SCHMITT Mathieu M1 PHCO PRO. Deepak R. Thakker and al.(2004) Novartis Institutes for Biomedical Research (Switzerland)

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1 SCHMITT Mathieu M1 PHCO PRO Deepak R. Thakker and al.(2004) Novartis Institutes for Biomedical Research (Switzerland)

2 Puce à ADN Gènes cibles potentielles des maladies neuro-psychiatriques Stratégie actuelle de modification génétique chez animal: longue et souvent limité par le développement des techniques et la compensation génétique qui masque le phénotype

3 Rappel: ARN interférent

4 ARN interférent In vitro Vecteur viral =>Etudie fonction des gènes dans cultures neuronales. In vivo Déficience du vecteur virale pour l étude physiopathologique =>expression uniquement dans certaines régions du cerveau Hypothèse de travail But: Produire une extinction de gènes dans l ensemble du cerveau.

5 Modèle in vivo pour tester l efficacité du siarn non viral But : Souris qui surexprime EGFP sous le contrôle du promoteur de la β-actine Méthodes: KpnI Recombinaison homologue dans cellule ES KpnI Promoteur β-actine EEGF EGFP Vérification par PCR et Southern Blot

6 Recombinaison homologue Promoteur β-actine EGFP Blastocyste Souris C57BL6 Introduit dans femelle pseudo gestante Cellule ES Souris agouti Souris chimère X F2 F1 X

7 Administration du EGFP-siARN dans le 3ème ventricule dorsal par minipompe osmotique reliée à une canule: 5 ---AGCYGACCCUGAAGUUCAUCT-3 3 -GTUCGACUGGGACAUCAAGUA---5 Contrôle: ARNsi scrambled sequence Expression d EGFP dans ces souris est ubiquitaire et presque uniforme dans tout le cerveau Détermine spécificité, temporalité et ampleur de l extinction du gène

8 Modèle in vivo pour tester la validité du siarn non viral Administration du DAT-siARN (transporteur de dopamine) dans le 3 ème ventricule dorsal Criblage de 12 siarn qui code pour différentes séquences d ARNm de DAT: 5 ---CAUGGCUCCAAUGCCACAATT-3 3 -GGGUACCGAGGUUACGGUGUU---5

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10 Administration intracerebroventriculaire dans souris qui surexprime EGFP Section coronaire de 10µm d épaisseur de chaque région du cerveau Hybridation in situ: brin antisens de l ARNm marqué au [ 35 S]

11 EGFP GABA Aα2

12 Mesures et observations de la fluorescence de l EGFP But: Vérification de l efficacité des sirna en mesurant le taux de protéines: avec 2 facteurs Temps et distribution spatiale Comparaison entre ARNm et protéine d EGFP Méthodes: Mesure de l intensité de fluorescence significative dans certaines régions et temps dépendant Profil similaire aux résultats précédents Gyrus denté (hippocampe) 15 % en plus de protéines EGFP avec le SiRNA par rapport ARNm EGFP (par rapport à la base) Surexpression d EFGP donc tout n est pas traduit

13 Rappel: système dopaminergique central Les 3 voies Voie nigro-striatale (nigrostriée) 80 % des neurones dopaminergiques Substance noire (pars compacta) Voie méso-corticolimbique Aire tegmentale ventrale Voie tubéro-infundibulaire Hypothalamus Striatum (noyau caudé et putamen) Stimulation motricité automatique et volontaire Impliqué dans la maladie de Parkinson Noyau accumbens, trabécules olfactifs, amygdales, hippocampe, cortex Mécanisme de récompense Apprentissage, mémoire Comportement émotif /anxiété Impliqué dans les psychoses et l addiction. Eminence médiale Régulation de la sécrétion de la prolactine.

14 But : Injection au niveau du 3 ème ventricule Proche des régions/voies dopaminergiques du mésencéphale TH, thyrosine-hydroxylase: enzyme limitante et régulatrice de la synthèse de la dopamine DAT, dopamine transporter: transporteur sélectif permet la recapture de la dopamine Induction d un Knock-down de la DAT Outils pharmacologiques GBR Vanoxerine 3 µg/jour (GBR3) 30 µg/jour (GBR30) DAT-siRNA Inhibiteur de la DAT Répression de DAT de la dopamine dans la fente synaptique de la stimulation des récepteurs dopaminergiques

15 Résultat de l activité locomotrice des souris But : Effet du DAT-siRNA et GRB Changement de comportement: hyperlocomotion SiRNA GBR Stimulation de la voie motrice 9 ème jour de l activité locomotrice 3 ème jour Stimulation de la voie dopaminergique nigro-striée Répression plus lente Inhibition plus rapide sirna est temps dépendant

16 Répression de l ARNm de DAT par les DAT-siRNA But: Relation du changement de comportement Mise en évidence de la répression des ARNm du DAT Spécificité par le contrôle de mesure de la TH mésencéphale: substance noire et aire tegmentale ventrale Méthodes: Hydribration in situ: [ 35 S] antisens de l ARNm De DAT et TH Quantification densitométrique Baisse significative de 33 % d ARNm de DAT par SiRNA Pas d effet du GBR sur les ARNm du DAT Pas de mécanisme de compensation avec la TH?

17 Résultat de la liaison du RTI-55 au transporteur DAT et SERT But: Vérifier la baisse des ARNm du DAT avec du DAT-siRNA en mesurant la proteine DAT Contrôle avec SERT (transporteur sérotoninergique) Mesure au niveau des aires des projections dopaminergiques Substance noire Aire tegmentale ventrale Méthodes: [ 125 I]RTI-55: ligand de DAT et SERT Mesure autoradiographique Noyau caudé Noyau accumbens Trabécules olfactifs Baisse de 49 % de la protéine DAT Aucun effet sur SERT Présence d un mécanisme d internalisation du DAT et dégradation?

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19 Technique de recherche pour la découverte des maladies génétiques et du rôle des protéines Maladies neurologiques et psychiatriques Caractéristiques Distribution spatiale Temps dépendant Intégration différente selon les neurones Diffusion dans le ventricule Transfection Dégradation des protéines Meilleur spécificité, temporalité et diffusion du SiRNA non viral par rapport au viral Avantages: Pas de neurotoxicité Spécificité sirna pour sa cible Alternative à un knockout (mort prématurée) Non viral 50 % de knock-down Viral 25% de knock-down Inconvénients: Atteinte de la dose maximale mais silencing incomplet (vs KO) Mise en place d une pompe avec une implantation ventriculaire

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21 Etude de traitement pour les maladies neurogénétiques Parkinson : dégénérescence progressive des neurones de la voie dopaminergique => Déplétion de dopamine dans le striatum DAT-siRNA Chorée de Huntington : Dégénérescence neuronale des fonctions motrices et cognitives => maladie autosomique dominante, huntingtine polyglutamique sirna de la huntingtine mutée Autres traitements étudiées avec sirna: hépatite B et C, HIV Nouveau modèle de la maladie neurogénétique: Schizophrénie : excès de dopamine dans les structures mesolimbiques Symptomes : délire, halucination. Attitudes agressives et hostiles DAT-siRNA Outil d étude efficace et ouvrant de nombreuses perspectives pour l étude de la fonction des gènes et de la physiopathologie Importance d adapter le moyen de transfection pour augmenter l efficacité et d avoir une distribution spatiale

22 Merci de votre attention

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