Extrait du sujets de BTS Biochimiste

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1 Extrait du sujets de BTS Biochimiste Exercice 1 Structure primaire (10 points) Une caséine a été séparée et purifiée. Il s'agit d'une protéine de masse molaire moléculaire g/mol. Elle présente une seule chaîne de 199 acides aminés. L'hydrolyse enzymatique par la chymosine conduit à la coupure de plus de 25 liaisons peptidlques. Cette hydrolyse s'effectue préférentiellement au niveau des liaisons contenant le groupe carboxyle d'une phénylalanlne ou d'une leucine. La séquence de l'un des peptides obtenus après action de la chymosine - le peptide P - est recherchée. La composition du peptide P en acides aminés est la suivante Arg, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Ser. L'hydrolyse trypsique du peptide P libère un acide aminé x, un tripeptlde T1 (Glu, Gly, Leu) et un pentapeptide T2 (Ile, His, Lys, Met, Ser). L'action du bromure de cyanogène sur le peptide P conduit à la formation d'un tétrapeptide BC1 et d'un pentapeptide DC2, présentant a son extrémité C terminale : une lactone d'homosérine. L'hydrolyse du peptide P par la thermolysine libère l'acide aminé basique x, un acide aminé y et un heptapeptide. Lors de l'action de la carboxypeptldase A sur le peptide P, le détachement des acides aminés en fonction du temps est le suivant : - apparition de leucine dans les 2 premières minutes, - apparition de leucine et de glycine dans les 5 premières minutes. Déterminer une séquence possible pour le peptide P. Donnée : Document 2 - spécificité des processus de clivage dans l'analyse des séquences d'acides aminés - Document 2: SPECIFICITE DES PROCESSUS DE CLIVAGE UTILISES DANS L'AHALYSE DES SEQUENCES D'ACIDES AMINES PROCESSUS SITE SPECIFICITE COMMENTAIRE 1 - Clivages terminaux 1.1 Clivage d'edman côté C de l'acide aminé N terminal 1.2 Carboxypeptidase A côté N de l'acide aminé C terminal 1.3 Carboxypeptidase B côté N do l'acide aminé C terminal 2 - Clivages Internes 2.1 Bromure de cyanogène Rn = n'importe quel amino-acide Rn = Arg, Lys, Pro Rn -1 = Pro Rn = Arg, Lys Rn -1 = Pro A l'exception des acides aminés N terminaux bloqués côté C de Rn Rn = Met Hautement spécifique 2.2 Trypsine côté C de Rn Rn = Lys, Arg 2.3 Chymotrypsine côté C de Rn Rn = Phe, Trp, Tyr, Leu 2.4 Thermolysine côté N de Rn Rn = Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr, Val Hautement spécifique Occasionnellement Rn = Met ou autres acides aminés Occasionnellement Rn = Ala ou autres acides aminés 2.5 Pepsine côté N de Rn Non spécifique Rn (résidu de rang n) : Indique la localisation du clivage.

2 Exercice 2 Structure primaire d'un peptide. La composition en acides aminés d'un peptide P, déterminée après hydrolyse acide est: Lys 1; Arg 1; AsX 1; Ser 1; GlX 1; Pro 1; Gly 1; Ala 1; Val 1; Met 2; Ile 1; Phe 1. La charge nette de P est +1 à ph 6,4. Après traitement de P par le DNFB. on obtient DNP-Ser. L'action de la carboxypeptidase sur P détache Ile. L'hydrolyse de P par la Trypsine donne 3 oligopeptides dont les compositions en acides aminés déterminées après hydrolyse acide sont : T1 Lys 1; GlX 1; Pro 1; Gly 1; Val 1; Met 1. T2 Arg 1; Ser 1; Ala 1; Met 1; Phe 1. T3 AsX 1; Ile 1. T1 absorbe fortement à 280nm. La charge nette de T3 a ph 6,4 est -1. L'hydrolyse de P par la Chymotrypsine donne 3 oligopeptides dont les compositions en acides aminés, déterminées après hydrolyse acide sont: CT1 Arg 1; Ala 1; Val 1; Met 1. CT2 Lys 1; AsX 1; GlX 1; Pro 1; Gly 1; Met 1; lle 1. CT3 Ser 1; Phe 1. L'hydrolyse de P par le bromure de cyanogène donne notamment 2 oligopeptides dont les compositions en acides aminés déterminées après hydrolyse acide sont: RC1 Arg 1; GlX 1; Ala 1; homosérine lactone 1. RC2 Lys 1; AsX 1; Pro 1; Gly 1; Ile 1. Traité par le réactif de Sanger: BC2 donne DNP Gly. Quelle est la séquence de P?

3 Exercice 3: Formule développée, variation de la charge en fonction du ph et détermination du phi On donne les peptides suivants : Lys-Ala-His-Glu-Met et Trp-Leu-Asp-Cys. Écrire la formule développée de ces peptides. Étudier la variation de leur charge nette en fonction du ph et déterminer leur ph isoélectrique. On utilisera les valeurs suivantes pour le pk a des différentes fonctions ionisables : α-cooh β ou γ-cooh α-nh 2 ε-nh 2 Imidazole Thiol Exercice 4: 3 4,5 8,5 10,5 6,5 10 Étude d'un dipeptide. Courbe d'absorbance en fonction du ph 1. Écrire la formule du dipeptide alanyl-tyrosine. 2. Préciser les différentes formes ioniques possibles de ce dipeptide en fonction du ph du milieu. On donne les valeurs des pk a à 25 T : Tyrosine: pka1: (-COOH) = 2,20; pka2 (-NH2) = 9,10; pka3 (-OH) = 10,10 Alanine: pka1: (-COOH) = 2,35; pka2 (-NH2) = 9,70 3. Application: on mesure la densité optique à 25 C et à 295nm d'une solution 0,4M d'alanyltyrosine à différents ph: on obtient les résultats suivants: ph 1,3 4,6 8 9,7 10,2 10, DO 295nm 0 0,01 0,08 0,3 0,55 0,68 0,87 0,91 0,91 Tracer la courbe traduisant la variation de la densité optique en fonction du ph. Interpréter la courbe. (BTS biochimiste 1974) Exercice 5: Analyse d'un peptide par électrochromatographie Un échantillon est soumis à une électrochromatographie sur papier (électrophorèse à ph 6,4 suivie d'une chromatographie ascendante en solvant organique). Après révélation à la ninhydrine, les spots 1, 3, 4 et 5 apparaissent colorés en mauve et le spot 2 en jaune (fig. 1). Les constituants 1 et 3 peuvent également être révélés par des réactifs de la fonction phénol et le constituant 4 par la réaction de Sakaguchi. Figure 1 Figure 2 1) Quelle peut être la nature des constituants correspondant aux taches 1, 2, 4, 5? 2) Après hydrolyse trypsique de l'échantillon et électrochromatographie dans les mêmes conditions que précédemment, on obtient la carte représentée par la figure 2. Quelle(s) hypothèse(s) peut-on

4 faire sur la nature de 3? 3) L'échantillon est déposé en haut d'une colonne de résine échangeuse de cations faible tamponnée à ph 6. L'élution est pratiquée en augmentant le ph. Dans quel ordre sortiront les différents constituants organiques? Que penser de cette séparation? (BTS biochimiste 1977) Exercice 6: Analyse d'un peptide 1) Comment peut-on mettre en évidence la nature peptidique du composé étudié? 2) L'hydrolyse acide totale et l'analyse chromatographique de l'hydrolysat révèlent que le peptide est constitué d'arginine (Arg), d'alanine (Ala), de valine (Val), de leucine (Leu), de phénylalanine (Phe) et de tyrosine (Tyr). Quel est le révélateur utilisé pour localiser ces acides aminés sur le chromatogramme? 3) Détermination de la formule brute: on détermine la masse molaire du peptide, on l'hydrolyse, on en fractionne les différents acides aminés que l'on dose séparément. On a obtenu la formule brute suivante: (Arg) 1, (Ala) 1, (Val) 1, (Leu) 1, (Phe) 1, (Tyr) 1, c'est un hexapeptide. La méthode à l'aminopeptidase montre que l'acide aminé NH 2 terminal est l'alanine (par convention le résidu NH 2 terminal est placé à l'extrémité gauche du peptide). L'hydrolyse trypsique conduit à 2 tripeptides dont l'un est constitué d'alanine, arginine et tyrosine. L'hydrolyse acide partielle conduit à un mélange de peptides: peptide P1 constitué d'arginine et de phénylalanine; peptide P2 constitué de leucine et de valine; peptide P3 constitué de phénylalanine, de leucine et d'arginine. En déduire la structure du peptide, c'est-à-dire sa séquence en acides aminés. La trypsine est spécifique des liaisons peptidiques impliquant le groupement carboxyle d'une arginine ou d'une lysine. (BTS biochimiste 1972) Exercice 7: On considère les oligopeptides suivants: Gly-Arg; Gly-Glu et Gly-Glu-Arg. On procède à une électrophorèse sur papier d'un mélange de ces 3 peptides à ph 1 et à ph 13. Après l'électrophorèse, on révèle les peptides avec la ninhydrine. On obtient 2 taches pour chaque électrophorèse. Ces taches sont localisées comme le montrent les figures 1 et 2: Laquelle des figures correspond à l'électrophorèse à ph 1, laquelle à l'électrophorèse à ph 13? Quel électrophorégramme obtiendrait-on à ph 7? Exercice 8: On soumet une séquence polypeptidique à une hydrolyse acide totale, à l'action des carboxypeptidases A et B, à la réaction de Sanger (DNFB) et à l'hydrolyse par la Trypsine. L'hydrolysat acide contient 1 Gly, 1 Glu, 1 Lys, 1 Leu, 1 Met, 1 Asp, 1 Arg, 1 Phe, 1 His et 1 Pro. Les carboxypeptidases A et B sont sans effet. La réaction de Sanger suivie d'hydrolyse totale conduit à DNP-Gly et DNP-Lys. Après action de la trypsine on obtient 4 fragments: - un tétrapeptide (1) qui donne avec le DNFB la DNP-Leu et la DNP-Lys; par ailleurs, (1) est traité avec BrCN; les produits de la réaction sont séparés; parmi eux figure un dipeptide non chargé en milieu neutre; - un tripeptide (2): après réaction avec le DNFB suivie d'hydrolyse, le mélange des aminoacides

5 est séparé par chromatographie sur résine échangeuse de cations, à ph 3; un des trois aminoacides n'est pas retenu par la résine et se retrouve dans les premières fractions de l'éluat; les aminoacides qui ont réagi avec le DNFB sont la Gycine et la Lysine; - un dipeptide (3): la réaction de Sanger révèle la présence de DNP-Asp; en outre, il donne une réaction de Sakaguchi positive; - le 4 e fragment (4) donne avec le DNFB la DNP-Gly; la chymotrypsine hydrolyse ce fragment en 2 dipeptides. Après action du BrCN sur le polypeptide on retrouve 2 peptides: l'un contenant Gly, Glu, Leu et Lys, l'autre tous les aminoacides restants. Établir la structure primaire de la séquence polypeptidique. Exercice 9: On donne le peptide suivant : Trp-Gly-Asp-Lys. 1. Écrire la formule développée de ce peptide. 2. Étudier la variation de sa charge nette en fonction du ph et en déduire la valeur de son ph isoélectrique. Données : pk a des différents groupements ionisables : pk1 pk2 pk3 Acide Aspartique 2,09 9,82 3,86 Glycine 2,34 9,6 Lysine 3,18 8,95 10,53 Triptophane 2,38 9,39