Introduction à la microscopie électronique

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1 Introduction à la microscopie électronique Pierre-Damien COUREUX Ecole polytechnique Méthodes biophysiques d'étude des structures de macromolécules Paris 7 6 avril 2016 Objectifs Connaître les avantages et inconvénients de la MET Qu est-ce que le contraste? Qu est-ce que la FTC? Comment résoudre une structure en 3D Quizz Différences entre la microscopie photonique et électronique? Différences entre microscopie électronique à balayage (MEB) et à transmission (MET)? Comment calculer la vitesse d un électron dans un MET? Que peut-on étudier avec un MET? Composition d un MET? Comment préparer un échantillon pour l étudier sur un MET? Avantages et inconvénients de la MET? 1

2 Avantages Ribosome de E. coli résolu à moins de 3 Å de résolution Fischer et al,

3 Isoler les différents conformations au sein du population de molécules Fischer et al, 2010 Quantité de matériel réduite Cristallographie aux rayons X ~200 µm ~100 µl Résonance magnétique nucléaire ~200 µm ~200 µl Microscopie électronique ~0.2 µm ~50 µl Inconvénients (et solutions) 3

4 Inconvénients Echantillon Dose contraste Bruit BIM Microscope Aberration de sphéricité Aberration de chromaticité Astigmatisme Modulation du signal Dose Dose = quantité d électrons par unité de surface (e - /Å 2 ) Quelle dose ai-je besoin pour voir mon échantillon? Fitting et al, 2012 Si on dépasse une dose de 20 électrons par Angstroem 2, on provoque des dommages d irradiation sur les échantillons congelés-hydratés Karuppasamy et al, e - /A 2 40 e - /A 2 60 e - /A 2 80 e - /A 2 4

5 Dose Faible flux Flux moyen Flux fort 50 e-/å e-/å 2 Karuppasamy et al, 2011 Dose = f(grossissement) Dose typique supportée par un échantillon congelé-hydraté 6,600x 660x 600x 6000x 60000x 38,000x e - /A e - /A 2 10 e - /A 2 1h 30s 1s 1 ère astuce : Imagerie «Low-dose» Search mode : x Focus mode : x Exposure mode : x Grassucci et al,

6 2 ème astuce : améliorer le contraste Contraste Définition : variation (=différence) d intensité entre 2 régions adjacentes Par exemple : contraste entre 2 pixels d une image ( I C I I ) I I Pour l œil humain, il faut un contraste supérieur à 5-10% pour qu il puisse être détecté 1 Contraste P 1 P 2 P 3 P 2 Intensité Intensité I 2 I 3 I 2 I I I 1 P 1 P 2 Pixel Fort contraste P 3 P 2 Faible contraste Pixel 6

7 Les différents types de contraste Contraste d amplitude (10%) Contraste de phase (90%) Contraste Dans un microscope électronique, le contraste provient à la fois d effets d amplitudes et d effets de phases. - Le contraste d amplitude est lié à la perte d électrons au passage du faisceau dans l échantillon et les diaphragmes des lentilles. - Le contraste de phase résulte de décalages de phases des différentes portions du faisceau qui contribuent à l image. Les termes de contraste d amplitude et de contraste de phase sont source de confusion. En fait on devrait dire contraste de diffusion et contraste d interférence. Mais ces termes ne sont pas employés dans la littérature de microscopie. Contraste d amplitude Durand et al, 2013 détecteur diaphragme 7

8 Coloration négative vs cryo Temps de préparation 5 min Temps de préparation 20 min Durand et al, 2013 Contraste de phase résolution contraste Compromis à trouver entre contraste et résolution! Image brute Diffusion élastique Signal Bruit Modulation Diffusion inélastique Système optique 8

9 Prise en compte du bruit Réduction du bruit par addition des images numérisées Additions sur images Rapport signal/bruit augmenté en augmentant le nombre de particules alignées! «Beam induced movement» Scheres, 2014 Prise en compte du «beam induced movement» Scheres,

10 Inconvénients Echantillon Dose contraste Bruit BIM Microscope Aberration de sphéricité Aberration de chromaticité Astigmatisme Modulation du signal Aberration de sphéricité des lentilles Les électrons passant près du centre de la lentille sont moins déviés de leurs trajectoires que des électrons passant près des bords de la lentille a disque de moindre confusion ds = ½. Cs. a 3 Cs = Constante d aberration de sphéricité a = demi-angle d ouverture diaphragme lentille Limite la résolution nominale ~ 2 Å Aberration de sphéricité des lentilles 10

11 Aberration de sphéricité des lentilles Correction Aberration chromatique des lentilles a diaphragme disque de confusion dc = a Cc { V-2 I V } I l 1 l 2 lentille Cc = Constante d aberration de chromaticité a= demi-angle d ouverture v/v = Variations de tension d accélération I/I = Variations d intensité de la cathode Pour des échantillons minces, l aberration chromatique reste faible (dc ~0.1 nm) Limite la résolution nominale ~ 0.5 Å Trois causes induisent des variations de longueurs d ondes: - des fluctuations dans les circuits de haute tension (normalement moins de 10-5 V) - des variations de vitesse des électrons émis par la cathode (±3.5 ppm) - des pertes d énergie dues aux chocs inélastiques des électrons avec le spécimen. Aberration chromatique des lentilles 11

12 Astigmatisme des lentilles Comme en optique, une lentille astigmate converge plus ou moins bien en X et en Y. Au lieu de produire une image ponctuelle, un point produit une image oblongue horizontale ou verticale suivant le plan focal considéré. Ici l observateur peut corriger l astigmatisme en équilibrant le courant passant dans les lentilles électromagnétiques multipolaires. Astigmatisme des lentilles Disque d Airy L image d un point n est pas un point mais une figure de diffraction (tache ou disque d Airy) composée d un disque central brillant entouré d anneaux concentriques alternativement noirs et brillants O a u v grossissement = v/u I diaphragme lentille disque de Airy Fonction d étalement d un point (Point Spread Function ou PSF en anglais) est une fonction mathématique décrivant la réponse d'un système d'imagerie à une source ponctuelle 12

13 Modulation du signal Image théorique de Déformation PSF l objet biologique x = Image prise de l objet biologique FT (Image théorique de l objet biologique) x = FT (Image prise de l objet biologique) Fonction de transfert de contraste (FTC) Dans un microscope électronique, la FTC caractérise la proportion et la qualité du contraste provenant à la fois d effets d amplitudes et d effets de phases. Elle se présente sous la forme : H(k) = 2 [(1-W) sing W cosg] Avec: k = fréquence spatiale (espace réciproque 1/distance) g = 2p (0,25 k 4 Cs l 3 0,5 l z k 2 ) W = pourcentage du contraste d amplitude l = longueur d onde des électrons Cs = Constante d aberration de sphéricité de la lentille z = sous-focalisation durant la prise de vue Contraste d'amplitude 10% Contraste de phase 90% 2 W cosg 2 (1-W) sing FTC totale W = 10 %, Cs = 1 mm, l= 0,025 Å z = -3,5 µm Cours E. Larquet 13

14 contraste contraste contraste Fonction d enveloppe E(k) = exp[-p 2 Q 2 (k 2 Cs l 3 - z k l) 2 ] exp[k 4 l2 Ds2 π 2 Cs λ ] 16 ln2 k exp[-( ) 2 ] Eg fréquences spatiales L'équation correspond au produit de trois enveloppes. -La première exponentielle décrit la taille de la source notée Q. -La seconde exponentielle rend compte de l'instabilité de la défocalisation notée Ds (traduction française pour "defocus spread"). -La troisième exponentielle regroupe les variations de tous les autres paramètres, avec Eg qui est la largeur à mi-hauteur de la fonction de type Gaussien. Dans cet exemple, les valeurs numériques sont : Q = Å -1, Cs = 1 mm, l = 0,025 Å, z = -3,5 µm, Ds = 200 Å et Eg = 0.12 Å -1. A FTC Fonction d enveloppe Détermine le maximum des fréquences spatiales transmises (la limite de l information i.e. la plus haute résolution réalisable avec le microscope) E(u) = E s (u)e c (u)e d (u)e v (u)e D (u) E s (u): instabilité de la source E c (u): aberration chromatique E d (u): mouvements du spécimen E v (u): vibrations du spécimen E D (u): détecteur C FTC x enveloppe B contraste contraste enveloppe fréquences spatiales D diffractogramme fréquences spatiales fréquences spatiales fréquences spatiales Modulation du signal Image théorique de Déformation PSF l objet biologique x = Image prise de l objet biologique FT (Image théorique de l objet biologique) x = FT (Image prise de l objet biologique) 14

15 Correction CTF 1 ère étape : estimation Correction CTF 1 ère étape : estimation 2 ème étape : correction par - inversion des phases (phase flipping) Spectre de puissance brut Correction CTF 1 ère étape : estimation 2 ème étape : correction par - inversion des phases (phase flipping) Contraste x -1 Contraste + x 1 15

16 Correction CTF 1 ère étape : estimation 2 ème étape : correction par - inversion des phases (phase flipping) - filtre de Wiener Correction CTF 1 ère étape : estimation 2 ème étape : correction par - inversion des phases (phase flipping) - filtre de Wiener FTC 1 FTC Image d un film de carbone 1 µm Fonction de transfert de contraste (FTC ou CTF en anglais) 16

17 Image réelle Spectre de puissance Spectre de puissance 0.5 µm 1 µm Images d un film de carbone 0.5 µm 1 µm 17

18 Astigmatisme Mouvement dans l image En résumé Le microscope électronique, une histoire de compromis Dose (< 10 e - /A 2 ) vs contraste vs résolution Modulation du signal par PSF vs correction Bruit vs hétérogénéité conformationnelle Réduction du bruit par addition des images numérisées Additions sur images 18

19 Résoudre une structure 3D d un complexe macromoléculaire Acquisition de données Tri des images Sélection des particules Alignement 2D Classification 2D Reconstruction 3D Projection 2D Collection de données (EPU FEI) Atlas = image de la grille Collection de données (EPU FEI) heures de collecte images particules Atlas = image de la grille Réglages position des trous, épaisseur de glace, dose, zones à collecter Collection automatique 19

20 Jeu de données 1500 images (avec environ 100 particules par image) Comment procéder? Tri des images Contamination éthane Contaminations Glace trop épaisse Glace non homogène Glace cubique Freeze-dried particles Grassucci et al, Nature protocols, 2007 Bonne ou mauvaise image? Scheres et al, Nature Protocols,

21 Fonction de transfert de contraste (FTC) Image théorique de Déformation PSF l objet biologique x = Image prise de l objet biologique FT (Image théorique de l objet biologique) x = FT (Image prise de l objet biologique) Bonne ou mauvaise image? Scheres et al, Nature Protocols, 2008 Sélection des particules Manuel Semi-automatique («knowledge based») Automatique 21

22 Sélection interactive des particules Signature Mais aussi EMAN2, Spider, Xmipp, Relion -Alignement Analyse 2D Fonction d auto-corrélation Fonction de corrélation croisée - Analyse statistique multivariée - Classification 2D Analyse 2D Fonction d auto-corrélation (FAC) C est la correlation croisée d une image avec elle-même Image FAC La FAC est un fonction centrée Fmax toujours à la position X = 0 et Y =0 La FAC est une fonction paire F(x,y) = F(-x,-y) 22

23 Coefficient de corrélation Analyse 2D Fonction d auto-corrélation Images réelles FAC Analyse 2D Fonction de corrélation croisée angulaire Référence Image à aligner Angle de rotation ( ) Analyse 2D Fonction de corrélation croisée Rotation 150 Image de départ Rotation

24 Analyse 2D Fonction de corrélation croisée X=26 px Y=30 px Image de référence X=-30 px Y=-30 px Analyse 2D Alignement Rotation : 350 Translation : -30px, -30px Même chose à faire pour les autres particules 24

25 Que peut-on (sa)voir grâce à l analyse 2D? Oligomérisation Rosenberg et al, 2006 SAXS 25

26 Interactions entre partenaires Ulbrich et al, 2009 Changements conformationnels Walker et al, Nature, 2000 Localiser une protéine dans un complexe Spliceosome humain Zhou et al. PNAS

27 Variabilité conformationnelle = hétérogénéité Lyumkis et al, 2012 Utile pour cristalliser sa protéine 2D 3D Structure 3D enveloppe Reconstruction ab-initio 3D à partir de particules isolées - Lignes communes dans l espace réciproque - Lignes communes dans l espace réel - Reconstruction conique aléatoire - Moyennation de sous-tomogrammes 27

28 Théorème de la section centrale Dans l espace réciproque, toute projection bidimensionnelle d un objet correspond à une section centrale dans la transformée de Fourier 3D de l objet. Chaque section centrale est orientée perpendiculairement à la direction de projection (direction du faisceau d électrons). Elena Orlova, EMBO, 2003 FT (0,0,0) Angles euler (0,90,0) (90,0,0) 28

29 Sinogrammes Lignes communes dans l espace réel Orlova et al, 2011 RCT Random Conical Tilt = Reconstruction conique aléatoire labs.mcb.harvard.edu/leschziner/research_methods.html 29

30 Moyennation des sous-tomogrammes Earl et al, 2013 Tomographie Briggs et al, 2006 Baumeister, 2004 Marsh et al, 2001 Tomogrammes Kudryashev et al, 2012 Quelles pourraient être les limitations de cette technique? 30

31 Que peut-on (sa)voir grâce à l analyse 3D? Interactions ADN-protéines Thorslund et al, 2010 Interactions ADN-protéines Song et al,

32 Interactions ARN-protéines 3.2A résolution Amunts et al, Science, 2014 Classification 3D Fernandez et al, Science, 2013 Hétérogénéité Approche bayesienne Scheres et al, Nature Methods,

33 Côté pratique - évaluation Accord entre projections et moyennes de classe Résolution Données biochimiques / bibliographiques Côté pratique - évaluation Accord entre projections et moyennes de classe Ludtke et al, 2004 Résolution FSC Fourier Shell Correlation Yu et al,

34 Résolution Côté pratique - évaluation Ludtke et al, 2004 Côté pratique - évaluation Accord entre projections et moyennes de classe Résolution Données biochimiques / bibliographiques Segmentation- recalage - Recalage par corps rigide («rigid body fitting») - Recalage flexible («flexible fitting») par modes normaux («coarse fine grain») 34

35 Structure d une protéine résolue par microscopie électronique Avantages : Inconvénients : Émergence des approches hybrides Sali et al, 2003 CLEM Correlative light-electron microscopy Tanaka et al, Cell Reports,

36 La biologie structurale aujourd hui Pas de technique idéale Complémentarité de techniques Echelle atomique cellulaire : biologie structurale intégrative Répondre à un problème biologique 36