Importance des enzymes métaboliques et des transporteurs dans les interactions médicamenteuses

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1 Importance des enzymes métaboliques et des transporteurs dans les interactions médicamenteuses Dr Youssef Daali, PharmD, PhD Pharmacologie et Toxicologie Cliniques

2 The Practice of Medicine in 1892 If it were not for the great variability among individuals, medicine might as well be a science and not an art Sir William Osler ( )

3 Sources of Inter-individual Variability Dose Concentration Effect PK PD Environmental factors Genetic factors Food Enzymes (CYP450) Co-medications Transporters Pollution Receptors Individualized Therapeutics Genotyping Phenotyping

4 Bioavailability of drugs: Cyclosporine example Following nonparenteral administration of a drug, a significant portion of the dose may be metabolically inactivated in either the intestinal endothelium or the liver before it reaches the systemic circulation. Limits oral availability of highly metabolized drugs 100 % F = 27% portal Liver 27% Systemic circulation 51 % 8 % 14 %

5 Métabolisme et transport dans le foie et l intestin

6 Devenir d un médicament dans l organisme OATP Phase 0 Phase I Phase II Phase III O 2 ROH X X XOH XOR Monooxygénases Ex: UGT Ex: MRP P450 Ex: PGP XOH Phase IV XOR Cellule (hépatocyte) Elimination Phase I: fonctionnalisation Phase II: conjugaison (+ hydrophile) Phase III: expulsion de conjugués ou du produit parent (ex: mdr, MRP) : expulsion du xénobiotique inchangé ou conjugué

7 Métabolisme et transport dans les reins

8 Overview of transporters localisation Intestinal efflux: P-gp, MRP2, BCRP Intestinal uptake: OCT1, OATP-B, OATP-A Biliary excretion: P-gp, BCRP, MRP2, BSEP, MDR3 Hepatic uptake: OATP-A, -B, -C, -8, NTCP, OAT1, OCT1 PO dosing IV administration Brain transport: P-gp, BCRP, MRP2 OAT3 (OATP-A, MCT) Intestine Vascular space Liver Brain Kidney Interstitial space Fecal excretion Renal secretion: OAT1-3, OCT2, MRP2, MRP4, P-gp Urinary excretion Renal reuptake: OATP-A, PepT2 Transporters contribute to the absorption, distribution and elimination of drugs, metabolites, various endogenous molecules, vitamins, and nutrients Tissue entry of drugs can be either facilitated or hindered by transporters

9 Tissue localization of enzymes Extrahepatic microsomal enzymes (oxidation, conjugation) Hepatic microsomal enzymes (oxidation, conjugation) Hepatic non-microsomal enzymes (acetylation, sulfation,gsh, alcohol/aldehyde dehydrogenase, hydrolysis, ox/red)

10 General Pathways of Xenobiotic Biotransformation Phase I (functionalization) reactions: oxidations and reductions (non exhaustive list) Cytochrome P450s, flavin-containing monooxygenases (FMOs), hydroxylases, lipooxygenases, cyclooxygenases, peroxidases, mononamine oxidases (MAOs)and various other oxidases, various reductases, NAD-and NADP-dependent alcohol dehydrogenases, aldehyde dehydrogenases, steroid dehydrogenases, dehalogenases, etc. Phase II (conjugation) reactions: transfer chemical moieties to water-soluble derivatives UDP glucuronosyltransferases,gsh S transferases, sulfotransferases, acyltransferases,glycosyltransferases, glucosyltransferases, transaminases, acetyltransferases, methyltransferases, etc. Hydrolytic enzymes Glycosylases, glycosidases, amidases,glucuronidases, paraoxonases, carboxylesterases, epoxide hydrolase and various other hydrolases, acetylcholinesterases and various other esterases

11 Répartition quantitative des CYP hépatiques et contribution au métabolisme médicamenteux 30% 10% 2C9 20% 2B6 5% 2C19 5% 2% 2D6 5% 1A2 10% 2E1 10% autres 5% 3A 40% 55%

12 Sources of variability of CYPs activity Genetic polymorphisms Environmental factors: inducers, inhibitors, disease, pollution, smoking, Multiple P450 s can catalyze same reaction (lowest K m is predominant) A single P450 can catalyze multiple pathways

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14 Codeine intoxication in UM of CYP2D6 with DDI Codeine for cough 25 mg 3 x/day UM for CYP2D6 and CYP3A inhibition Acute renal failure Accumulation of morphine and metabolites coma and respiratory depression 20 to 80 fold higher concentration of moprhine and metabolites

15 Méthodes: les techniques d étude du métabolisme in vitro technique avantages désavantages Microsomes du foie humain - Faciles à préparer - simple utilisation - stockés à -80 C pendant plusieurs années - Faible activité des enzymes de phase II - Incubations courtes - pas pour les études d induction Cellules recombinantes - Identification et confirmation de l implication des isozymes individuels Lignées cellulaires - Culture cellulaire simple - Durée de vie non-limitée - Etudes d induction possibles - Onéreux -Temps de préparation relativement long Hepatocytes - modèle proche de la situation in vivo - maintenus quelques jours en culture - croissance inefficace in vitro - préparation à partir du tissus hépatique frais -disponibilité de tissus humains Coupes de foie - bonne représentation de la situation in vivo - enzymes de phase I et phase II - Diminution rapide des niveaux de CYPs -disponibilité de tissus humains

16 Méthodes: préparation des microsomes et incubations

17 Principales Familles de Transporteurs Solute carrier transporters (SLC22A gene) membres Organic anion transporters (OATs) Organic cation transporters (OCTs) ATP binding cassette proteins family (ABC gene) ABCB1: MDR, P glycoprotéine (P gp) ABCC2 (MRP2), ABCC4 (MRP4), ABCC6 (MRP6): Multidrug resistance proteins ABCG2 (BCRP): Breast cancer resistance protein

18 Pgp: Polymorphisme génétique P-glycoprotéine codée chez l humain par le gène ABCB1 (MDR1) (chromosome 7 (7q21)) Espèces Humain Souris, rat Gène(s) ABCB1 abcb1a (mdr1a) et abcb1b (mdr1b) Plus d une centaine de «single nucléotide polymorphisms» (SNPs) identifiés à ce jour C3435T (exon 26) G2677T (exon 21) C1236T (exon 12) Polymorphisme génétique et variabilité d expression : Génotype C3435T Taux de P-gp rénale et intestinale 1.5x et 2x inférieurs chez volontaires TT par rapport aux CC Siegmund M et al. J Am Soc Nephrol 2002;13: ; Hoffmeyer S et al. Proc Natl Acad Sci 2000; 97:3473-8

19 Polymorphisme génétique (suite) Variabilité inter-ethnique Fréquences de génotype du polymorphisme ABCB1 C3435T dans populations d origines ethniques différentes Fromm MF. Adv Drug Deliv Rev 2002; 54:

20 Effect of Pgp Genetic Polymorphism and DDI on digoxin PK Digoxine 0.25mg/j Digoxine (1mg)/Rifampicine (600mg) per os P=0.006 Paramètre Contrôle Rifampicine C max (ng/ml) AUC (0-144h) (ng.h/ml) 5.4 ± ± ± 0.7 a 38.2 ± 12.4 b a P<0.001; b P<0.005 Greiner B et al. J Clin Invest 1999;104: Corrélation entre génotype ABCB1(C3435T) et concentrations plasmatiques Cmax de digoxine (per os) au steady-state chez le volontaire sain (n = 14) Hoffmeyer S. et al. PNAS 2000;97:3473-8

21 The effect of hyperforin on irinotecan therapy. Pgp Pgp Meijerman I et al. The Oncologist 2006;11: by AlphaMed Press

22 Le modèle Caco-2 Lignée cellulaire dérivée de l adénocarcinome colorectal humain Mise en culture de jours Restriction paracellulaire appropriée Surexpression de la P-glycoprotéine Différenciation en monocouches confluentes polarisées Etude du transport bidirectionnel Modèle in vitro recommandé par la FDA Identification de substrats, inhibiteurs et inducteurs de la P-glycoprotéine US Food and Drug Administration 2006; Sun H et al. Expert Opin Drug Metab Toxicol 2008; 4(4):

23 Critères de validation du modèle Caco-2 Littérature Restriction paracellulaire (mesure des TEERs) (Fonctionnalité de la P-gp par le biais d un substrat contrôle) Critères de validité établis dans notre laboratoire Différenciation et intégrité des monocouches cellulaires Caractérisation morphologique des monocouches cellulaires Mesure des TEERs et du transport paracellulaire du [ 3 H]-mannitol Expression et fonctionnalité de la P-glycoprotéine Western Blot Interaction avec la P-gp de substrats contrôles

24 Validation du modèle Caco-2 Différenciation des monocouches cellulaires Méthode Résultats Microscopie électronique (TEM): Fixation dans glutaraldehyde 2% Coupe transversale Post-fixation dans tétroxyde d osmium 1% Déshydratation via différents gradients d éthanol Fixation dans de l Epon 812 Examination sous microscope électronique Microvillosités Jonctions serrée Desmosome Interdigitations 0. 5 µ m Noyau Monocouches cellulaires (21j) Kanaan M. et al. Curr Drug Metab 2008; 9:144-51

25 Validation du modèle Caco-2 (suite) Intégrité des monocouches cellulaires Méthodes Résultats Ι/ Résistances transépithéliales Ω.cm 2 Ohmmètre Millicell-ERS ΙΙ/ Passage paracellulaire du [ 3 H]-mannitol < 1% Insert Transwell Costar Löscher W et Potschka H. Nat Rev Neurosci 2005;6: ; Kanaan M. et al. Curr Drug Metab 2008; 9:144-51

26 Validation du modèle Caco-2 (suite) Expression de la P-gp Méthode Résultat Western Blot Lysat des cellules Séparation de 10ug de protéines totales par SDS/Page et blotted sur membrane de nitrocellulose Incubation des membranes avec anticorps monoclonal anti-humain MDR1 (C219) suivi d un anticorps secondaire HRP-conjugué Detection de la protéine immunoréactive par ECL-Hyperfilm 170 kd A B C A: cellules non-soniquées B: cellules soniquées C: supernageant Kanaan M. et al. Curr Drug Metab 2008; 9:144-51

27 Validation du modèle Caco-2 (suite) Fonctionnalité de la P-gp Transport transepithélial de substrats contrôles (rhodamine et digoxine) Modèle d expérimentation Calculs Coefficient apparent de perméabilité (P app ) P-gp P app (cm/s) = (dq / dt) / (A x Co x 60) Substrat de la P-gp Papp(B-A) / Papp(A-B) > 2 A-B : lumière intestinale compartiment sanguin ou compartiment sanguin SNC B-A : compartiment sanguin lumière intestinale ou SNC compartiment sanguin En présence d un inhibiteur de la P-gp Papp(A-B) Papp(B-A) Artursson P. J Pharm Sci 1990;79:476-82; Karlsson J et al. Br J Pharmacol 1993;110:

28 Validation du modèle Caco-2 (suite) Fonctionnalité de la P-gp Transport transepithélial de substrats contrôles Rhodamine 123 (5µM) Digoxine (5µM) ph 6.8/7.4 ph 7.4/7.4 ph 6.8/7.4 ph 7.4/7.4 * * * * Quantité transportée (pmol/cm 2 /3h) * * * * Quantité transportée (pmol/cm 2 /3h) * * * * Contrôle +Cyclosporine Contrôle +Cyclosporine Kanaan M. et al. Curr Drug Metab 2008; 9: Transport A-B 0 0 Contrôle +GF Contrôle + GF Transport B-A ; *P<0.01

29 Exemples de substrats de la Pgp Classe médicamenteuse Substrats Agents de diagnostic Antagonistes des réc. H1 Antagonistes des réc. H2 Anthelminthiques Anti-arhythmiques Antibiotiques Anticancéreux Antidépresseurs Anti-émétiques Anti-épileptiques Rhodamine-123 Fexofénadine Ranitidine Ivermectine Digoxine Erythromycine Doxorubicine Amitryptiline Dompéridone Carbamazépine Antifongiques Antigoutteux Anti-hypertenseurs Antimalariques Antipsychotiques Anti-VIH Glucocorticoïdes Hypolipémiants Immunosuppresseurs Opioïdes Itraconazole Colchicine Céliprolol Méfloquine Olanzapine Indinavir Dexaméthasone Pravastatine Tacrolimus Morphine

30 Modulateurs de la Pgp Inhibiteurs 1 ère génération : Clarithromycine, ciclosporine A, érythromycine, kétoconazole, quinidine, sirolimus, tacrolimus, tamoxifène, vérapamil, jus de pamplemousse 2 ème génération : PSC-833 (valspodar), VX-710 (biricodar) 3 ème génération : GF (elacridar), LY (zosuquidar), R (laniquidar), XR9576 (tariquidar) Inducteurs Carbamazépine, dexaméthasone, rifampicine, millepertuis («Saint-John Wort»)

31 Polymorphisme du OATP1B1 rs Number Nucleotide change Caucasians variant allele frequency Function rs c.521t>c 8-20% Reduced activity rs c.388a>g 30-45% In-vitro (reduced activity) rs c.463c>a 13-23% no change rs c.1929a>c 3-9%??

32 Impact of OATP1B1 polymorphism on Statin PK and side effects c.521t>c N Engl J Med 2006, 359:

33 Impact of OATP1B1 genetic polymorphism on statins PK R Elsby, CPT 2012

34 Impact of OATP1B1 and CYP3A inhibition on statins PK R Elsby, CPT 2012

35 Statins and DDI R Elsby, CPT 2012

36 Fruits Drugs interactions via intestinal OATP transporters Graprfruit juice Orange juice Apple juice Dolton CPT 2012

37 Exemples de substrats du OATP1B1 Substances endogène: Acides biliaires, eicosanoides, bilirubin, thromboxane A2, etc. Antibiotiques: rifampicine, cefazolin, benzylpenicilline, etc. Anticancéreux: SN-38, Pazopanib, Gimatecan, etc. HIV: darunavir, lopinavir, saquinavir, etc. antihypertenseurs: Bosentan, Enalapril, Valsartan, Olmesartan, etc. Autres: Methotrexate, fexofenadine, sirolimus, troglytazone, etc.

38 Exemples d inhibiteurs du OATP1B1 Inhibitor IC 50 or K i μm Darunavir 3.1 Atazanavir 1.5 Atorvastatin 0.87 Bromocriptine 0.7 Clarithromycin Cyclosporine Estradiol 3.3 Estropipate 0.06 Hyperforin 0.82 Ketoconazole 19.2 Lopinavir 0.5 Paclitaxel 0.03 Pazopanib 0.79 Rifampin Ritonavir Rosiglitazone 6.0 Saquinavir Sildenafil 1.5 Sirolimus 6.49 Tacrolimus

39 Expression of OATPs in HeLa Cells Using Vaccinia-Based Transfection System Utilizes the highly efficient bacteriophage T7 RNA polymerase Modular system for evaluating uptake transporters; only one cell line to passage No need to establish range of stably transfected cells for each transporter Lipofectin (positively charged) Plasmid with OATP-X cdna (negatively charged) 1. Plasmid containing OATP-X cdna and viral promoter successfully carried into the cell by lipofectin 2. Expression of OATP-X within hrs post-infection by vaccinia virus ptm1 T7 OATP-X - HeLa Cell Membrane (net negative charge) T7 Polymerase OATP-X expressing HeLa cell

40 Expression of OATP-A in HeLa Cells Using Vaccinia-Based Transfection System Fexofenadine uptake, pmol.mg protein [ 14 C]-Fexofenadine Uptake over Time OATP-A Vector Control Time, minutes Figure courtesy of Richard B. Kim

41 Ex-vivo study of DDI between Gd-BOPTA and Rifampicin Rifampicine Hepatic uptake rate Drug-drug interactions Gd-BOPTA OATP1B1/1B3 Sinusoid Efflux back to sinusoids MRP3/4 Hepatic concentrations of competing drugs Hepatocyte Gd-EOB-DTPA Drugs Biliary excretion rate Drug-drug interactions MRP2 Retrieval Daali Y et al BJP 2013 Rifampicine Bile canaliculus

42 BOPTA transport through hepatocytes Daali Y et al BJP 2013

43 BOPTA transport through hepatocytes 0 um Rif 100 um Rif Daali Y et al BJP 2013

44 Daali Y et al BJP 2013

45 Conclusions Comme les enzymes du métabolisme, les transporteurs d influx et d efflux jouent un rôle important dans la variabilité de réponse aux médicaments. Des modèles in-vitro, ex-vivo ou in-vivo sont disponibles pour la caractérisation des transporteurs. Synergie entre les enzymes du métabolisme et les transporteurs d influx et d efflux pour la prise en charge des médicaments ou substances endogènes. Manque d études cliniques démontrant l impact du polymorphisme génétique et des interactions médicamenteuses aux niveau des transporteurs.