taq polymérase. Activité 5-3 de la Taq polymérase. Hydrolyse de la sonde : la fluorescence n est plus absorbée. Mesure de la fluorescence émise par l émetteur et proportionnelle à la quantité d acides nucléiques présents. D après

18 PCR syndromique Plusieurs couples d amorces ciblent différents agents étiologiques (bactério/viro). Exemples : - Sd méningé - Sd respiratoire - Sd diarrhéique D après B. Pozzetto et JM Huraux

19 Diagnostic moléculaire détecter ou caractériser le génome de l agent infectieux repose sur la capacité d une séquence monocaténaire d ac. nucléiques (ADN ou ARN) à se lier spécifiquement avec une séquence complémentaire. Hybridation : - en milieu liquide - avec amplification du signal d hybridation (ex de l ADN branché) - sur membrane ou sur puce Amplification génique : PCR +++ polymerase chain reaction = réaction de polymérisation en chaîne Séquençage nucléotidique

20 Séquençage nucléotidique selon SANGER Principe Effectuer la synthèse d un brin d ADN complémentaire (ADNc) à partir d une séquence ADN ou ARN puis déterminer la séquence de ce brin d ADNc Technique de Sanger : technique enzymatique aux «didésoxynucléotides»

21 Séquençage nucléotidique selon SANGER 1 ADN AMORCE 5 ou 3 terminateurs de chaîne chacun marqué par un fluorochrome différent

22 2 Taq A partir de l amorce, la Taq ajoute de façon aléatoire un déoxy- ou un didéoxynucléotide complémentaire de la séquence d ADN. La synthèse du nouveau brin s arrête dès l addition d un didéoxynucléotide.

23 3 Après 20 à 30 cycles, on obtient de multiples copies de fragments de toutes les longueurs possibles. Chacun se termine par un didéoxynucléotide.

24 4

25 Séquençage automatique

26 Séquençage automatique

27 Indications des méthodes moléculaires diagnostic d une infection - détection d un agent pathogène dans un prélèvement - intéressant quand culture lente (résultat plus rapide par BM) ou si urgence diagnostique ex : bacille de la tuberculose, méningite à méningocoque quand culture difficile voire impossible ex : virus de l hépatite C caractériser un agent pathogène - «classer» les agents pathogènes ex : selon génotype VHC : efficacité thérapeutique différente selon génotype papillomavirus (HPV): haut ou bas risque de développer cancer du col utérin - différencier des agents pathogènes de non pathogènes, morphologiquement non distinguables ex : PCR pour distinguer les amibes Entamoeba histolytica et Entamoeba dispar (commensale) suivi thérapeutique des patients infectés - l agent pathogène reste-t-il détectable malgré le traitement? - détecter des mutations associées à la résistance aux traitements ex : Plasmodium falciparum et résistance aux anti-paludéens Staphylococcus aureus et résistance à la méticilline VIH et résistance aux anti-rétroviraux

28 Une petit idée des prix Recherche d Ag rotavirus dans les selles 5 euros Sérologie VIH 15 euros Western blot VIH 43 euros PCR ARN VIH = charge virale VIH 60 euros Séquençage VIH 300 euros (recherche de mutations de résistance RT/prot) Nomenclature 2013