Polycopié de Biologie Cellulaire UE 2 : La cellule et les tissus

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1 Stage de Pré-Rentrée du Tutorat 26 août septembre 2013 Polycopié de Biologie Cellulaire UE 2 : La cellule et les tissus Fiches de cours Enoncés des exercices Ne peut être vendu ou utilisé dans un but commercial sous peine de poursuite. Ce fascicule de cours et d exercices a été entièrement réalisé par le Tutorat Ni les professeurs, ni la faculté ne pourront être tenus responsables de la validité des informations qu'il contient, même en cas d'une éventuelle relecture par un professeur. 1

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3 Sommaire Chapitre n 1 : Introduction à la biologie - Cours Page 4 - Exercices Page 7 Chapitre n 2 : Noyau interphasique - Cours Page 11 - Exercices Page 25 Chapitre n 3 : Cytosquelette - Cours Page 30 - Exercices Page 36 Chapitre n 4 : Jonctions cellule-cellule et cellule-matrice - Cours Page 37 - Exercices Page 44 3

4 Chapitre n 1 : Introduction à la biologie Cours INTRODUCTION On divise habituellement le corps humain en différents compartiments. Un être humain peut être décrit comme une somme de systèmes, chacun composé d un assemblage d organes, formés de tissus, composés de cellules, qui contiennent de nombreux organites et des molécules. CELLULE EUCARYOTE La cellule est la plus petite unité capable de manifester, de manière autonome, les propriétés du vivant. C est l unité de base structurale et fonctionnelle du vivant. Elle synthétise l ensemble de ses constituants en utilisant les éléments du milieu extracellulaire. Elle croît, se multiplie et meurt. Une cellule eucaryote est subdivisée en différents compartiments cellulaires : on dit qu elle est compartimentée. Cette compartimentation présente de nombreux avantages ; plus une réaction a lieu dans un volume réduit, plus elle est rapide car le substrat rencontre plus rapidement l enzyme. Les cellules eucaryotes : - sont limitées par une membrane plasmique qui les sépare du milieu extérieur. - possèdent un noyau qui contient la chromatine baignant dans le nucléoplasme et limité par une enveloppe nucléaire. - possèdent un cytoplasme qui est composé de cytosol dans lequel on trouve des organites : ribosomes, réticulum endoplasmique lisse et rugueux, lysosome, etc. Les cellules eucaryotes sont très diversifiées et varient par leur taille, leur structure et leur fonction. L organisme est composé d environ cellules. OUTILS D ETUDE 1) La microscopie La microscopie permet d augmenter la résolution de l œil. Il existe deux types de microscopie : photonique et électronique. Le microscope photonique La microscopie photonique utilise le photon pour éclairer l échantillon à observer. Il existe trois types de microscopies photoniques : o Le microscope à fond clair : Il existe plusieurs manières d observer des objets par ce type de microscopie, par exemple : - La coloration de l échantillon à observer. - Le microscope à contraste de phase, qui transforme la variation de densité et d épaisseur en contrastes observables sur une image. 4

5 o Le microscope à fluorescence : Il faut que l échantillon à observer possède des molécules fluorescentes, soit naturelles, soit ajoutées par génie génétique, soit fixées grâce à des anticorps. On éclaire ensuite l échantillon avec la longueur d onde correspondant au matériau fluorescent. o Le microscope confocal à balayage laser : Il permet l observation d échantillons fluorescents grâce à un laser focalisé sur un plan de l échantillon. Parfois on utilise plusieurs lasers. Il permet après un traitement numérique de visualiser l échantillon en 3D. Le microscope électronique Elle utilise des électrons, et permet une résolution 1000 fois supérieure à la microscopie photonique. Il y a deux types de microscopie électronique : à transmission et à balayage. o Microscopie électronique à transmission : Des atomes vont se fixer sur l échantillon, en créant un contraste visualisable ensuite. o Microscopie électronique à balayage : L échantillon est recouvert de métal qui est opaque aux électrons. On peut ainsi obtenir une image 3D de l échantillon. 2) La cytométrie en flux avec trieur de cellules Cette technique permet de trier les cellules en fonction de certains critères. On l utilise notamment pour caractériser la production d une protéine fluorescente dans une culture de cellules par rapport à une autre culture qui ne la produirait pas. Cet outil permet de détecter les cellules fluorescentes en leur affectant une charge négative, les cellules non fluorescentes seront affectées d une charge positive. Un système de tri va ensuite séparer les cellules chargées négativement des cellules chargées positivement. On obtient un graphique qui montre le nombre de cellules en fonction de l intensité mesurée. 3) L électrophorèse On applique un champ électrique entre deux extrémités d un gel afin de séparer les molécules d un mélange initial en fonction de leurs caractéristiques physico-chimiques. On dépose un mélange de protéines dans le puits d un gel de polyacrylamide avec du SDS, qui dénature les protéines, et les charge négativement, permettant leur migration vers le pôle + du gel. On peut ainsi séparer les différentes protéines uniquement en fonction de leur taille, appelée poids moléculaire. Les petites protéines migrent plus vite, donc plus loin, en se faufilant dans les mailles plus petites du gel. Le dithiothréitol (DTT) permet de rompre les ponts disulfures. 4) Immunofluorescence Cette technique est utilisée pour repérer une molécule dans une cellule, grâce à des anticorps liés à des fluorochromes. On utilise un anticorps primaire contre la molécule que l on recherche, puis un anticorps secondaire celui qui est lié au fluorochrome contre l anticorps primaire. 5

6 5) Expression d une protéine fluorescente dans une cellule eucaryote Il est possible de faire exprimer par la cellule elle-même une protéine fluorescente. On prépare par génie génétique un fragment d ADN où le gène de la protéine à étudier a été combiné à un gène qui code pour une protéine fluorescente. Une protéine de fusion est alors crée, entre la protéine d intérêt et la protéine fluorescente. On fait rentrer l ADN recombinant par 3 méthodes : - Micro-injection : on injecte l ADN recombinant à l aide d un micropipette. - Electroporation : on perméabilise la membrane de la cellule par un choc électrique, pour que l ADN recombinant puisse y pénétrer. - Transfection : on encapsule l ADN recombinant dans un liposome qui fusionne avec la membrane plasmique de la cellule et y relargue l ADN 6

7 Chapitre n 1 : Introduction à la biologie Exercices Avant propos : En biologie cellulaire, vous serez interrogés sur des questions de cours, mais également sur des exercices mettant en application vos connaissances et nécessitant une bonne réflexion. Ce sont deux façons différentes d évaluer vos connaissances et il vous faudra savoir manier les deux. Concernant les exercices, les énoncés sont souvent très longs, noyant ainsi les informations importantes. Dans ce cas, n hésitez à vous armer d un stabylo ou d un brouillon pour faire le tri ;) Question 1 : Parmi ces propositions sur la spécificité du vivant, laquelle (lesquelles) est (sont) exactes? A. Les cellules eucaryotes sont la version primitive des cellules. B. Le vivant possède un haut degré de complexité de d organisation. C. Les virus sont des cellules néfastes aux autres êtres vivants. D. La cellule vit rarement seule. E. Chez un être humain on trouve plus de cellules eucaryotes que de bactéries. Question 2 : Parmi ces propositions sur la cellule et l origine du vivant, laquelle (lesquelles) est (sont) exactes? A. Une cellule animale mesure en moyenne en 0,01 et 0,03 mm. B. Les premières cellules sont probablement apparues il y a 1,5 milliards d années. C. L ATP est la molécule principale de stockage de l énergie et peut stocker environ 10 kcal/mol. D. La grande diversité structurale et fonctionnelle des cellules est à l origine de fonctions très variées chez les êtres vivants. E. La cellule élémentaire est un petit compartiment limité par une membrane, une monocouche de phospholipides. Question 3 : Parmi ces propositions sur les outils d étude cellulaire, laquelle (lesquelles) est (sont) exactes? A. La résolution de la microscopie photonique est de 0,2µm. B. En microscopie photonique à fluorescence, l utilisation de la fluorescéïne rend visible les constituants cellulaires ciblés en bleu. C. L introduction de molécules fluorescentes ou marquées dans les cellules peut se faire par micro-injection, électroporation ou migration. D. La microscopie électronique à transmission (MET) permet de reconstituer une image en 3D. E. Lors d une cytométrie en flux et trieur de cellules, les cellules fluorescentes sont affectées d une charge négative. Les questions 4 à 6 sont liées. Les infections à rotavirus sont la première cause de diarrhée aiguë sévère du jeune enfant dans le monde. Ces virus infectent les entérocytes matures de l intestin grêle et causent des dommages structuraux et fonctionnels. Un modèle proposait l hypothèse suivante : la diminution de l activité des disaccharidases résulte de la destruction des entérocytes infectés au niveau de l extrémité des villosités. Cependant ce modèle physiopathologique ne peut pas expliquer les situations dans lesquelles une diminution de l activité des disaccharidases est observée lorsque l intestin infecté par le rotavirus présente seulement des modifications histo-pathologiques. En effet, en fonction de la sévérité des modifications histo-pathologiques, il a été démontré que l activité des disaccharidases (sucrase-isomaltase, lactase et maltase-glucoamylase) est plus ou moins réduite. 7

8 Nous allons nous intéresser aux cellules Caco-2-enterocyte-like, où la souche de rotavirus RRV se multiplie et est relâchée sans destruction cellulaire. Dans cet exercice nous allons essayer de trouver la cause de la diminution de l activité de la sucrase-isomaltase à la surface des cellules Caco-2- enterocyte-like. On peut considérer que l activité de la sucrase-isomaltase est proportionnelle à sa quantité à la membrane des cellules Caco-2. Les cellules Caco-2 ont été prélevées à partir d un adénocarcinome de côlon humain, puis mises en culture en présence de DMEM (Dulbecco/Vogt modified Eagle s minimal essential medium, un milieu de culture propice aux cellules Caco-2), d acides aminés, de glucose et de péniciline. Après 24 heures de culture, on analyse l activité de la sucrase-isomaltase, du γ-glu, du DPP IV, de l APN et de l AP. Les résultats sont présentés sur les graphes ci-dessous. La barre hachurée représente l activité des enzymes étudiés dans les cellules Caco-2 contrôles, la barre blanche dans les cellules infectées par RRV. On a également fait une immunofluorescence d un antigène spécifique présent à la surface des virus RRV, les résultats sont présentés sur l image de gauche. Figure 1 Question 4 : En vous basant sur les documents ci-dessus et vos connaissances, indiquer la (les) proposition(s) exacte(s) : A. L image de gauche a été obtenue grâce à un microscope électronique à transmission. B. Les cellules de l image de gauche seront détruites par le rotavirus RRV. C. Seule l activité de la sucrase-isomérase diminue sensiblement parmi celles des protéines analysées. D. L activité de l enzyme APN est la même dans les cellules contrôles et dans les cellules infectées par RRV. E. La culture de cellules Caco-2 est une culture de cellules souches. 8

9 On essaye également de voir la localisation de l activité de la sucrase-isomaltase (partie A) et de la dipeptidylpeptidase-4 (DPP IV) (partie B). On réalise une immunofluorescence par micro-injection pour détecter la SI dans la partie A et la DPP IV dans la partie B du document. La dipeptidylpeptidase-4 est tout comme la sucrase-isomaltase un enzyme. Les résultats sont présentés ci-dessous : Figure 2 Question 5 : En vous basant sur les documents ci-dessus et vos connaissances, indiquer la (les) proposition(s) exacte(s) : A. Les images ci-dessus confirment la diminution de l activité de la sucrase-isomaltase dans les cellules infectées par RRV. B. La dipeptidylpeptidase-4 dans les cellules contrôles et dans les cellules infectées par RRV colocalise. C. Pour obtenir ces images, on a probablement utilisé des liposomes. D. On a utilisé un anticorps dirigé contre la sucrase-isomaltase et couplé à un fluorochrome. E. La partie de l anticorps qui reconnaît un antigène est Fab. On décide alors de réaliser une expérience pour déterminer le moment de la synthèse de la sucraseisomaltase qui est atteint par l infection par le rotavirus RRV. On réalise une expérience de pulsechase, qui consiste à introduire dans la cellule un acide aminé radioactif au moment du pulse, ici la méthionine-35s, ce dernier constituant ensuite les protéines en cours de synthèse, et de suivre l évolution de ces protéines au cours du temps (chase). De cette façon, on peut voir quelle étape de la synthèse de la sucrase-isomaltase est altérée. Des cellules Caco-2 contrôles et des cellules Caco-2 infectées par le rotavirus RRV subissent un pulse d 1 heure avec de la méthionine-35s, puis la localisation de la sucrase-isomaltase dans la cellule est suivie au cours du temps. Après chaque temps de chase, on fait immunoprécipiter la sucraseisomaltase des cellules contrôles (C) et infectées par RRV (I) ; ces protéines recueillies sont analysées par SDS-PAGE. 9

10 Le graphique B représente la quantité de sucrase-isomaltase en cours de synthèse dans les cellules Caco-2 contrôles et infectées par RRV, à différents temps de chase. Figure 3 Question 6 : En vous basant sur les documents ci-dessus et vos connaissances, indiquer la (les) proposition(s) exacte(s) : A. La quantité de sucrase-isomaltase synthétisée dans les cellules Caco-2 contrôles est inférieure à la quantité de sucrase-isomaltase synthétisée dans les cellules Caco-2 infectées par RRV. B. L image A est obtenue par microscopie photonique. C. Une chase réalisée tout de suite après le pulse ne met en évidence que des sucrase-isomaltases à 200 kda. D. Après 3 heures de chase, on trouve la même proportion de sucrase-isomaltase 200 kda et 210 kda dans les cellules contrôles et dans les cellules infectées par RRV. E. On en déduit que la synthèse de la sucrase-isomaltase n est pas altérée par le rotavirus RRV. 10

11 Chapitre n 2 : Noyau interphasique Cours I- INTRODUCTION 1) Caractéristiques du noyau Le noyau est présent chez les cellules eucaryotes uniquement. Les cellules procaryotes n en possèdent donc pas. Le noyau est délimité par une enveloppe nucléaire (EN), constituée d une double membrane, et forme un compartiment particulier au sein de la cellule. Dans le compartiment du noyau se trouvent la chromatine (constituée d ADN et de protéines), le nucléole, et toutes les molécules et complexes moléculaires nécessaires au fonctionnement de l ADN et à la maturation des ARN. Ainsi, le noyau contient la quasi-totalité de l ADN de la cellule (la mitochondrie possède un génome propre). Le noyau ne contient pas la même quantité d ADN tout au long du cycle cellulaire (constitué des phases G1/S/G2/M). En effet, pendant la phase S a lieu la réplication de l ADN, c est-à-dire la formation d une 2 ème chromatide sur chaque chromosome. Ainsi, en G2, la quantité d ADN est deux fois plus importante qu en G1. Le noyau est visible pendant l interphase (G1/S/G2), lorsque les chromosomes sont décondensés. Pendant la mitose, il y a rupture de l enveloppe nucléaire, le noyau perd donc son individualité, par contre les chromosomes sont visibles car ils sont condensés. 11

12 2) Grandes fonctions du noyau Le noyau assure 3 grandes fonctions : Stockage des molécules d ADN (l ADN est compacté sous forme de chromatine). Synthèse des acides nucléiques (ADN, ARNt, ARNm, ARNr). Transports nucléocytoplasmiques (via les pores). Attention : - La synthèse des protéines s effectue dans le cytoplasme! - L ADN ne sort pas du noyau! II- CHROMATINE 1) Définition La chromatine est un complexe formé d ADN, d histones, et de protéines non histones (protéines de la charpente). Elle correspond à la structuration des 46 chromosomes humains, à leur «empaquetage» (c est ce qui permet de faire tenir 2,5 mètres d ADN dans un noyau de 5-6µm de diamètre). 2) Hétérochromatine et euchromatine Il existe deux types de chromatine qui diffèrent au niveau structurel (organisation de la chromatine), fonctionnel (expression des gènes), biochimique et par leur localisation. Type de chromatine Structure Expression des gènes Localisation Modifications biochimiques Hétérochromatine (HC) Condensée Non Inactive Non associée aux polymérases et non transcrite Contre la membrane nucléaire interne -Hypoacétylation des histones H3 - Méthylation de l ADN Euchromatine (EC) Peu condensée Oui Active Peut subir transcription et traduction. Dispersée dans le nucléoplasme Forme des boucles entre des zones d HC -Hyperacétylation des histones H3 - Pas de méthylation de l ADN Attention : L hétérochromatine est inactive, mais pas forcément de manière irréversible : - Hétérochromatine constitutive : inactive de façon irréversible. On la trouve par exemple au niveau du centromère, des télomères et du chromosome X. - Hétérochromatine facultative : elle peut se transformer en euchromatine, et peut donc retrouver sa capacité transcriptionnelle. 12

13 3) Différentes échelles de condensation de l ADN De la double hélice d ADN jusqu au chromosome, il existe plusieurs échelle de condensation successive de l ADN : o Nucléosome : Le nucléosome est le constituant de base de la chromatine. Il est constitué de 146 paires de base d ADN enroulées autour de 8 molécules d histones (ce qui forme un octamère : 2[H 2A + H 2B] + 2[H 3 + H 4]). Le maintien de l ADN autour de l octamère d histones est assuré par des interactions électrostatiques entre l ADN et les protéines. o Fibre nucléosomique : La fibre nucléosomique (ou nucléofilament) est formée d une succession de nucléosomes, reliés par de l ADN de liaison (54 paires de bases). On l assimile à un «collier de perles» où chaque perle est un nucléosome. Elle mesure environ nm de diamètre. Un nucléosome peut être libéré de la fibre nucléosomique par digestion de l ADN de liaison par une enzyme appelée nucléase (attention : la nucléase peut dégrader l ADN de liaison exposé mais ne peut pas attaquer l ADN enroulé autour des histones). o Fibre de chromatine : La fibre nucléosomique correspond à la compaction du nucléofilament. Elle mesure environ 30 nm de diamètre. L ADN entrant et l ADN sortant d un nucléosome ne se croisent pas à 180, mais sont parallèles : ainsi, les nucléosomes qui se suivent ne sont donc pas sur une même ligne mais sont en zigzag. Une cinquième histone (H1) se place au niveau du pincement entre l ADN entrant et l ADN sortant de chaque nucléosome. Son rôle serait entre autre de déplacer les queues des histones H3, les libérant de leur interaction avec l ADN. Ceci permet donc de moduler le degré de compaction de l ADN et assure la plasticité du mouvement. 13

14 o Chromatide : La fibre de chromatine se reploie en boucles, qui s organisent d elles-mêmes en rosettes à 7 pétales, qui par empilement vont former une chromatide d un chromosome mitotique. Remarque : En G1, le chromosome interphasique est constitué d une seule fibre chromosomique (ou chromatide), en G2 (donc après la réplication), il est constitué de deux fibres chromosomiques. 4) Place d un chromosome interphasique dans le noyau Bien que non discernables comme des entités séparées, les chromosomes interphasiques sont organisés et individualisés à l intérieur du noyau. Chaque chromosome occupe un volume défini dans le nucléoplasme, appelé territoire chromosomique. L organisation des chromosomes dans l espace nucléaire contraint un gène donné à occuper une position particulière qui le rendra plus ou moins accessible aux protéines régulatrices. L ARNm nouvellement synthétisé se trouve en périphérie des territoires chromosomiques. 5) Matrix Attachment Region (MAR) Les MARs sont des séquences d ADN ( paires de base) associées à la matrice nucléaire pendant l interphase. Ces éléments jouent un rôle dans la structure de la chromatine, en organisant le génome des cellules eucaryotes en boucles indépendantes de chromatine. Une telle ségrégation de la chromatine permet de former des régions d ADN décompacté, plus accessible à la machinerie de transcription. Une boucle d euchromatine contient classiquement plusieurs gènes, avec pour chacun un site d initiation de la transcription. Une origine de réplication existe sur chaque boucle, en général au centre de la boucle. 14

15 6) Grandes fonctions de l ADN dans le noyau interphasique o Réplication de l ADN pendant la phase S de l interphase : Il s agit d une synthèse bidirectionnelle des brins d ADN à partir d un œil de réplication : On peut mettre en évidence la réplication de l ADN en incorporant de la thymidine tritiée (radioactive) au milieu de culture : elle est incorporée à l ADN lors de la réplication et sa radioactivité permet de localiser l ADN répliqué par autoradiographie. o Transcriptions : - Transcription des ARNm grâce à une ARN polymérase - Maturation de l ARNm, avec deux types d événements : Modifications en 5 P (coiffe), et en 3 OH (queue polya) Excision des introns et épissage des exons Le deuxième rôle du nucléosome : Le nucléosome n est pas seulement un moyen d empaqueter l ADN, il joue également un rôle essentiel pour rendre possible les grandes fonctions nucléaires : transcription, réplication, réparation de l ADN. En effet, en modifiant la compaction de l ADN, le nucléosome va rendre l ADN plus ou moins accessible aux protéines régulatrices. 15

16 Il existe trois possibilités pour moduler l activité du nucléosome : o Des complexes de remodelage avec ATPase : ils suppriment les liaisons phosphates et distendent partiellement les contacts entre ADN et histones o Des modifications post-traductionnelles : aux extrémités des histones, il y a mise en place de protéines de régulation, qui vont changer la configuration spatiale. o Des incorporations de variants d histones, qui existent physiologiquement dans la cellule. 7) Technique de l étalement moléculaire Cette technique permet de mettre en évidence deux images de la chromatine correspondant à deux niveaux de compaction de la chromatine interphasique, d obtenir des images des gènes en action, d obtenir des images de la réplication de l ADN. Etapes de l étalement moléculaire : On plonge les cellules dans une solution saline de faible concentration, ce qui permet de maintenir les liaisons entre l ADN et les histones On ajoute un détergent pour lyser les membranes cellulaires, et un polyanion qui étale la chromatine (les charges négatives du polyanion repoussent les charges négatives de l ADN) Une centrifugation permet de récupérer les noyaux On observe la chromatine qui s échappe des noyaux lysés et on l observe au MET après l avoir vaporisée avec du platine. 16

17 III- NUCLEOLE 1) Définition Le nucléole est le site de la biogenèse des sous-unités ribosomiques 40s et 60S. Il s agit d une zone de stockage transitoire de produits de la transcription (sauf l ARNr 5S) et de la maturation des ARNr (= ARN ribosomaux). Attention : le nucléole est dépourvu de membrane! 2) Organisateurs nucléolaires Le nucléole est organisé autour des organisateurs nucléolaires, c est-à-dire des boucles comportant les gènes des ARNr 47S. Chez l Homme, les gènes des ARNr sont situés sur les chromosomes 13, 14, 15, 21 et 22 : il existe donc au total 10 boucles = 10 organisateurs nucléolaires. L ADN qui porte les gènes des ARNr correspond à l ADN des constrictions secondaires des chromosomes concernés (constriction primaire = le centromère). 17

18 3) Evolution du nucléole après la mitose Au début de l interphase, le noyau possède autant de nucléoles que d organisateurs nucléolaires, c est-à-dire 10. Puis les nucléoles grossissent et confluent pour n en former en général qu un seul. Pendant la mitose, le nucléole disparaît, il se reconstitue pendant la phase G1. 4) Structure du nucléole On peut distinguer différentes «zones» au niveau du nucléole, chacune étant le lieu d un évènement particulier : - Centres fibrillaires (CF) : ils correspondent aux espaceurs intergéniques non transcrits (c est-à-dire les zones de l ADN qui séparent deux gènes et qui ne subissent pas la transcription) - Composants fibrillaires denses (CFD) : ils sont le site de maturation des ARNr - Frontière entre CF et CFD : c est le lieu de la transcription (donc du passage de l information sous forme d ADN à l ARN). - Composant granulaire : c est le lieu de stockage des sous unités ribosomiques avant leur exportation (car la vitesse de fabrication des sous unités est supérieure à la vitesse de leur exportation vers le cytoplasme). 18

19 5) Etape de la biogenèse des sous unités ribosomiques o Il y a tout d abord transcription de l ADNr, qui est situé au niveau des organisateurs nucléolaires du nucléole, en ARNr 47s, sous l action de l ARN polymérase I. o Puis on observe une maturation de cet ARNr 47S, qui est coupé progressivement pour aboutir aux différents types d ARN ribosomaux : ARNr 28S, ARNr 18S et ARNr 5,8S. o Afin de former les sous-unités ribosomiques qui constitueront les ribosomes, les ARNr du nucléole sont rejoints par : L ARNr 5S, synthétisé dans le noyau mais PAS dans le nucléole, grâce à l ARN polymérase III. Des protéines ribosomiques, qui sont synthétisées dans le cytoplasme, à partir d ARNm transcrit dans le noyau par l ARN polymérase II. o Il y a ensuite formation des petite et grande sous unités ribosomiques : - Petite sous-unité 40S : formée d ARNr 18S et de protéines. - Grande sous-unité 60S : formée d ARNr 5,8S et 28S + ARNr 5S + protéines. o Enfin, ces deux particules pré-ribosomiques (la petite et la grande sous-unité) sont exportées dans le cytoplasme, où elles s assemblent pour former un ribosome mature 80S. 19

20 IV- ENVELOPPE NUCLEAIRE ET PORES 1) Enveloppe nucléaire L enveloppe nucléaire est formée par : - Une membrane externe, recouverte de ribosomes - Une membrane interne, tapissée de lamina, du côté du nucléoplasme - Un espace intermembranaire périnucléaire, qui est en communication avec la cavité du reticulum endoplasmique granuleux (REG). L enveloppe nucléaire est percée de pores, qui permettent la communication entre le nucléoplasme et le cytoplasme. 2) Structure du Nuclear Pore Complex = NPC Un pore nucléaire mesure environ 120 nm de diamètre. Il est constitué de 3 anneaux : - L anneau nucléoplasmique est situé sur la face nucléaire (donc la face interne de l enveloppe nucléaire). - L anneau cytosolique se trouve sur la face cytoplasmique. Ces deux anneaux présentent une symétrie d ordre 8, c est-à-dire qu ils possèdent 8 rayons disposés autour d un transporteur central, qui traverse la double membrane nucléaire. Le diamètre de ce canal, qui représente l ouverture proprement dite du pore, varie de 10 à 30 nm. - Un troisième anneau, plus petit, se situe dans le nucléoplasme (petit anneau nucléoplasmique). Il est relié à l anneau nucléoplasmique par des filaments radiaires qui vont former une cage. Des filaments cytosoliques partent de l anneau cytosolique vers le cytoplasme. De même, des filaments nucléoplasmiques partent depuis le petit anneau nucléoplasmique. Enfin, le NPC est constitué de nombreuses protéines (environ 400, dont 30 types différents) : les nucléoporines. Certaines de ces nucléoporines sont des glycoprotéines ancrées dans l enveloppe nucléaire. 20

21 3) Transports nucléo-cytoplasmiques a) Molécules transportées - Les ions et les petites molécules, dont le poids moléculaire (PM) est inférieur à 40 kda, transitent par les canaux latéraux du pore, sans nécessité d énergie. Il s agit de diffusion passive. - Les grosses molécules passent par le canal central du pore, ce transport nécessite de l énergie. b) Protéines Ran - Ran GAP (G Activating Protein) est exclusivement cytoplasmique (près des pores nucléaires). Elle stimule l hydrolyse du GTP en GDP par Ran. Ran GDP est donc localisée dans le cytosol. - Ran GEF (G Exchange Factor) est exclusivement nucléaire, fixée à la chromatine. Elle favorise l échange du GDP en GTP. Ran GTP est donc localisée dans le noyau. - Cette compartimentation de Ran GDP et Ran GTP de part et d autre de l enveloppe nucléaire conditionne l orientation des échanges nucélo-cytoplasmiques. c) Processus d import : du cytoplasme vers le noyau Il s agit d importer les protéines impliquées dans la transcription, dans la réplication, les protéines associées à l ADN et l ARNr etc. En effet, il est important de se souvenir que la fabrication des protéines a lieu dans le cytoplasme et non dans le noyau, mais que certaines protéines sont indispensables au fonctionnement du noyau : il faut donc les importer. 21

22 Etapes : 1- Assemblage importine β / protéine NLS (= Nuclear Localization Signal) dans le cytoplasme qui est dépourvu de Ran GTP. 2- Passage du pore (entrée dans le noyau) et liaison de l importine β avec Ran GTP, pour lequel elle a une grande affinité. 3- Désassemblage spontané de l importine β et de son cargo (car l affinité de l importine β pour le Ran GTP est plus grande que celle pour le cargo). 4- Nouveau passage du pore (sans la protéine NLS) et nécessité d un complexe de désassemblage (Nup358 + Ran GAP) qui va hydrolyser Ran GTP en Ran GDP l importine β est à nouveau sans cargo, prête à être réutilisée. * NLS : Il s agit d un signal porté par toutes les protéines qui sont destinées à être importées dans le noyau. Remarques : - L importine β travaille soit seule, soit associée à une protéine appelée importine α. - La nucléoporine Nup358 fait partie des filaments cytoplasmiques émanant de l anneau cytosolique. Elle possède des motifs répétés FG (phénylalanine, glycine), 4 domaines de liaison à Ran GTP, et elle est associée à Ran GAP (qui fait l échange GTP GDP). d) Processus d export : du noyau vers le cytoplasme On exporte par exemple des ARNm matures, les petites et grandes sous unités ribosomiques, les ARNt 22

23 Etapes : 1- L exportine rentre seule dans le noyau. 2- Il y a ensuite un assemblage dans le noyau entre l exportine, Ran GTP et une protéine NES (=Nuclear Export Signal). 3- Ce complexe assemblé passe par le pore (et donc entre dans le cytoplasme). 4- Puis il y a un désassemblage du complexe par Nup358 + ran GAP. * NES : Il s agit d un signal porté par les protéines qui sont présentes dans le noyau, et qui sont destinées à retourner dans le cytoplasme. Les protéines NES portent donc aussi un signal NLS puisqu elles se trouvent dans le noyau et ont donc été importées auparavant. e) Nécessité d importer du Ran GDP Il y a une nécessité d importer du Ran GDP dans le noyau. Cette importation se fait via la protéine de transport NTF2. Dans le noyau, Ran GDP sera transformé en Ran GTP par Ran GEF, afin de reconstituer le stock de Ran GTP dans le noyau, qui s épuise à force d être exporté dans le cytoplasme avec les importines et exportines. 23

24 f) Molécules intervenant dans l export des ARN Selon le type d ARN, ce ne sont pas les mêmes molécules qui interviennent dans leur export : - Export des ARNt : exportine-t et exportine-5 - Export des sous unités ribosomiques : exportine-1 - Export des ARNm : il ne repose ni sur l intervention des karyophérines (importines et exportines), ni sur le gradient Ran GTD / Ran GDP. Il se fait grâce à des protéines associées à l ARNm pendant sa maturation, qui ne possèdent pas de NES mais des domaines d affinités pour les FG (Phe Gly) répétés des nucléoporines du canal, ce qui permet leur déplacement au travers du canal. V- LAMINA La lamina est une couche protéique de 0,2 µm au contact de la membrane nucléaire. Elle est constituée de lamines, des filaments intermédiaires très résistants. La lamina a ainsi un rôle dans l architecture du noyau. Il y a deux types de lamines : - Type A : Lamines A et C. Elles sont produites par épissage alternatif du gène LMNA. - Type B : Lamines B1 et B2 (provenant de deux gènes différents). Une mutation des lamines peut avoir plusieurs conséquences : - Une perturbation des transports nucléo-cytoplasmiques, car les lamines intéragissent avec les nucléoporines. - Une perturbation de l organisation de la chromatine, car les lamines participent à la fixation des chromosomes à l enveloppe nucléaire. - Une production d ARN anormaux, car l euchromatine se fixe sur des petits agrégats de lamines (par exemple : les MARs) dans le nucléoplasme, pour la réplication, la réparation de l ADN, la transcription et l épissage des ARNm. 24

25 Chapitre n 2 : Noyau interphasique Exercices Question 1 : Parmi les propositions suivantes concernant la chromatine et l étalement moléculaire, laquelle (lesquelles) est (sont) exacte(s)? A. Le nucléotide est le constituant de base de la chromatine. B. Le détergent utilisé lors de l étalement moléculaire rompt l enveloppe nucléaire. C. Lorsque l on utilise la technique de l étalement moléculaire, on applique une forte force ionique afin de séparer l ADN des histones. D. Un chromosome est formé à partir de deux fibres de chromatine. E. La fibre nucléosomique correspond à l euchromatine et la fibre de 30nm à l hétérochromatine. Question 2 : Parmi les propositions suivantes concernant le nucléole, laquelle (lesquelles) est (sont) exacte(s)? A. La transcription se déroule à la frontière entre composant fibrillaire dense et composant granulaire. B. La grande sous unité ribosomique contient uniquement l ARNr 5,8S, 28S, 5S. C. La petite sous unité ribosomique se forme grâce à deux types d ARN polymérases uniquement, la I et la II. D. Les protéines ribosomiques s assemblent sur l ARN 47S après sa synthèse. E. Les unités géniques de l ARN 47S représentent l hétérochromatine nucléolaire. Question 3 : Parmi les propositions suivantes concernant le nucléole, laquelle (lesquelles) est (sont) exacte(s)? A. Au début de l interphase, le noyau possède autant de nucléoles que d organisateurs nucléolaires. B. Les gènes des ARNr 47S correspondent aux constrictions secondaires visibles sur 5 chromosomes différents chez l homme. C. Le nucléole correspond à une accumulation transitoire d ADN, d histones, d ARN polymérase et d ARN. D. Le nombre d organisateurs nucléolaires double lors de la mitose. E. On trouve des protéines dans le nucléole. Question 4 : Parmi les propositions suivantes concernant le noyau, laquelle (lesquelles) est (sont) exacte(s)? A. La cellule procaryote ne contient ni noyau, ni ADN. B. L enveloppe nucléaire est une double membrane. C. Dans un cycle cellulaire l ordre des phases est invariable. D. Les cellules en G0 possèdent des chromosomes bien visibles. E. Le noyau contient tout l ADN de la cellule. Question 5 : Parmi les propositions suivantes concernant le noyau, laquelle (lesquelles) est (sont) exacte(s)? A. Tous les acides nucléiques sont synthétisés dans le noyau. B. Les protéines participant à la chromatine sont synthétisées dans le noyau. C. L enveloppe nucléaire comporte un espace intermembranaire. D. Parmi les transports nucléo-cytoplasmiques on trouve l importation d ions. E. Parmi les transports nucléo-cytoplasmiques on trouve l importation d acides nucléiques. 25

26 Question 6 : Parmi les propositions suivantes concernant la chromatine, laquelle (lesquelles) est (sont) exacte(s)? A. L hétérochromatine est 10 fois plus condensée que l euchromatine. B. L hétérochromatine forme des boucles entre les zones d euchromatine. C. La chromatine est formée de protéines non histone. D. L euchromatine, au contraire de l hétérochromatine, est dite «active». E. L hétérochromatine se trouve surtout en périphérie du noyau. Les questions 7 à 9 sont liées. Dans cet exercice, on cherche à étudier le rôle de Ran et NTF2 dans les transports nucléocytoplasmiques, ainsi que leur mode de fonctionnement. On décide d abord de faire des expériences utilisant des homocaryons (cellules possédant plusieurs noyaux suite à une fusion) afin de détecter les mouvements de Ran entre les noyaux. Deux cultures de cellules BHK21 (baby hamster kidney) ont été transfectées séparément, l une avec Pkh3Ran, permettant de détecter Ran à l aide d un motif triple hémagglutinine (HA), l autre avec un plasmide codant la fusion avec la GR-GFP (glucocorticoid receptor and green fluorescent protein). Les cellules exprimant HA-Ran sont ensuite mélangées avec les cellules exprimant GR-GFP puis fusionnées à l aide de poly-éthylène glycol pour former des homocaryons. Après minutes d incubation en présence de cycloheximide, permettant l inhibition de la synthèse de nouvelles protéines, les cellules sont fixées et l HA-Ran est détecté par immunofluorescence indirecte (figure 1), le second anticorps utilisé est alors couplé au Texas Red (coloration rouge/violette). On sait que le récepteur aux glucocorticoïdes (GR) se déplace entre le cytosol et le noyau, servant ainsi de contrôle positif aux transports nucléo-cytoplasmiques dans cette expérience. Lorsque les deux colorations (GFP et Texas Red) sont présentes au même endroit, on observe du jaune (apparaît en blanc sur ce schéma). Figure 1 : 26

27 Question 7 : Parmi les propositions suivantes concernant cette première expérience, laquelle (lesquelles) est (sont) exacte(s)? A. Le résultat 1 est obtenu si HA-Ran se déplace à l intérieur et à l extérieur du noyau. B. Le résultat 2 est obtenu si HA-Ran reste dans le noyau. C. Les cellules observées sont vivantes. D. Ces résultats montrent que Ran peut être exporté et importé dans le noyau. E. Il existe un troisième résultat possible où l on observerait des noyaux rouges et des noyaux jaunes. On s intéresse maintenant au rôle de NTF2 dans ces transports. Des cellules perméabilisées sont incubées avec du NTF2 recombinant, du Ran et un système de régénération d énergie. Après 30 minutes, les cellules sont fixées et colorées avec des anticorps anti-ran (figure 2a). Figure 2 : La coloration DAPI permet le marquage des noyaux. 27

28 On sait que NTF2 peut se lier aux nucléoporines telles que p62. On décide d utiliser un mutant de NTF2 par mutation ponctuelle (E24K), possédant un résidu de lysine en position 42 au lieu de l acide glutamique. NTF2 (E24K) a la capacité de lier p62 mais pas Ran (figure 2b). Question 8 : Parmi les propositions suivantes concernant les expériences précédentes, laquelle (lesquelles) est (sont) exacte(s)? A. La figure 2a montre que l accumulation de Ran dans le noyau est dépendante de la présence d énergie ainsi que sa liaison à NTF2. B. La figure 2a montre qu en l absence de NTF2, Ran ne s accumule plus dans le noyau. C. La figure 2b montre que NTF2 permet l accumulation de Ran dans le noyau en se liant à celuici. D. D après vos connaissances, les noyaux colorés par DAPI apparaissent rouges. E. D après vos connaissances, si on avait réalisé une mutation empêchant la liaison de NTF2 avec les nucléoporines et non Ran, le résultat observé serait le même que pour la figure 2b (NTF2 E24K, anti-ran). Pour déterminer si l importation nucléaire de Ran par NTF2 est spécifique, ou s il s agit d une propriété commune à toutes les protéines se liant à Ran et pouvant intéragir avec les nucléoporines, on observe les effets de la transportine et de l importine-β dans l importation de Ran en absence de NTF2 (figure 3a). Pour conclure ce tout petit exercice vraiment trop court pour vous, on se demande si Ran-GTP peut fonctionner seul en tant que substrat pour l importation en utilisant un Ran-GTP mutant : Ran(G19V), qui est insensible à RanGAP (figure 3b). 28

29 Figure 3 : Question 9 : Parmi les propositions suivantes concernant les expériences précédentes, laquelle (lesquelles) est (sont) exacte(s)? A. La transportine permet l importation de Ran. B. L importine-β permet l importation de Ran. C. La transportine peut avoir un rôle de séquestration de Ran à l intérieur du noyau lorsque NTF2 est présent. D. Ran (G19V) est un bon substrat pour l accumulation nucléaire de Ran. E. D après vos connaissances, vous savez que si Ran-GTP est insensible à Ran-GAP, le gradient Ran-GTP/GDP est perturbé, d où une perturbation des transports nucléo-cytoplasmiques. 29

30 Chapitre n 3 : Cytosquelette Cours I- PRESENTATION DU CYTOSQUELETTE Le cytosquelette est un des constituants majeurs des cellules : comme son nom l indique, il s agit du «squelette» cellulaire. 1) Constituants Le cytosquelette est un réseau de filaments cytoplasmiques. On décrit 3 grands types de filaments : les microtubules, les microfilaments et les filaments intermédiaires. Chaque type de filament est composé de l assemblage de monomères spécifiques. Ainsi, les microtubules sont composés de monomères de tubuline, les microfilaments de monomères d actine, et les filaments intermédiaires de monomères de kératine principalement. La tubuline et l actine sont des molécules globulaires, tandis que la kératine est une molécule fibreuse, allongée. La distribution spatiale et l organisation de chaque type de réseau de filaments est particulière. Au sein d une cellule épithéliale par exemple, les microfilaments ont une distribution sous-corticale (sous la membrane plasmique) ; les microtubules quant à eux sont accrochés au centrosome (structure centrale près du noyau) et rayonnent vers la périphérie ; enfin les filaments intermédiaires se distribuent de la périphérie (membrane plasmique) vers le centre. 2) Fonctions du cytosquelette Le cytosquelette assure deux grandes fonctions au sein des cellules : - Une fonction structurale : il permet le maintien de la structure cellulaire (lui confère sa forme) et l adaptation de cette structure à l environnement, ainsi que le positionnement des organites intracellulaires. - Une fonction motrice : il permet le déplacement des organites et des vésicules au sein des cellules (= trafic intracellulaire) et déplacement des cellules elles-mêmes (= motilité). La contribution du cytosquelette à ces différentes fonctions dépend du type de filament et des protéines qui lui sont associées. Par ailleurs, les différents types de filaments s associent ou se relayent pour assurer ces fonctions. Il est important de noter que chaque type de filament a des propriétés spécifiques de résistance à la déformation. Les filaments intermédiaires sont les plus résistants à la déformation, ils sont doués d une certaine élasticité. 30

31 II- FILAMENTS INTERMEDIAIRES 1) Structure et assemblage des filaments intermédiaires Les filaments intermédiaires (FI) sont des structures fibreuses, compactes et résistantes. Ils sont formés par l association complexe de nombreux monomères. La région centrale de ces monomères est riche en hélices α, conférant ainsi aux FI leur structure en bâtonnets, et riche en répétitions heptade (coil-coil), ce qui favorise les interactions protéine-protéine. L assemblage d un FI se fait grâce à l enroulement successif de plusieurs monomères, ce qui lui confère sa grande résistance. Les monomères constitutifs des FI mesurent en moyenne 48nm de long. Ils s assemblent deux à deux, formant ainsi des dimères superenroulés. Ces dimères s assemblent tête-bêche pour former des tétramères, qui euxmême s assemblent pour former des octamères superenroulés. La formation d un filament intermédiaire résulte de l association de plusieurs de ces octamères. 2) Diversité des filaments intermédiaires Il existe une grande diversité de monomères de filaments intermédiaires, responsables des diverses localisations et fonctions de ces filaments : - Kératine (21 espèces) : cellules épithéliales. - Vimentine : cellules d origine endodermique. - Protéines de neurofilaments : cellules nerveuses. - Lamines nucléaires : lamina nucléaire. - Desmine : cellules cardiaques. La partie centrale de ces différents monomères est quasiment identique. Ce sont les extrémités N- terminale et C-terminale des monomères qui confèrent des propriétés différentes aux filaments intermédiaires ainsi formés. 3) Fonctions des filaments intermédiaires Les FI assurent le maintien de l architecture cellulaire et tissulaire (= fonction structurale). Exemples : cohésion et stabilité mécanique au sein des épithéliums (filaments intermédiaires de kératine), continuité et élasticité neuronale (neurofilaments), stabilisation de la membrane nucléaire et interaction avec la chromatine (lamines nucléaires). 31

32 III- MICROTUBULES 1) Structure et assemblage des microtubules Les microtubules (MT) sont des filaments formés de deux types de monomères globulaires très semblables : la tubuline α et la tubuline β, cette dernière contenant du GTP échangeable. L assemblage des MT comprend trois phases : - La nucléation : La tubuline α et la tubuline β s associent pour former des dimères, qui euxmêmes s additionnent les uns à la suite des autres (=polymérisation) donnant ainsi des protofilaments. A partir d une certaine longueur de protofilaments, ceux-ci se replient sur eux-même pour former un tube creux. - L élongation : La polymérisation continue et le tube creux s allonge, donnant ainsi naissance à un microtubule. - L équilibre : Il existe une concentration critique (Cc) en dimères pour laquelle la polymérisation (gain de sous-unités) et la dépolymérisation (perte de sous-unités) s équilibrent : on obtient alors un MT de taille constante. L assemblage des MT est asymétrique : il existe une extrémité (+) à croissance rapide et une extrémité (-) à croissante lente. Cette asymétrie est retrouvée in vivo dans tous les types cellulaires, on parle de cellules «polarisées». Elle est liée à des problèmes de conformation et d affinité : La forme des dimères n est pas favorable à leur insertion à l extrémité (-) du MT, contrairement à l autre extrémité. Il doit donc y avoir un changement de conformation des dimères pour que la polymérisation puisse se faire via l extrémité (-), d où une vitesse de formation du MT plus lente de ce côté. De plus, une hydrolyse du GTP des tubulines en GDP survient peu de temps après l association du dimère au MT. Or la forme GDP a moins d affinité pour le polymère que la forme GTP et tend à se dissocier du MT. Puisque l élongation du MT à l extrémité (+) est rapide, les dimères sous forme GTP n ont pas le temps d être hydrolysés sous forme GDP, contrairement à l extrémité (-) dont l élongation est lente. Ainsi, l équilibre croissance/dépolymérisation est dynamique et repose sur des mécanismes complexes de phosphorylation/déphosphorylation du couple GTP/GDP. La concentration en dimère GTP est critique pour l élongation : si cette concentration est suffisante (C >> Cc), l élongation est plus rapide que l hydrolyse et le microtubule croît. Certaines drogues viennent perturber cette dynamique : - Colchicine, vinblastine, nocodazole : bloquent la polymérisation et provoquent la dépolymérisation. - Taxol et GTPγS : bloquent la dépolymérisation en empêchant l hydrolyse du GTP en GDP. 32

33 2) Protéines associées aux microtubules Deux types de protéines sont associés aux microtubules : - Des protéines régulatrices qui permettent la stabilisation des extrémités des MT, la formation de liaisons entre plusieurs MT, des interactions avec divers composants cellulaires. Exemples : MAP-2, tau. - Des protéines motrices (moteurs moléculaires) qui assurent le transport de divers éléments le long des MT. Exemples : kinésines (se déplaçant vers l extrémité (+) du MT = trafic antérograde) et dynéines (se déplaçant vers l extrémité (-) du MT = trafic rétrograde). 3) Fonctions des microtubules Le rôle principal des MT est le trafic intracellulaire (=fonction motrice), c est-à-dire le transport de vésicule, d ARNm, de complexes chromosomes/protéines associées, de virus, etc. Ces différents «chargements» sont pris en charge par des moteurs moléculaires (kinésines et dynéines) distincts. Les MT jouent également un rôle d organisation du cytosol et des compartiments membranaires (=fonction structurale). Le centrosome, organite situé près du noyau, est le centre organisateur des MT. Il supporte leur asymétrie et permet leur polymérisation : c est un centre nucléateur. Les MT enchâssés dans le centrosome par leur extrémité (-) ont une grande dynamique, ce qui assure le positionnement des organites intracellulaires. Ainsi, le REG se distribue le long des MT en ramifiant vers l extérieur, tandis que l appareil de Golgi est ramassé autour du centrosome grâce aux dynéines qui le ramènent vers le centre de la cellule. Centrosome entouré de MT Cellule et ses organites 33

34 IV- MICROFILAMENTS 1) Structure et assemblage des microfilaments L assemblage des microfilaments (MF) est similaire à celui des microtubules. La polymérisation se réalise par ajout de monomères d actine aux deux extrémités, mais se fait de façon asymétrique puisque la croissance est plus rapide à l extrémité (+) qu à l extrémité (-). Il existe toutefois quelques différences avec l assemblage des microtubules : - Tous les monomères d actine sont les mêmes (pas de monomère α et β). - Ces monomères renferment une molécule d ATP échangeable (et pas du GTP). - Une fois polymérisé, le MF forme un tube plein (et pas creux comme le MT). - La polymérisation se fait plus lentement que pour les MT. De plus, lorsque les deux extrémités du MF sont libres et que les conditions de concentration intracellulaire d actine sont favorables, l association et la dissociation aux deux extrémités se fait à la même vitesse. Dans ce cas particulier, la longueur du filament reste constante mais le filament se déplace en glissant : c est ce qu on appelle le «treadmilling». Enfin, certaines drogues viennent perturber la dynamique des MF : - Cytochalasines : bloquent la polymérisation en se fixant sur l extrémité (+). - Phalloïdines, ATPγS : bloquent la dépolymérisation. 2) Protéines associées aux microfilaments Les protéines pouvant se lier à l actine des MF sont nombreuses et ont des rôles divers. Nom de la protéine Fonction Protéine participant : Profiline Augmentation de la polymérisation en stimulant l échange GTP GDP Thymosine Blocage de la polymérisation par rétention des monomères d actine A l homéostasie des MF Tropomyosine Consolidation des MF Gelsoline Fragmentation des MF (en présence de Ca 2+) Fimbrine et villine Formation de faisceaux serrés α-actinine Formation de faisceaux larges Filamine Réticulation (formation de réseaux) A l organisation des MF Spectrine et dystrophine Ancrage des MF sur la membrane cellulaire Myosine II (longue queue) Contraction musculaire Aux fonctions motrices Myosine I, V (petite queue) Mouvements sur les MF des MF 34

35 3) Fonctions des microfilaments Les fonctions du réseau de MF sont étroitement dépendantes des protéines associées à l actine. Les MF jouent un rôle dans la création et le maintien des structures cellulaires (= fonction structurale). Exemple : ils participent à la formation des microvillosités et des plaques d adhésion focales. Ils permettent également la motilité (déplacement cellulaire) et un certain trafic intracellulaire (= fonction motrice). Exemple de trafic intracellulaire : certaines bactéries recrutent l actine cellulaire pour se propulser dans la cellule et passer d une cellule à une autre. TABLEAU RECAPITULATIF Type de filament Filament intermédiaire Microtubule Microfilament Diamètre 10 nm 25nm 8 nm Structure Monomères différents selon le type de filament (kératine principalement) Monomères de tubuline (tubuline α et β) Monomères d actine Assemblage Par enroulement successif de plusieurs monomères Par polymérisation et dépolymérisation des monomères (assemblage asymétrique) Protéines associées _ Protéines régulatrices (MAP-2 ; tau) Protéines motrices (kinésine, dynéine) Homéostasie des MF (profiline, thymosine, tropomyosine, gelsoline) Organisation des MF (fimbrine, villine, α-actinine, filamine, spectrine, dystrophine) Fonctions motrices des MF (tropomyosine, myosine) Localisation De la périphérie (membrane plasmique) vers le centre Du centre (centrosome) vers la périphérie Sous la membrane plasmique Fonctions Structurale (maintien de l architecture cellulaire et tissulaire) Motrice (trafic intracellulaire) Structurale (positionnement des organites intracellulaires) Structurale (création et maintien des structures cellulaires) Motrice (motilité, trafic bactérien) 35

36 Chapitre n 3 : Cytosquelette Exercices Question 1 : Parmi les propositions suivantes concernant les filaments intermédiaires, laquelle (lesquelles) est (sont) exacte(s)? A. Les répétitions heptade favorisent les interactions protéine-protéine. B. Un filament intermédiaire de base est composé de 6 octamères. C. Les kératines relient les cellules entre elles par l intermédiaire des jonctions serrées. D. Les neurofilaments assurent la continuité et la rigidité des neurones. E. Des FI sont présents dans le noyau de la cellule. Question 2 : Parmi les propositions suivantes concernant les microtubules, laquelle (lesquelles) est (sont) exacte(s)? A. La colchicine, tout comme le taxol, bloque la polymérisation. B. L assemblage est asymétrique : une extrémité plus à croissance à rapide et une extrémité moins à croissance lente. C. La kinésine est une protéine motrice qui se dirige vers les extrémités moins. D. Il existe une concentration critique en dimère pour laquelle le gain et la perte des sous-unités s équilibrent. E. Le transport n est qu une fonction secondaire des microtubules. Question 3 : Parmi les propositions suivantes concernant les microtubules, laquelle (lesquelles) est (sont) exacte(s)? A. Le centrosome est un centre nucléateur : il supporte l asymétrie des microtubules. B. Des modifications pré-traductionnelles peuvent moduler la stabilité des microtubules. C. Les dynéines et kinésines possèdent des domaines ATPasique. D. La GTPgammaS bloque la dépolymérisation. E. Les microtubules enchâssés dans le centrosome ont une grande dynamique. Question 4 : Parmi les propositions suivantes concernant les protéines de liaison à l actine, laquelle (lesquelles) est (sont) exacte(s)? A. La filamine participe à l homéostasie des microfilaments. B. La spectrine et l a dystrophine assure l ancrage sur la membrane. C. La rétention des monomères d actine entraine un blocage de la polymérisation. D. L interaction entre la myosine I et les microfilaments nécessite du Ca²+. E. La tropomyosine a une fonction motrice. Question 5 : On met une solution de microfilaments en présence d un produit A. On observe alors que ces microfilaments cessent de polymériser même si on les met dans une situation favorisant leur assemblage. D après vos connaissance on peut dire que : A. Le produit A peut être la tropomyosine. B. Le produit A peut être la filamine. C. Le produit A peut être la thymosine. D. Le produit A peut être la phalloïdine. E. Le produit A peut être la cytochalasine. 36

37 Chapitre n 4 : Jonctions cellule-cellule et cellule-matrice Cours Les cellules doivent interagir et coopérer entre elles et avec leur environnement. Ces interactions se font principalement par l intermédiaire de jonctions. Les jonctions sont assurées par des protéines spécifiques et ont des fonctions propres. Toutes les jonctions ont des fonctions de signalisation. I- INTERACTIONS CELLULE CELLULE 1) Jonctions serrées Les jonctions serrées, situées au pôle apical des cellules épithéliales, assurent l imperméabilité et l étanchéité des épithéliums. C est pourquoi elles sont aussi appelées jonctions étanches (tight junctions) ou jonctions occlusives (zonula occludens). Elles portent sur tout le pourtour cellulaire, ce sont ainsi des jonctions en anneau, ou en ceinture (zonula). Leur fonction peut facilement être mise en évidence par addition d un traceur dans le milieu extracellulaire : on remarque qu au pôle apical, les jonctions serrées ne laissent pas passer le traceur, tandis qu au pôle basolatéral le traceur peut s infiltrer dans l espace inter-cellulaire, mais s arrête au niveau des jonctions serrées. Les principales protéines impliquées dans la formation des jonctions serrées sont les occludines et les claudines. Ces protéines sont des tétraspanines : elles sont formées de 4 segments transmembranaires et de 2 boucles extracellulaires hydrophobes ou chargées. Les extrémités N-terminale et C- terminale des protéines sont ancrées dans la cellule et ce sont les boucles qui assurent la liaison entre les cellules adjacentes. Cette interaction est dite homophile, c est-à-dire qu elle a lieu entre des protéines identiques : une occludine interagit avec une occludine, une claudine avec une claudine. Les jonctions serrées sont reliées aux microfilaments d actine des cellules. 37

38 2) Jonctions d ancrage Les jonctions d ancrage assurent l attachement entre les cellules. Il en existe différents types, toutes structurées sur le même modèle : le cytosquelette de chaque cellule est relié à une protéine d attachement intracellulaire, elle-même reliée à une protéine de liaison transmembranaire. Ce sont ces dernières qui assurent l attachement entre deux cellules adjacentes. Il existe deux types de jonctions d ancrage intercellulaires : les jonctions adhérentes et les desmosomes. Entre deux cellules épithéliales adjacentes, on trouve du pôle apical vers le pôle basal : les jonctions serrées, puis les jonctions adhérentes, puis les desmosomes. Cette organisation spécifiques des épithéliums est appelée complexe de jonctions. a) Jonctions adhérentes Dans les jonctions adhérentes, on peut retrouver deux classes de molécules d adhérence cellulaires (CAM) (ou protéines de liaison transmembranaire) : les cadhérines ou les Ig-CAM. o Cadhérines : Il existe plusieurs types de cadhérines, selon le tissu dans lequel elles se situent : E-cadhérine (épithéliums), N-cadhérine (tissu nerveux, cœur), P-cadhérine (placenta, épiderme). Elles permettent un ancrage solide et permanent entre les cellules, et jouent ainsi un rôle majeur dans l adhérence cellulaire. Elles assurent une liaison de type homophile avec les cadhérines de la cellule adjacente. Ce sont des molécules calciumdépendantes, présentant 5 domaines de liaison au Ca 2+. o Ig-CAM : Les Ig-CAM sont des molécules d adhérence cellulaire de la superfamille des immunoglobulines, présentant 5 domaines Ig reliés par des ponts disulfures. Elles assurent une liaison cellulaire de type homophile, mais plus faible que les cadhérines. Ainsi, elles jouent un rôle régulateur et modulent l ancrage des cellules fonction des besoins. Ce sont des molécules indépendantes du calcium. Les cadhérines et les Ig-CAM sont reliées à des glycoprotéines cytoplasmiques qui servent de protéines d attachement : les caténines (présentes sous forme α, β et γ). Le tout est accroché aux microfilaments d actine à l intérieur de la cellule : cette liaison avec le cytosquelette est indispensable. Remarque : Comme les jonctions serrées, les jonctions adhérentes intéressent tout le pourtour cellulaire (zonula adherens). 38