U.F.R. des Sciences et Techniques

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1 1 Année 2002 Université de Cergy-Pontoise U.F.R. des Sciences et Techniques Ecole doctorale des Sciences et Ingiénerie N d Ordre _ _ _ _ _ _ Thèse pour obtenir le grade de Docteur de l Université de Cergy-Pontoise Discipline : biochimie cellulaire présentée et soutenue publiquement par Laurent POULOUIN le 11 octobre 2002 Caractérisation de la fibronectine du plasma sanguin humain et de son fragment de 60kDa : purification, stabilité et analyse qualitative des glycosylations. Directeur de thèse : Pr. Jean-Marie Imhoff Jury M. Gaston Godeau, Université Paris V René Descartes, Rapporteur, M. William Hornebeck, Université de Reims, Rapporteur, Mme Halima Darbeïda, Université de Cergy-Pontoise, M. Jacques Chabbat, Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies, Les Ulis, M. Olivier Gallet, Université de Cergy-Pontoise, M. Jean-Marie Imhoff, Université de Cergy-Pontoise.

2 2 Les travaux présentés dans ce mémoire ont été réalisés au sein des Equipes de Recherche sur les Relations Matrice Extracellulaire-Cellule de l Université de Cergy-Pontoise. Ils font suite aux travaux de recherche menés dans le même laboratoire lors de la préparation de mon Diplôme d Etudes Approfondies Endocrinologie et Interactions Cellulaires dispensé par la faculté de Médecine du Kremlin-Bicêtre (Université de Paris-Sud / Orsay). Je souhaite remercier vivement Monsieur le Professeur Jean-Marie Imhoff pour la confiance qu il a témoigné à mon égard depuis le début de mes études universitaires. Sa sagesse et ses qualités humaines ont toujours représenté pour moi des idéaux à atteindre. Je suis très reconnaissant et remercie Monsieur Gaston Godeau, Professeur de l Université de Paris V René Descartes, et Monsieur William Hornebeck, Directeur de Recherche CNRS à l Université de Reims, qui ont accepté d être mes rapporteurs. Je souhaite remercier Monsieur Jacques Chabbat du Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies. Ces travaux n auraient jamais pu être réalisés sans le concours de ses services. Je le remercie d avoir accepté de faire partei de ce jury. Je remercie Madame le Professeur Halima Darbeïda pour les précieux conseils qu elle m a donné tout au long de mes travaux. Je souhaite remercier Madame Marie-France Breton et Monsieur Xavier Blondeau, qui m ont accompagné tout au long de mes travaux et qui m ont donné l opportunité d enseigner. L enseignement est ce qui m a fait rentrer à l université de Sciences en lieu et place de la faculté de médecine. A titre personnel, je ne saurais dissocier les activités de recherche de l enseignement universitaire. Je souhaite remercier tout particulièrement Madame Françoise Discala pour son aide et son soutien précieux. Je voudrais remercier Catherine Le Cœur avec qui j ai partagé les problèmatiques de purification de la fibronectine et pour l amitié qu elle a témoigné à mon égard. Qu elle soit persuadée de la mienne. Je tiens à exprimer toute ma gratitude à Madame le Docteur Jeanne Grosclaude et à Madame Suzanne Labiau du Laboratoire de Virologie et Immunologies Moléculaires de l Institut National de Recherche Agronomique de Jouy-en-Josas pour leur accueil, leur soutien tout le long de mes travaux et leurs aides précieuses lors de la préparations des sera poly et monoclonaux. Je remercie Franck Carreiras et Emmanuel Pauthe pour les analyses physiologiques et physicochimiques qu ils ont acceptés volontiers de faire. Je ne saurais oublier mes compagnons de paillasse : Hélène Boetti, Julie Huet et Hugues Berry, et l ensemble des équipes du laboratoire et du département de biologie de l université. Je tiens à remercier ma hiérarchie et mes collégues du centre de recherche de France Télécom pour leurs précieux encouragements lors de la rédaction de mon manuscrit. Enfin, je remercie Monsieur Olivier Gallet. L amitié que j ai pour lui n est ignorée de personne. Il a su m accompagner et m encourager depuis le début. Je reste persuadé que je n aurai jamais terminé, voire commencé, ces travaux sans lui. Qu il reçoive mon infinie reconnaissance.

3 3 «L'important dans la recherche, c'est l'imprévisible» François Jacob. In memoriam Mélanie-Jeanne, A mes parents, A Eowald et à Sylvie, Avec tout mon amour.

4 4 Résumé Caractérisation de la fibronectine du plasma sanguin humain et de son fragment de 60kDa : purification, stabilité et analyse qualitative des glycosylations. La combinaison de trois étapes de chromatographie d affinité sur gélatine et sur héparine permet de purifier d importantes quantités de fibronectine à partir de cryoprécipité de plasma sanguin humain ou de plasma citraté. Les rendements obtenus sont de / milligrammes de fibronectine par gramme de cryoprécipité et de 0.16 milligramme de fibronectine par millilitre de plasma. En optimisant les conditions d élution, nous obtenons des fractions homogènes sur gels SDS-PAGE. L utilisation de sera polyclonaux en immunorévélation montre que notre fraction est homogène et qu elle n est contaminée ni par le fibrinogène ni par le facteur von Willebrand. Aucune activité protéolytique ne peut être détectée par zymographie sur gélatine ou après incubation jusqu à 456 heures à 37 C en présence de calcium, de zinc et de mercure. Les caractéristiques physicochimiques et physiologiques de la fibronectine purifiée par notre protocole en trois étapes, appelée highly purified fibronectin (hpfn), sont identiques aux préparations issues d autres protocoles. Nous pouvons purifier, avec une grande pureté, un fragment de 60kDa (F60) comportant les domaines de liaison aux collagènes (CBD) après hydrolyse de la fibronectine par la trypsine. Les cartographies qualitatives des glycosylations de la fibronectine et du fragment ont été réalisées grâce à des lectines végétales. Ces travaux permettent de proposer de nouvelles méthodes de purification ou d analyse des interactions entre la protéine et ses ligands. Les résultats obtenus par cette caractérisation et nos protocoles de purification permettent d envisager l étude des interactions cellulaires et moléculaires faisant intervenir la fibronectine et ses fragments. Nous proposons d ores et déjà un protocole original d étude des interactions entre la fibronectine et le collagène de type I basé sur l utilisation des lectines végétales.

5 5 SOMMAIRE 1 INTRODUCTION HISTORIQUE STRUCTURE ET PROPRIETES DE LA FIBRONECTINE De la Cold-insoluble-Globulin à la fibronectine La molécule de fibronectine Caractéristiques physico-chimiques Modifications post-traductionnelles de la fibronectine La fibrillogenèse La Fibronectine et ses ligands La Fibronectine et ses fragments INTERACTIONS ENTRE LA FIBRONECTINE ET LES RECEPTEURS CELLULAIRES Les intégrines Autres récepteurs Mécanismes de transduction RELATIONS ENTRE LA MATRICE ET L ORGANISME Influence de la cellule sur la matrice Influences sur la physiologie humaine MATERIELS ET METHODES MATERIELS Produits sanguins Réactifs Chaînes de chromatographie Résines de chromatographie Protéines et enzymes Dialyse Tampons METHODES Purification de protéines Méthodes analytiques... 62

6 6 4 RESULTATS ET DISCUSSION PURIFICATION DE LA FIBRONECTINE Chromatographie d affinité à la gélatine Chromatographie d affinité à l héparine Rendements Critères de purification et contrôles PURIFICATION DES DERIVES DE FIBRONECTINE PRESENTANT LE SITE D AFFINITE A LA GELATINE Hydrolyse de la fibronectine Chromatographie d affinité à la gélatine Chromatographie d affinité à l héparine en perfusion Chromatographie échangeuse d anions en perfusion Rendements Critères de purification CARACTERISATIONS DES GLYCOSYLATIONS ET APPLICATIONS Analyse des glycosylations Mise en application CONCLUSION BIBLIOGRAPHIE

7 7 TABLE DES FIGURES Figure 1 : Régulation de l expression du gène codant pour la fibronectine Figure 2 : Représentation des formes épissées de la fibronectine Figure 3 : Observation de la fibronectine Figure 4 : Représentation des domaines composant le monomère de fibronectine Figure 5 : Modèles tridimensionnels déterminés par résonance magnétique nucléaire des domaines de la fibronectine Figure 6 : Structures potentielles des chaînes de glycosylation de la fibronectine du plasma sanguin humain Figure 7 : Affinités entre les différents domaines de la fibronectine Figure 8 : Domaines d affinités de la fibronectine pour ses ligands Figure 9 : Domaines d affinités de la fibronectine pour la gélatine et les collagènes Figure 10 : Sites d interactions avec les intégrines portés par la fibronectine Figure 11 : Structures à trois dimensions des domaines III 7-10 présentant les séquences RGD et PHSRN Figure 12 : Protocole de purification de la fibronectine en trois étapes Figure 13 : Protocole de purification de la fibronectine en trois étapes Figure 14 : Protocole de purification de la fibronectine par le protocole de Le Cœur et al Figure 15 : Protocole de purification de la fibronectine sur Concanavaline A Figure 16 : Protocole de purification de F60 et de F Figure 17 : schémas de congélation des échantillons avant lyophilisation Figure 18 : Comparaison SDS-PAGE des fibronectines plasmatiques humaines Figure 19 : Elution de la fibronectine sur colonne d affinité à la gélatine Figure 20 : Purification de la fibronectine par chromatographie d affinité à la gélatine Figure 21 : Analyse SDS-PAGE des étapes de purification de la fibronectine Figure 22 : Analyse des étapes de purification de la fibronectine par zymographie Figure 23 : Localisation des sites d affinité aux glycosaminoglycanes et à la gélatine portés par la fibronectine Figure 24 : Purification de la fibronectine par chromatographie d affinité à l héparine Figure 25 : Concentration de la fibronectine par chromatographie d affinité à la gélatine Figure 26 : Analyse par SDS-PAGE et par immunorévélation de la stabilité d hpfn Figure 27 : Analyse SDS-PAGE et par immunorévélations des différentes préparations de fibronectine... 87

8 8 Figure 28 : Spectrophotométrie UV des préparations de fibronectine Figure 29 : Spectrofluorométrie des préparations de fibronectine Figure 30 : Adhésion des cellules IGROV1 sur les préparations de fibronectine et de F Figure 31 : Carte d hydrolyse de la fibronectine Figure 32 : Analyse des profils d hydrolyse de hpfn par la trypsine Figure 33 : Purification des fragments de fibronectine par chromatographie d affinité à la gélatine Figure 34 : Analyse SDS-PAGE des étapes de purification de F Figure 35 : Purification des fragments de fibronectine par chromatographie d affinité à l héparine Figure 36 : Purification des fragments de fibronectine par chromatographie échangeuse d anions Figure 37 : Analyse SDS-PAGE des étapes de purification de F60 sur Poros-HQ Figure 38 : Analyse par immunorévélation de la stabilité de F Figure 39 : Dosage ELISA de hpfn et de F60 par des sera polyclonaux Figure 40 : Spectrophotométrie UV de F Figure 41 : Représentation du F Figure 42 : Détection de hpfn fixée sur membrane par les lectines biotinylées Figure 43 : Reconnaissance des structures polyholosidiques de la fibronectine par les lectines végétales Figure 44 : Reconnaissance de préparations de fibronectine plasmatique humaine fixées sur membrane par les lectines biotinylées Figure 45 : Reconnaissance de hpfn fixée sur membrane de nitrocellulose ou sur plaque de microtitration par les lectines biotinylées Figure 46 : Reconnaissance de hpfn et de F60 fixés sur membrane par les lectines biotinylées Figure 47 : Augmentation de l association des lectines sur F60 après dénaturation Figure 48 : Comparaison de la réponse aux lectines biotinylées entre hpfn et Coll-I Figure 49 : Etude de la dissociation du complexe FN / Coll-I

9 9 Table I: Différentes dénominations de la fibronectine Table II : Traduction de l'arnm précurseur de la fibronectine codant pour 2386 aminorésidus Table III : Distribution des mécanismes de reconnaissances pour les complexes intégrines.. 31 Table IV : Activités protéolytiques cryptiques portées par les fragments de fibronectine Table V : Caractéristiques des immunoglobulines utilisées Table VI : Caractéristiques des lectines utilisées Table VII : protocole de coloration des gels au nitrate d argent par oxydation des protéines au bichromate de potassium Table VIII : protocole de coloration des gels à l acide périodique, à la base de Schiff et au nitrate d argent Table IX : Immunorévélation des protéines fixées sur membrane Table X: Dosages immunologiques Table XI : Révélation des protéines fixées sur membrane grâce aux lectines marquées à la digoxigénine Table XII : Révélation des protéines grâce aux lectines biotinylées Table XIII: Etude des interactions Fibronectine Collagène avec la lectine de Ricinus communis Table XIV : Pureté, rendements et taux de purification de la fibronectine à partir de cryoprécipité de plasma sanguin humaine Table XV : Reconnaissance par les lectines des structures glycosylées de hpfn Une annexe «Comparaison des protocoles de purification de la fibronectine» est insérée entre les pages 134 et 135. Un CD-ROM comportant le présent manuscrit et le support de soutenance est attaché à la troisième de couverture.

10 10 Abréviations Ix IIx IIIx IIIcs αxβy ADN ADP ARNm BA BAEE βmsh C CAM CBD cjun CLHP CPSH CS Ct C1q Da DIG DEAE E.C. EDA EDB EDS EDTA EGF ELISA FAK FBG FBN Fc FN FXIII x ème domaine de type I de la fibronectine x ème domaine de type II de la fibronectine x ème domaine de type III de la fibronectine Segment de liaison des domaines de type III de la fibronectine Intégrine composée des sous-unités αx et βy Acide DéoxyriboNucléique Adénosine Di-Phosphate Acide RiboNucléique messager N-(α)-Benzoyl-L-arginine N-(α)-Benzoyl-L-arginine Ethyl Ester β-mercaptoethanol. Coefficient de maillage des gels de polyacrylamide (rapport bisacrylamide/acrylamide) Molécule d adhérence cellulaire Domaine de liaison aux collagènes de la fibronectine proto-ongogène humain jun Chromatographie liquide à hautes performance Cryoprécipité de plasma sanguin humain Segment de connection de la fibronectine Extrémité carboxy-terminale Protéine 1q du complément Dalton Digoxigenine Di-Ethyl-Amino-Ethyle Référence de la classification des enzymes Extra-Domaine A de type III de la fibronectine Extra-Domaine B de type III de la fibronectine Syndrome d'ehlers-danlos Sel tétrasodique de l acide éthyène diamino-tétracétique Facteur de croissance épithélial Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Kinase des foci d adhérence Fibrinogène Fibrine Partie constante des immunoglobulines Fibronectine Transglutaminase plasmatique (Facteur de coagulation XIII)

11 11 F60 Fragment de fibronectine présentant les domaines I 6 II 1-2 I 7-9 III 1-2 F160 Fragment de fibronectine présentant les domaines I 6 II 1-2 I 7-9 III 1-10 HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid hpfn Fibronectine hautement purifiée HSPG Protéoglycanes à héparanes-sulfates H1 Domaine de la fibronectine présentant la séquence en acides aminés Ile-Asp-Ala ICAM Molécule d adhérence intercellulaire ICAP-1 Protéine associée au domaine cytoplasmique des intégrines-1 IFNγ Interferon γ Ig Immunoglobuline IgA Immunoglobuline de type A IgG Immunoglobuline de type G IgM Immunoglobuline de type M IL Interleukine ILK Kinase liée aux intégrines IRS-1 Premier substrat du récepteur à l insuline MMP Métallo-protéase de la matrice extracellulaire Nt Extrémité amino-terminale p/p Poids/poids PAL Phosphatase alcaline PAGE Gel d électrophorèse de polyacrylamide PECAM Molécule d adhérence cellulaire entre les plaquettes et les cellules endothéliales PI3K Phosphate-Inositol-3 Kinase PMN Neutrophile polymorphonucléaire PMSF Phenylmethylsulfonyl Fluoride PNGase F Glycopeptidase F PNPP Paranitrophenol phosphate RGD Séquence en acide aminés Arg-Gly-Asp RGDS Séquence en acide aminés Arg-Gly-Asp-Ser SDS Dodécyl sulfate de sodium SHx Séquence d homologie à l oncogène du sarcome de Rous de type x SRC Protéine oncogène du sarcome de Rous SU Sous-unité T Concentration totale en polyacrylamide TCA Acide trichloroacétique TGFβ Facteur de croissance tumoral β TEMED N, N, N, N -Tetramethylethylenediamine TLCK N-Tosyl-L-Lysine Chloromethyl Cétone TNFα Facteur de nécrose tumorale α TPCK N-Tosyl-L-Phenylalanine Chloromethyl Cétone Tris Tris(hydroxymethyl)aminoéthane

12 12 V VCAM v/v vwf Région de variabilité de la fibronectine Molécule d adhérence des cellules vasculaires Volume/volume Facteur von Willebrand

13 13 Résidus holosidiques Fuc Gal GalNAc Glc GlcA GlcNAc IdoA Man NeuA Fucose Galactose N-acétyl-galactosamine Glucose Acide glucuronique N-acétyl-glucosamine Acide iduronique Mannose Acide neuramidique (acide sialique) Lectines végétales ConA DBA DSA GNA GSL-I LCA MAA PHA-E PHA-L PNA PSA RCA 120 SBA SJA SNA UEA-I WGA swga Agglutinine issue de Canavalia ensiformis Agglutinine issue de Dolichos biflorus Agglutinine issue de Datura stramonium Agglutinine issue de Galanthus nivalis Agglutinine de type I issue de Griffonia simplicifolia Agglutinine issue de Lens culinaris Agglutinine issue de Maackia amurensis Erythroagglutinine issue de Phaseolus vulgaris Leucoagglutinine issue de Phaesolus vulgaris Agglutinine issue de Arachis hypogaea Agglutinine issue de Pisum sativum Agglutinine de 120 kda issue de Ricinus communis Agglutinine issue de Glycine max Agglutinine issue de Sophorica japonica Agglutinine issue de Sambucus nigra Agglutinine issue de type I issue de Ulex europaeus Agglutinine issue de Triticum vulgaris Agglutinine succinylée issue de Triticum vulgaris

14 14 1 INTRODUCTION Le développement et le fonctionnement de tous les types cellulaires d un individu dépendent des interactions que ces cellules développent avec leur environnement. Les principales molécules indispensables à la régulation du développement et de la différenciation cellulaire sont soit des facteurs de croissance ou de différenciation, soit des hormones, soit des éléments de la matrice extracellulaire. Pendant longtemps, les éléments de la matrice extracellulaire furent considérés comme des agents ayant peu d importance pour la vie cellulaire. La matrice extracellulaire participait alors uniquement à l organisation d un individu, à son intégrité mécanique, aux caractères de rigidité et/ou d élasticité de la peau, des os, des voies vasculaires, des poumons et des autres organes. Des protéines dites d adhérences - comme la fibronectine permettent aux cellules de se fixer sur les éléments des différents tissus conjonctifs. Il apparaît désormais évident que les interactions entre les cellules et les protéines d'adhérence au tissu conjonctif sont à l origine et permettent l'émission de signaux qui affectent la morphologie, l'expression protéique et la survie des cellules. Les propriétés d adhérence de la fibronectine sont dues à différentes séquences aminées distinctes pouvant porter des chaînes de glycosylation. Afin de pouvoir caractériser les interactions entre la fibronectine et ses ligands plasmatiques (la fibronectine est retrouvée dans les plasmas), extracellulaires ou cellulaires, nous avons orienté nos travaux sur l analyse qualitatives et dynamiques de ces glycosylations portées par la glycoprotéine. Dans une première partie, nous décrivons un protocole de purification en trois étapes qui permet d obtenir des préparations de fibronectine pure, stables dans le temps et non dénaturées par la méthode de purification proposée. Cette fibronectine nous permet de purifier un fragment d intérêt de 60kDa présentant le domaine glycosylé de liaison aux collagènes. Le protocole décrit dans une seconde partie permet d obtenir des lots du fragment purs par analyse SDS-PAGE et stables dans le temps. A partir de ces fractions protéiques homogènes, l utilisation de lectines végétales nous permet de réaliser une analyse dynamique par cartographie d accessibilité des structures glycosylées de la fibronectine et du fragment de 60kDa, décrite dans une troisième partie. Nos résultats

15 15 nous permettent d envisager de nouveaux protocoles de purification de la fibronectine et de ses dérivés. De plus, ces cartographies nous permettent de proposer de nouveaux protocoles d études des interactions entre la fibronectine et ses ligands.

16 16 2 HISTORIQUE 2.1 Structure et propriétés de la fibronectine De la Cold-insoluble-Globulin à la fibronectine En 1948, une protéine, dénommée cold insoluble globulin (globuline insoluble à froid) pour sa capacité à précipiter à froid, fût mise en évidence par co-précipitation avec le fibrinogène à partir du plasma sanguin (Morrison et al., 1948 : cf. Table I). Présente dans le plasma sanguin à une concentration élevée (370 mg/l chez l'homme, 285 mg/l chez la femme), elle fût longtemps assimilée à une forme dérivée du fibrinogène (Edsall et al., 1955). Une première purification de la protéine en 1970 dénonça cette hypothèse, la cold insoluble globulin n étant pas reconnue par des anticorps dirigés spécifiquement contre le fibrinogène (Mosseson et al., 1970). Identifiée lors de nouveaux processus physiologiques, la cold insoluble globulin reçut alors d autres dénominations relatives aux différentes fonctions supposées de la molécule, comme opsonic α2-surface binding glycoprotein (Glycoprotéine opsonique α2 de liaison à la surface cellulaire) (Lanser et al., 1980). Cold insoluble globulin Opsonic α2 surface binding protein Major fibroblast glycoprotein Surface fibroblast antigen Cell surface protein Collagen cell attachment protein Table I: Différentes dénominations de la fibronectine En 1973, une nouvelle protéine présente sur la membrane cytoplasmique de fibroblastes a été identifiée (Hynes, 1973). Dénommée major fibroblast glycoprotein (protéine majeure du fibroblaste) ou surface fibroblast antigen (antigène de surface des fibroblastes) (Ruoslahti et Vaheri, 1975), elle fût observée à la surface d autres types cellulaires et nommée alors cell surface protein (protéine de surface cellulaire) (Alexander et al., 1979). Cette protéine fut ensuite isolée sous forme fibrillaire dans la matrice extracellulaire et dénommée fibronectine,

17 17 du latin fibro et nectere, littéralement la fibre qui relie (Stenman et Vaheri, 1978). La protéine étant capable de faire adhérer les cellules sur le collagène de type I, elle fut dénommée ccap (collagen Cell Attachment Protein / protéine d adhésion cellulaire au collagène) (Kleinman et al., 1978). La fibronectine peut représenter une part importante des protéines de la matrice extracellulaire. Dans le cartilage de la trachée, la fibronectine correspond à plus de 20% de la masse sèche du tissu (Stechschulte et al., 1997). A partir de 1975, la comparaison de la cold insoluble globulin et de la fibronectine a révélé des caractéristiques d affinité identiques pour les mêmes ligands (Ruoslahti et Vaheri, 1975 ; Vuento et al., 1977) et des propriétés physico-chimiques identiques ou très similaires (Alexander et al., 1979). Même si quelques légères différences de séquence restent affirmées (Yamada et Kennedy, 1979), la cold insoluble globulin, qui n est que l isoforme soluble de la fibronectine retrouvée dans le plasma sanguin, porte depuis le nom de fibronectine plasmatique. D autres formes solubles ont été ensuite identifiées chez différentes espèces animales dans l urine (Katayama et al., 1993), les glaires cervicales (Greenhagen et al., 1996), le liquide amniotique, le liquide céphalorachidien (Ruoslahti et al., 1981), le plasma séminal (Pinke et al., 1997), la salive (Pearlstein et al., 1980), le vitré oculaire (Ménasche et al., 1997) et le lait (Reisinger et Welsch, 1992). Enfin, des formes homologues à la fibronectine ont été retrouvées chez les végétaux (Zhu et al., 1993) La molécule de fibronectine Expression Le gène codant pour la fibronectine est systématiquement localisé avec les gènes de l isocitrate déshydrogènase I et de la γ-cristalline, formant un groupe syntènique. Identifiées chez la souris, le bœuf et le rat, ces régions sont semblables en cytologie et illustrent la conservation cytogènique de ce groupe de gènes dans l évolution. Chez l homme, le gène codant pour la fibronectine est retrouvé dans les régions chromosomiques 2p14p16, 2q34q36 et 11q12.1q13.5. Si toutes les copies du gène sont exprimées dans les cellules germinales, seules celles portées par le chromosome 2 sont exprimées dans les cellules somatiques (Jhanwar et al., 1986). Le gène est constitué d une succession de séquences répétitives analogues codant pour trois domaines (dénommés domaines de type I, de type II ou de type III) probablement issus d un minigène ancestral. De tels domaines sont retrouvés sur d autres protéines de la matrice extracellulaire, du plasma, de la membrane plasmique ou du cytosol.

18 18 Chaque domaine de type I ou de type II est codé par un exon, et chaque domaine de type III par deux exons (sauf III 9 ) (Boyd et al., 1993). Stimulation par le sérum? Transcription? G10 CRE CCAAT SP1 AP2 SP1 TATA? AMPc G10bp E1a CREB ATF-2 cjun AMPc NF-1 Tax CP-1 Rb E1a? Activation facteur Activation transcription Inhibition transcription 25 bp Figure 1 : Régulation de l expression du gène codant pour la fibronectine AMPc : Adenosyl MonoPhosphate cyclique ; cjun : proto-oncogène humain jun ; Tax : agent issu de HTLV-1 ; E1a : agent issu de l'adenovirus E1a ; Rb : protéine suppressive de tumeur issu du retinoblastome ; Facteur de transcription : CREB : élément de réponse à l'ampc ; ATF-2 : Activating transcription factor 2 ; C/EBP : protéines inductrices liant la séquence CCAAT ; G10bp : protéine liant les séquences G10 ; Cibles de transcription : CRE : élément de réponse à l'ampc ; G10 : séquence riche en guanidine. D après Kornblihtt et al., 1996 La synthèse de la fibronectine est stimulée par l EGF, le TGFβ, l IFNγ, les corticoïdes et les hormones thyroïdiennes et inhibée par les oestrogènes, le TNFα et l IL-1 (Murata et al., 1990 ; Stamm et al., 1992 ; Vollmer et al. 1995). La transcription du gène codant pour la fibronectine est sous la régulation du SRE (serum response element / élément de réponse au sérum) et de l AMPc (Kornblihtt et al., 1996 ; cf. Figure 1) et libère un ARN messager précurseur codant pour 2386 acides aminés. De nombreux types cellulaires expriment puis sécrètent la fibronectine afin de s assurer un support matriciel. L isoforme plasmatique de la

19 19 fibronectine est sécrétée par les hépatocytes (Tamkun et Hynes, 1983), les cellules endothéliales et les macrophages (Hynes et Yamada, 1982) Variabilité Le gène de la fibronectine est un modèle reconnu de l épissage alternatif (Kornblihtt et al., 1996). L'ARN messager codant pour la fibronectine peut être épissé en quatre points, nommés Extra-Domaine de type III A (EDA), Extra-Domaine de type III B (EDB), région de variabilité (V) qui contient le IIIcs (Type III connecting segment / segment de connection des domaines de type III) et région d adhésion cellulaire (C) situés respectivement après les modules III 11, III 7, III 14 et III 15 (cf. Figure 2). Les régions épissées codent le plus souvent pour les domaines de la fibronectine qui sont reconnues par ses récepteurs cellulaires. Les processus d épissage permettent donc de moduler l adhérence cellulaire sur la fibronectine. EDB EDA V C N S S C III 14 - I 11 III 7 - III 8 III 11 - III 12 III 14 - III 15 -I 10 -I 11 III 7 -EDB-III 8 III 11 -EDA-III 12 III 14 - V 64 - III 15 -I 10 -I 11 Type I Type II III 14 - V 89 - III 15 -I 10 -I 11 III 14 - V 95 - III 15 -I 10 -I 11 Type III Domaine épissé III 14 - V - III 15 -I 10 -I 11 Figure 2 : Représentation des formes épissées de la fibronectine D après Hynes, 1993.

20 20 Les isoformes qui ont le plus de séquences épissées (EDA-,EDB-,V-,C- et EDA-,EDB-,V-,C+), donc les formes les plus courtes, sont celles qui constituent les isoformes plasmatiques de la protéine (Boyd et al., 1993). Toutefois, une faible proportion de fibronectine retrouvée dans le plasma sanguin est constituée des isoformes cellulaires de la glycoprotéine (2.4 mg/l soit moins de 0.85% de la fibronectine présente dans la circulation générale) (Ylatupa et al., 1993). L expression des isoformes de fibronectine contenant les séquences EDA et EDB est accrue lors des processus de développement, de migration cellulaire (et donc de l embryogenèse), de cicatrisation, des processus tumorigènes, et des atteintes aiguës des tissus et des cellules endothéliales (Myers, 1993) Description morphologique La fibronectine, observée par microscopie électronique à transmission et rotation, apparaît sous la forme d'un collier de perle flexible de 2 à 3 nm de diamètre et de 130 nm de long (Erickson et Carrell, 1983 ; cf. Figure 3). La structure générale de ce filament est en forme de 'V' (Alexander et al., 1978 ; Colonna et al., 1978 ; Engel et al., 1981). Figure 3 : Observation de la fibronectine Image Principale : miscroscopie sous immunofluoresence révélant la matrice de fibronectine entourant une monocouche de fibroblast. Encart : molécules de fibronectine sous forme étendue en solution dans un tampon très ionique observée par microscopie électronique à transmission et rotation.

21 Structure de la protéine La protéine est composée de deux chaînes polypeptidiques de 220 à 250 kda chacune, qui se lient l une à l autre selon un arrangement anti-parallèle lors de la maturation postsécrétionnelle in situ par deux ponts disulfures près de l extrémité carboxy-terminale des simples chaînes (McKeown-Longo et Mosher, 1984). N S S C Type I Type II Type III Domaine épissé Figure 4 : Représentation des domaines composant le monomère de fibronectine Les deux S indique la position des résidus cystéine permettant de créer les deux ponts dissulfure reliant, selon un arrangement anti-parallèle, les deux chaînes qui forment la molécule de fibronectine. Les structures des différentes régions de la fibronectine dépendent des domaines qui les composent (cf. Figure 4) : Les domaines de type I et de type II, qui comportent respectivement 45 et 60 résidus aminés, possèdent de nombreux ponts disulfures stabilisant des structures en feuillets β donnant respectivement aux domaines une configuration en doigt de gant et en kringle (Litvinovich et al., 1991 ; cf. Figure 5). L étude physico-chimique de l extrémité amino-terminale de la fibronectine montre que les domaines de type II sont structurés à 80% de feuillets β et à 20% de β-tours (Brumfeld et Werber, 1993 ; Pickford et al., 1997).

22 22 A B C Nt Nt Nt Ct Ct Ct Figure 5 : Modèles tridimensionnels déterminés par résonance magnétique nucléaire des domaines de la fibronectine A : domaines I 4-5 (Williams et al., 1994) ; B : domaine II 1 (Sticht et al., 1998) et C : domaine III 10 (Copie et al., 1998). Les liaisons hydrogènes sont représentées en pointillés et les ponts disulfures en traits pleins rouge. Les domaines de type II sont très conservés entre les espèces (Ali, 1984a), expliquant le pouvoir faiblement immunogène de ces domaines observé plus tôt (Ruoslahti et al., 1979). Les domaines de type III possèdent 60 résidus aminés et ont des séquences et des structures Ig-like de type s qui sont les plus conservées entre les espèces (Bork et al., 1994). Ces domaines ne possèdent pas de ponts disulfures et peuvent donc subir après hydrolyse d importants changements conformationnels. Malgré leurs origines communes, chaque domaine de type III possède des propriétés physico-chimiques propres, comme les domaines III (Novokhatny et al., 1992).

23 Caractéristiques physico-chimiques Le phi de la fibronectine est compris selon l isoforme entre 5.5 et 6.3. Le phi théorique, calculé à l aide de la théorie des équilibres multiples de la séquence primaire est égale à 5.32 (cf. Table II). Son coefficient de sédimentation (s 20,w ) est de 5.6S. Le coefficient d absorption molaire à 280nm est de l.mol -1.cm -1, soit un A % égale à 1.28 (Mosesson et al., 1975). La concentration de recouvrement de la fibronectine (C*) est de 120 g/l (Pelta et al., 2000). Résidu Nombre / Chaîne Pourcentage A (Ala) C (Cys) D (Asp) E (Glu) F (Phe) G (Gly) H (His) I (Ile) K (Lys) L (Leu) M (Met) N (Asn) P (Pro) Q (Gln) R (Arg) S (Ser) T (Thr) V (Val) W (Trp) Y (Tyr) Table II : Traduction de l'arnm précurseur de la fibronectine codant pour 2386 amino-résidus. (d après Mosesson et al. 1975)

24 Modifications post-traductionnelles de la fibronectine La molécule de fibronectine est N- et O-glycosylée. Les sites potentiels des N-glycosylations sont localisés sur les résidus Arg430 (II 2 ), Arg542 (I 8 ), Arg877 (III 3 ), Arg1007 (III 5 ), Arg1244 (III 7 ) et Arg2108 (III 15 ). La masse de ces glycosylations représente jusqu à 5.1% de la masse totale de la protéine, dont 1.2% d acide N-neuramidique (acide sialique), 1.8% d hexose et 2.1% d hexosamine (Mosseson et al., 1975). L étude de ces chaînes à 90% sialicilées (Takasaki et al., 1980) a permis de déterminer leurs séquences (Takasaki et al., 1979 ; cf. Figure 6). Ces chaînes de glycosylations protègeraient la protéine contre la protéolyse et participeraient à l affinité de la protéine pour certains ligands (Bernard et al., 1982). Les glycosylations portées par la molécule de fibronectine sont spécifiques du tissu. La fibronectine la plus glycosylée est la fibronectine onco-foétale présente dans le liquide amniotique pour laquelle les glycosylations représentent 9.5% de la masse totale de la protéine(hynes et Yamada ; 1982 ; Ruoslahti et al., 1998). De plus, la fibronectine oncofoétale est une des rares fibronectines O-glycosylée (Mandel et al., 1994) et est la seule qui présente des polylactosamines dans ses chaînes de glycosylation (Zhu et Laine, 1985). Au sein d une même localisation, les glycosylations peuvent varier comme entre la fibronectine plasmatique extraite des vaisseaux du placenta en début de gestation et celle extraite en fin de gestation. D autres formes de glycosylation ont été décrites comme l ADPribosylation du domaine RGDS lors de la dégranulation des polynucléaires neutrophiles (Terashima et al., 1998) ou la glycosylation non-enzymatique (ou glycation) dépendante de la glycémie et du temps depuis lequel la fibronectine a été secrétée dans le plasma sanguin (Tarsio et al., 1985 ; Sengoelge et al., 1998). La fibronectine subit d autres modifications post-traductionnelles comme la phosphorylation des résidus séryl et thréonyl (Ali, 1984b) et la sulfatation des résidus tyrosyl (Mosseson et al., 1970).

25 25 NeuNAcβ2 Galβ1 4GlcNAcβ1 2Manα1 6Galβ1 4GlcNAcβ1 2Manα1 6 Manβ1 4GlcNAcβ1 4GlcNAc 3 NeuNAcβ2 NeuNAcβ2 4(6)Galβ1 4GlcNAcβ1 2Manα1 6(4)Galβ1 4GlcNAcβ1 2Manα1 6 Manβ1 4GlcNAcβ1 4GlcNAc 3 NeuNAcβ2 4(6)Galβ1 4GlcNAcβ1 2Manα1 NeuNAcβ2 4Galβ1 4GlcNAcβ1 2Manα1 6 NeuNAcβ2 6 Manβ1 4GlcNAcβ1 4GlcNAc 3 NeuNAcβ2 6 NeuNAcβ2 4Galβ1 4GlcNAcβ1 2Manα1 NeuNAcβ2 4Galβ1 4GlcNAcβ1 2Manα1 6 NeuNAcβ2 6 Manβ1 4GlcNAcβ1 4GlcNAc 3 Figure 6 : Structures potentielles des chaînes de glycosylation de la fibronectine du plasma sanguin humain Man : mannose ; NeuA : acide neuramidique (acide sialique) ; Gal : galactose ; GlcNAc : N-acétyl-glucosamine (d après Takasaki et al., 1979) La fibrillogenèse Les dimères solubles de fibronectine peuvent former dans le tissu conjonctif un réseau de fibres de 5 à 18 nm de diamètre grâce à de nombreux sites identifiés tout le long de chaque chaîne (Schwarzbauer, 1991 ; Dzamba et Peters, 1991). Lors d'une première étape, tous les domaines du segment I 1-5 se lient aux domaines III (Homandberg et Erickson, 1986 ; Quade et McDonald 1988 ; McKeown-Longo et Mosher 1983 ; cf. Figure 7) et initient la polymérisation de la protéine (Aguirre et al., 1994; Bultmann et al., 1998). Ensuite, le domaine I 9 III 1 stabilise la fibrillogenèse (Chernousov et al., 1991 ; Aguirre et al., 1994) en se liant au domaine III 10 (Hocking et al., 1996) et au segment I 1-5 (Hocking et al., 1994) permettant la formation d'un complexe III 9-10 / I 1-5 (Wu et al., 1996). D'autre part, les domaines III se lient à I (Homandberg et Erickson, 1986).

26 26 Les fibrilles de fibronectine s'associent à la tenascine-c (une protéine d'adhérence cellulaire au tissu-conjonctif) (Chiquet-Ehrismann et al., 1991). Ce complexe se forme éventuellement en présence de perlecan (HSPG) qui facilite l'association entre les deux molécules d'adhérence (Chung et Erickson, 1997 ; Hopf et al., 1999). N I 1-5 I 9 III 1 III 9-10 III I S S C Type I Type II Type III Domaine épissé Reconnaissance entre les domaines Figure 7 : Affinités entre les différents domaines de la fibronectine Les différents sites sont représentés sur une simple chaîne de fibronectine. Xy : y ème domaine de type X. L'ensemble du processus de fibrillogenèse est soumis à la régulation des récepteurs cellulaires à la fibronectine comme les intégrines α V β3 et α IIb β3 (Woods et Couchman, 1994). Le réseau ainsi formé ne peut être solubilisé en culture cellulaire qu'en présence de S.D.S., de déoxycholate et d'agents réducteurs. La formation de ce dernier n est pas dû à la création ou à la formation de ponts disufures entre les dimères mais à l'incapacité de resolubiliser la glycoprotéine sans devoir déstructurer les kringles qui participent à la fibrillogenèse (Chen et Mosher, 1996 ; Sottile et Mosher, 1997).

27 La Fibronectine et ses ligands La fibronectine est aujourd hui considérée par beaucoup d auteurs comme l une des protéines majeures de l adhérence cellulaire au tissu conjonctif. La fibronectine porte de très nombreux sites d affinité répartis sur les monomères (cf. Figure 8). N S S C I 6 II 1-2 I 7-9 (CBD) collagènes I à VII gélatine C1q, C3 III fibulines I 1 facteur XIII (trangslutaminase plasmatique) I 1-5 III 1 glycosaminoglycanes ADN (faible) (protéoglycanes) Ac. téïchoique (bactéries) III 4-6 ADN III glycosaminoglycanes (fort) (protéoglycanes) I 6 II 1-2 I 7-9 III 1-2 actine fibrine I 1-4 fibrine (20 C) Ig I 9 III 1 Ig III Ig I fibrine (20 C) Figure 8 : Domaines d affinités de la fibronectine pour ses ligands Les différents sites sont représentés sur une simple chaîne de fibronectine. Xy : y ème domaine de type X. Les éléments reconnus peuvent être classés parmi trois groupes Ligands matriciels Collagènes et gélatine La fibronectine se lie aux collagènes I à VII grâce au domaine I 6 II 1-2 I 7-9 dénommé CBD (Collagen Binding Domain / domaine de liaison aux collagènes ; Engvall et Ruoslahti, 1977 ; Hynes et Yamada, 1982 ; Chen et al., 1997 ; Chang et al., 1997 ; cf. Figure 9). L interaction

28 28 entre la FN et la gélatine (collagène de type I dénaturé par la chaleur) est 200 fois supérieure (K d = M) à l interaction entre la FN et le collagène de type I (Yamada, 1983). L héparine facilite l adhésion de la fibronectine au collagène de type 1 (Johansson S et Hook M, 1980). site A site B I 6 II 1-2 I 7 I 8-9 Coll IV Coll I Figure 9 : Domaines d affinités de la fibronectine pour la gélatine et les collagènes Les domaines de type I sont représentés en orange et les domaines de type II en rouges. Les sites potentiels de glycosylation sont en position 430 sur le second domaine de type II et en position 528 et 542 sur le 8 ème domaine de type I (flèches marrons à tête ronde). Sur le second domaine de type II sont portées les 3 méthionines (en position 412, 432 et 446) intervenants dans la liaison du CBD à la gélatine (flèches orange à tête en diamant). Le CBD est composé de deux sites d affinité distincts, I 6 II 1-2 I 7 et I 8-9 (Ingham et Brew, 1992 ; Sticht et al., 1998). Le domaine I 9 intervient pour la liaison entre la fibronectine et le collagène de type I. Le domaine I 7 est essentiel à la liaison de la fibronectine au collagène de type IV (Shimizu et al., 1997). Chaque domaine du CBD a de l'affinité pour les autres domaines qui le flanque et chacun contribue à l'intégrité structurale de ses voisins (Litvinovich et al., 1991). Les glycosylations portées par ces sites modulent leur affinité pour les différents collagènes (Zhu et Laine, 1985). L interaction entre la gélatine et le CBD fait intervenir les méthionines 412, 432 et 446 du domaine II 2 (Miles et Smith, 1993) et certaines structures en «épingle à cheveux» des domaines I 6 II 1-2 (Pickford et al., 2001).

29 Fibulines La fibronectine permet l'incorporation des fibulines-1 A-D et de la fibuline-2 dans le tissu conjonctif et s'associe à ces glycoprotéines lors de la formation du thrombus (Sasaki et al., 1995 ; Godyna et al., 1995 ; Reinhardt et al., 1996 ; Sasaki et al., 1996). L'interaction entre la fibronectine et les fibulines-1 A-D est portée par les domaines III sur un site distinct du domaine d'affinité aux glycosaminoglycanes (Balbona et al., 1992) Glycosaminoglycanes et protéoglycanes La fibronectine se lie aux glycosaminoglycanes sulfatés et non-sulfatés, éventuellement portés par des protéoglycanes, grâce à deux domaines d'affinité (Yamada et al., 1980). Un site de forte affinité est porté par les domaines III qui comporte la séquence consensus RRAR retrouvé sur d'autres protéines liant l'héparine. (Cardin et al., 1991 ; Barkalow et Schwarzbauer, 1991). Bien que le mécanisme d'interaction soit identique, ce site a plus d'affinité pour l'héparine (extraite des bovins) que pour les héparanes sulfates, les chondroïtines sulfates (dont le dermatan sulfate) ou l'acide hyaluronique (Barkalow et Schwarzbauer, 1994) de l homme. Un second site, dit de faible affinité, est porté par les domaines I 1-5. Ingham et al. (1990) supposent que la faible affinité du site est due à la reconnaissance exclusive d'une souspopulation de glycosaminoglycanes. L ensemble de ces interactiosn est régulées par les cations divalents (calium, magnésium et manganèse ; Hayashi et Yamada, 1983) Ligands plasmatiques La fibronectine porte près du CBD un site d affinité pour la transglutaminase érythrocytaire. Le complexe ainsi formé comporte deux molécules de tranglutaminases pour une molécule de fibronectine (LeMosy et al., 1992). Le fragment I 6 II 1-2 I 7-9 III 1-2 lie la fibrine (Ruoslahti et Vaheri, 1975 ; Rostagno et al., 1994) comme les fragments amino- et carboxy-terminaux (I 1-5 et I ) de la fibronectine, mais ces derniers ne lient à la fibrine qu à la température ambiante (20 C) et non à 37 C (Seidl et Hörmann, 1983). La fibronectine reconnaît également la thrombospondine et le facteur XIII a transglutaminase. Le domaine d'affinité de ce dernier est localisé sur le domaine I 1, la transglutaminase reconnaissant la séquence EAQQIV (Parameswaran et al. ; 1990 ; Sottile et al., 1991, Potts et al., 1995).

30 30 Enfin, la fibronectine se lie aux protéines 1q et 3b du complément (C1q et C3b) grâce aux domaines I 6 II 1-2 I 7-9 (Tenner et Cooper, 1980). L interaction entre la fibronectine et C1q est facilité en présence de calcium (Kono et al., 1983) Ligands intracellulaires La fibronectine possède différentes affinités pour des composants intracellulaires : L ADN est reconnu grâce aux domaines III 1 et III 4-6. Cette interaction est elle aussi soumise à la régulation des cations divalents (Hayashi et Yamada, 1983). Le domaine d affinité pour l actine est contenu dans le fragment I 6 II 1-2 I 7-9 III 1-2 (Keski-Oja et Yamada, 1981) sur le CBD (Keski-Oja et al., 1981) Ligands et opsonisation La fibronectine a trois sites d affinité pour les immunoglobulines sur les domaines I 1-4, I 9 III 1 et III Pour ces trois sites, l affinité est la plus forte pour les IgG, puis pour les IgM et la plus faible pour les IgA. (Rostagno et al., 1991). Dans un rôle d opsonine, la fibronectine reconnaît grâce à son domaine I 1-5 l acide téïchoique présent à la surface de bactéries comme les Staphylococci (Ruoslahti et al., 1982), les Pseudomonae (Proctor et al., 1982), les Streptococci (Ozeri et al., 1998) et les Clostridiae (Kreutz et Jürgens, 1995). La fibronectine interagit avec des virus, comme les myxo- et les paramyxoviridae (Choppin et Scheid, 1980), le virus du sarcome de Rous (Stanislawski, 1983), le virus de l hépatite A (Seelig R et al., 1984) ou avec des protozoaires comme Trypanosoma cruzi ou les Leishmaniae (Wyler et al., 1985). Si, en reconnaissant ces microorganismes, la fibronectine joue le rôle d opsonine, elle facilite aussi l invasion de l organisme par les micro-organismes pathogènes La Fibronectine et ses fragments Des fragments de fibronectine sont libérés lors de nombreux processus physiologiques et pathologiques au cours desquels des protéases sont secretées. Ainsi dans le cas d inflammations chroniques (les ulcérations variqueuses par exemple) (Grinnell et al., 1992), des fragments de fibronectine sont libérés (Grinnell et Zhu, 1996). Chez les malades atteints de mucoviscidose et infectés par Pseudomonas aeruginosa, des fragments de fibronectine sont libérés dans le plasma (Allal et al., 1992). De tels fragments sont retrouvés dans le plasma de grands brûlés (La Celle et al., 1991). Par contre, il n y a pas d hydrolyse de la fibronectine lors des inflammations aiguës (Grinnell et al., 1992).

31 31 Les fragments libérés reproduisent des caractéristiques de la fibronectine native, ou en présentent de nouvelles. Ils sont dits alors porteurs d activité cryptique. 2.2 Interactions entre la fibronectine et les récepteurs cellulaires Les intégrines Les intégrines représentent une famille de protéines hétéro-dimèriques sulfatées (Veiga et al., 1996) et glycosylées (Kawano et al., 1993) présentes à la surface des cellules. Elles reconnaissent d'autres récepteurs cellulaires ou des éléments du tissu conjonctif et participent ainsi à l'adhérence des cellules entre elles et sont indispensables à l'adhérence des cellules avec les éléments de la matrice extracellulaire. Parmis la vingtaine de complexes intégrines, plus d'une dizaine reconnaissent la fibronectine, d'une manière exclusive ou non (cf. Table III). Reconnaissance exclusive de la fibronectine Reconnaissance nonexclusive de la fibronectine α Mise en jeu de RGD - 3 β 1, α 8 β 1 Reconnaissances α V β 3, α V β 6 RGD-dépendante Mise en jeu de RGD et de α PHRSN 5 β 1, α V β 1 αii b β 3 Reconnaissances LDV-dépendante Mise en jeu de CS1 α x β 8 dont α V β 8 α 4 β 7 Mise en jeu de CS1 / CS5 / H1 / EDA - α 4 β 1, α 9 β 1 Table III : Distribution des mécanismes de reconnaissances pour les complexes intégrines d après Johansson et al., Les intégrines reconnaissent, notamment grâce aux ions calcium fixés sur la sous-unité A et à ses glycosylations (Kawano et al., 1993), un ou plusieurs domaines portées par chaque monomère de la fibronectine.

32 Mécanismes moléculaires de la reconnaissance du ligand matriciel Une majeure partie de la reconnaissance des intégrines sur la fibronectine est due à différentes séquences peptidiques (RGDS, EDA, III 10 ; LDV, V/CS-1 ; REDV, V/CS-5 ; IDA, III 14 /H1 ; cf. Figure 10) présentées par celle-ci (Guan et Hynes, 1990; Komoriya et al., 1991 ; Mould et al., 1994 ; Akiyama et al., 1995a, Mould et al., 1999, Liao et al., 2002 ). Les résidus aspartyl de ces séquences cibles sont reconnus par les deux sous-unités grâce à une séquence localisée près des sites de fixation des ions divalents (Humphries et al., 1993). D'autres séquences ou structures interviennent indirectement et s'assurent de la bonne configuration de la fibronectine pour qu'elle soit reconnue par l'intégrine. Ainsi, la séquence YTIYVIAL (portée par III 14 ) est associée aux autres domaines de forte affinité à l héparine (III ) afin de permettre le libre accès des intégrines aux séquences des domaines III 8-10 (Fukai et al., 1996 ; Fukai et al., 1997). I 1-5 III 4-5 EDB III 9 III 10 EDA III 14 IIIcs N S S C H1 V (CS-1) V (CS-5) P 1407 HSRN R 1524 GDS P 1669 EDG I 1897 DA L 2011 DV R 2091 EDV Ig-like YTIYVIAL Figure 10 : Sites d interactions avec les intégrines portés par la fibronectine Les différents sites sont représentés sur une simple chaîne de fibronectine. Xy : y ème domaine de type X. IIIcs : Type III connecting segment, segment de liaison de type III. Les séquences portées en marron interagissent avec les sous-unités des intégrines. La séquence et les domaines portés en orange participent à la présentation des séquences de liaison aux intégrine aux récepteurs complexes membranaires.

33 33 Les domaines III4-5, dont les structures ont d'importantes homologies avec les immunoglobulines (Ig-like) de type 's', participent à la présentation de la protéine d'adhérence aux intégrines (Obara et Yoshizato, 1997) Liaisons RGD dépendantes L'intégrine α 5 β 1 est le prototype du récepteur cellulaire à la fibronectine reconnaissant la séquence RDG (cf. Figure 11). La reconnaissance de la séquence RGD (III 10 ) par β1 est facilitée et l'affinité entre les deux protéines augmentée si α5 se lie à PHSRN (III 9 ) (Bowditch et al., 1994 ; Mardon et Grant, 1994 ; Akiyama et al., 1995b ; Mould et al., 1997 ; Redick et al., 2000), et uniquement si la conformation entre III 9 et III 10 n a pas été modifiée (Grant et al., 1997). Figure 11 : Structures à trois dimensions des domaines III 7-10 présentant les séquences RGD et PHSRN La structure d'un fragment comportant les domaines III 7-10 a été déterminé par cristallographie aux rayons X. Les domaines III 7-10 sont représentés respectivement en pourpre, bleu, vert et en jaune sur quatre vues orientées de 60 par rapport à la précédente. La boucle portant la séquence peptidique RGDS est représentée en rouge. La séquence d'activation PHSRN est représentée en bleue. La représentation montre que la séquence RGDS est portée par une boucle qui en dehors de l'axe du fragment (elle se situe à 10 angströms du corps de la molécule) et que les domaines III9 et III10 font apparaître un espace de 40 angströms permettant aux intégrines d'avoir accès à la séquence RGDS (d après Leahy et al., 1996.

34 34 Les domaines I1-5 de la FN peuvent se lier à α5β1 à la place de la séquence RGDS et moduler les réponses cellulaires (fibroblastes de prépuce) dues à l'activation des intégrines (McKeown-Longo et Mosher, 1985; Sottile et al., 1991 ; Dzamba et al., 1994 ; Hocking et al., 1998) Liaisons LDV dépendantes L'intégrine α 4 β 1, qui illustre la liaison de la fibronectine avec les intégrines sans faire intervenir la séquence RGD, reconnaît les domaines III 14 -V de la fibronectine. Sur ces domaines, l'intégrine se fixe grâces aux séquences LDV de CS-1 et IDA de H1 (avec moins d'affinité pour ce dernier). La reconnaissance de ces deux séquences est accrue par la séquence REDV de CS-5 qui agit comme un activateur synergiste (Komoriya et al., 1991 ; Mould et al., 1994). La reconnaissance de la fibronectine par les intégrines est soumis à la régulation de l ADPribosyltransférase (E.C ) secrétée par les PMN qui inhibe la liaison des intégrines à la glycoprotéine greffant un résidu ADP-ribosyl sur la séquence RGDS de la protéine d'adhérence (Terashima et al., 1998) Autres récepteurs Les galectines (1 et 3) et la L-sélectine, des récepteurs membranaires qui possèdent une activité lectine calcium-dépendante, permettent l'adhérence des neutrophiles sur la fibronectine en reconnaissant soit les structures glycosidiques de la protéine, soit en ayant en plus une affinité pour le core de la protéine extracellulaire (Sikorski et al., 1996; Warfield et al., 1997, Moiseeva et al., 1999). La galectine-3 peut ensuite former un complexe membranaire en reconnaissant les structures glycosylées de l'intégrine (Ochieng et al., 1998). Les syndécanes 1 à 4 participent à la formation de focale d'adhérence en reconnaissant un élément de la matrice extracellulaire liant les glycosaminoglycanes comme la fibronectine. La reconnaissance de leur ligand induit la phosphorylation de leurs domaines cytoplasmiques (Woods et Couchman, 1996) permettant d'activer la liaison entre l'intégrine et son ligand (Brown 1997).

35 35 Le domaine I 6 II 1-2 I 7-9 III 1-2 de la fibronectine est reconnu par un récepteur de 165kDa de l odontoblaste qui est nécessaire à la différenciation de ce dernier (Lesot et al., 1992). La reconnaissance de la fibronectine par les intégrines active alors différentes voies de transduction au sein de la cellule Mécanismes de transduction Voie des tyrosines kinases L'activation des voies des tyrosine-kinases par activation d'irs1 (Insulin Receptor Substrate 1 / premier substrat du récepteur à l'insuline) ou d'ilk (Integrin Linked Kinase / kinase liée aux intgérines) (LaFlamme et Auer, 1996 ; LaFlamme et al., 1997). L'activation de la voie des petites protéines G et de Ras en particulier par activation (directe ou indirecte) de pp52 SHC (Rous Sarcoma Homologous Component / oncogène homologue à l'agent du sarcome de Rous) par la SU β des intégrines (Law et al., 1996) pp125 FAK L'activation de pp125 FAK (Focal Adhesion Kinase / kinase des foci d'adhérence) entraîne l'activation de la voie des tyrosine-kinases (par l'activation de Grb2 et de p85 PI3K (phosphoinositol 3 kinase), mais également une restructuration du cytosquelette grâce à phosphorylation de la taline, de la paxilline et de la vinculine (Otey, 1996 ; Bellis et al., 1997 ; van Kooyk et al., 1998). L'activation de ces deux élements entraîne une polymérisation de l'actine et la formation de fibres de tension (stress fibers) (Iwamoto et al., 1998). L immunoprécipitation de ces fibres de tensions par des anticorps dirigés contre l actine, montre que ces fibres de tensions sont physiquement liées à la fibronectine par l intermédiaire des complexes protéiques des focales d adhésion (Katoh et al., 1998) Intégration des forces de tensions En plus de ces voies de transduction "classiques", l'adhérence de la cellule au tissu conjonctif entraîne le processus de tensegrity (Ingber 1997). La tensegrity (ou tensional integrity / intégration des forces de tensions) est la stabilisation des forces de tension et de compression au sein d une architecture qui comporte des structures rigides et élastiques. La résultante des phénomènes de tensegrity est la forme physique des éléments (artificiels ou naturels comme les cellules). L intégration cellulaire des forces

36 36 physiques peuvent induire différentes voies de transduction du signal comme par la modulation des activités des protéines transmembranaires. Au niveau intracellulaire, les modifications du cytosquelette, induites par la polymérisation de l'actine et la formation des fibres de tensions, peuvent influencer les activités des éléments liés aux cytosquelette. Une illustration de la tensegrity est l'augmentation de la transcription de la fibronectine par les cellules endothéliales lors de la hausse de la pression artérielle (Takasaki et al., 1990). 2.3 Relations entre la matrice et l organisme Influence de la cellule sur la matrice Influence sur la physiologie cellulaire L'adhérence de la cellule au tissu conjonctif via entre autre la fibronectine peut avoir différentes influences sur le comportement cellulaire Motilité cellulaire et chemotactisme La formation des foci d adhérence puis des fibres de tensions permettent aux cellules de migrer à travers le tissu conjonctif. Certains éléments contribuent à l adhérence cellulaire et d autres sont indispensables pour un type cellulaire donné. Les éléments du tissu conjonctif et leurs fragments vont initier la migration cellulaire en devenant des agents chemotactiques. Différents fragments issus de l'hydrolyse ménagée de la fibronectine initient ou augmentent la migration cellulaire RGD-indépendante comme les fragments portant les domaines III (Kapila et al., 1997) et I (Fukai et al., 1995). Dans le cas des réponses cellulaires aux infections, les fragments de fibronectine générés par les neutrophiles et portant le CBD participent au chemotactisme recrutant les monocytes et augmentent l'adhérence du macrophage sur le lieu de l'inflammation (Norris et al., 1982 ; Proctor, 1987) Influence sur le cycle cellulaire La matrice extracellulaire intervient lors de la régulation de la prolifération cellulaire par les facteurs de croissance.

37 37 Les glycosaminoglycanes incorporés dans le tissu conjonctif lient les facteurs de croissance (Schuppan et al., 1998). Les protéines liant les glycosaminoglycanes comme la fibronectine et les collagènes de types I, III, V et VI jouent alors un rôle de réservoir de facteurs de croissance, les éléments du tissu conjonctif étant appelés agents de crinopexie (Feige et Baird 1995). Le contact entre la cellule et les protéines du tissu conjonctif induit et/ou permet la prolifération (Kapila et al., 1998). L adhésion à la fibronectine permet la stimulation de la division cellulaire par les facteurs de croissance (Danen et al., 2000). La libération de fragments de protéines matricielles peut jouer des effets contradictoires : Le fragment I 1-5 de la FN peut par exemple inhiber la prolifération de cellules de Schwann (Muir et Manthorpe, 1992) Le domaine III est un agent d adhérence et de développement axonal des neurones des systèmes nerveux embryonnaires périphériques et centraux (Rogers et al., 1985 ; Rogers et al., 1987) tandis que le domaine III 14 inhibe la conversion myofibroblastique des cellules hépatiques en étoile (Kato et al., 2001) Gènes cibles des voies de transduction du signal issues de l adhérence Les voies de transduction du signal activées par l adhérence cellulaire au tissu conjonctif ou par des fragments des protéines matricielles induisent des modifications transcriptionelles (Ostberg et al., 1995). Les fragments de fibronectine stimulent la sécrétion de TNFα par les monocytes (Beezhold et Personius, 1992). Les fragments présentant le domaine EDA, comme ceux libérés lors des processus inflammatoires et de la cicatrisation, activent la réponse immunitaire de l'organisme face aux invasions bactériennes en augmentant l'expression et la sécrétion des récepteurs TLR4 (Tolllike receptor 4) (Tauszig et al., 2000). L'adhérence des macrophages sur la fibronectine est indispensable à la sécrétion de MMP9 (Xie et al., 1998). Dans le cartilage, les fragments de fibronectine induisent une diminution de la synthèse des protéoglycanes (Xie et al., 1993 ; Homandberg et al., 1993) et une chondrolyse, après injection intra-articulaire, en activant la sécrétion in vivo de protéases (Xie et Homandberg, 1993).

38 Dégradation de la matrice extracellulaire Les cellules peuvent initier des phénomènes d inside-out (effet de la cellule vers son environnement) qui font intervenir les récepteurs cellulaires du tissu conjonctif. Les cellules peuvent secréter des protéases (MMPs, cathepsines, trypsin-like, élastases) qui vont dégrader le tissu conjonctif. Lors de la dégradation des protéines du tissu conjonctif, la libération des fragments de fibronectine accentue la destruction de la matrice extracellulaire. Certains auteurs ont supposé que les fragments de fibronectine activaient la sécrétion de protéases par les cellules du tissu (cf.table IV) ou portaient des activités protéolytiques cryptiques (Xie et Homandberg, 1993). Activité Mécanisme Domaine Référence Aspartyl-protéase III Gélatinolytique 6-7 Planchenault et al., 1990 Métalloprotéase III 9-10 Boudjennah et al., 1996 Laminolytique Fibronectinolytique Aspartyl-protéase Trypsin-like III I 1-5 Collagènolytique de type IV Métalloprotéase I 5 II 1-2 I 6-8 Emod et al., 1990 Lambert-Vidmar et al., 1991a Lambert-Vidmar et al., 1991b Table IV : Activités protéolytiques cryptiques portées par les fragments de fibronectine Réorganisation de la matrice extracellulaire La cellule participe à l organisation et à la réorganisation de la matrice extracellulaire. Dans le cas de la fibronectine, les fibrilles néoformées sont co-localisées avec l'intégrine α5β1 sur les foci d'adhérence (Christopher et al., 1997) : ces récepteurs sont activés par des éléments cytosoliques des voies de transduction des facteurs de croissance ou des hormones et du cytosquelette (McKeown-Longo et Etzler, 1987). Cette activation induit un changement conformationel de l ecto-domaine des intégrines observables par immunologie (Takagi et al., 1997). La fibronectine liée par sa séquence RGDS à la sous-unité α5 (Hedin et al., 1997) expose alors des domaines crytiques (Zhong et al., 1998) et forme des fibrilles qui sont incorporées dans la matrice non-soluble. La galectine-1 participe elle aussi à l organisation de la matrice extracellulaire en se liant aux résidus galactose portés par la fibronectine (Ozeki et al., 1995 ; Perillo et al., 1998).

39 Influences sur la physiologie humaine Processus physiologiques Le développement embryonnaire Après la fécondation, l'expression des intégrines et donc l'adhérence aux ligands de la matrice extracellulaire change au cours de l'implantation du zygote et du développement embryonnaire (Aplin, 1996). Les voies de transduction activée par pp125 FAK permettent la migration cellulaire puis la différenciation (Shiokawa et al., 1998). Les différents éléments de la matrice extracellulaire vont conduire la cellule migrante vers le site de développement du tissu puis déterminer sa transformation (Gibson et al., 1983). La fibronectine est indispensable à la formation du myocarde et des vaisseaux (George et al., 1997). De plus, la fibronectine est le support de la migration cellulaire lors de la formation et du développement de la crête neurale (Henderson et Copp, 1997) Processus de coagulation Les fibronectines plasmatiques et cellulaires jouent le rôle d'agent de coagulation (Witte et Barbul, 1997 ; Brotchie et Wakefield, 1990). Au cours de l'hémostase, les plaquettes adhèrent aux fibres de collagène I et III grâce au facteur von Willebrand, à la thrombospondine et à la fibronectine. La fibronectine et le facteur von Willebrand se lient sur différents sites distincts des collagènes de la matrice sous-endothéliale pour permettre la formation du thrombus (Houdijk et al., 1985) La cicatrisation Suite à une blessure, la fibronectine contribue à la formation d un caillot avec la fibrine (Greiling et Clark, 1997). La fibronectine est liée à la fibrine grâce au facteur XIII (transglutaminase plasmatique), étape essentielle pour l adhérence des fibroblastes (Corbett et al., 1997). Les macrophages sécrètent de la fibronectine afin d'accélérer le recrutement et l'activation cellulaire des fibroblastes (Witte et Barbul, 1997). Lors de la réparation des vaisseaux, les protéoglycanes sulfatés et la fibronectine sont essentiels à la migration des cellules endothéliales (Chon et al., 1997). Les fibroblastes adhèrent au réseau fibrine/fibronectine puis secrètent des protéases afin de dégrader le tissu lésé. Les syndécanes (1 et 4) se lient aux protéases et contribuent à la régulation de la balance protéolytique lors

40 40 des processus de cicatrisation (Kainulainen et al., 1998). Les fragments de collagènes libérés participeront au recrutement d autres fibroblastes qui synthétiseront une néo-matrice composée de fibronectine et d hétéro-fibrilles de collagènes I/III et I/V (Cordeiro et al., 1997). Dans le cas de plaies de la lame basale, la guérison passe par des étapes de migration cellulaire, puis de prolifération grâce à la sécrétion de fibronectine 24 heures après la lésion, puis de collagène de type IV et de laminine 36 heures après la lésion (Kamei et al., 1998) L opsonisation Même si la fibronectine n'est pas toujours considérée comme une opsonine, la glycoprotéine intervient lors des phénomènes inflammatoires. Les fragments libérés lors de la dégradation de la fibronectine par les bactéries activent les récepteurs de la protéine 3 du complément (C3). Ils activent également les récepteurs aux Fc (partie constante des immunoglobulines) et permettent ainsi l'augmentation de la phagocytose des bactéries (Yamada, 1983). Enfin, ils augmentent l'activité bactéricide des lymphocytes en prolongeant la sécrétion de super-oxydes et de peroxyde d'hydrogène (Proctor, 1987). Toutefois, si la fibronectine se lie aux bactéries et participe à leur opsonisation, elle augmente l adhérence de micro-organismes au sein de l organisme. Les pathogènes utilisent alors la fibronectine afin de coloniser l organisme et de résister aux attaques du système immunitaire Processus pathologiques Cancer Lors de la tumorigénèse et de la formation des métastases, les cellules perdent avec leur phénotype de cellule différenciée l expression tissu-spécifique des intégrines (Sanders et al., 1998) et modifient les éléments des chaînes de glycosaminoglycanes de leurs protéoglycanes membranaires. L ensemble du micro-environement de la cellule cancéreuse est modifié (Park et al., 2000). Des protéoglycanes à chondroïtine sulfate sont sécrétés afin de minimiser l adhérence cellulaire tout en activant la migration. Les cellules tumorales modifient l expression des protéines de la matrice extracellulaire pour permettre leur adhérence et diminuer la capacité de crinopexie de la matrice (Moscatello et al., 1998; Patel et al., 1998 ; Boudreau et Bissell, 1998 ; Hansen et Bissell, 2000). La libération de messagers paracrines par la cellule tumorale modifie l expression de ces protéines par les fibroblastes. Ceux-ci, en

41 41 présence des produits sécrétés par des cellules d adénocarcinome colorectal, modifient l épissage alternatif de la fibronectine afin de secréter des isoformes contenant la région EDA. Grâce aux nouveaux complexes membranaires et aux modifications de la composition du tissu conjonctif, les cellules cancéreuses vont augmenter leur adhérence pour la matrice extracellulaire et réaliser l invasion tumorale (Akiyama et al., 1995b ; Enam et al., 1998). Dans le cas des cellules cancéreuses ovariennes, celles-ci peuvent également utiliser la fibronectine pour inhiber la prolifération des lymphocytes et diminuer leur propre neutralisation par le système immunitaire (Olt et al., 1992) Maladies chroniques et/ou dégénératives Différentes maladies chroniques résultent d un déséquilibre du tissu conjonctif. Dans le cas de la fibronectine, une hypersécrétion de la protéine par les fibroblastes entraîne une sclérodermie systémique (Stamm et al., 1992). Dans le cas de certains syndromes d'ehlers-danlos (EDS III, IV et VII), l'analyse des ARNm (Zoppi et al., 1998) montre que le processus d'épissage alternatif est modifié au sein des fibroblastes entraînant une sous-expression (30%) des formes de fibronectine pourvues en domaine EDA (EDA+FN) par rapport aux fibroblastes issus de tissus sains (où les formes EDA+FN représentent 70% de la population des ARNm). Après traduction, la fibronectine s'accumule dans le cytoplasme des cellules, entraînant un déficit en fibronectine dans le tissu conjonctif et une désorganisation de ce dernier. D autres pathologies chroniques ne sont pas dues à un défaut d un des éléments de la matrice extracellulaire mais ont des effets sur la physiologie du tissu conjonctif. Les cas d artériosclérose observés lors des diabètes sont dus à la glycation de la fibronectine, qui combinée à la présence d'il-1α, augmente ostensiblement l'expression d'e-sélectine et de CAM (ICAM-1, VCAM-1 et PECAM) chez les cellules endothéliales, tout en captant le monoxyde d'azote, empêchant la relaxation vasculaire (Sengoelge et al., 1998). Ces phénomènes accompagnent une hyper sécrétion de versicane par les cellules musculaires lisses qui empêche la capture des LDL par les cellules mésenchymateuses. Au cours des différents phénomènes d arthrose (dysplasie focale, maladie de Paget, dysplasie poly-épiphysaire ou facteur génétique), les phénomènes inflammatoires provoque un déséquilibre entre l anabolisme et le catabolisme des constituants du tissu conjonctif (dont le collagène II). Les chondrocytes, après une atteinte de la matrice, sur-expriment des protéines

42 42 peu présentes dans le cartilage sain, comme la fibronectine, les collagènes I et III, et des protéoglycanes de faible poids moléculaire. Les polymorphonucléaire neutrophiles de l inflammation sécrètent de la fibronectine et de la thrombospondine (Kreis et al., 1989). L apport de ces différents éléments au sein du cartilage entraîne alors une déstructuration de la matrice extracellulaire. En effet, la fibronectine, une fois sécrétée et incorporée dans le cartilage, est hydrolysée par le processus inflammatoire. Certains fragments de fibronectine sont retrouvés dans la synovie de l'articulation atteinte de polyarthrite (Xie et al., 1992) et contribuent à la chondrolyse en absence d acide hyaluronique (Homandberg et al., 1997 ; Williams et al., 1997). D autres fragments de fibronectine entraînent l augmentation de l anabolisme cellulaire. Les cartilages deviennent alors plus résistants face aux nouvelles agressions mais perdent leur caractéristiques structurales (Homandberg et Wen, 1998) Enjeux thérapeutiques Les éléments du tissu conjonctif étant liés à de nombreux processus physiologiques et/ou pathologiques, ils pourraient constituer une palette d outils thérapeutiques Aide au diagnostic La présence anormale de fibronectine ou de fragments de fibronectine contribuent au diagnostic et au pronostic de nombreuses pathologies. La présence d un taux élevé de fibronectine fœtale dans les glaires cervicales permet d évaluer les risques d accouchement avant terme et de pré-éclampsie chez des patientes présentant des contractions avant la 34 ème semaine d aménorrhée (Greenhagen et al., 1996). La présence de fibronectine et/ou de ses fragments dans les urines peut renseigner sur la malignité et le pouvoir métastasique de tumeurs non-implantées dans les voies uro-génitales (Katayama et al., 1993) Lutte thérapeutique Les éléments du tissu conjonctif interviennent sur la vie cellulaire en régulant sa prolifération et sa différenciation, en particulier en permettant l adhérence cellulaire. Dans la lutte anticancéreuse, l utilisation des propriétés d adhérence de la cellule maligne sur la matrice extracellulaire permet d aborder deux stratégies : l attaque directe des cellules tumorales et la lutte contre la néoangiogénèse de la tumeur. Dans le premier cas, des anticorps dirigés contre des intégrines spécifiquement exprimés par la cellule cancéreuse et radio-

43 43 marqués avec un émetteur de particules α ou β pourraient être utilisés par injection intratumorale pour combattre les processus de cancérogenèse (Saga et al., 1997). Pour lutter contre la néoangiogenèse, des antagonistes des complexes intégrines comme le peptide RGD cyclique pourraient être utilisés comme agent anti-néovascularisation de la tumeur chez l animal (Zetter 1998). L'injection intratumorale d'anticorps anti-α v β3 inhibe également l'angiogénèse par induction de l'apoptose des cellules endothéliales prolifératives (Brooks et al., 1994). D autres antagonistes non-peptidiques à usage oral sont actuellement a l'étude. Ces outils permettent de lutter contre la formation de tumeurs secondaires. L utilisation du peptide RGDS prévient ainsi de la formation de métastase du poumon chez la souris infectée avec des cellules de mélanome (Humphries et al., 1986). L utilisation de fragment de fibronectine issu du domaine III 1 (dénommé anastellin) permet de lutter contre les trois volets de la tumorigenèse en inhibant à la fois la croissance et l angiogenèse de la tumeur primaire et l implantation de cellules pré-métastasiques (Yi et Ruoslahti, 2001). Une autre stratégie consiste à ne pas détruire la cellule maligne, mais de la contrôler. La transfection par des gènes codant pour les intégrines α5β1 ou α2β1 convertit l aspect et le cycle de vie de cellules cancéreuses en ceux de cellules non-tumorigènes (Giancotti et Ruoslahti, 1990 ; Zutter et al., 1995). L utilisation topique de fibronectine autologue réduit les temps de cicatrisation des ulcères cornéens, des ulcères cornéens herpétiques et des ulcères variqueux chroniques des membres inférieurs (Brotchie et Wakefield, 1990 ; Stamm et al., 1992). L apport de fibronectine exogène purifiée corrige l activité déficiente d opsonisation dans les cas de septicémie, de brûlures étendues et de chirurgie traumatisante (Lanser et al., 1980). Des complexes fibronectine/fibrine (Tissucol ) sont utilisés comme colle biologique comme agent d'hémostase ou d'adhérence tissulaire, permettant la synthèse de matrice collagènique, la colonisation et la prolifération cellulaire (cellule du ligament parodontal) (Fabris et al., 1998).

44 44 L'utilisation de la fibronectine, seule ou associé à d'autres composés biologiques en utilisation topique (dans le cas des substituts de peau par exemple) exige d'étudier et de caractériser les interactions entre la fibronectine et son principal ligand, le collagène de type-i. Il faut avant tout disposer d'importantes quantités de fibronectine, pure et stable dans le temps, dotée de conformations physico-chimiques et physiologiques non-dénaturées par le protocole de purification. L'obtention d'un fragment de fibronectine comportant le domaine de liaison au collagène permettra de faciliter l'étude des interactions en la fibronectine et le collagène. Enfin, l'étude qualitative et dynamique des glycosylations portées par la glycoprotéine et son fragment précisera ensuite le rôle des structures glycosylées participant à la complexation des deux protéines.

45 45 3 MATERIELS ET METHODES 3.1 Matériels Produits sanguins Le cryoprécipité de plasma sanguin humain (CPSH) est fourni par le Laboratoire du Fractionnement et des Biotechnologies de l Etablissement Français du Sang (Les Ulis) sur sa propre certification. Le plasma sanguin citraté est aimablement fourni avant sa congélation par le Centre de Transfusion de l Ouest Parisien (Pontoise) Réactifs Les produits chimiques répondent aux normes de l ACS (American Chemical Society / Société Américaine de Chimie). Les sels servant à la C.L.H.P. (Chromatographie Liquide à Hautes Performances) sont de haute pureté et qualifiés pour C.L.H.P.. Les sels et les réactifs nécessaires aux électrophorèses et aux électro-transferts sont de qualités pour électrophorèse et sont fournis par Bio Rad. L eau utilisée est de l eau purifiée par colonnes de déminéralisation et par osmose inverse ayant une résistance supérieure à 18MΩ (HPSelect). Sauf en cas d incompatibilité chimique ou physique, les solutions tampons sont filtrées à travers une membrane 0.22µm Chaînes de chromatographie Chromatographie basse pression Les chaînes de chromatographie liquide à basse pression sont composées d une pompe P3 (Pharmacia Biotech) ou Minipuls (Gilson), d un conductimètre en ligne et d un spectrophotomètre UV-1 muni d'un filtre à 280 nm (Pharmacia Biotech) C.L.H.P. La chaîne de marque Waters est composée d une pompe 625, d un injecteur automatique d échantillons 717plus et d un spectrophotomètre à simple longueur d onde 486 ou à double longueur d onde Elle est contrôlée par un logiciel Millenium32. Les tampons, préalablement dégazés sous vide d air, sont continuellement dégazés pendant la chromatographie par l injection d hélium (100ml/h/tampon pendant 15 min. puis 15ml/h/tampon).

46 Résines de chromatographie Les résines d héparine-cellufine et de gélatine-cellufine sont de marque Chisso Corporation et sont fournies par Interchim (Montluçon, France). Les résines ConA - agarose et protéine A - agarose sont fournies par Pharmacia Biotech (Les Ulis, France). Les résines de chromatographies en perfusion Poros - HQ et Héparine - Poros sont fournies par Roche Diagnostics (Meylan, France) Protéines et enzymes La fibronectine commerciale purifiée à partir de plasma sanguin humain a été fournie par Sigma (Meylan, France). Les immunoglobulines polyclonales commerciales sont fournies par Sigma, par Dako (Trappes, France) ou par Biosys (Compiègne, France ; cf.table V). Les lectines biotinylées sont de marque Vector et fournies par Biosys. Les lectines marquées à la digoxigénine (DIG) ont été fournies par Roche Diagnostics (cf. Table VI). L'avidine et la phosphatase alcaline couplée à la biotine ont été fournies par Bio Rad (Marnes La Coquette, France). Les autres protéines ont été fournies par Sigma et/ou par Roche Diagnostics. Trypsine traitée au TPCK, E.C Glycopeptidase F (PNGase F), E.C Gélatine bovine Dialyse Les membranes de dialyse sont de marque Cellusep (Polylabo, Strasbourg, France) et ont un seuil de coupure de 30kDa. Les dialyses sont effectuées sous agitation magnétique à +8 C Tampons Les abréviations utilisées correspondent aux tampons suivants : TE : Tris-HCl 50mM, EDTA 1mM à ph 7.4. TEBS : Tris-HCl 50mM, NaCl 150mM, EDTA 1mM à ph 7.4. TBS : Tris-HCl 50mM, NaCl 150mM à ph 7.4. TxTBS : Tris-HCl 50mM, NaCl 500mM, Tween % (p/v) à ph 7.4

47 47 Antigène Conjugué Hôte Dilution Référence Fournisseur hpfn Lapin 1/2500 ème Laboratoire de Virologie et hpfn Souris 1/2500 ème Immunologie Moléculaires F60 Souris 1/2500 ème INRA / Jouy-en-Josas FN Lapin 1/10000 ème F-3648 Sigma vwf Lapin 1/6000 ème A0082 Dako FBG Lapin 1/6000 ème A0080 Dako Ig Lapin PAL Mouton 1/10000 ème A-3687 Sigma Ig Lapin PAL Chèvre 1/4000 ème BI2507 Biosys Ig Souris PAL Chèvre 1/10000 ème A-5324 Sigma Ig Souris PAL Mouton 1/4000 ème BI2513C Biosys Table V : Caractéristiques des immunoglobulines utilisées HpFN : fibronectine plasmatique humaine hautement purifiée ; F60 : fragment de 60kDa présentant les domaines I 6 II 1-2 I 7-9 III 1-2 de la fibronectine plasmatique humaine ; FN : fibronectine plasmatique humaine ; vwf : facteur von Willebrand humain ; FBG : fibrinogène humain ; Ig : immunoglobulines ; PAL : phosphatase alcaline conjuguée à l immunoglobuline. Les dilutions, données par les fournisseurs, sont identiques pour les révélations immunologiques et les dosages immunoglogiques.

48 48 Lectine Origine Conjugué Dilution Motifs reconnus Fournisseur ConA Canavalia ensiformis biotine 1µg/ml Man, 2 Vector DBA Dolichos biflorus biotine 1µg/ml Gal, GalNAc Vector DSL Datura stramonium digoxigenine 1µg/ml GlcNAc Boerhinger GNA Galanthus nivalis digoxigenine 1µg/ml Man (1-3) Man Boerhinger LCA Lens culinaris biotine 1µg/ml Man Vector MAA Maackia amurensis digoxigenine 5µg/ml NeuA (2-3) Gal Boerhinger PHA-E Phaesolus vulgaris biotine 1µg/ml 2 Vector PHA-L Phaesolus vulgaris biotine 1µg/ml 3, 4 Vector PNA Arachis hypogaea digoxigenine 10µg/ml Gal (1-3) GalNAc Boerhinger PSA Pisum sativum biotine 1µg/ml Man Vector RCA 120 Ricinus communis biotine 1µg/ml Man Vector SBA Glycin max biotine 1µg/ml Gal, GalNAc Vector SJA Sophorica japonica biotine 1µg/ml Gal, GalNAc Vector SNA Sambucus nigra digoxigenine 1µg/ml NeuA Boerhinger SNA Sambucus nigra biotine 1µg/ml NeuA Vector UEA-1 Ulex europaeus biotine 1µg/ml Fuc (1-2) Gal Vector WGA Triticum vulgaris digoxigenine 10µg/ml NeuA, GlcNAc Boerhinger WGA Triticum vulgaris biotine 1µg/ml NeuA, GlcNAc Vector succwga Triticum vulgaris biotine 1µg/ml GlcNAc Vector Table VI : Caractéristiques des lectines utilisées Les dilutions, données par les fournisseurs, sont identiques pour les révélations sur membranes et les dosages sur plaques. Pour chaque lectine sont associés les motifs holosidiques reconnus. Man : mannose ; NeuA : acide neuramidique (acide sialique) ; Gal : galactose ; GalNAc : N-acétyl-galactosamine ; GlcNAc : N-acétylglucosamine ; Fuc : fucose ; 2 : structure bi-antennaire ; 3 : structure triantennaire ; 4 : structure quadri-antennaire.

49 Méthodes Purification de protéines Solubilisation du cryoprécipité de plasma sanguin humain Un morceau de 35g de pâte de cryoprécipité de plasma sanguin humain (CPSH) stocké à 80 C est solubilisé à température ambiante sur un plateau oscillant à 200 tour/min. pendant trois heures dans 175ml de tampon TEBS (5 fois sa masse [g] en volume [ml]) complémenté avec 1mM final de PMSF préalablement dissout dans de l acétone ou de l isopropanol. La solution est ensuite centrifugée à g à température ambiante pendant 10min. Le culot est écarté et le surnageant est ensuite conservé à 8 C Purification de la fibronectine par le protocole en trois étapes Sauf exceptions, toutes les étapes de purification sont réalisées à 8 C afin de minimiser les dégradations protéolytiques, tout en minimisant la précipitation à froid des complexes fibronectine/fibrinogène Chromatographie d affinité à la gélatine La fraction protéique est injectée sous un flux linéaire de 480 cm/h dans une colonne de gélatine-cellufine (2.2 x 30cm) stabilisée par du TEBS. Les protéines retenues sont éluées par un tampon TE NaCl 1M, par un tampon TE NaCl 1M Urée 1M puis par un tampon acétate 20mM, NaBr 1M à ph 5.5, par un tampon TBS CaCl 2 400mM ou par un tampon TE NaCl 250 mm Urée 3M (Le protocole utilisant l urée est schématisé sur la Figure 12). Les fractions recueillies sont immédiatement soit dialysées contre du TE, soit diluées afin d obtenir une concentration en NaCl égale à 50mM. Après chromatographie, la colonne est régénérée par du TE NaCl 2M Urée 7M avant d'être rééquilibrée dans le tampon de stabilisation Chromatographie d affinité à l héparine Les fractions obtenues précédemment sont injectées sur une colonne d héparine-cellufine (SR25/45 Pharmacia, volume 200ml) stabilisée dans du TEBS. Le flux linéaire appliqué est de 22 cm/h. Les protéines retenues sont éluées grâce à l injection de tampon TE complementé par des concentrations croissantes de NaCl (0.15, 0.25 et 0.5M) séparé par des rinçages de colonnes par injection du tampon de stabilisation. Après chromatographie, la résine est

50 50 régénérée par du TE NaCl 2M Urée 7M avant d'être rééquilibrée dans le tampon de stabilisation. Cryoprécipité de plasma sanguin humain solubilisation Chromatographie d'affinité gélatine-cellufine NR G NaCl NaCl 1M G urée NaCl 250mM Urée 3M Chromatographie d'affinité héparine-cellufine NR H 150 NaCl 150mM H 250 NaCl 250mM H 500 NaCl 500mM Chromatographie d'affinité gélatine-cellufine NR G urée NaCl 250mM Urée 3M hpfn Figure 12 : Protocole de purification de la fibronectine en trois étapes NR : fractions non retenues ; Gx : fraction éluée de la colonne d affinité à la gélatine par le composé x ; Hx : fraction éluée de la colonne d affinité à l héparine par une concentration de x mm de NaCl.

51 Purification de la fibronectine par le protocole de Vuento L ensemble de ce protocole de purification, décrit par Vuento et Vaheri (1979) (Cf. Figure 13), est réalisé à température ambiante. Dès la solubilisation du cryoprécipité et lors de chaque étape de purification, tous les tampons sont additionnés de benzamidine 1mM, EDTA 5mM NaN 3 0.5% Chromatographie d exclusion Le cryoprécipité de plasma sanguin humain solubilisé et centrifugé est injecté sur une colonne de Sepharose 6B (seuil de coupure : 10 à 4000kDa ; 1.6 x 120 cm) stabilisée dans du Tris-HCl 50mM à ph 7.5. Le flux linéaire appliqué est de 30 cm/h. La colonne est régénérée après chromatographie par du TE NaCl 2M Urée 7M avant d'être rééquilibrée dans le tampon de stabilisation Chromatographie d affinité à la gélatine La première fraction protéique exclue lors de l étape précédente est injectée sous un flux linéaire de 480 cm/h dans une colonne de gélatine-cellufine (2.2 x 6.5cm) stabilisée par Tris- HCl 50mM NaCl 150mM à ph 7.5. Les protéines retenues sont éluées par un tampon Tris- HCl 50mM NaCl 1M à ph 7.5, par un tampon Tris-HCl 50mM NaCl 150mM arginine 0.2M à ph 7.5 puis par un tampon Tris-HCl 50mM NaCl 150mM arginine 1M à ph 7.5. Les fractions recueillies lors de la dernière étape sont immédiatement dialysées contre du Tris-HCl 50mM à ph Chromatographie d affinité à l arginine La dernière fraction protéique obtenue lors de la chromatographie d affinité à la gélatine est injectée sous un flux linéaire de 60 cm/h dans une colonne de gélatine-cellufine (1.6 x 5cm) stabilisée par Tris-HCl 50mM à ph 7.5. Les protéines retenues sont éluées par un tampon Tris-HCl 50mM NaCl 0.1M à ph 7.5.

52 52 Cryoprécipité de plasma sanguin humain solubilisation Chromatographie d exclusion Sepharose 6B 6B 1 6B 2 6B 3 Chromatographie d'affinité gélatine-cellufine NR G NaCl G 0.2 G 1 NaCl 1M Arginine 0.2M Arginine 1M Chromatographie d'affinité Arginine-sepharose NR A NaCl 100mM hpfn Figure 13 : Protocole de purification de la fibronectine en trois étapes 6Bx : x ème fraction éluée sur Sepharose 6B ; NR : fractions non retenues ; Gx : fraction éluée de la colonne d affinité à la gélatine par le composé x ; A : fraction éluée de la colonne d affinité à l arginine par 100mM de NaCl.

53 Purification de la fibronectine par chromatographie échangeuse d ions. Ce protocole de purification a été décrit par Le Cœur et al. (résultats non-publiés, cf. Figure 14) et est réalisé à température ambiante. Dès la solubilisation du cryoprécipité et lors de chaque étape de purification, tous les tampons sont additionnés de benzamidine 1mM, EDTA 5mM NaN 3 0.5% Chromatographie échangeuse d anions Le cryoprécipité de plasma sanguin humain solubilisé et centrifugé est injecté sur une colonne de DEAE Fast Flow (2.2 x 8cm), stabilisée dans du Tris-HCl 50mM à ph 7.5. Le flux linéaire appliqué est de 120 cm/h. Les protéines retenues sont ensuite éluées grâce à l injection de tampon Tris-HCl 50mM NaCl 0.1 à ph 7.5 puis de Tris-HCl 50mM NaCl 0.5 à ph 7.5. Après chromatographie, la résine est régénérée par du TE NaCl 2M Urée 7M avant d'être rééquilibrée dans le tampon de stabilisation Chromatographie d affinité à l héparine La dernière fraction obtenue précédemment est injectée sur une colonne d héparine-cellufine (2.2 x 30cm) stabilisée dans du Tris-HCl 50mM à ph 7.5. Le flux linéaire appliqué est de 22 cm/h. Les protéines retenues sont éluées grâce à l injection de tampon de stabilisation complementé par des concentrations croissantes de NaCl (0.15, 0.25 et 0.5M) séparé par des rinçages de colonnes par injection du tampon de stabilisation. Après chromatographie, la résine est régénérée par du TE NaCl 2M Urée 7M avant d'être rééquilibrée dans le tampon de stabilisation.

54 54 Cryoprécipité de plasma sanguin humain solubilisation Chromatographie échangeuse d anions DEAE sepharose Fast Flow NR D 0.1M NaCl 0.1M D 0.5M NaCl 0.5M Chromatographie d'affinité héparine-cellufine BK H 150 NaCl 150mM H 250 NaCl 250mM H 500 NaCl 500mM hpfn Figure 14 : Protocole de purification de la fibronectine par le protocole de Le Cœur et al. NR : fractions non retenues ; Dx : fraction éluée de la colonne échangeuse d anions DEAE sepharose fast flow par une concentration de x mm de NaCl ; Hx : fraction éluée de la colonne d affinité à l héparine par une concentration de x mm de NaCl.

55 Purification de la fibronectine sur Concanavaline A Chromatographie d affinité à l héparine Le cryoprécipité de plasma sanguin humain solubilisé et centrifugé est injecté sur une colonne d héparine-cellufine (SR25/45 Pharmacia, volume 200ml, cf. Figure 15), spécifique à cette étape de purification, stabilisée dans du TE NaCl 50mM. Le flux linéaire appliqué est de 22 cm/h. La colonne est rincée grâce à l injection de TEBS. Les protéines retenues sont ensuite éluées grâce à l injection de tampon Tris-HCl 50mM NaCl 1M CaCl 2 10mM à ph 7.4. Après chromatographie, la résine est régénérée par du TE NaCl 2M Urée 7M avant d'être rééquilibrée dans le tampon de stabilisation Chromatographie d affinité à la concanavaline-a La fraction protéique recueillies après la chromatographie d affinité sur héparine est directement injectée sous un flux linéaire de 60 cm/h dans une colonne de concanavaline A - agarose (1.1 x 20cm ) stabilisée par du Tris-HCl 50mM NaCl 1M CaCl2 10mM à ph 7.4. La colonne est rincée par le tampon de stabilisation puis les protéines éluées par du Tris-HCl 50mM NaCl 150mM alpha-méthyl glucoside 200 mm, CaCl 2 10mM. Après chromatographie, la colonne est régénérée par du Tris-HCl 50mM, NaCl 2M, à ph 7.4 avant d'être rééquilibrée dans Tris-HCl 50mM, NaCl 150mM, CaCl2 10mM à ph Chromatographie d affinité à l héparine Les fractions obtenues précédemment sont diluées au tiers avec du TE (afin d obtenir une concentration finale de NaCl égale à 50mM) puis injectées sur une colonne d héparinecellufine (SR25/45 Pharmacia) stabilisée dans du TEBS. Le flux linéaire appliqué est de 22 cm/h. Les protéines retenues sont éluées grâce à l injection de tampon TE complementé par des concentrations croissantes de NaCl (0.2 et 0.5M). Après chromatographie, la résine est régénérée par du TE NaCl 2M Urée 7M puis rééquilibrée dans le tampon de stabilisation. Les fractions éluées avec NaCl 0.5M sont dialysées contre du TEBS.

56 56 Cryoprécipité de plasma sanguin humain solubilisation Chromatographie d'affinité héparine-cellufine NR H 150 H 1000 Chromatographie d'affinité Concanavaline A - agarose NR ConA α-méthyl glucoside 200mM CaCl2 10mM Chromatographie d'affinité héparine-cellufine NR H 200 H 500 FN ConA Figure 15 : Protocole de purification de la fibronectine sur Concanavaline A BK : fractions non retenues ; Hx : fraction éluée de la colonne d affinité à l héparine par une concentration de x mm de NaCl ; ConA : fraction éluée de la colonne d affinité à la Concanavaline A ; FN ConA : fibronectine purifiée sur concanavaline A.

57 Purification des fragments F60 et F Hydrolyse de la fibronectine par la trypsine La trypsine (Boerhinger U/mg) est solubilisée à 1mg/ml dans une solution d'acide chlorydrique 1mM, NaCl 1.5M, CaCl 2 20mM avant d'être titrée selon la méthode décrite par Rick (1963). Une fois titrée, la solution de trypsine est ajoutée à une préparation de fibronectine hautement purifiée solubilisée dans du TBS (1mg/ml) à raison 4.9U tryspsine /mg de protéine (soit une molécule de trypsine pour 250 chaînes de fibronectine). Après ajout de CaCl 2 20mM final, le mélange est laissé trois heures à 37 C sous agitation à balancier. L'hydrolyse est alors stoppée par l'ajout de TLCK (solubilisé dans HCl 1mM) 5µM final Chromatographie d affinité à la gélatine La fraction protéique est injectée sous un flux linéaire de 480 cm/h dans une colonne de gélatine-cellufine (2.2 x 6cm) stabilisée par du TEBS (Cf. Figure 16). Les protéines retenues sont éluées par un tampon TE NaCl 250 mm Urée 3M. Les fractions recueillies sont immédiatement dialysées contre (NH 4 ) 2 CO 3 avant lyophylisation. Après chromatographie, la résine est régénérée par du TE NaCl 2M Urée 7M avant d'être rééquilibrée dans son tampon de stabilisation Chromatographie d affinité sur héparine-cellufine Les fractions lyophilisées sont re-suspendues dans le tampon de stabilisation avant d être injectées sur une colonne d héparine-cellufine (2.2 x 6cm) stabilisée dans du TE. Le flux linéaire appliqué est de 22 cm/h. Les protéines retenues sont éluées grâce à l injection de tampon TE complementé par des concentrations croissantes de NaCl (140mM, 320mM et 380mM). Après chromatographie, la résine est régénérée par du TE NaCl 2M Urée 7M avant d'être rééquilibrée dans son tampon de stabilisation.

58 58 hpfn Hydrolysation par la trypsine Chromatographie d'affinité gélatine-cellufine NR G urée NaCl 250mM Urée 3M Lyophylisation Chromatographie d'affinité héparine-poros NR H 140 NaCl 140mM H 380 NaCl 380mM Lyophylisation Chromatographie HQ-POROS Q 120 Q 300 NaCl 120mM NaCl 300mM Lyophylisation Lyophylisation F60 F160 Figure 16 : Protocole de purification de F60 et de F160. NR : fractions non retenues ; Gx : fraction éluée de la colonne d affinité à la gélatine par le composé x ; Hx : fraction éluée de la colonne d affinité à l héparine par une concentration de x mm de NaCl ; Qx : fraction éluée de la colonne échangeuses d anions par une concentration de x mm de NaCl

59 Chromatographie d affinité à l héparine en perfusion Sur une chaîne HPLC, les fractions sont injectées sur une colonne de Poros-héparine (0.5 x 5cm Roche diagnostics) stabilisée par un tampon Tris-HCl 20mM (4% solution mère à 0.5M). Le flux linéaire appliqué est de 1070 cm/h. Les protéines retenues sont éluées grâce à un gradient continu étalé sur 10 min. de NaCl entre 0 et 680mM (0 à 17% d'une solution mère à 4M) en complément du Tris-HCl. Après chromatographie, la résine est régénérée par NaCl 2M avant d'être rééquilibrée dans son tampon de stabilisation Chromatographie échangeuse d anions en perfusion Sur une chaîne HPLC, les fractions sont injectées sur une colonne échangeuse d'anions à forte affinité Poros-HQ (0.5 x 5cm Boerhinger) stabilisée par un tampon Tris-HCl 20mM (4% solution mère à 0.5M). Le flux linéaire appliqué est de 1070 cm/h. Les protéines retenues sont éluées grâce à un gradient continu étalé sur 13 min. de NaCl entre 0 et 2M (0 à 50% d'une solution mère à 4M) en complément du Tris-HCl Purification du collagène de type I Le protocole d obtention du collagène a été décrit par Berman et al. (1973). L ensemble des étapes permettant de purifier du collagène de type I est réalisé à 4 C afin de minimiser la dénaturation du collagène en gélatine et les dégradations par les protéases Solubilisation des tendons de rats Quinze queues de rat, conservés à 18 C depuis le sacrifice de animaux, sont décongelées à 4 C. Les queues sont incisées longitudalement puis dénudées. Les vertèbres sont dissociées une à une grâce à deux pinces, puis séparées afin de tirer les tendons qui y sont attachés. Les tendons sont ensuite coupés de la vertèbre, puis placés immédiatement dans une solution de NaCl 1M préalablement refroidie à 4 C. L ensemble des tendons est de nouveau lavé grâce à une solution de NaCl 1M (à 4 C) puis rincé à l eau (à 4 C) avant d être placé dans une solution d acide acétique (AcOOH) 0.5M (à 4 C) à raison de 30ml par queue pendant 24h sous agitation magnétique lente Purification du collagène Les tendons, solubilisés dans l acide acétique, sont centrifugés à 10000g pendant 20min. à 4 C. Les culots sont éliminés, puis les surnageants à nouveau centrifugés 19000g pendant 1 heure à 4 C. Les culots sont à nouveau écartés. Une solution de NaCl à 25% (p/v) est ajoutée

60 60 aux surnageants grâce à une pompe au débit de 3ml/min sous agitation magnétique lente afin d atteindre une concentration finale de 7% (p/v). Une fois le collagène précipité, la préparation est centrifugée à 15000g pendant 20min. à 4 C. Les tubes de centrifugation sont retournés sur un buvard afin de sécher les culots. Les culots sont dissous dans une solution d AcOOH 0.5M à 4 C à raison de 15ml par queue puis dialysés trois fois contre 0.01M Na 2 HPO 4 ph 8.3 glacé et entouré de glace. Le collagène précipité est centrifugé à 15000g pendant 20min. à 4 C. Les culots sont à nouveau séchés avant d être re-suspendus pendant une nuit dans AcOOH 50mM avant d être congelés. Les aliquotes sont dialysées extemporanément contre du TBS glacé et entouré de glace Lyophilisation des protéines Les préparations des protéines à lyophiliser (afin de les conserver ou de les concentrer) sont dialysées à +8 C contre une solution de carbonate d'ammonium à 1% (p/v) (20 fois le volume des préparations). Les solutions sont alors congelées dans des ballons rodés plongés dans un dewar rempli d'azote liquide. Les ballons sont mis en rotation grâce à une canne tenue à la main de façon à réaliser une fine pellicule de glace sur l'ensemble de la surface interne (cf. Figure 17). Après une première lyophilisation (10-5 Pa), les lyophilisats (sous la forme d un film fin) sont re-suspendus dans un minimum d'eau bidistillée avant d'être recongelés dans des tubes cryogéniques ou des ballons selon le principe décrit précédemment. Après la seconde lyophilisation, les lyophilisats obtenus sont exempts de tout sel, le carbonate d'ammonium s'étant sublimé en ammoniac, en dioxyde de carbone et en eau.

61 61 canne ballon rodé pellicule de glace azote liquide dewar Figure 17 : schémas de congélation des échantillons avant lyophilisation Le ballon rodé, contenant la solution de protéine, est plongé dans un dewar rempli d'azote liquide. Le ballon est mis en rotation grâce à une canne tenue à la main de façon à réaliser une fine pellicule de glace sur l'ensemble de la surface interne Obtention d anticorps polyclonaux Les anticorps polyclonaux ont été obtenus par l équipe du Docteur Jeanne Grosclaude du laboratoire de Virologie et Immunologie Moléculaires du centre INRA de Jouy-en-Josas. Une fraction de 100µg de hpfn ou de F6O (1mg/ml) est ajoutée à 100µl d adjuvant complet de Freud. Le mélange est vortexé puis homogénéisé grâce à une sonde à ultrasons. L émulsion obtenue est injecté par voie intra-podale dans les deux pieds d une souris. Un rappel, contenant la même dose d antigène mélangé à un volume égal d adjuvant incomplet de Freud, est injecté par la même voie 8 jours après. 15 jours après la première injection, l animal est sacrifié et le sang collecté. Le sérum obtenu est éventuellement injecté sur une colonne de protéine A agarose (0.5 x 5cm Pharmacia Biotech) afin de purifier les immunoglobulines selon les recommandations du fournisseur.

62 Déglycosylation des protéines Une solution de protéines à déglycosyler (1mg/ml dans HEPES-NaOH 0.2M) est mise en présence de glycopeptidase F (PNG-F) avec un rapport 1/20 [unité PNG-F]/[µmole de chaîne de glycosylation) pendant 5 heures à 37 C sous agitation magnétique Méthodes analytiques Electrophorèse en conditions dénaturantes Les gels SDS-PAGE (Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis) sont réalisés selon la méthode décrite par Doucet et Trifaro (1984). Le gel résolutif de 0.75 mm d épaisseur est composé d acrylamide/bisacrylamide (T=5, 7.5 ou 10%, C=0.58 ou 2.67%), éventuellement supporté par un film hydrophobe (Gel Bond Pharmacia biotech) tamponné par Tris-Glycine 0.2M, glycérol 5%, SDS 0.4% à ph 8.8 et polymérisé en présence de TEMED (0.1% v/v) et de persulfate d ammonium (0.0005% p/v) avant d être surfacé par de l éthanol absolu. Les protéines solubilisées dans un tampon de charge (bleu de bromophénol %, glycérol 25%, SDS 7.5% final) sont déposées dans des puits formés dans un gel de concentration d acrylamide/bisacrylamide (T=3%, C=2.67%) tamponné par un tampon Tris-HCl 750mM, SDS 0.4% à ph 6.8. La migration est réalisée en présence d un tampon Tris-glycine 0.1M SDS 0.1% à ph 8.3 sous une intensité de 0.3 ma/mm 2 section de gel (soit ici 20mA/gel). Afin de minimiser la dénaturation des protéines par la chaleur, les cuves sont continuellement refroidies par un système de circulation d eau (Hoefer Pharmacia Biotech). La masse des protéines est estimée grâce à l utilisation de marqueurs de poids moléculaires (HMW Sigma) composés de myosine (205kDa), β-galactosidase (105kDa), phosphorylase B (96kDa), albumine sérique bovine (66kDa), ovalbumine (45kDa) et anhydrase carbonique (29kDa) Coloration des gels au nitrate d argent Deux méthodes ont été utilisées pour la coloration des gels au nitrate d argent. Dans la suite du mémoire, les gels colorés à l argent le seront indifféremment par l un ou l autre des protocoles. Les gels sont ensuite éventuellement colorés au bleu de Coomassie R250, certaines protéines étant pas ou peu visibles avec la coloration à l argent.

63 Coloration au nitrate d argent par oxydation au bichromate de potassium Cette méthode, réalisée grâce à un kit fourni par BioRad, reprend la méthode décrite par Merril et al. (1981) (cf. Table VII). Après migration, les protéines sont fixées dans le gel grâce à une solution de TCA à 5% (p/v) ou par un mélange acide acétique glacial 10% (v/v), méthanol 40% (v/v) deux fois 15 min. Les protéines sont ensuite oxydées pendant 5 min. par un mélange K 2 Cr 2 O 7 3.4mM HNO 3 3.2mM. Le gel est ensuite rincé dans de l eau distillée trois fois 5 min. avant d être placé dans une solution d AgNO 3 0.2% pendant 30 min. Après un rincage des gels de 30 sec. dans de l eau, les protéines sont révélées par une solution de Na 2 CO M H 2 C0 1.85mM. La coloration est ensuite stoppée par rinçage des gels dans une solution d acide acétique à 5% (v/v) pendant 30 min Coloration PAS/Argent Ce second protocole, décrit par Gradilone et al. (1998), permet de prévisualiser les protéines glycosylées grâce à l acide périodique et à la base de Schiff avant de les colorer au nitrate d argent (Cf. Table VIII). Après fixation des protéines 10 min. dans une solution d acide acétique à 7.5 % (v/v), les gels sont incubés 15 min. dans une solution d acide périodique à 1% (p/v) avant d être rincé dans de l eau (6 x 5 min.). Les gels sont incubés 15 min. dans le réactif de Schiff permettant la coloration des protéines glycosylées. Les protéines sont ensuite oxydées dans une solution de métabisulfite de sodium à 0.5% (p/v) 3 fois 10 min. Après rinçage des gels 6 x 5 min. dans de l eau ceux-ci sont incubés placés dans un mélange AgNO 3 0.2% (v/v) H 2 CO 0.03% (v/v) pendant 30 min. Les protéines sont ensuite révélées par une solution de Na2CO M formaldéhyde 1.85mM thiosulfate de sodium 0.001%. La coloration est ensuite stoppée par rinçage des gels dans une solution d acide acétique à 2.5% (v/v) pendant 30 min Coloration des gels au bleu de Coomassie Coloration au bleu de Coomassie G250 colloïdal Ce protocole de coloration au bleu de Coomassie G250 colloïdal a été décrit par Diezel et al. (1972). Deux grammes de bleu de Coomassie G250 sont dissouts dans 2l H 2 SO 4 0.5M sous agitation magnétique forte pendant trois heures. Le mélange est ensuite filtré sur papier avant d être

64 64 additionné de 220ml NaOH 10M, puis de 310ml TCA 100% (p/v) sous agitation magnétique. Le mélange devient alors vert. Le colorant préparé, les gels sont placés dans celui-ci pendant 3h à 50 C (ou une nuit à température ambiante) sous agitation à balancier. Les gels sont ensuite rinçés à l eau, les protéines apparaissant alors en bleu Coloration au bleu de Coomassie R250 Les gels de polyacrylamide sont placés 30 min. dans le colorant préalablement filtré sur gaze (Bleu de Coomassie R % (p/v), acide acétique glacial 9.2% (v/v), éthanol 45.4% (v/v)) préparé selon la méthode de Laemmli (1970). Les gels sont ensuite décolorés pendant une nuit sous agitation sur balancier dans un mélange acide acétique 7.5% (v/v), éthanol 40% (v/v). Un protocole en une étape propose de placer les gels 16 heures dans un mélange de bleu de Coomassie R % (p/v), acide acétique 10 % (v/v), méthanol 10% (v/v) préalablement chauffé au micro-ondes. Les protéines majoritaires sont alors visibles dès 5 min. de coloration.

65 65 Coloration des SDS-PAGE au nitrate d'argent par oxydation des protéines au bichromate de potassium (Merril et al., 1981) TCA 5% ou 2 fois 15min. AcOOH glacial 10% (v/v), MeOH 40% (v/v) K 2 Cr 2 O 7 3.4mM HNO 3 3.2mM 5min. ddh 2 O 3 fois 5min. AgNO 3 0.2% (p/v) 30min. ddh 2 O 30sec. Na 2 CO M H 2 CO 1.85mM Atteindre l'intensité désirée AcOOH glacial 5% (v/v) 30min. Table VII : protocole de coloration des gels au nitrate d argent par oxydation des protéines au bichromate de potassium Le protocole a été décrit par Merril et al. (1981). TCA : acide trichloroacétique ; AcOOH : acide acétique ; MeOH : méthanol ; ddh 2 O : eau doublement distillée ou osmosée ; H 2 CO : formaldéhyde. Coloration des SDS-PAGE au PAS / nitrate d'argent (Gradilone et al., 1998) AcOOH 7.5% (v/v) H 5 IO 6 1% (p/v) ddh 2 O Réactif de Schiff Na 2 S 2 O 5 0.5% (p/v) ddh 2 O AgNO 3 0.2% (p/v) H 2 CO % (v/v) ddh 2 O Na 2 CO M H 2 CO 1.85mM Na 2 S 2 O % AcOOH glacial 2.5% (v/v) 10min. 15min. 6 fois 5min. 15min. 3 fois 10min. 6 fois 5min. 30min. 30sec. Atteindre l'intensité désirée 30min. Table VIII : protocole de coloration des gels à l acide périodique, à la base de Schiff et au nitrate d argent Le protocole a été décrit par Gradilone et al. (1998). AcOOH : acide acétique ; H 5 IO 6 : acide périodique ; ddh 2 O : eau doublement distillée ou osmosée.; Na 2 S 2 O 5 : métabilsufite de sodium ; H 2 CO : formaldéhyde ; Na 2 S 2 O 3 : thiosulfate de sodium.

66 Analyse densitométrique des gels SDS-PAGE Les gels SDS-PAGE colorés à l argent sont numérisés grâce à une caméra à haute définition. L image est analysée grâce au logiciel One-Dscan (Scanalytics) afin de déterminer la proportion de chaque bande Mise en évidence des activités protéolytiques Zymographie Des gels SDS-PAGE sont coulés dans les conditions décrites ci-dessus par Doucet et Trifaro (1984), un substrat protéique (gélatine alimentaire 1 à 2mg/ml final p/v) étant additionné à la solution avant polymérisation (Blobel et Dobberstein 1975 ; Heussen et Dowle, 1980). Après migration, le gel est lavé deux fois 30 min. dans un tampon Tris-HCl 50mM Triton X-100 1% (p/v) à ph 7.4 afin d éliminer l excès SDS puis incubé 16 heures dans un tampon TBS CaCl 2 5mM ZnCl 2 1µM HgCl 2 1µM à 37 C sous agitation à balancier. Les gels sont ensuite colorés au bleu de Coomassie R Détection des activités fibronectinolytiques en milieu liquide Un échantillon de fibronectine ou d un de ses fragments est mis en solution dans du TBS éventuellement additionné de CaCl 2 5mM, et/ou de ZnCl 2 1µM et/ou de HgCl 2 1µM ou d EDTA 5mM. Les échantillons sont ensuite incubés de 0 à 456 heures dans un thermocycleur à 37 C avant d être congelés, puis analysés par SDS-PAGE Etude conformationelle Spectrophotométrie UV Les échantillons à analyser, ayant une concentration de 0.5mg/ml, sont placés dans un spectrophotométre (Pharmacia Biotech) thermostaté à 37 C afin de mesurer l absorption en fonction de la longueur d onde Spectrofluorométrie Les échantillons à analyser, ayant une concentration de 30µg/ml, sont placés dans un spectrofluorimétre (Perkin Elmer) thermostaté à 37 C. Les spectres, obtenus après excitation de l échantillon à 280nm et mesure de la fluorescence entre 300 et 400nm, sont issus de 16 mesures du même échantillon.

67 Révélation de complexes protéiques Transfert des protéines sur membranes après électrophorèse (Western Blot) Ce protocole de transfert des protéines des gels d électrophorèse sur membrane de PVDF dérive de celui décrit par Burnette (1981). Le gel d électrophorèse, éventuellement précoloré au Sypro-orange (BioRad) avant visualisation aux UV, est placé à plat sur une membrane de PVDF (BioRad) préalablement activée 5 sec. dans du méthanol. Les deux éléments, sont ensuite placés entre deux buvards imbibés par un tampon Tris-Glycine 25mM à ph 8.3, méthanol 20% (v/v). Le tranfert est réalisé dans un champs électrique entre deux plaques de carbone NovaBlot (Pharmacia Biotech) sous une intensité de 1.25mA/cm2 de contact entre les électrodes pendant une heure. L efficacité du transfert est vérifiée par coloration des membranes de PVDF au rouge ponceau S (0.25% p/v dans une solution de TCA à 3% p/v). Cette coloration disparaît ensuite lors des étapes de blocage des membranes. Le transfert terminé, le gel peut être coloré au bleu de Coomassie R Dépôts des protéines sur membrane (Dot Blot) Les protéines (0.2 à 1mg/ml) sont déposées en une goutte de 0.5µl sur une membrane de nitrocellulose renforcée de nylon (BioRad). La membrane est séchée à température ambiante avant incubation Immunorévélation L ensemble du protocole est effectué à 37 C et reprend le protocole de Burnette (1981) (cf. Table IX). Après transfert, les sites actifs de la membrane sont bloqués lors de l incubation des membranes dans un tampon de blocage (TBS lait écrémé pulvérisé 5% p/v Tween % p/v) trois fois 15 min. sous agitation sur balancier. La membrane est ensuite incubée en présence des anticorps primaires dilués (selon indications du fournisseur) dans le tampon de blocage pendant une heure. Après trois nouveaux rinçages de 15 min. dans le tampon de blocage, la membrane est ensuite incubée avec l anticorps secondaire couplé à la phosphatase alcaline dilué dans le tampon de blocage pendant 1 heure. La membrane est rincée deux fois 10 min. dans du TBS Tween % (p/v) puis deux fois 10min. dans TBS avant de révéler la présence des anticorps secondaires grâce à l utilisation d un kit (BioRad) utilisant le bleu de tétrazolium et le 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate.

68 Dosages immunologiques L ensemble du protocole (cf. Table X) est réalisé à 37 C. Les échantillons sont déposés dans des cupules Maxisorp (Nunc) dans un volume de 100µl pendant 1 heure. Les cupules sont ensuite rincées trois fois 10min. avec du TBS Tween %. L anticorps primaire (dilué selon les données du fournisseur dans le même tampon) est placé dans les cupules puis incubé 1 heure. Après trois nouveaux rinçages, l anticorps secondaire est déposé (dilué selon les données du fournisseur dans le même tampon) et les cupules incubées pendant une heure avant d être rincées deux fois par du TBS Tween %, puis deux fois dans du TBS. Le dosage est réalisé grâce à l utilisation de PNPP 0.1% p/v dans Diéthanolamine 10%, MgCl 2 1mM, la densité optique des différents puits étant ensuite lues à 420nm Analyse des glycosylations Lectines marquées à la DIG L ensemble du protocole (cf. Table XI) est effectué à 37 C. Les échantillons à analyser ont été fixés sur membrane après électrotransfert comme décrit ci-dessus. La membrane est bloquée pendant une heure par de la gélatine à 0.5% solubilisée dans Tris-HCl 50mM, NaCl 500mM à ph 7.4 avant d être rincée 3 fois 10min. dans du TBS MgCl 2 1mM, MnCl 2 1mM, CaCl 2 1mM. La membrane est incubée en présence des lectines marquées à la digoxigenine (GNA, SNA et DSA à 1µg/ml, MAA à 5µg/ml, PNA et WGA à 10µg/ml dans le même tampon) pendant une heure. La membrane est ensuite rincée trois fois 10min. avant d être incubée en présence d immunoglobulines dirigées contre la digoxigénine et couplées à la phosphatase alcaline (0.75U/ml dans TBS) pendant 1 heure. La membrane est rincée trois fois 10min. dans du TBS avant de révéler l activité phosphatase alcaline grâce à l utilisation d un kit (BioRad) utilisant le bleu de tétrazolium et le 5-bromo-4- chloro-3-indoyl phosphate.

69 69 Immunorévélation des protéines fixées sur membrane (Burnette et al., 1981) TBS lait écrémé pulvérisé 5% (p/v) Tween % (p/v) Anticorps primaire dilué dans TBS lait écrémé pulvérisé 5% (p/v) Tween % (p/v) TBS lait écrémé pulvérisé 5% (p/v) Tween % (p/v) Anticorps secondaire PAL dilué dans TBS lait écrémé pulvérisé 5% (p/v) Tween % (p/v) TBS Tween % (p/v) TBS Révélation de l activité PAL 3 fois 15min. 1 heure 3 fois 15min. 1 heure 2 fois 10min. 2 fois 10min. Atteindre l intensité désirée Table IX : Immunorévélation des protéines fixées sur membrane Le protocole, décrit par Burnette et al. (1981), convient pour les protéines fixées après électrophorèse et électrotransfert sur PVDF (western bot) ou dépôt sur nitrocelullose (dot blot). TBS : Tris-HCl 50mM, NaCl 15OmM à ph 7.4 ; PAL : phosphatase alcaline. Les anticorps primaires et secondaires sont dilués suivant les recommandations des fournisseurs. L activité phosphatase alcaline est révélée grâce à un kit BioRad utilisant le bleu de tétrazolium et le 5-bromo-4-chloro-3- indoyl phosphate. Dosages immunologiques Fixation des protéines diluées dans TBS TBS Tween % (p/v) Anticorps primaire dilué dans TBS Tween % (p/v) TBS Tween % (p/v) Anticorps secondaire PAL dilué dans TBS Tween % (p/v) TBS Tween % (p/v) TBS DEA 10% (v/v) PNPP 0.1% (p/v) MgCl 2 1mM 1 heure 3 fois 10min. 1 heure 3 fois 10min. 1 heure 2 fois 10min. 2 fois 10min. Atteindre l intensité désirée avant lecture à 420nm Table X: Dosages immunologiques TBS : Tris-HCl 50mM, NaCl 15OmM à ph 7.4 ; DEA : Diéthanolamine ; PNPP : paranitrophénolphosphate. Les anticorps primaires et secondaires sont dilués suivant les recommandations des fournisseurs.

70 70 Révélation des protéines fixées sur membrane grâce aux lectines marquées à la digoxigénine Tris-HCl 50mM, NaCl 500mM à ph 7.4, gélatine 0.5% (p/v) 1 heure TBS MgCl 2 1mM, MnCl 2 1mM, CaCl 2 1mM 3 fois 10min. Lectine marquées à la DIG diluée dans TBS MgCl 2 1mM, MnCl 2 1mM, CaCl 2 1mM 1 heure TBS MgCl 2 1mM, MnCl 2 1mM, CaCl 2 1mM 3 fois 10min. Anticorps dirigés contre la DIG et couplé PAL dans TBS MgCl 2 1mM, MnCl 2 1mM, CaCl 2 1mM 1 heure TBS 3 fois 10min. Révélation de l activité PAL Atteindre l intensité désirée Table XI : Révélation des protéines fixées sur membrane grâce aux lectines marquées à la digoxigénine Le protocole convient pour les protéines fixées après électrophorèse et électrotransfert sur PVDF ou dépôt sur nitrocellulose (dot blot). TBS : Tris-HCl 50mM, NaCl 15OmM à ph 7.4 ; DIG : digoxigénine ; PAL : phosphatase alcaline. Les lectines et les anticorps sont diluées selon les recommandations du fournisseur. L activité phosphatase alcaline est révélée grâce à un kit BioRad utilisant le bleu de tétrazolium et le 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate. Révélation des protéines grâce aux lectines biotinylées TxTBS gélatine 0.5% (p/v) TxTBS Lectine biotinylée 1µg/ml dans TxTBS TxTBS TxTBS avidine 0.3µg/ml PAL biotinylée 0.3µg/ml TxTBS TBS Révélation de l activité PAL 1 heure 3 fois 10min. 1 heure 3 fois 10min. 1 heure 2 fois 10min. 2 fois 10min. Atteindre l intensité désirée Table XII : Révélation des protéines grâce aux lectines biotinylées Le protocole convient pour les protéines fixées après électrophorèse et électrotransfert sur PVDF, sur nitrocellulose (dot blot) ou dans une plaque de microtitration. TxTBS : Tris-HCl 50mM, NaCl 500mM, Tween % (p/v) à ph 7.4 ; TBS : Tris-HCl 50mM, NaCl 15OmM à ph 7.4 ; PAL : phosphatase alcaline. L activité phosphatase alcaline est révélée sur membrane grâce à un kit BioRad utilisant le bleu de tétrazolium et le 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate ou sur plaque grâce au PNPP 0.1% dans DEA 10% (v/v) MgCl 2 1mM avant lecture à 420nm.

71 Lectines biotinylées L ensemble du protocole (cf. Table XII) est effectué à 37 C. Les échantillons à analyser ont été fixés sur membrane comme décrit ci-dessus (par transfert ou dépôt). La membrane est bloquée pendant une heure par de la gélatine à 0.5% solubilisée dans TxTBS (Tris-HCl 50mM, NaCl 500mM, Tween % (p/v), MgCl 2 1mM à ph 7.4). La membrane est ensuite découpée puis placée dans des tubes à hémolyse contenant 0.5µg/ml de lectine biotinylée dans le tampon d incubation. Les tubes sont placés 1 heure dans un four à hybridation rotatif puis les membranes rincées trois fois 10 min. par le tampon d incubation. Les membranes sont ensuite incubées 1 heure en présence d avidine (0.3µg/ml) et de phosphatase alcaline biotinylée (0.3µg/ml) solubilisées ensembles depuis 30min. sous agitation magnétique dans le tampon d incubation. Après deux nouveaux rinçages de 10 min. dans TxTBS et deux de 10min. dans TBS, les activités phosphatase sont révélées grâce à un kit BioRad utilisant le bleu de tétrazolium et le 5-bromo-4-chloro-3-indoyl phosphate Cartographie qualitative et relative des glycosylations Le protocole rassemble les principes du protocole précédent, excepté l incubation des échantillons dans des cupules de dosage ELISA (Maxisorp Nunc) (100µg dans 100µl/puits) pendant 30 min. avant blocage des sites par la solution de gélatine. Le dosage est réalisé grâce à l utilisation de PNPP 0.1% p/v dans Diéthanolamine 10% (v/v), MgCl 2 1mM, la densité optique des différents puits étant ensuite lues à 420nm Etude de l interaction fibronectine - collagène type I L ensemble du protocole (cf. Table XIII) est effectué à 37 C. Les échantillons de collagènes (100µg) sont déposés dans des cupules Maxisorp (Nunc) dans un volume de 100µl pendant 1 heure. Les cupules sont rincées trois fois 10min. avec le tampon d incubation Tris-HCl 50mM, NaCl 500mM, Tween % (p/v), MgCl 2 1mM à ph 7.4. La fibronectine (150µg/puits dans le tampon de stabilisation) est ajoutée aux cupules qui sont incubées pendant une heure. Après trois nouveaux rinçages, les puits sont incubés en présence de lectine de 120kDa de Ricinus communis (RCA 120 ) à 0.5µg/ml pendant une heure.

72 72 Les cupules sont rincées puis incubées 1 heure en présence d avidine (0.3µg/ml) et de phosphatase alcaline biotinylée (0.3µg/ml) solubilisées depuis trente minutes sous agitation magnétique dans le tampon d incubation. Les cupules sont rincées deux fois par du TBS Tween %, puis deux fois dans du TBS. Le dosage est réalisé grâce à l utilisation de PNPP 0.1% p/v dans Diéthanolamine 10%, MgCl 2 1mM, la densité optique des différents puits étant ensuite lues à 420nm. Etude des interactions Fibronectine Collagène avec la lectine de Ricinus communis TxTBS gélatine 0.5% (p/v) TxTBS HpFN 250µg/puits dans TxTBS TxTBS éventuellement additionné de sel ou de chaotropes RCA-120 biotinylé 1µg/ml dans TxTBS TxTBS TxTBS avidine 0.3µg/ml PAL biotinylée 0.3µg/ml TxTBS TBS DEA 10% (v/v) PNPP 0.1% MgCl 2 1mM 1 heure 3 fois 10min. 1 heure 3 fois 10min. 1 heure 3 fois 10min. 1 heure 2 fois 10min. 2 fois 10min. Atteindre l intensité désirée Table XIII: Etude des interactions Fibronectine Collagène avec la lectine de Ricinus communis TxTBS : Tris-HCl 50mM, NaCl 500mM, Tween % (p/v) à ph 7.4 ; TBS : Tris-HCl 50mM, NaCl 15OmM à ph 7.4 ; hpfn : fibronectine hautement purifiée selon le protocole en trois étapes ; RCA-120 : lectine de 120kDa extraite de Ricinus communis ; PAL : phosphatase alcaline.

73 73 4 RESULTATS ET DISCUSSION. 4.1 Purification de la fibronectine Nous avons comparé et analysé les différents facteurs pouvant jouer un rôle dans les différentes méthodes de purification Chromatographie d affinité à la gélatine La plupart des lots de fibronectine préparés dans les laboratoires ou disponibles dans le commerce sont purifiés à partir de plasma sanguin humain selon le protocole décrit par Engvall et Ruoslathi en Ce protocole repose sur une purification par chromatographie d'affinité sur une colonne de gélatine-agarose. La fibronectine obtenue grâce à cette méthode n'est pure qu'à 90 ou 95% (selon les données fournisseurs ; cf. Figure 18, puits A à E). Les contaminants copurifiés avec la protéine sont du fibrinogène et ses peptides (67, 56 et 47kDa), du complexe facteur von Willebrand / facteur VII, des fragments de fibronectine présents physiologiquement dans le plasma sanguin et des protéases portant une activité gélatinolytique (Smilenov et al., 1992). A B C D E F G H I J FN Figure 18 : Comparaison SDS-PAGE des fibronectines plasmatiques humaines. Les échantillons (solubilisés dans SDS 3.5 % p/v βmsh 1.5% v/v final) sont déposés sur un gel de polyacrylamide à 8.5% avant coloration au nitrate d argent. Fibronectine commerciale A : 1µg ; B : 2µg ; C : 5µg ; D : 10µg ; E : 20µg. hpfn F : 1µg ; G : 2µg ; H : 5µg ; I : 10µg ; J : 20 µg.

74 74 De plus, Miekka et al. (1982) ont montré par spectrofluorescence que les préparations de fibronectine issues de ce protocole étaient dénaturées par les hautes concentrations d urée (>5M) utilisées pour éluer la fibronectine retenue sur la résine de gélatine. Agin et Gartner (1982) ont proposé d utiliser du glucose pour éluer la fibronectine retenue sur une résine de gélatine-sépharose 4B mais ceci nécessite une forme particuliere de la gélatine en bille. Une alternative serait de substituer l étape de chromatographie d affinité sur la gélatine par une autre méthode. En effet, les normes FDA (Food and Drug Administration) et bientôt celles de l AFSSAPS (Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Santé) tendent en effet à réglementer l usage de produits dérivés du collagène dans la purification de biomolécules à usage thérapeutique et ceci dans le but de limiter toutes éventuelles contaminations par les prions. Mais, faute d alternative fiable et éprouvée, l optimisation de la chromatographie d affinité à la gélatine est préférable d autant plus que le fournisseur (Pharmacia) certifie la conformité de leur résine avec le cahier des charges de la FDA. Afin d obtenir une fibronectine de haute pureté, non-dénaturée, stable dans le temps, et non copurifiée avec des protéases, nous avons développé un autre protocole de purification. Celle-ci consiste à modifier les conditions d élution de la fibronectine retenue sur la matrice de gélatine - pour éviter les modifications structurales de la glycoprotéine et compléter le protocole par au moins une étape de purification supplémentaire. Cependant, si l étape de chromatographie d affinité sur gélatine entraîne la copurification des gélatinases et des collagènases présentes physiologiquement dans le plasma sanguin humain, elle a le mérite d optimiser la purification en séparant plusieurs protéines sériques comme l albumine Injection du cryoprécipité de plasma sanguin humain Après injection de l échantillon dissout et centrifugé de cryoprécipité de plasma sanguin humain, la colonne d affinité à la gélatine est rincée par le tampon de stabilisation complété à 1M NaCl (cf. Figure 19) conformément aux recommandations de Faull et al. (1994) afin d éliminer les protéines ne possédant pas ou peu d interactions spécifiques avec la gélatine (comme l albumine sérique). Les faibles concentrations d urée (jusqu à 1M, éventuellement associées à 1M NaCl) qui sont connues pour rompre les associations fibronectine fibrinogène et préconisées par les auteurs, n ont pas été utilisées car elles entraînent l élution précoce d une partie de la fibronectine retenue (environ 30%).

75 75 absorbance à 280nm (UDO) 2 1,5 1 0,5 A B C D volume (ml) Figure 19 : Elution de la fibronectine sur colonne d affinité à la gélatine. Les échantillons de cryoprécipité de plasma sanguin humain sont injectés sur une colonne de gélatine-cellufine (2.2 x 40cm) stabilisée dans du TEBS (Tris-HCl 50mM, NaCl 150mM, EDTA 1mM à ph 7.4). Les flèches indiquent l injection des tampons d élution composés de (A) NaCl 1M, (B) urée 1M, (C) NaBr 1M et (D) NaCl 250mM urée 3M Elution par chute de ph Afin de minimiser les éventuelles dénaturation de la fibronectine, une alternative à l utilisation de chaotropes comme l urée est d éluer la fibronectine en abaissant brutalement le ph. L injection de tampon dont le ph est sous le phi de la fibronectine (compris entre 5.5 et 6.3) induit des changements conformationnels de la glycoprotéine et permet donc d observer son élution. A température ambiante, l élution des protéines retenues sur gélatine-cellufine est observée lors d un abaissement de ph de 7.4 à 5.5 par l injection d un tampon d acétate de sodium. Pour réaliser l élution à 8 C, le tampon doit être complémenté par 1M de NaBr. Cependant, si cette méthode proposée par Faull et al. (1994) a l avantage de ne pas utiliser d agent chaotropes comme l urée ou la guanidine, plus de 50% de la fibronectine injectée reste retenue dans la colonne. Celle-ci peut être recueillie après injection du tampon de stabilisation complémenté avec 3M urée et 250mM NaCl décrit ultérieurement.

76 Elution par utilisation de cation divalent. Les cations divalents régulant l interaction entre la fibronectine et différents ligands, nous avons souhaité observer la possibilité d éluer la fibronectine en présence d EDTA ou de fortes concentrations de cations. La fibronectine se liant au C1q en présence de calcium grâce au domaine collagènique en triple hélice de celui-ci, nous avons cherché à inhiber la liaison entre la gélatine et la fibronectine en présence d EDTA. Aucune élution n est observée lors de l injection du tampon de stabilisation complété par 50mM d EDTA, mais 30% de la fibronectine retenue sur la résine de gélatine-cellufine est éluée par le tampon de stabilisation complementé à 100mM d EDTA. 40% de la fibronectine injectée est recueillie après injection de TBS contenant 400mM de CaCl 2. Si le magnésium et le manganèse n influencent pas l association entre la fibronectine et ses ligands en présence de calcium (Hayashi et Yamada, 1982), nous n observons aucune élution lors de l injection de TBS, ZnCl 2 15mM ou de TBS, CaCl 2 400mM, ZnCl 2 15mM. Ceci nous laisse supposer que la fibronectine est plus affin pour le zinc que pour le calcium (pour mémoire, la fibronectine possède deux sites de forte liaison au calcium avec Kd=1.3mM et douze sites de faible liaison avec Kd=2.3mM ; Amphlett et Hrinda, 1983) Elution en présence d urée Conformément aux préconisations du revendeur de résine (Interchim), du NaCl doit être ajouté pour éluer l ensemble des protéines retenues en présence d urée. Ainsi, 50mM de NaCl en présence d urée 4M solubilisée dans du TE permet de recueillir 95% de la fibronectine injectée alors que l injection de TE contenant 6M d urée ne permet de récupérer qu une faible partie (<40%). L élution de la fibronectine avec 3M d urée 250mM NaCl (cf. Figure 20) est un compromis qui permet de recueillir plus de 95% de la fibronectine injectée tout en évitant la dénaturation par l urée qui a lieu avec des concentrations supérieures à 5M (Miekka et al., 1982). La réinjection des fractions non-retenues permet de s'assurer de l épuisement de ces fractions en fibronectine. La chromatographie d affinité sur gélatine permet d appréhender les interactions entre les molécules de fibronectine. Après injection des protéines sur une colonne de gélatine-cellufine, le milieu de stabilisation en présence de CaCl 2 400mM, de NaBr 1M ou de tampon acétate à ph 5.5 permet l élution d une importante quantité (60%) de fibronectine. La masse de la part

77 77 restante, éluée en présence d urée 3M, NaCl 250mM, est proportionnelle au volume de matrice. Nous pouvons supposer qu en réutilisant la colonne, la résine d affinité à la gélatine se transforme en résine d affinité à la fibronectine liée à la gélatine. Le CaCl 2, le NaBr et la chute de ph permettent principalement de dissocier les complexes fibronectine fibronectine. L association des molécules de fibronectine entre elles est connue pour être inhibée par le calcium en présence d héparine (Richter et al. 1985). Le calcium peut dans ce cas privilégier l interaction fibronectin-héparine aux dépends des interactions fibronectine-fibronectine (Hayashi et Yamada, 1983). Il faut explorer l action des différents ions divalents sur les interactions fibronectine fibronectine et fibronectine collagène en modulant l association et les concentrations des différents cations, puis observer leur effet lorsqu ils sont associés aux glycosaminoglycanes. absorbance à 280nm (UDO) 2 1,5 1 0,5 A B volume (ml) Figure 20 : Purification de la fibronectine par chromatographie d affinité à la gélatine. Les échantillons de cryoprécipité de plasma sanguin humain sont injectés sur une colonne de gélatine-cellufine (2.2 x 40cm) stabilisée dans du TEBS (Tris-HCl 50mM, NaCl 150mM, EDTA 1mM à ph 7.4). Les flèches indiquent l injection de tampon d élution composés de (A) NaCl 1M et (B) NaCl 250mM urée 3M.

78 78 Ils permettront d affirmer ou d éliminer l hypothèse d une association fibronectine - fibonectine sur la résine de gélatine et d étudier le rôle du zinc dans la liaison fibronectine - fibronectine. Deux méthodologies sont actuellement à l étude au laboratoire : la première propose d étudier les interactions entre la fibronectine en solution et la fibronectine fixée sur matrice ou sur polymère, la seconde les caractéristiques d interactions de la fibronectine en milieu liquide ou en gel. Les différentes fractions recuellies sur gélatine-cellufine, quelle que soit la composition du tampon d élution, n apparaissent pas homogènes sur gel SDS-PAGE comme lors de l utilisation de l urée (cf. Figure 21 puits D) et du protocole décrit par Engvall et Ruoslahti (1977) (cf. Figure 18, puits A à E). De plus, les différentes fractions sont contaminées par des gélatinases (cf. Figure 22, puits C et D). A partir de ces préparations semi-purifiées et contaminées par des protéases, nous devons chercher à compléter notre protocole de purification. Les préparations réalisées grâce à l élution à l urée, et donc avec un très haut rendement, serviront de produit de départ pour ces étapes supplémentaires Chromatographie d affinité à l héparine En 1986, Johansson et Smedsrod proposent d'ajouter une étape de purification sur tamis moléculaire (Aca22). Ce protocole ne permet pas d'atteindre une qualité satisfaisante. De plus, elle allonge considérablement le temps de purification tout en diminuant fortement les rendements. En effet, si la méthode permet d éliminer la métallo-protéinase de la matrice extracellulaire 9 (MMP9) copurifiée par le protocole d Engvall et de Ruoslahti (1977), d autres activités gélatinolytiques sont détectées. Des résultats médiocres sont également obtenus lors de purification sur colonne échangeuse d'ions (Amrani et al. 1983).

79 79 A B C D E F G H I FN Figure 21 : Analyse SDS-PAGE des étapes de purification de la fibronectine. Les échantillons (7µg solubilisés dans SDS 3.5 % p/v βmsh 1.5% v/v final) sont déposés sur un gel de polyacrylamide à 8.5% avant coloration au nitrate d argent. A : cryoprécipité de plasma sanguin humain solubilisé ; B : fraction non-retenue sur gélatine-cellufine ; C : fraction éluée avec 1M NaCl sur gélatine-cellufine ; D : fraction éluée avec 3M urée 250mM NaCl sur gélatine cellufine ; E : fraction éluée avec 150mM NaCl sur héparine-cellufine ; F : fraction éluée avec 200mM NaCl sur héparine-cellufine ; G : fraction éluée avec 500mM NaCl sur héparine-cellufine ; H : fraction éluée avec 3M urée 250mM NaCl avec la seconde chromatographie sur gélatine-cellufine ; I : fibronectine commerciale. A B C D E F G H FN FNsc Figure 22 : Analyse des étapes de purification de la fibronectine par zymographie. Les échantillons (7µg solubilisés dans SDS 3.5 % p/v final) sont déposés sur un gel de polyacrylamide à 8.5% copolymérisé avec 0.2% de gélatine. Après incubation, le gel est coloré au bleu de Coomassie R250. A : cryoprécipité de plasma sanguin humain solubilisé ; B : fraction non-retenue sur gélatine-cellufine ; C : fraction éluée avec 1M NaCl sur gélatine-cellufine ; E : fraction éluée avec 3M urée 250mM NaCl sur gélatine cellufine ; F : fraction éluée avec 150mM NaCl sur héparinecellufine ; G : fraction éluée avec 200mM NaCl sur héparine-cellufine ; H : fraction éluée avec 500mM NaCl sur héparine-cellufine. FN : dimère de fibronectine : FNsc : monomère de fibronectine.

80 80 L association de la chromatographie d affinité à la gélatine à une autre chromatographie d affinité pourrait permettre d obtenir une purification de la fibronectine de bonne qualité (en termes de rendements et de pureté). L association de la chromatographie d affinité à l arginine à la chromatographie d affinité au collagène (Vuento et Vaheri, 1979) donne d excellents résultats mais, comme pour les chromatographies d affinités aux ions métalliques immobilisés (IMACs, Smilenov et al., 1992), les rendements sont très faibles. La fibronectine portant de très nombreux sites d affinités à de nombreux ligands, nous pouvons utiliser l un d eux afin de dissocier la fibronectine obtenue par la chromatographie d affinité à la gélatine de ses contaminants. L un des premiers ligands de la fibronectine est elle-même. Si la réalisation d'une chromatographie d'affinité à la fibronectine suppose de disposer de ligand pur, les hypothèses suggérées par l analyse des résultats de la chromatographie d affinité à la gélatine laissent entendre que cette étape n apporterait pas ou peu d amélioration. Nous pensons en effet que nous observerions sur une telle colonne les mêmes résultats que sur une colonne de gélatinecellufine usagée. De plus, cette matrice ne permettrait pas de séparer la fibronectine de ses ligands plasmatiques. Enfin, la fibronectine fixée à la résine serait sensible aux gélatinases et aux autres protéases co-purifiées avec la fibronectine lors de la première étape. Une chromatographie sur fibrine (issu de l hydrolyse du fibrinogène par la thrombine) présente les mêmes inconvénients et ne permettrait pas de séparer la fibronectine et le fibrinogène (et ses peptides) co-purifiés lors de la première étape. La molécule de fibronectine porte de nombreux sites d affinité à l héparine. Parmi ceux-ci, celui qui a la plus forte affinité pour ce ligand est, sur le monomère de fibronectine, diamétralement opposé au domaine d affinité à la gélatine. (cf. Figure 23). Seules les chaînes entières de fibronectine et les grands fragments de la glycoprotéine (>200kDa) peuvent présenter à la fois une forte affinité pour l héparine et pour la gélatine. Miekka et al. (1982) et Smilenov et al. (1992) décrivent l intérêt de la chromatographie d affinité à l héparine en complément d une première étape de chromatographie d affinité à la gélatine. Si sur un volume important de résine d héparine-cellufine, nous injectons sous un faible flux linéaire les fractions retenues sur gélatine et dialysées contre le tampon de stabilisation, l adjonction de concentrations croissantes en NaCl (150mM, 250mM et 500mM) dans le tampon de stabilisation permet de distinguer 4 fractions (cf. Figure 24). Les fractions non

81 81 retenues et celles recueillies avec 150mM de NaCl ne contiennent de la fibronectine que sous forme de traces parmi de nombreux contaminants. L utilisation de NaCl à 250mM et à 500mM (séparés par une étape d injection de tampon de stabilisation) permet de recueillir pour les deux fractions une fibronectine homogène sur gel SDS-PAGE, mais une analyse de la fraction éluée avec 250mM de NaCl (cf. Figure 22, puits F) par zymographie révèle la présence d activités gélatinolytiques à 72kDa. Une concentration de NaCl de 300mM serait suffisante pour recueillir l ensemble de la fibronectine retenue, mais l utilisation de 500mM permet d accroître la concentration en protéines des fractions en sortie de colonne. N C S S I 1-5 glycosaminoglycanes (faible) I 6 II 1-2 I 7-9 (CBD) gélatine III 13 III cs III 15 glycosaminoglycanes (fort) Figure 23 : Localisation des sites d affinité aux glycosaminoglycanes et à la gélatine portés par la fibronectine. Le CBD représente la Collagen Binding Domain qui porte l affinité pour le collagène et la gélatine.

82 82 absorbance à 280nm (UDO) 2 1,5 1 0, concentration NaCl (mm) volume (ml) 0 Figure 24 : Purification de la fibronectine par chromatographie d affinité à l héparine Les échantillons sont injectés sur une colonne d héparine-cellufine (2.5 x 45cm) stabilisée dans du TE (Tris-HCl 50mM, EDTA 1mM à ph 7.4). Les fractions sont recueillies par augmentation de la concentration en NaCl entre 0 et 500mM dans le tampon d élution (ligne de pointillés). D après Miekka et al. (1982) et Smilenov et al. (1992), la chromatographie d affinité sur héparine ne permet pas d éliminer les contaminants portant une activité protéolytique des préparations de fibronectine. Cependant, ces auteurs réalisent l élution de la fibronectine retenue sur la matrice d héparine en une seule étape avec 300mM NaCl sans procéder à des étapes de rinçages préliminaires. Or de nombreuses protéines - comme le fibrinogène, le facteur von Willebrand, et la vitronectine traitée à l urée (Yatohgo et al. 1988) - possèdent une réelle affinité pour les glycosaminoglycanes (Mohri et Ohkubo, 1993). De plus, l héparine portant de nombreuses charges anioniques grâce aux résidus sulfates portés par les structures holosidique, la matrice d héparine peut se comporter comme une résine échangeuse de cations de faible capacité. Pour la préparation de fibronectine hautement purifiée, seule la fraction éluée sur chromatographie d affinité à l héparine grâce à 500mM de NaCl (et donc dépourvue d activité gélatinolytique) sera utilisée.

83 83 Afin de simplifier notre protocole de purification et d accroître son rendement, les fractions éluées après chromatographie d affinité à la gélatine peuvent être directement injectées sur la colonne d héparine après une simple dilution (1 : 1) avec le tampon de stabilisation afin d atteindre des concentrations finales de 125mM de NaCl et 1.5M d urée. Les fractions recueillies après la chromatographie d affinité à l héparine peuvent éventuellement être ré-injectées directement sur une colonne de gélatine-cellufine afin d augmenter la concentration finale en fibronectine et de rétablir le degré de pureté en cas de contaminations bactériennes (cf. Figure 25). Les fractions recueillies (comme décrit précédement) sont homogènes sur gels SDS-PAGE colorés au PAS/Argent jusqu à 20µg / [puits 5mm] (cf. Figure 21 et Figure 18 puits F à J). La fibronectine, ainsi purifiée par notre protocole en trois étapes (cf. Figure 12), est dénommée hpfn pour highly purified fibronectin. absorbance à 280nm (UDO) 2 1,5 1 0, volume (ml) Figure 25 : Concentration de la fibronectine par chromatographie d affinité à la gélatine. Les échantillons sont injectés sur une colonne de gélatine-cellufine (2.2 x 40cm) stabilisée dans du TEBS (Tris-HCl 50mM, NaCl 150mM, EDTA 1mM à ph 7.4). La flèche indique l injection de tampon d élution composé de NaCl 250mM urée 3M.

84 Rendements Le rendement obtenu pour la première chromatographie d affinité à la gélatine est de / SD (n=7) [mg protéines retenue]/[g de cryoprécipité] (cf. Table XIV). La ré-injection des protéines non-retenues permet d augmenter le rendement qui atteint / SD (n=7) [mg protéines retenue]/[g de cryoprécipité]. Pour la chromatographie d affinité à l héparine, le rendement obtenu avec la fraction recueillie avec 500mM de NaCl est de 66.4% +/- 4.8% SD (n=15). Enfin, le rendement de la seconde chromatographie d affinité à la gélatine après dialyse est de 86.1% +/- 3.1 SD (n=10). En associant une chromatographie d affinité à la gélatine avec élution à l urée, une chromatographie d affinité à l héparine en distinguant les fractions recueillies à 250 et à 500mM de NaCl et une seconde chromatographie d affinité à la gélatine, le rendement obtenu est de / SD [mg hpfn]/[g de cryoprécipité]. Par analyse densitométrique des gels, la pureté estimée est supérieure à 99.5%. Ce protocole proposé permet de purifier la fibronectine à partir de plasma sanguin humain citraté (plasma obtenu et conditionné après le don de sang total ou par plasmaphérèse). Il permet alors d obtenir la hpfn (aux caractéristiques identiques à celle obtenue à partir de CPSH) avec un rendement de 0.16 [mg hpfn] / [ml plasma frais citraté].

85 85 Pureté, rendements et taux de purification de la fibronectine à partir de cryoprécipité de plasma sanguin humain Etape Pureté (%) Rendement Taux de (mg fibronectine / g purification cryoprécipité) Cryoprécipité de plasma sanguin humain 4.7 N/A N/A solubilisé Première chromatographie sur / (n=7) 17.5 gélatine-cellufine Chromatographie sur héparine-cellufine >99.5* / (n=15) >21.2 Seconde chromatographie sur gélatine-cellufine >99.5* / (n=7) >21.2 Table XIV : Pureté, rendements et taux de purification de la fibronectine à partir de cryoprécipité de plasma sanguin humaine. La fibronectine est purifiée à partir du cryoprécipité de plasma sanguin humain grâce à une première chromatographie d affinité sur gélatine-cellufine (avec élution par NaCl 250mM, urée 3M), d héparine-cellufine (avec élution par NaCl 500mM) et la seconde chromatographie d affinité sur gélatine-cellufine. La pureté est estimée par analyse densitométrique de SDS-PAGE. * indique que les fractions ne présentent pas d activités protéolytiques par zymographie. Les rendements sont exprimés +/- l erreur standard (SD), n est le nombre d expériences distinctes. N/A : non-applicable Critères de purification et contrôles Afin de valider le critère de haute pureté de nos préparations d hpfn, nous devons caractériser les fractions obtenues Electrophorèse SDS-PAGE La migration d un échantillon après chaque étape de purification sur des gels colorés au PAS/Argent et Bleu de Coomassie R250 (cf. Figure 21), montre que les préparations de

86 86 fibronectine sont homogènes dès l étape de chromatographie d affinité sur l héparine, et ceci avec une élution à 250mM et 500mM de NaCl. Par rapport aux préparations commerciales (purifiées selon le protocole d Engvall et de Ruoslahti, 1977) qui comportent des contaminants dont les masses sont entre 30 à 40kDa, 65kDa, 85kDa, 120kDa et 150kDa, la préparation d hpfn est homogène sur gel avec un dépôt de 20µg / [puits 5mm] et une coloration au PAS/Argent et au Bleu de Coomassie (cf. Figure 18). La préparation commerciale apparaît comme hétérogène avec un dépôt dix fois plus faible (2µg / [puits 5mm]) Révélations immunologiques L utilisation d anticorps polyclonaux dirigés contre la fibronectine montre, après électrotransfert, que les préparation d hpfn sont, comme sur gel SDS-PAGE, homogènes (cf. Figure 26 puits G). Notre protocole permet donc d obtenir des préparations de fibronectine exemptes de fragments de la protéine. FN A B C D E F G H I Figure 26 : Analyse par SDS-PAGE et par immunorévélation de la stabilité d hpfn Les échantillons de fibronectine hautement purifiée (hpfn) sont incubés en présence de calcium 5mM pendant 72h (A) 144h (B) 256 (C) et 456h (E et H), de CaCl2 5mM, ZnCl2 1mM, HgCl2 1mM pendant 456h (F et I) ou d EDTA 5mM pendant 456h (D et G). Après incubation, les échantillons sont déposés sur un gel de polyacrylamide à 8.5% (7µg solubilisés dans SDS 3.5 % p/v final) avant coloration au bleu de Coomassie G250 (A à E) ou électrotransfert et immunorévélation grâce à des anticorps polyclonaux dirigés contre la fibronectine du plasma sanguin humain (G à I).

87 87 L utilisation d anticorps polyclonaux dirigés contre le fibrinogène humain (cf. Figure 27 puits J) ou contre le facteur von Willebrand humain (cf. Figure 27 puits K) révèle des fractions homogènes d une protéine dont la masse est similaire à celle de la fibronectine. Ces deux protéines étant copurifiées avec la fibronectine du plasma sanguin humain, les sera polyclonaux commerciaux obtenus alors reconnaissent ici hpfn. Toutefois, l absence de bandes supplémentaires démontre que les préparations d hpfn sont exemptes de traces de fibrinogène ou de facteur von Willebrand. FN A B C D E F G H I J K SDS-PAGE WB hfbg WB vwf Figure 27 : Analyse SDS-PAGE et par immunorévélations des différentes préparations de fibronectine. HpFN est comparée aux fibronectines issues d autres protocoles de purification. hpfn (A, F et K) ; fibronectine éluée avec 200mM NaCl sur la colonne d héparinecellufine (B et G) ; fibronectine purifiée par le protocole de Vuento et Vaheri 1979 (C et H) ; fibronectine purifiée sur DEAE-sépharose par Le Cœur et al. (D et I) ; fibronectine commerciale (E et J). Gel d électrophorèse révélé au Bleu de Coomassie R250 après électrotransfert (A à E) ; Immunorévélation avec un sérum polyclonal dirigé contre le fibrinogène humain (F à J) ; Immunorévélation avec un sérum polyclonal dirigé contre le facteur von Willebrand humain (K) Zymographie Sur les zymogrammes contenant de la gélatine et incubés dans un milieu favorable aux activités protéolytiques (et gélatinolytique en particulier) à 37 et à ph 7.4, des activités protéolytiques sont détectées lors des premières étapes du protocole de purification (cf. Figure

88 88 22). Si des activités gélatinolytiques sont révélées dans la fraction éluée avec 250mM NaCl lors de la chromatographie d affinité à l héparine, ces activités ne sont pas associées aux préparations d hpfn obtenues à partir de la fraction éluée avec 500mM NaCl Stabilité en milieu liquide L absence de contaminant protéolytique est confirmé par la stabilité de nos préparations de fibronectine (cf. Figure 26), incubées 456h à 37 C en présence de CaCl 2 et/ou ZnCl 2 et/ou HgCl 2, connus pour stimuler les activités protéolytiques. Ces conditions défavorables et des temps aussi longs (456h) n ont jamais été décrits. Cette expérience démontre le degré de pureté de nos préparations et l'intérêt du protocole présenté. La réalisation des incubations en milieux non stériles (tubes et tampons) montre une forte probabilité d hydrolyse de la fibronectine après 12 heures d incubation. Ces résultats sont en contradiction avec ceux présentés par Planchenault et Keil-Dlouha (1995) qui observaient une autoprotéolyse de la fibronectine en présence de 10mM CaCl 2 après 72 heures d incubation à 37 C Stabilité conformationelle Afin de s assurer de la non-dénaturation de la fibronectine obtenue par le protocole de purification utilisant des concentrations raisonnées de chaotropes (urée), nous avons comparé hpfn avec d autres préparations de fibronectine n utilisant pas (ou peu) de chaotropes (purifiées par : chromatographie d affinité à l arginine, Vuento et Vaheri, 1979 ; chromatographie échangeuse d anions chromatographie d affinité à l héparine, Le Cœur et al., résultats non-publiés ; chromatographie d affinité sur concanavaline-a, Gallet et al., résultats non-publiés) préalablement analysés par SDS-PAGE et par immunorévélation (cf. Figure 27). Par spectrophotométrie UV (cf. Figure 28) et par spectrofluorométrie (cf. Figure 29), aucune différence ne peut être observée entre nos préparations de fibronectine hautement purifiée et les préparations n utilisant pas (ou peu) de chaotropes.

89 % Imax hpfn H500 Vuento CLC ConA longueur d'onde (nm) Figure 28 : Spectrophotométrie UV des préparations de fibronectine. Les spectres d absorption des échantillons (0.5mg/ml) de fibronectine issus de différents protocoles (hpfn : bleu ; Vuento : vert ; Le Cœur et al. : orange et ConA ; rouge) sont mesurés entre 260 et 340nm. Les courbes sont normalisées sur leur intensité maximale (qui varie entre 279 et 279,5nm). L absence de modification structurelle de la fibronectine purifiée grâce à notre protocoles en trois étapes est confirmée par Pelta et al. (2000) grâce à des expériences de diffraction de lumière et de diffraction de neutrons. De plus, l adhésion de cellules d adénocarcinome ovarien (souche IGROV1) est identique pour les différentes préparations de fibronectine (Carreiras et al., résultats non-publiés, cf. Figure 30). Ce dernier résultat démontre que la fibronectine purifiée selon notre protocole possède des caractéristiques physiologiques semblables aux fibronectines issues des protocoles n utilisant pas (ou peu) de chaotropes.

90 hpfn H500 H250 Vuento Le Cœur ConA F60 Figure 29 : Spectrofluorométrie des préparations de fibronectine. Les spectres d émission des échantillons (30µg/ml) de fibronectine issus de différents protocoles (hpfn : marron ; H500 : turquoise ; H200 : rose ; Vuento : bleu marine ; Le Cœur et al. : bleu clair ; ConA : rouge et F60 : vert) sont mesurés après excitation à 280nm (A) entre 300 et 400nm. Les courbes sont normalisées sur leur intensité maximale.

91 Pourcentage d'adhésion H200 hpfn ConA F60 Source de fibronectine Figure 30 : Adhésion des cellules IGROV1 sur les préparations de fibronectine et de F60. Les échantillons de fibronectine ou de dérivés issus de différents protocoles (hpfn : bleu ; H200 : turquoise ; ConA ; rouge et F60 : violet) ont été placés 2 heures dans une plaque de microtitration (1µg/puits). Après séchage des puits, des cellules IGROV1 ont été mise en culture dans ces puits pendant 2 heures. Après lavage des plaques, les cellules adhérentes ont été fixées au glutaraldéhyde 1% puis colorées au cristal violet. Apres solubilisation en présence de SDS 0.1% pendant 15 min., l absorbance des puits est lue à 595nm. Les résultats présentés, isssu de trois expériences différentes, donnent le pourcentage d adhésion obtenu par rapport à l utilisation d albumine bovine (1µg/puits). La fibronectine purifiée par notre protocole en trois étapes est pure, stable dans le temps, et possède des caractéristiques physicochimiques et physiologiques identiques aux autres préparations de fibronectine ayant un plus faible rendement. Ce faisceau d observations tend à prouver l absence d activité autoprotéolytique portée avec hpfn. Cette absence ne serait pas due à une mauvaise configuration conformationelle de la glycoprotéine due au protocole de purification en trois étapes. A partir nos préparations de fibronectine, de haute pureté, nous pouvons toutefois chercher les activités protéolytiques pouvant être portées par les fragments de fibronectine (activités dites cryptiques).

92 Purification des dérivés de fibronectine présentant le site d affinité à la gélatine Afin d étudier les interactions entre la fibronectine et les collagènes et étudier une possible activité collagénase de type-iv (Lambert-Vidmar et al., 1991b), nous proposons un protocole permettant d obtenir, à partir d hpfn, un fragment de la glycoprotéine portant le Collagen Binding Domain (CBD) et ses régions proches. Des travaux préliminaires ont permis de cartographier sur la molécule de fibronectine les sites d hydrolyse de plusieurs protéases (cathepsine D, trypsine, chymotrypsine, pepsine et thermolysine, cf. Figure 31). L utilisation de la trypsine nous permet d optimiser l obtention de fragments de taille définie et facilement positionnables sur la molécule (Della-Maura 1995) Hydrolyse de la fibronectine La réalisation d une gamme d hydrolyse de la fibronectine par la trypsine avec un rapport enzyme substrat de 1/100 e à 1/1000 e (1 molécule d enzyme pour x simple chaîne de fibronectine de 250 kda) oriente notre protocole pour une hydrolyse au 1/250 e (cf. Figure 32). Le ratio E/S a été analysé pour des concentrations d hpfn égales à 1mg/ml. L utilisation du TLCK permet de nous affranchir de la présence de la trypsine active à la fin de l hydrolyse. Afin de minimiser la dégradation des fragments par d éventuelles contaminations bactériennes, les hydrolysats sont conservés à 8 C dans des tubes stériles Chromatographie d affinité à la gélatine La chromatographie d affinité à la gélatine est la méthode de référence qui permet de purifier les fragments de fibronectine portant le CBD. L hydrolysat, dont la concentration est de 1 [mg équivalent hpfn] / ml, est directement injecté sur la colonne sans dialyse préalable. Le protocole est en tout point similaire à celui réalisé lors de la purification de la fibronectine native. Une étape de rinçage avec 1M NaCl n éluant aucune protéine retenue, l élution des protéines est limitée à l utilisation, comme pour hpfn, de tampon de stabilisation additionné d urée 3M, NaCl 250mM (cf. Figure 33). Ici encore, la ré-injection des fractions non-retenues permet d accroître les rendements. Les fractions recueillies avec l injection de TE Urée 3M NaCl 250mM ne sont pas homogènes sur SDS-PAGE (cf. 34 puits C).

93 93 N R 259 : thl, try, thr, pls T 274 :try,thr,pls S 577 : catd S 598 : thl S 670 :thl D 874 : thl, try N 976 :try T 1325 :chy T 1506 : pep T 1600 : thl, chy, pep T 1780 :chy T 2051 :chy T 2120 : thl C Figure 31 : Carte d hydrolyse de la fibronectine Les principaux sites d hydrolyse de la fibronectine sont présentés selon la convention suivante : X n signifie que l hydrolyse a lieu après le résidu aminé X qui est en position n sur la chaîne de fibronectine. try : trypsine ; chy : chymotrypsine ; thr : thrombine ; pls : plasmine ; catd : cathepsine D ; thl : thermolysine ; pep : pepsine (d après Della-Maura, 1995 et Berry et al., 1998).

94 94 A B C D E F G FN Figure 32 : Analyse des profils d hydrolyse de hpfn par la trypsine. Après digestion de la fibronectine par la trypsine pendant 3 heures, les échantillons (7µg solubilisés dans SDS 3.5 % p/v final) sont déposés sur un gel de polyacrylamide à 8.5%. Les ratios enzyme / substrats sont A : 1/75 e ; B : 1/150 ; C : 1/250 e ; D : 1/500 e ; E : 1/750 e ; F : 1/1000 e et G : 1/2500 e (molécule de trypsine / simple chaînes de fibronectine). 1,25 absorbance à 280nm (UDO) 1 0,75 0,5 0, volume (ml) Figure 33 : Purification des fragments de fibronectine par chromatographie d affinité à la gélatine. Les échantillons sont injectés sur une colonne de gélatine cellufine (2.2 x 6cm) stabilisée dans du TEBS (Tris-HCl 50mM, NaCl 150mM, EDTA 1mM à ph 7.4). La flèche indique l injection de tampon d élution composé de NaCl 250mM urée 3M.

95 95 A B C D E F F160 F Figure 34 : Analyse SDS-PAGE des étapes de purification de F60. Les échantillons (7µg solubilisés dans SDS 3.5 % p/v final) sont déposés sur un gel de polyacrylamide à 8.5% avant révélation au nitrate d argent. A : hydrolysat de fibronectine par la trypsine (E/S : 1/250 ème ) ; B : fraction non-retenue sur gélatinecellufine ; C : fraction éluée avec 3M urée 250mM NaCl sur gélatine cellufine ; D : fraction éluée avec 3M urée 140mM NaCl sur héparine-poros ; E : fraction éluée avec 300mM NaCl sur héparine-poros ; F : fraction éluée avec 3M urée 150mM NaCl sur héparine-poros après réduction au βmsh. Afin de pouvoir poursuivre la purification, les fractions sont dialysées contre une solution de carbonate d ammonium à 1% avant lyophilisation Chromatographie d affinité à l héparine en perfusion La chromatographie d affinité pour l héparine permet de séparer les molécules de fibronectine ou ses grands fragments (qui conservent une forte affinité à l héparine à 300mM) des petits fragments qui n ont plus aucune affinité pour les glycosaminoglycanes et de ceux qui ont une affinité relative. Sur le schéma d hydrolyse de la fibronectine (cf. Figure 31), le fragment issu de l hydrolyse de la glycoprotéine par la trypsine portant le CBD présente théoriquement les régions III 1-2 qui portent un site dit faible affinité à l héparine. Ce site n a pas de réelle affinité pour les glycosaminoglycanes dans les conditions physiologiques (NaCl 150mM) et la matrice d héparine joue le rôle d une colonne échangeuse de cations.

96 96 Par chromatographie en perfusion, qui permet de réaliser une chromatographie d affinité à très haut débit, quatre fractions peuvent être séparées en employant un gradient continu en NaCl (cf. Figure 35). Un fragment, dont la masse de 60kDa est similaire à celle du fragment recherché, est élué avec un fragment de 160kDa avec une faible concentration de NaCl (140mM) (cf. Figure 34 puits D). Si la séparation est réalisée à faible pression sur une résine d héparine cellufine dans des conditions similaires à celles servant à la purification de la fibronectine, les quatre mêmes populations de fragments peuvent être séparées. L élution du fragment de 60kDa (accompagnée par celle du fragment de 160kDa) est alors observée avec une concentration de NaCl 100mM. 1,5 500 absorbance à 280nm (UDO) 1,25 1 0,75 0,5 0, concentration NaCl (mm) volume (ml) Figure 35 : Purification des fragments de fibronectine par chromatographie d affinité à l héparine Les échantillons sont injectés sur une colonne d héparine-poros (0.5 x 5cm) stabilisée dans du Tris-HCl 16mM à ph 7.4. Les fractions sont éluées par augmentation de la concentration en NaCl entre 0 et 680mM en 10min. (ligne de pointillés).

97 Chromatographie échangeuse d anions en perfusion. Afin de séparer les fragments de 60 et 160kDa, nous avons injecté les fractions après dialyse et lyophilisation sur une colonne de chromatographie échangeuse d anions en perfusion. En utilisant un gradient continu de NaCl, deux fractions homogènes sont obtenues (cf. Figure 36). Une première, éluée avec une concentration de NaCl 120mM qui contient le fragment de 60kDa, et une seconde, éluée avec NaCl 300mM, qui contient le fragment de 160kDa (cf. Figure 37). absorbance à 280nm (UDO) 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0, concentration NaCl (mm) volume (ml) 0 Figure 36 : Purification des fragments de fibronectine par chromatographie échangeuse d anions Les échantillons sont injectés sur une colonne Poros-HQ (0.5 x 5cm) stabilisée dans du Tris-HCl 16mM à ph 7.4. Les fractions sont éluées par augmentation de la concentration en NaCl entre 0 et 400mM en 10min. (ligne de pointillés).

98 98 A B C F F60 Figure 37 : Analyse SDS-PAGE des étapes de purification de F60 sur Poros-HQ. Les échantillons (7µg solubilisés dans SDS 3.5 % p/v βmsh 1.5% v/v final) ont été déposés sur un gel de polyacrylamide à 6% puis révélés au nitrate d argent. A : fraction injectée ; B : fraction éluée avec 140mM NaCl; C : fraction éluée avec 280mM NaCl Rendements L utilisation de la lyophilisation après chaque chromatographie permet d accroître les rendements en permettant la collecte des fractions à faible concentration de protéines et en permettant d utiliser la chromatographie liquide à hautes performances. La première étape de chromatographie d affinité est réalisée avec un rendement de 19.9% +/- 2.7 SD (n=8) en pratiquant la ré-injection des fractions non retenues. Après élution des protéines sur la colonne d héparine-poros, le rendement obtenu est de 26.3% +/- 1.5 SD (n=4) par rapport à la masse de protéines recueillies lors de l étape précédente. La chromatographie échangeuse d anions en perfusion a un rendement de /- 1.6 SD [mg F60] / [mg eq FN] (n=3). Le rendement global obtenu est 2.3 +/- 0.2 SD [mg F60] / [100 mg hpfn] (cf. Figure 16).

99 99 Le fragment de 160kDa issu de ce protocole de purification ne sera pas caractérisé. En effet, sa taille importante tend à lui conférer des caractérisitiques proches des monomères de fibronectine et ceci complique l étude des caractéristiques spécifiques du CBD Critères de purification Electrophorèse SDS-PAGE Les différentes étapes de chromatographies sont analysées par SDS-PAGE (cf. Figure 34 et Figure 37). Seule la dernière chromatographie échangeuse d anions permet d obtenir deux populations homogènes sur gels SDS-PAGE en conditions non-réductrices (F60 et F160). En présence de βmsh, les fractions contenant le F60 présentent une bande majoritaire à 60kDa et une bande minoritaire à 45kD représentant moins de 10% (Figure 34 puits F). La fraction étant homogène en condition non-réductrice, nous pouvons supposer que la trypsine hydrolyse une faible proportion de F60 sur un kringle ou en doigts-de-gants du CBD. Le fragment de 45kDa est alors visible après coupure des ponts dissulfures. Nous pouvons remarquer l augmentation de la masse apparente du fragment en condition réductrice, due à la déstructuration de ces structures tertiaires Révélation immunologique L utilisation d anticorps polyclonaux dirigés contre hpfn confirme, après électro-transfert, l homogénéité des préparations de F60 (cf. Figure 38). Cependant, les anticorps polyclonaux de souris dirigés contre le F60 ne reconnaissent ni le fragment fixé sur membrane (PVDF ou nitrocellulose), ni le fragment déposé dans une cupule pour ELISA. Le même sérum reconnaît par contre la fibronectine dans toutes les conditions (cf. Figure 39).

100 100 A B C D E F F Figure 38 : Analyse par immunorévélation de la stabilité de F60. Les échantillons de fragment de 60kDa (F60) sont incubés en présence de calcium 5mM pendant 24h (A) 48h (B) 72h (C) et 144h (E), de CaCl2 5mM, ZnCl2 1mM, HgCl2 1mM pendant 144h (F) ou d EDTA 5mM pendant 144h (D). Après incubation, les échantillons sont déposés sur un gel de polyacrylamide à 8.5% (7µg solubilisés dans SDS 3.5 % p/v final) avant électrotransfert puis immunorévélation par un sérum polyclonal dirigé contre la fibronectine du plasma sanguin humain. A 2 B 2 absorbance 420nm (UDO) absorbance 420nm (UDO) / / masse antigène (ng/puits) dilution séra masse antigène (ng/puits) dilution séra C D 2 2 absorbance 420nm (UDO) absorbance 420nm (UDO) / / masse antigène (ng/puits) dilution séra masse antigène (ng/puits) dilution séra Figure 39 : Dosage ELISA de hpfn et de F60 par des sera polyclonaux. Des échantillons de fibronectine hautement purifiée (A et B, en bleu) et de fragment F60 (C et D, en mauve) sont fixés sur plaque ELISA (25 à 500mg/puits). La révélation est réalisée avec des sera polyclonaux de souris dirigés contre fibronectine hautement purifiée (A et C) ou contre le fragments F60 (B et D) dilués au 1/25 e, 1/250 e et au 1/2500 e.

101 101 Ceci peut être expliqué par les modifications d accessibilité induites par la fixation du fragment sur les différents supports. Nous pouvons supposer en effet que la liaison entre F60 et le polymère de la plaque de microtitration cache certaines structures ou favorise l exposition (et donc l accessibilité) d autres domaines Stabilité en milieu liquide L analyse sur gel SDS-PAGE d aliquotes de F60 incubées en milieu stérile jusqu à 144h à 37 C en présence d EDTA (comme témoin négatif), ou d ion calcium, zinc et mercure (activateurs de protéases) ne permet pas de révéler la co-purification d éléments porteurs d une activité fibronectinolytique (cf. Figure 38). Cette observation, combinée aux résultats négatifs obtenus avec le F60 par zymographie sur gélatine ne permettent pas de mettre en évidence les activités gélatinolytiques décrites par Lambert-Vidmar et al. (1991b). Nous devrions toutefois, pour conclure cette investigation, analyser la capacité du F60 a dégrader le collagène de type IV et la laminine (comme l ont observé les auteurs) avant de conclure à l absence de toute activité protéolytiques portées par ce fragment. L incubation d aliquotes de F60 à 4 C dans du TEBS démontre une tendance naturelle du fragment à s agréger. Ces observations sont confirmées par l analyse des spectres d absorption UV des préparations des fragments. Après centrifugation, le spectre de F60 présente une absorbance importante entre 310 et 340nm, pouvant s expliquer par la formation d agglomérats (cf. Figure 40). Les préparations de fragments sont donc conservées sous forme lyophilisée et ne seront solubilisées qu extemporanément Identification des fragments Le séquençage des dix premiers résidus aminés des préparations de F60 (réalisé grâce au concours du Pr Cassian-Bon et du laboratoire de microséquençage des protéines de l Institut Pasteur de Paris) montre que la préparation est homogène (l ensemble des composés présente la même séquence amino-terminale). La séquence A 296 AVYQPQ permet de localiser et d identifier le F60 comme le fragment portant les domaines I 6 II 1-2 I 7-9 III 1-2 (cf. Figure 41).

102 %Imax longueur d'onde (nm) Figure 40 : Spectrophotométrie UV de F60. Le spectre d absorption des échantillons (0.5mg/ml) de fragment de 60kDa (F60, en mauve) est comparé au spectre de la fibronectine hautement purifiée dont il est issu (hpfn, en bleu). Les spectres sont mesurés entre 260 et 340nm. Les courbes sont normalisées sur leur intensité maximale (qui varie entre 279 et 279,5nm). N C A 260 AVYQPQPHPQPPP Figure 41 : Représentation du F60. Le séquençage des dix premiers résidus aminés (soulignés) de la préparation de fragment de 60kDa (F60) par micro-séquençage montre que F60 comporte les domaines I 6 II 1-2 I 7-9 III 1-2.

103 Caractérisations des glycosylations et applications Analyse des glycosylations Glycosylations de hpfn Les lectines ont été étudiées chez les animaux (Drickamer et Taylor, 1993), et en particulier celles présentes dans les fluides circulants (Casset et al., 1997). Les lectines animales sont classées en 4 catégories en fonction de leurs spécificités : C-lectines, S-lectines, P-lectines et les pentraxines. Le groupe des C-lectines comporte les Mannose Binding Protein (MBP) du sérum (Weis et Drickamer, 1994) dont l activité est calcium-dépendante. La fibronectine portant des résidus mannose, la glycoprotéine est potentiellement reconnue par ces lectines du sérum ou des complexes membranaires liés aux éléments de la matrice extracellulaire. La formation de complexes FN-MBP peut jouer un rôle dans les fonctions attribuées à la fibronectine comme la thrombose et la cicatrisation. Afin de permettre d appréhender le rôle des glycosylations dans la liaison entre la fibronectine et ses différents ligands, les affinités de différentes lectines végétales (couplées à la digoxigénine ou à la biotine) pour la fibronectine ont été évaluées à partir de fibronectine fixée sur membrane (PVDF ou nitrocellulose) (cf. Figure 42).

104 104 ConA PSA LCA SNA WGA swga UEA RCA ng 100 ng 50 ng SBA SJA DBA PNA GSL-1 PHA-E PHA-L KL 250 ng 100 ng 50 ng Figure 42 : Détection de hpfn fixée sur membrane par les lectines biotinylées. Une goutte (0.5µl) de fibronectine hautement purifiée (hpfn) est déposée sur une membrane de nitrocellulose (250ng, 100ng et 50ng). Après blocage de la membrane avec de la gélatine, celle-ci est découpée puis incubée en présence des lectines biotinylées (0.5µg/ml). La révélation est réalisée avec un complexe avidine / phosphatase alcaline biotinylée (0.3µg/ml chaque) avant révélation. Les résultats positifs (cf. Table XV) obtenus avec la concanavaline A (ConA, extraite de Canavalia ensiformis) démontrent l accessibilité des lectines pour des structures polyholosidiques comportant des résidus mannose (Man) et pouvant être bi-antennaires (cf. Figure 43). La présence de résidus Man est confirmée par les résultats positifs obtenus avec les agglutinines extraites de Ricinus communis, de Pisum sativum et de Lens culinaris (RCA 120, PSA et LCA). Les résultats négatifs obtenus avec l agglutinine extraite de Galanthus nivalis (GNA) démontrent l inaccessibilité de la lectine à des résidus mannose (Man) terminant les structures polyholosidiques. La présence de structures ramifiées est appuyée par les résultats obtenus avec les lectines extraites de Phaesolus vulgaris. Les résultats positifs obtenus avec l erythroagglugtinine montrent que les structures des glycosylations accessibles par les lectines sont bi-antennaires, les résultats négatifs de la leucoagglutinine dénonçant la possibilité d accéder à des structures plus complexes (tri- ou quadri-antenaires).

105 105 Les chaînes de glycosylations se terminent en majorité par des résidus d acide neuramidique (NeuA, également dénommé acide sialique) liés par les agglutinines extraites de Triticum vulgaris et de Sambus nigra (WGA et SNA). Les résultats négatifs obtenus par la lectine succinylée de Triticum vulgaris ou l agglutinine extraite de Datura stramonium (swga et DSL) confirment la présence de NeuA et dénoncent l accessibilité au sein de structures à des résidus N-acétyl-glucosamine (GluNAc). Les résultats négatifs obtenus avec l agglutinine de Maackia amurensis (MAA) montrent que ces résidus d acide sialique n appartiennent pas à des structures NeuA (2-3) Gal. Des réponses faibles obtenues en présence de Dolichos biflorus (DBA), Glycin max (SBA) et Sophorica japonica (SJA) montrent que certaines chaînes sont terminées par des résidus galactose ou N-acétyl-galactosamine (Gal ou GalNAc) suite à l action de neuramidases sériques qui participent au renouvellement des protéines (turn-over ; Feinberge et al., 2000). Des résultats négatifs obtenus avec l agglutinine extraite de l arachide (PNA) dénoncent l accessibilité de la lectine à des structures Gal (1-3) GalNAc. De même, les résultats négatifs obtenus avec l agglutinine extraite d Ulex europaeus (UEA-1) dénoncent la présence de chaînes latérales présentant des résidus fucose (α (1-2) Fuc) liées à des résidus Galactose (Gal). Les résultats obtenus avec les lectines végétales concordent avec le séquençage total réalisé par Takasaki et al. (1979) à partir de fibronectine de plasma sanguin bovin. Les résultats (cf. Figure 43) obtenus avec les lectines (BDA, SBA et SJA) montrent cependant qu une partie de la population de fibronectine du plasma sanguin humain ne porte pas de résidus neuramidiques aux extrémités leurs branches terminées par des résidus galactose. Ceci peut être expliqué par l action des neuraminidases plasmatiques secrétées par le foie afin d assurer un turn-over des protéines circulantes du plasma sanguin. Des expériences complémentaires pourraient être effectuées à partir d autres sources de fibronectine soluble (comme l urine ou le lait). Les 8 sites potentiels de N-glycosylation sont localisés sur le monomère de fibronectine sur les résidus 430, 528, 542, 1007, 1244 et 2108 (SWISS-PROT : locus FINC-HUMAN). Si les résultats obtenus avec les lectines ne permettent pas de donner les séquences précises des chaînes de glycosylation, nous obtenons cependant de précieuses informations.

106 106 Man NeuA Gal Structure Lectine Man Man(1-3)Man NeuA NeuA(2-3)Gal Gal Gal(1-3)GalNAc GalNAc GlcNAc Fuc(1-2)Gal ConA DBA + + DSL - GNA - LCA +++ MAA - PHA-E +++ PHA-L - - PNA - - PSA +++ RCA SBA + + SJA + + SNA +++ UEA-1 - WGA swga - Table XV : Reconnaissance par les lectines des structures glycosylées de hpfn. Pour chaque lectine sont associés les motifs holosidiques reconnus et la réponse observée avec des échantillons de fibronectine hautement purifiée fixés sur membrane. Man : mannose ; NeuA : acide neuramidique (acide sialique) ; Gal : galactose ; GalNAc : N-acétyl-galactosamine ; GlcNAc : N-acétyl-glucosamine ; Fuc : fucose ; 2 : structure bi-antennaire ; 3 : structure tri-antennaire ; 4 : structure quadri-antennaire.

107 107 A Galβ1 4GlcNAcβ1 2Manα1 Galβ1 4GlcNAcβ1 2Manα1 6 Manβ1 4GlcNAcβ1 4GlcNAc 3 B Galβ1 4GlcNAcβ1 2Manα1 NeuNAcβ2 4Galβ1 4GlcNAcβ1 2Manα1 6 NeuNAcβ2 6 Manβ1 4GlcNAcβ1 4GlcNAc 3 C NeuNAcβ2 6 NeuNAcβ2 4Galβ1 4GlcNAcβ1 2Manα1 NeuNAcβ2 4Galβ1 4GlcNAcβ1 2Manα1 6 NeuNAcβ2 6 3 Manβ1 4GlcNAcβ1 4GlcNAc ConA, PSA, LCA, RCA 120 SNA, WGA DBA, SBA, SJA PHA-E, ConA Branchements éventuels Figure 43 : Reconnaissance des structures polyholosidiques de la fibronectine par les lectines végétales. Sur les séquences proposées par Takasaki et al. (1979) à partir de la fibronectine du plasma sanguin bovin, les résultats positifs obtenus avec les lectines végétales sur hpfn ont été associés aux résidus et aux structures potentielles. A, B, et C représentent les structures potentielles proposées par Takasaki et al. (1979) à partir de séquençages chimiques. Les structures reconnues sont : Man (en violet), reconnus par ConA, PSA, LCA et RCA 120 ; NeuNAC (en orange) reconnus par SNA et WGA ; Gal en position terminale (en vert) reconnus par DBA, SBA, WGA ; les structures bi-antennaires (en bleu avec un filet en pointillé) sont reconnues par PHA-E et par ConA. Les résidus d acide neuramidique (sur fond jaune) sont des branchements potentiels. Par rapport aux propositions des auteurs, les structures possédant un résidu Gal en position terminale sont présentées (A et B). Ces structures représentent la population minoritaire de glycosylations potentiellement reconnues par DBA, SBA et SJA. Man : mannose ; NeuNAc : acide N-acétyl-neuramidique ; Gal : galactose ; GlcNAc : N-acétyl-glucosamine.

108 108 Contrairement au séquençage chimique, l utilisation des lectines végétales permet d associer un critère qualitatif aux résidus holosidiques en déterminant l accessibilité de ces résidus par des protéines en solution avec la fibronectine Comparaison des patrons d accessibilité aux glycosylations Fibronectines natives La reconnaissance des agglutinines sur la fibronectine traduisant l accessibilité des lectines aux structures polyholosidiques de la fibronectine, nous avons comparé le marquage par les lectines biotinylées des fibronectines issues de notre protocole en trois étapes ou celles issues de protocoles classiques ou non-dénaturants. Les fibronectines, fixées sur membranes de nitrocellulose ou au fond d un puits de plaque ELISA, présentent des patrons qui ne permettent pas de les différencier (cf. Figure 44). L unique différence obtenue dépend de la méthode choisie pour fixer la glycoprotéine. Si les fibronectines sont fortement reconnues sur membrane par ConA, PSA, LCA, SNA et RCA 120, la glycoprotéine, une fois fixée sur un puits ELISA, n est fortement reconnue que par ConA, SNA, RCA 120, SBA et DBA (cf. Figure 45).

109 109 ConA PHA L 0,250 PSA PHA E LCA 0,150 GSL I 0,050 SNA PNA -0,050 WGA DBA swga SJA SBA RCA 120 UEA hpfn H250 Vuento CLC ConA Figure 44 : Reconnaissance de préparations de fibronectine plasmatique humaine fixées sur membrane par les lectines biotinylées. Les échantillons (250ng) de fibronectine issus de différents protocoles (hpfn : bleu ; H200 : turquoise ; Vuento : vert ; Le Coeur : orange et ConA : rouge) sont fixés sur membrane de nitrocellulose puis incubés en présence de lectines biotinylées (0.5µg/ml). Les complexes sont révélés avec un complexe avidine / phosphatase alcaline biotinylée (0.3µg/ml chaque). Après analyse densitométrique, la reconnaissance entre la lectine étudiée et les différentes fibronectine sont estimées.

110 ConA 110 PHA L PSA 0,25 PHA E LCA 0,15 GSL I 0,05 SNA PNA -0,05 WGA DBA swga SJA UEA Blot ELISA SBA RCA 120 Figure 45 : Reconnaissance de hpfn fixée sur membrane de nitrocellulose ou sur plaque de microtitration par les lectines biotinylées. Les échantillons (250ng) de fibronectine issue de notre protocole de purification (hpfn) ont été fixés sur membrane de nitrocellulose (ligne continue) ou sur plaque de microtitration 96 puits (ligne en pointillée) puis incubés en présence de lectines biotinylées (0.5µg/ml). Les complexes sont révélés par un complexe avidine / phosphatase alcaline biotinylée (0.3µg/ml chaque). Après analyse densitométrique, la reconnaissance entre la lectine étudiée et hpfn. Si cela confirme la non-dénaturation de hpfn par rapport aux lots de fibronectine préparés sans ou avec peu de chaotropes, cette expérience insiste sur l influence du polymère (sur lequel la protéine a été fixée) lors de la formation des complexes protéiques F60 Fixés sur membrane de PVDF, les cartes de glycosylations de hpfn et de F60 sont très similaires (cf. Figure 46). Si le fragment, au contraire de la molécule native, n est pas reconnu par l erythroagglugtinine de Phaesolus vulgaris, il porte des structures polyholosidiques accessibles et reconnues par les autres lectines reconnaissant la fibronectine. Les structures

111 111 portées par le fragment seraient donc représentatives de l ensemble des chaînes de glycosylations portées par la fibronectine. Figure 46 : Reconnaissance de hpfn et de F60 fixés sur membrane par les ConA PHA L 0,350 PSA PHA E 0,250 LCA 0,150 GSL I 0,050 SNA PNA -0,050 WGA DBA swga SJA UEA hpfn F60 SBA RCA 120 lectines biotinylées. Les échantillons (250ng) de fibronectine issue de notre protocole en trois étapes (hpfn, en bleu) et de fragment de 60kDa (F60, en mauve) ont été fixés sur membrane de nitrocellulose puis incubés en présence de lectines biotinylées (0.5µg/ml). Les complexes ont été révélés par un complexe avidine / phosphatase alcaline biotinylée (0.3µg/ml chaque). Après analyse densitométrique, la reconnaissance entre la lectine étudiée et les différentes fibronectine sont estimées. L ajout de βmsh (5% v/v) destiné à rompre les structures en kringle et en doigt-de-gant du F60 modifie la reconnaissance des protéines fixées sur membrane de nitrocellulose par les lectines en favorisant l exposition des glycosylations portés par la protéine (cf. Figure 47).

112 112 D une manière générale, l association entre la protéine et la lectine est facilitée. L erythroagglutinine de Phaesolus vulgaris reconnaît alors beaucoup plus facilement les structures bi-antennaires des polyholosides portés par la fibronectine et le F60. ConA PSA LCA SNA WGA swga UEA RCA120 SBA SJA DBA PNA GSL-1 PHA-E PHA-L A B KL A B Figure 47 : Augmentation de l association des lectines sur F60 après dénaturation. Les échantillons de fragment de 60kDa (F60, 250ng, 100ng et 50ng) ont été fixés sur membrane de nitrocellulose sous forme native (A) ou dénaturée par βmsh 5% v/v (B) puis incubés en présence de lectines biotinylées (0.5µg/ml). Les complexes ont été révélés par un complexe avidine / phosphatase alcaline biotinylée (0.3µg/ml chaque) Déglycosylation de hpfn et de F60 Afin d étudier le rôle des glycosylations dans les interactions entre la fibronectine ou son fragment de 60kDa et ses ligands, nous avons tente de déglycosyler ces protéines. L action de la glycopeptidase F (Peptido-N-Glycanase F ou PNG-F) entraîne l agglomération spontanée et irréversible de la fibronectine et du fragment F60. Le changement de conformation de la glycoprotéine et de son produit dérivé n est cependant pas dû à une déglycosylation totale car les fractions protéiques, séparées sur gel SDS-PAGE, sont toujours reconnues par les lectines végétales. La déglycosylation des protéines par la Glycopeptidase F (PNG-F) doit en effet être réalisée après incubation en conditions réductrices et dénaturantes (Higgins et Friedman, 1995) en présence de SDS, de Nonidet P-40 et à 100 C.

113 113 Une alternative repose sur la modification des structures polyholosidiques, soit par l hydrolyse enzymatique sélective des chaînes entre deux résidus, soit par la modification chimique ou enzymatique des résidus. Pour le fragment de 60kDa (F60), ceci suppose de réaliser préalablement le séquençage des structures polyholosidiques portées par celui-ci. Cette expérience permettra en plus de connaître précisément la séquence des chaînes portées par le fragment et de les comparer aux hypothèses faites pour l ensemble des structures de la fibronectine native et valider les différences observées entre F60 et hpfn par analyse de la formations des complexes lectines Mise en application Purification de la fibronectine L analyse des réponses obtenues avec notre gamme de lectines végétales pour l ensemble des protéines du plasma sanguin humain pourra permettre d optimiser l utilisation des lectines pour purifier la fibronectine puis ses fragments. La chromatographie d affinité à la concanavaline-a est une première application de la cartographie qualitative des résidus holosidiques de la fibronectine. Elle constitue une alternative à la réalisation d une chromatographie d affinité à la gélatine et donc à l utilisation de la gélatine et des chaotropes. Si la fibronectine obtenue est homogène sur SDS-PAGE, l analyse par zymographie de ces fractions révèlent la contamination de celles-ci par des gélatinases. Des premières purifications menées aux laboratoire, associant chromatographies d affinité à l héparine et utilisation de la concanavaline-a, permettent de purifier la fibronectine avec un rendement de 3.16 [mg hpfn]/[g de cryoprécipité] (cf. Figure 15). L utilisation de lectines végétales fixées sur des matrices permettrait également de purifier le F60. Les sites potentiels de glycosylation étant répartis sur le monomère de fibronectine, cette étape de purification devra être néanmoins complétée par une autre chromatographie. Un exemple d application est le protocole proposé par Zhu et Laine en Celui-ci est basé sur la combinaison d une chromatographie d affinité à la gélatine et d une chromatographie d affinité sur lectine de Lycopersicon tetragonolobus pour isoler les fragments portant le CBD à partir du placenta. Ceux-ci, issus de la fibronectine oncofoetale, possèdent spécifiquement

114 114 des chaînes polyholosidiques composée de N-acétyl-lactosamine non observés sur la fibronectine du plasma sanguin humain Analyse des interactions entre le collagène Type I et la fibronectine L analyse des interactions entre la fibronectine et le collagène n est pas rendue aisée par les propriétés physicochimiques et les propriétés de reconnaissance et d adhésion des deux protéines. L utilisation de la résonance de plasmon (BiaCore) est impossible en raison de l agrégation spontanée de la fibronectine et du collagène de type I. Si nous ne voulons pas modifier la structure des protéines, les seules alternatives proposées sont le marquage d une des protéines (à l 125 I ou à la digoxigénine) ou l utilisation de molécules reconnaissant spécifiquement un des éléments du complexe comme les anticorps. Cependant, la fibronectine et le collagène reconnaissent et/ou se lient non-spécifiquement aux immunoglobulines (la fibronectine possède une affinité pour la partie Fc). Grâce à l analyse de la reconnaissance du collagène de type I par les lectines se liant à la fibronectine, nous constatons que le collagène n est pas reconnu par la lectine de 120kDa extraite de Ricinus communis (RCA 120 ) (cf. Figure 48). L utilisation de cette lectine peut permettre d étudier les conditions de dissociation des complexes fibronectine-collagène type I. L'analyse se fait après la formation des complexes collagène type I / fibronectine dans des cupules de microtitration où le collagène a été fixé. Après une étape de décomplexation (en présence de l'élément susceptible de dissocier le complexe) et différents rinçages, la fibronectine restant dans la cupule est titrée avec le RCA 120.

115 115 A ConA LCA PSA SNA RCA 120 SJA B Figure 48 : Comparaison de la réponse aux lectines biotinylées entre hpfn et Coll-I. Les échantillons de fibronectine hautement purifiée (hpfn, A) et de collagène de type I (B) purifié à partir de tendons de rat ont été fixés sur membrane de nitrocellulose (250ng, 100ng et 60ng) puis incubés en présence de lectines biotinylées (0.5µg/ml). Les complexes sont révélés par un complexe avidine / phosphatase alcaline biotinylée (0.3µg/ml chaque). La dissociation est observée en présence des différents chaotropes testés (urée 4M, imidazole 0.5M, arginine 1M, histidine 0.2M, spermidine 0.1M, cf. Figure 49). En présence de sels, le complexe reste stable en présence de NaCl 1M ou de CaCl 2 400mM mais se rompt en présence de NaBr 1M. Enfin, le complexe reste stable en présence de Tween % (p/v) ou de Tween % (p/v) NaCl 1M. Les résultats obtenus avec le CaCl 2 convergent avec l hypothèse de la transformation, en moins en partie, de l étape de chromatographie d affinité à la gélatine en chromatographie d affinité à la fibronectine.

116 absorbance 420nm (UDO) NaCl 1M NaBr 1M Imidazole 0.5M Urée 4M Spermidine 0.1M Arginine 1M Histidine 0.2M CaCl2 400mM NaCl NaBr Imidazole Urée Spermidine Arginine Histidine CaCl 2 1M 1M 0.5M 4M 0.1M 1M 0.2M 400mM Figure 49 : Etude de la dissociation du complexe FN / Coll-I Les échantillons (100ng/puits) de collagène de type 1 (Coll-1) purifié à partir de tendons de rat sont fixés sur plaque de microtitration puis incubés en présence de fibronectine hautement purifiée (250ng/puits) puis de lectine de 120kDa biotinylée extraites de Ricinus communis (RCA-120, 0.5µg/ml). Les complexes sont révélés par un complexe avidine / phosphatase alcaline biotinylée (0.3µg/ml chaque). Après analyse densitométrique, les résultats présentent l activité phosphatase alcaline après dissociation des complexes fibronectine collagène type 1 en présence de sels et de chaotropes par rapport aux témoins positifs et négatifs

117 117 5 CONCLUSION Par chromatographies d affinités à la gélatine et à l héparine, nous avons purifié avec un fort rendement une fibronectine homogène sur gel SDS-PAGE. L utilisation d anticorps polyclonaux dirigés contre le fibrinogène humain et le facteur von Willebrand humain ne révèle aucun de ces contaminants dans les fractions purifiées. De plus, aucune activité protéolytique ne peut être détectée dans la fraction purifiée par zymographie ou après incubation 456h à 37 C en présence d activateurs de protéases. La spectrophotométrie UV et la spectrofluorométrie ne permettent pas de distinguer de différence entre la fibronectine purifiée par notre protocole en trois étapes de celles obtenues chaotropes. La cartographie qualitative par les lectines végétales ne permet pas non plus de distinguer les différentes fractions de fibronectine. Cette absence de différence conformationelle - et donc la non-dénaturation - de la fibronectine purifiée par notre protocole a été depuis observée grâce à des expériences de diffraction de lumière et de diffraction de neutrons. Enfin, la fibronectine purifiée par notre protocole en trois étapes possède des caractéristiques physiologiques vérifiées par des tests d adhérence cellulaires - identiques aux autres préparations de fibronectine. A partir de cryoprécipité de plasma sanguin humain, le rendement obtenu est de / SD [mg hpfn]/[g de cryoprécipité]. Notre protocole permet également de purifier la fibronectine à partir de plasma sanguin humain citraté avec un rendement de 0.16 [mg hpfn] / [ml plasma frais citraté]. Comme nous l avons souhaiter lors de l élaboration de cette méthode de purification, la fibronectine purifiée par notre protocole en trois étapes (hpfn) est donc pure, stable dans le temps, et possède des caractéristiques physico-chimiques et physiologiques identiques aux autres préparations de fibronectine ayant un plus faible rendement. A partir de cette source de fibronectine, nous avons purifié et caractérisé le fragment d affinité pour le collagène de 60kDa (F60) comportant les domaines I 6 II 1-2 I 7-9 III 1-2. Ce fragment est obtenu dans des fractions homogènes sur gel SDS-PAGE et sur immunorévélation utilisant des anticorps polyclonaux dirigés contre hpfn. L incubation d aliquotes de F60 en milieu

118 118 stérile jusqu à 144h à 37 C en présence d activateurs de protéases ne permet pas de révéler la co-purification d éléments porteurs d une activité protéolytique. L utilisation des lectines végétales a permis de réaliser une cartographie qualitative des structures glycosylées portées par la fibronectine et par le F60 et pouvant intervenir dans les interactions entre la glycoprotéine et ses ligands. Les résultats obtenus concordent avec le séquençage total réalisé antérieurement par des méthodes chimiques à partir de fibronectine de plasma sanguin bovin. Nos résultats permettent de définir plus précisément l accessibilité des résidus et des structures polyholosidiques par les lectines et montrent que s il existe des isoformes peptidiques de la fibronectine plasmatique il existe aussi des isoformes de glycosylation. Les résultats obtenus entre hpfn et F60 sont très similaires. Le fragment porte les structures polyholosidiques accessibles et reconnues par la quasi-totalité des lectines reconnaissant la fibronectine. Ces structures seraient donc globalement représentatives de l ensemble des chaînes de glycosylations portées par la fibronectine. La cartographie qualitative des glycosylations a permis la mise au point d un protocole d analyse des interactions entre la fibronectine et le collagène de type I. La dissociation de ce complexe est observée en présence de chaotropes. En présence de sels, les résultats obtenus avec le CaCl 2 convergent avec l hypothèse de la transformation, en moins en partie, de l étape de chromatographie d affinité à la gélatine en chromatographie d affinité à la fibronectine. Pour continuer l exploration de l action des ions divalents et notamment du zinc sur les interactions fibronectine fibronectine et fibronectine collagène, deux études sont en cours au laboratoire : la première consiste à étudier les interactions fibronectine fibronectine soit à partir de la glycoprotéine fixée sur matrice ou sur polymère, soit en milieu liquide ou en gel. La deuxième prolonge les expériences présentées ici et utilise les lectines végétales issues de Ricinus communis pour continuer d étudier l interaction entre la fibronectine et le collagène de type I. Nous avons tenté de déglycosyler hpfn et le F60 afin d étudier la participation des glycosylations de la fibronectine lors des interactions de la protéine avec ses ligands. Cependant, les différentes tentatives de déglycosylation enzymatiques de hpfn ou de F60

119 119 dans des conditions non-dénaturantes ont échoué. Une alternative repose sur la modification de ces structures polyholosidiques, soit par l hydrolyse enzymatique sélective des chaînes entre deux résidus accessibles, soit par la modification chimique ou enzymatique des résidus. Pour le F60, ceci suppose de réaliser préalablement le séquençage chimique des structures polyholosidiques portées par celui-ci. Cette expérience permettra en plus de connaître précisément la séquence des chaînes portées par le fragment et de les comparer aux hypothèses faites pour l ensemble des structures de la fibronectine native. De plus, elle permettra de valider les différences mineures observées entre F60 et hpfn lors de l analyse de la formations des complexes lectines-glycoprotéine. L utilisation des anticorps polyclonaux et des lectines végétales a démontré la variabilité des résultats observés en fonction des substrats utilisés pour la fixation des protéines. Ceci peut être expliqué par les modifications d accessibilité induites par la fixation fragment sur les différents supports. Nous pouvons supposer en effet que la liaison entre hpfn (ou le F60) et le polymère de la plaque de microtitration cache certaines structures ou favorise l exposition (et donc l accessibilité) d autres domaines en fonction du support. Ces résultats doivent constituer une mise en garde quant aux conditions expérimentales des futures études sur la fibronectine et ses fragments et en particulier lors des études des interactions entre la protéine et ses ligands. La chromatographie d affinité à la concanavaline-a est une première application de la cartographie qualitative des résidus holosidiques de la fibronectine. Elle constitue une alternative à la chromatographie d affinité à la gélatine et donc à l utilisation de l urée. Des premières purifications menées au laboratoire permettent d envisager la proposition d un nouveau protocole de purification de la fibronectine ou de ses dérivés. Un exemple d application est une purification basée sur la combinaison d une chromatographie d affinité à la gélatine et d une chromatographie d affinité sur lectine de Lycopersicon tetragonolobus pour isoler les fragments portant le CBD à partir du placenta. Ceux-ci, issus de la fibronectine oncofoetale, possèdent spécifiquement des chaînes polyholosidiques composée de N-acétyl-lactosamine non observés sur la fibronectine du plasma sanguin humain.

120 120 La réalisation des cartographies qualitatives des différentes fibronectines (plasmatiques, tissulaires, cellulaires, ) permettra de séparer les fibronectines ou leurs fragments de même séquence protéique issus d une population hétérogène de fibronectines, obtenue par culture cellulaire ou par dissection.

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138 138 Caractérisation de la fibronectine du plasma sanguin humain et de son fragment de 60kDa : purification, stabilité et analyse qualitative des glycosylations. La combinaison de trois étapes de chromatographie d affinité sur gélatine et sur héparine permet de purifier d importantes quantités de fibronectine à partir de cryoprécipité de plasma sanguin humain ou de plasma citraté. Les rendements obtenus sont de / milligrammes de fibronectine par gramme de cryoprécipité et de 0.16 milligramme de fibronectine par millilitre de plasma. En optimisant les conditions d élution, nous obtenons des fractions homogènes sur gels SDS-PAGE. L utilisation de sera polyclonaux en immunorévélation montre que notre fraction est homogène et qu elle n est contaminée ni par le fibrinogène ni par le facteur von Willebrand. Aucune activité protéolytique ne peut être détectée par zymographie sur gélatine ou après incubation jusqu à 456 heures à 37 C en présence de calcium, de zinc et de mercure. Les caractéristiques physicochimiques et physiologiques de la fibronectine purifiée par notre protocole en trois étapes, appelée highly purified fibronectin (hpfn), sont identiques aux préparations issues d autres protocoles. Nous pouvons purifier, avec une grande pureté, un fragment de 60kDa (F60) comportant les domaines de liaison aux collagènes (CBD) après hydrolyse de la fibronectine par la trypsine. Les cartographies qualitatives des glycosylations de la fibronectine et du fragment ont été réalisées grâce à des lectines végétales. Ces travaux permettent de proposer de nouvelles méthodes de purification ou d analyse des interactions entre la protéine et ses ligands. Les résultats obtenus par cette caractérisation et nos protocoles de purification permettent d envisager l étude des interactions cellulaires et moléculaires faisant intervenir la fibronectine et ses fragments. Nous proposons d ores et déjà un protocole original d étude des interactions entre la fibronectine et le collagène de type I basé sur l utilisation des lectines végétales. Characterization of human blood plasma fibronectin and its 60kDa fragment : purification, stability and glycosylation dynamic analysis Large amounts of soluble fibronectin were purified from cryoprecipitated or fresh citrated human blood plasma by a three-step combination of gelatin and heparin-cellufine affinities chromatography. The yield obtained was / mg of fibronectin per gram of cryopecipitated plasma. By optimizing the elution conditions, we obtained a homogeneous fraction on SDS-PAGE and Western blot. Neither fibrinogen or von Willebrand factor may be detected by western-blot. No proteolytic activities were detected by zymography on gelatin. Furthermore, the fibronectin preparation was stable over time up to 456 hours at 37 C in the presence of either calcium, zinc or mercury. Physical and physiological conformations of fibronectin prepared by this three-step protocol are identical with fibronectins purified with other available protocols. From this preparation of very stable fibronectin, called high purified fibronectin (hpfn), we purified after trypsin-hydrolysis a 60kDa fragment (F60) containing the Collagen Binding Domain (CBD). Glycosylations of native protein and fragment were analysed by dynamic mapping and give possible ways to purify and study interactions between fibronectin compounds and theirs ligands. These purified and stable preparations may be useful for cellular tests or interaction analysis. In this latter aim, we have begun study interactions between fibronectin and type I collagen by an original lectinbased protocol. Discipline : Biochimie cellulaire Mots-clefs : fibronectine (FN), purification, stabilité, chromatographie, caractérisation, glycosylation, interaction. E.R.R.M.E.Ce Université de Cergy-Pontoise U.F.R. des Sciences et Techniques. 2 av Adolphe Chauvin Pontoise CERGY-PONTOISE cedex