FACULTE DE MEDECINE PARIS DESCARTES

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1 FACULTE DE MEDECINE PARIS DESCARTES Tutorat Sujet de Biologie n 2 Durée de l épreuve : 2 heures A LIRE AVANT DE COMMENCER L EPREUVE : Vérifiez que le sujet comporte 16 pages imprimées recto-verso, numérotées de 1 à 16. Ce sujet est composé de questions rédactionnelles auxquelles vous devrez répondre de manière claire et complète dans les cadres prévus à cet effet (un élément rédigé hors du cadre-réponse n'est pas pris en compte à la correction). Le tutorat, une initiative du Cercle Cartésien des PCEM1 C2P1 1

2 EXERCICE 1 : Le réticulum endoplasmique granuleux (REG) joue un rôle clé dans de nombreux processus : la régulation de l homéostasie du calcium intracellulaire, la synthèse, la maturation, et le devenir des protéines. Une équipe de chercheurs s est concentrée sur le rôle d une protéine du RE : la calnexine (CNX). 1) Présentez la calnexine et son rôle au sein du REG. Afin d étudier le rôle de la calnexine, les chercheurs disposent d une lignée de cellules sauvages (CEM) exprimant la calnexine et d une lignée de cellules présentant une absence totale en calnexine (NKR). Leurs travaux ont permis de mettre en évidence un nouveau rôle clé du REG : la régulation de l apoptose. En effet le REG contient de nombreuses protéines impliquées dans le mécanisme de la mort cellulaire programmée, dont la protéine Bap31. Cette dernière est une protéine transmembranaire dont la partie cytosolique possède un domaine de mort. On cherche à étudier le rôle de la calnexine dans le stress du RE*. Pour étudier ce phénomène on dispose du Thapsigargin (TG), un agent provoquant un stress du RE. *En effet, dans certaines conditions expérimentales, la quantité de protéines de conformation anormale dans le RE augmente si fortement que ces protéines s accumulent, forment des agrégats et ne sont plus dégradées, plaçant les cellules dans une situation de «stress du réticulum endoplasmique» qui peut aboutir à la mort cellulaire par apoptose. 2

3 Après lyse cellulaire, on effectue un Western Blot. Les protéines sont révélées à l aide d anticorps anti-calnexine (figure 1). 2) Complétez le Western Blot ci-dessous. Figure 1 On réalise une première série d expériences. Figure 2 A Figure 2 B Figure 2 C Figure 2A : Western Blot. L extrait protéique a été séparé par SDS-PAGE, électro-transféré sur une membrane de nitrocellulose et révélé à l aide d immunoglobulines anti-bap31. µg of protein = quantité de Thapsigargin ajoutée. Précision sur le WB : ce sont 2 WB qui ont été mis ensemble pour regrouper les figures (c était comme ça dans l article) on a étudié séparement l expression de p20 et celle de Bap31. 3

4 La figure 2B représente le pourcentage d expression de deux protéines en fonction des différentes lignées cellulaires. La figure 2C représente la fragmentation de l ADN au sein des cellules. U : cellules non traitées ; TG : cellules traitées au Thapsigargin. 3) D après l analyse des figures 2A, 2B et 2C quelles hypothèses peut-on déduire des ces figures? Toujours dans le but de trouver le rôle de la calnexine dans un stress de RE, on entreprend de nouvelles expériences. 4

5 Figure 3 : Co-immunoprécipitation. On a traité préalablement des cellules au Thapsigargin. L immunoprécipitation (IP) est obtenue avec des immunoglobulines anti-bap31. Les extraits cellulaires ont été soumis à une électrophorèse SDS-PAGE : celui de gauche a été révélé avec des anticorps anti-calnexine (Calnexin) et celui de droite avec des anticorps anti-bap31. IgG a été précipitée et révélée par des anticorps anti-igg. 4) Expliquez le but de la co-immunoprécipitation? Pourquoi révèle-t-on IgG? 5) Interprétez les résultats obtenus et émettez une hypothèse concernant le rôle de la calnexine. 6) Citez deux exemples de mécanismes conduisant à l apoptose, et faites l inventaire des «acteurs» qui y participent. 5

6 On cherche désormais à savoir comment l apoptose induite par un stress du RE est initiée. Figure 4 : Des cellules ont été lysées et leurs protéines séparées par SDS-PAGE, suivi d un Western Blot. Les protéines ont été révélées par des anticorps anti-bax et anti-bcl-2. Les bandes protéiques immunoréactives ont été quantifiées à l aide d un scanner densitométrique. Le rapport Bax : Bcl-2 a été étudié dans les lignées CEM et NKR. 6

7 7) A l aide de la réponse formulée à la question précédente, interprétez les résultats de la figure 4. Quelle(s) hypothèse(s) peut-on alors formuler? 8) Formulez une hypothèse concernant l élément qui pourrait initier l apoptose par stress du RE, sachant qu il s apparente à un élément clé connu d un des deux mécanismes d apoptose. Les chercheurs découvrent que c est la caspase 3 qui clive Bap31 lors de cette apoptose. 9) En conclusion, résumez l ensemble des évènements pouvant conduire à l apoptose par un stress du RE au sein d une cellule CEM. (Vous pouvez vous aider d un schéma pour illustrer vos propos). 7

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9 EXERCICE 2 : Des chercheurs se sont intéressés à différents mécanismes d apoptose, ou mort cellulaire programmée. Ils ont pu identifier des régulateurs de l apoptose induite par FAS. Pour cela, ils ont utilisé une lignée de cellules DF-1 de poulet exprimant le récepteur humain FAS. Ces cellules sont susceptibles d entrer en apoptose induite par FAS, à l aide d anticorps humains agonistes de FAS. Les cellules ont été transfectées avec des GSEs (genetic suppressor elements), qui sont des fragments de gènes codant pour des ARNm antisens ou des protéines dominant-négatifs*. (Les GSEs en détail : ils créent des interférences avec des gènes «endogènes» et empêchent la synthèse des protéines endogènes fonctionnelles). * La méthode utilisant les dominant-négatifs permet d observer les conséquences d une perte de fonction protéique donnée : en effet, il s agit d injecter dans la cellule cible un ARNm codant pour une protéine (celle dont on veut étudier l effet) tronquée (=négatif) en excès, qui inhibe la fonction (=dominant) de la protéine endogène minoritaire. Après transfection de différents GSEs, le pourcentage de survie cellulaire a été mesuré à l aide d une coloration au bleu de méthylène 4h après addition des anticorps agonistes de FAS. EGFP a été utilisé comme témoin. Le taux de survie dans chaque type de construction est donné en comparaison aux mêmes cellules en l absence des anticorps de FAS (fixés à 100%). Figure 1 : Tableau présentant l action de 12 GSEs sur la survie cellulaire. Cyt b=cytochrome b. 1) Dans l expérience, quel est le rôle des anticorps agonistes de FAS? 9

10 2) Quels résultats pouvez-vous déduire de la figure 1? Pour étudier de plus près le cytochrome b, des fractions cytoplasmiques et mitochondriales ont été préparées à partir de cellules HeLa exprimant FAS de manière endogène laissées sans traitement (contrôle = nt), ou traitées avec des anticorps agonistes de FAS pendant un certain temps (de t=0,5h à t=4h). Les fractions ont été analysées par Western Blot pour le cytochrome b (cyt b), GRP75 (un marqueur mitochondrial), PCNA (un marqueur cytoplasmique), et pour le cytochrome c (cyt c). Les anticorps anti-cytochrome b utilisés sont des anticorps P49 ne reconnaissant que la partie C-terminale de celui-ci. 30 et 15 représentent les masses moléculaires et sont exprimées en kda. Figure 2 : Western Blot du cytochrome b, de GRP75, de PCNA et du cytochrome c dans le cytosol et dans la mitochondrie à des temps donnés (de 30 min à 4h). 3) Que peut-on déduire des résultats de la figure 2? Quelle hypothèse pouvez-vous formuler concernant le cytochrome b? 10

11 Pour comprendre le rôle du cytochrome b, des cellules HeLa exprimant FAS de manière endogène ont été infectées par des virus permettant l expression de EGFP (témoin), du cytochrome b entier, de la partie C-terminale du cytochrome b (Cyt b ), de la partie N-terminale du cytochrome b, de la portion du cytochrome b correspondant à un GSE, nommé GSE F21* ainsi que le GSE F21 lui-même couplé soit avec le cytochrome b cytochrome b entier ou sa partie C-terminale. Le pourcentage de survie cellulaire a été mesuré à l aide de la coloration au bleu de méthylène 72h après infection et est indiqué en comparaison du contrôle EGFP (fixé à 100%). * Le GSE F21 est un GSE qui correspond à une portion de 42 acides aminés de la partie C- terminale du cytochrome b. Figure 3 : Tableau représentant le taux de survie cellulaire après transfection des gènes d EGFP, du cytochrome b, de sa partie C-terminale, de sa partie N-terminale, de GSE F21, de GSE F21 associé au cytochrome b ou bien à sa partie C-terminale. 4) Que pouvez-vous déduire de la figure 3? 11

12 En raison des différences entre génomes nucléaire et mitochondrial, les chercheurs n ont pas pu utiliser la séquence de l ADN mitochondrial codant pour le cytochrome b pour permettre l expression cytoplasmique de la protéine. La séquence mitochondriale du gène codant le cytochrome b contient 11 tryptophanes codés par des codons qui sont interprétés comme codons STOP dans le génome nucléaire. Ainsi, une séquence de gène artificielle humaine du cytochrome b codant les mêmes acides aminés mais utilisant le code nucléaire a été générée. Notons que le GSE F21 ne contient pas de codons codant pour un tryptophane. 5) Rappelez brièvement les différences principales entre les génomes nucléaire et mitochondrial? L original GSE F21 (séquence mitochondriale) et la version recodée (séquence nucléaire) agissent de la même manière. 6) Quelle est la nature de l élément codé par le GSE F21 d après les informations de l introduction? Justifiez. 12

13 Pour comprendre l implication du cytochrome b dans les voies apoptotiques, on réalise des cultures cellulaires de la lignée HeLa exprimant FAS de manière endogène. A t=0h une partie de celles-ci sont incubées avec FAS-L ( ), l autre partie est incubée avec FAS-L, mais aussi avec Z-IETD-FMK, un inhibiteur de l activation de la caspase 8 ( ). On mesure le taux de survie des différents groupes à t=4h et t=24h. Figure 4A : Graphique représentant le taux de survie des cultures cellulaire incubées avec soit le ligand FAS (FAS-L) ( ) ou avec FAS-L+ Z-IEDT-FMK ( ). A t=8h, on réalise un Western Blot de ces cultures cellulaires pour le complexe IV de la chaine respiratoire de la mitochondrie (Cplx IV), les cytochromes b et c, la -actine et la procaspase 8. Le blot est réalisé à partir d extraits de fractions cytoplasmiques et mitochondriales de la précédente lignée cellulaire incubées soit avec FAS-L ou FAS-L+ Z- IEDT-FMK ou bien alors non traitées. Figure 4B : Western Blot du complexe IV de la chaine respiratoire de la mitochondrie (cplx IV), des cytochromes b et c, de la -actine et de la procaspase 8 à partir d extraits cytoplasmiques et mitochondriaux des lignées cellulaires de la figure 4A. 13

14 7) Au vu des résultats de la figure 4A et 4B que peut-on déduire quant au rôle de la caspase 8 dans le déroulement de l apoptose? A-t-elle un effet sur cytochrome b? Si oui lequel? Dans une autre expérience on extrait les fractions cytoplasmique et mitochondriale de cellules de la lignée HeLa exprimant FAS de manière endogène. Elles ont ensuite été transfectées ou non avec le gène codant Bcl-2, et mises en contact ou non (nt) avec les anticorps agonistes de FAS. Puis on réalise un Western Blot de Bcl-2, et des cytochromes c et b dans les deux fractions (Figure 5). Figure 5 : Western Blot de Bcl-2 et des cytochromes c et b dans la fraction cytoplasmique et mitochondriale après traitement ou non (nt) par les anticorps agonistes de FAS et transfectées ou non par Bcl-2. 14

15 Puis d autres cellules de la lignée HeLa exprimant FAS de manière endogène sont transfectées avec différents gènes codant pour : le cytochrome b, le GSE F21, Z-Vad (un inhibiteur de l ensemble des caspases) et Bcl-2. A t=24h, les cellules sont incubées avec des anticoprs angonistes de FAS. A t=48h, on mesure le taux de survie cellulaire grâce à une coloration au bleu de méthylène. Les résultats sont présentés dans le graphique de la figure 6. Figure 6 : Tableau représentant le taux de survie cellulaire après transfection des différents gènes. EGFP est utilisé comme témoin dans une lignée de cellules non incubées par les anticorps agonistes de FAS. Les protéines traduites sont localisées dans le cytoplasme. 8) Quelle hypothèse peut-on émettre quant au rôle de Bcl-2 d après les expériences de la figure 5 et 6? 15

16 Ce sujet du tutorat de Biologie a été réalisé par : Célia AZOULAY (PCEM2), Nicolas BARRAUD (PCEM2), Iris BITUMBA (PCEM2), Cécilia SROUSSI (PCEM2) et Oriane RIMOND (PCEM2). Un grand merci à Jeremy DO CAO (PCEM2) et Guillaume RIEUL (PCEM2) pour la relecture, et aux P1 (Damien, Hiba et Nicolas) qui ont testé le sujet! Vous êtes chics! Sous la coordination de Sandrine ANDRE (PCEM2) Adresse de référence pour la Biologie: tutoratbiologiec2p1@gmail.com, pour toutes questions concernant les sujets. Une réponse à toutes vos questions est aussi disponible sur les forums mis à votre disposition : rubrique Forum : Tutorat / PCEM1 Le tutorat est une initiative du C2P1 Le rendu de note est obligatoire, afin que les classements puissent être représentatifs. Il faut vous rappeler qu'il s'agit d'un concours et donc que la note n'a aucune signification, seul le classement final en a une. Pour pouvoir être classé et ainsi vous comparer aux autres, une correction rigoureuse ainsi que le rendu de note honnête sont des éléments indispensables. Vous avez jusqu à mardi soir 23h59 pour rendre votre note sur le site 16