Intérêts, Exigences et Difficultés de la Toxicologie Analytique
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- Jean-Baptiste Joseph
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1 Intérêts, Exigences et Difficultés de la Toxicologie Analytique Hélène Eysseric CHU Grenoble Alain Turcant CHU Angers Congrès annuel de la Société Française de Toxicologie Toxicologie de la pharmacodépendance aux médicaments et aux drogues Paris, 23 et 24 octobre 26
2 Ex de Cas Cliniques Cas n 1 : H, préparateur en pharmacie convulsions après prise de tramadol hypersensibilité, banale intox aiguë? Cas n 2 : plusieurs cas de décès ML : méthadone +. imputabilité variable selon sujets (naïfs, usagers chroniques, en sevrage) => étude des cheveux?
3 Quelles explications, quelles solutions? Cas n 3 : Enfant 3 ans, Somnolence, dépistage urinaire positif en cannabis et opiacés! origine? Cas n 4 : Enfant 32 mois, Somnolence, [oxazépam] Plasma = 45 mg/l!! (2 à 5 x conc mais bonne tolérance => exposition chronique? conc.thérap.)
4 Intérêts de la Toxicologie Analytique Selon le contexte, Selon l histoire du patient, 4 types d aide potentielle 1. évaluation du degré de pharmacodépendance 2. suivi traitements de substitution 3. suivi sevrage 4. scientifique
5 1. Aide à l évaluation du degré de Pharmacodépendance Confirmation biologique d une conduite toxicophile (abus) Toxicologie clinique Toxicologie médico-légale Toxicologie épidémiologique Toxicologie professionnelle
6 Toxicologie Clinique Hospitalisation lors d une intoxication aiguë, Prise en charge médicale, Cas n 1 : H, 29 ans, préparateur pharmacie 1cp Contramal LP2 puis 6 cps Topalgic à 5 en 6h pour lombalgies Convulsions ; Rivotril 1mg OK Analyses Toxicologiques pour confirmer niveau d exposition
7 Tramadol et Abus (Dossier CAP Angers, 4/26) Analyse toxicologique type screening chromatographique : (LC/DAD) [tramadol] Plasma : 3,5 mg/l mau DAD1 A, Sig=23,4 Ref=55,1 (AVR6\44-29.D) T EI 6 toxique > 1 mg/l potentiellement létale > 2 mg/l min *DAD1, (122 mau,apx) Ref=5.837 of D *TRAMADOL Norm mois avant : crise convulsive origine? Aveu ultérieur d abus => Prise en charge pour sevrage nm
8 Toxicologie Professionnelle Analyse des causes d un accident du travail (sang) Suivi médical d un salarié (urines, cheveux) - évaluation aptitude à un poste à risques, - cas des patients toxicomanes
9 Toxicologie Médico-Légale Recherches des causes de la mort enquète DRAMES Conduite automobile après usage de substances psycho-actives (Loi SR 23) Infraction à la législation des stupéfiants (contrôle judiciaire, analyse de saisies, ) Soumission chimique : une autre forme de «pharmaco-dépendance»?
10 Toxicologie Epidémiologique Mise en évidence de nouveaux usages chez les jeunes adultes, chez les sportifs, 4/24 : 2 lycéens internes Notion toxicomanie Urgences : hallucinations visuelles, mydriase, agitation cannabis ou autre substance?
11 Intoxication au Datura stramonium (thèse M.Tollet Angers 26) Alcaloïdes tropaniques responsables de la toxicité : atropine, scopolamine Interrogatoire (souvent limité du fait des hallucinations) Examen clinique ++ Syndrome anticholinergique Recherche urinaire d atropine et de scopolamine (GC/MS) Voire dans les cheveux (LC/MS/MS) (Kintz et al. JAT 26) de 2 à 24 : 69 Intoxications (CAP Angers) Augmentation progressive des appels (5 en 2, 23 en 24)
12 Intérêts de la Toxicologie Analytique Selon le contexte, Selon l histoire du patient, 4 types d aide potentielle 1. évaluation du degré de pharmacodépendance 2. suivi traitements de substitution 3. suivi sevrage 4. scientifique
13 2. Aide au suivi des traitements de substitution Contrôle biologique d observance ex : législation méthadone Surveillance de rechutes Mise en évidence d émergence d autres toxicomanies ex : cocaïne en hausse chez les patients substitués à la méthadone?
14 3. Aide au suivi des sevrages Stupéfiants Médicaments Tabac Alcool
15 Ex de suivi urinaire : sevrage à la buprénorphine Patient 1 : en sevrage Patient 2 : en rechute U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U8 U9 U1 U11 U1 U2 U3 U4 U5 U6 U7 U8 U9 U1 U11 Bup (ng/ml) Bup (ng/ml) Nor Bup (ng/ml) Nor Bup (ng/ml)
16 Marqueurs biologiques du tabac CO air expiré < 8ppm abstinence Cotinine et Hydroxycotinine urine (tests IC, LC/UV) < 5 µg/l abstinence Tabagisme passif < 15 µg/l Nicotine, Cotinine et Hydroxycotinine plasma, salive (LC/MS/MS) Distinction : fumeur léger/important (ratio OH-COT/COT) Suivi cinétique des patients sous patch
17 Indirects Marqueurs biologiques de l alcool enzymes (γgt,, ASAT, ALAT), VGM transferrine déficiente en hydrates de carbone (CDT) transferrine désialylée (SDT) Directs esters éthyliques d acides gras (FAEE) : cheveux (GC/MS) éthyl glucuronide (sang), urine, cheveux (LC/MS/MS) marqueur alcoolisation récente (U,(, 3j), chronique (C)( distinction consommateurs occasionnels, réguliers, importants corrélation avec quantité consommée : > 3g/j > 4pg/mg de cheveux
18 4. Intérêts Scientifiques : toxicocinétique Ex d élimination urinaire de méthadone et EDDP chez le nouveau-né né de mère traitée J1 J3 J5 J7 J9 J11 J13 J15 J17 J19 Méthadone (ng / mg de créatinine) EDDP (ng / mg de créatinine)
19 4. Intérêts Scientifiques : toxicodynamie Cas n 2 : Augmentation du nombre de décès avec une faible concentration sanguine de méthadone interprétation? Intérêt de l analyse des cheveux (information sur l exposition chronique) pour l évaluation de l état de tolérance pharmaco-dynamique? Sachant qu une concentration sanguine est toxique dès 2 µg/l chez sujet naïf dès 75 µg/l chez usager chronique
20 Diagnostic de décès toxique impliquant la méthadone Pour 3 parmi 6 cas de décès médico-légaux, l analyse des cheveux a apporté une aide à l interprétation : Méthadone capillaire Segment récent/passé +/+ Consommateur chronique -/- +/- Consommateur récent Sujet naïf [méthadone] sang en µg/l interprétation thérapeutique toxique toxique Communications journées pharmacodépendances Biarritz 25, congrès annuel SFTA 26
21 Exigences de la Toxicologie Analytique Mise en œuvre de moyens techniques pour l isolement isolement, l identification et le dosage d un xénobiotique à partir d une matrice (le plus souvent biologique ) ce n est pas que la nature d un produit qui détermine sa toxicité mais bien aussi sa concentration! qualité des prélèvements + qualité des techniques et contrôles qualité
22 Qualité du Prélèvement - le choix du bon milieu biologique => Contexte + Délai entre exposition et prélèvement (Cinétique d élimination) - une bonne conservation => Moyens Techniques (chambre froide, congélateurs)
23 Analyses Toxicologiques Prélèvements selon Contexte Sécurité routière Infraction législation des stupéfiants Hospitalisation : anamnèse toxique? dépistage : urine, (salive) dosage : sang, air expiré restitution permis : cheveux usage : urine, (sueur) injonction thérapeutique : urine, cheveux sang, urine Soumission chimique Selon le délai : sang, urine ou cheveux
24 Analyses Toxicologiques Matrices selon Cinétique Sang, salive : quelques heures Urines : quelques jours Cheveux : des semaines, des mois
25 Généralités sur les Cheveux Passé Pointe Présent Scalp Racine Pousse d environ 1 cm/mois ( cm) «Mémoire» de l exposition à des toxiques
26 Analyses Toxicologiques Intérêt des Cheveux Consommateur régulier Consommateur en sevrage
27 Quelles Techniques Analytiques? 1ère étape qualitative recherche large (screening) 2ème étape quantitative Pas une mais un ensemble de méthodes avec avantages /inconvénients : rapidité sensibilité, spécificité coût reproductibilité, précision Méthodes immunochimiques Méthodes chromatographiques
28 Méthodes Immunochimiques Qualitatives Objectif : identifier une Classe de médicaments ou stupéfiants, donc plusieurs molécules d une même famille - Choix d un d Anticorps pour une Famille Chimique - Résultat Qualitatif : Positif ou Négatif voire Semi-quantitatif - Interprétation tation parfois délicate d : Seuil de Positivité # Seuil de Détection Affinité variable des différentes molécules de cette famille vis à vis de l Anticorps : Faux Négatifs Réactions Croisées (parenté structurale) : Faux Positifs
29 Tests rapides IC et Cannabis Cas n 3 : Enfant 3 ans, somnolent : médicaments mère? Dépistage urinaire opiacés et cannabis : + FPIA cannabis négatif CLHP/SM/SM cannabis : négatif opiacés : pholcodine CLHP/DAD chlorphéniramine, ac. niflumique Après enquête : Nifluril suppo Autre prise : Hexapneumine? Ac. niflumique 5 mg/l FPIA cannabis : négatif IC : positif
30 Méthodes Immunochimiques Spécificité des Tests selon famille chimique Benzo. Opiacés Cocaïne pas de Faux-Positifs (FP) mais Faux-Négatifs (FN) (bromazépam, BDZ faiblement dosées) pas de FP ; FN (si < seuil) buprénorphine non dosée opioïdes non dosés(méth., DPX, fentanyl, tramadol ) pas de FP ; FN (si < seuil) Cannabis pas de FP (sauf ac. niflumique en tests solides) ; FN (si < seuil) Amphét. FP (anorexigènes ; benfluorex, heptaminol, ofloxacine) FN (dérivés ecstasy ; amphét. exotiques)
31 Méthodes Chromatographiques Approche Qualitative et Quantitative Objectif : identifier formellement et quantifier une ou plusieurs substances médicamenteuses, stupéfiantes, Recherche en aveugle : screening (LC/DAD, GC/MS, LC/MS, LC/MS/MS) Recherche/dosage ciblé : (LC/DAD, GC/MS mode SIM, GC/MS/MS, LC/MS/MS) Spécificité optimale recherchée
32 Séparation Chromatographique (GC ou LC) CPG CLHP Elution = f (Température) Elution = f (Solvants) Inj Gaz (N2, He) Tr Tr 1 Four 5-3 C Ech. Injecteur C O L O N N E Ech. Injecteur C O L O N N E Four 2-5 C Inj Pompe Tr Tr 1 S o l v a n t s Signal Détecteur Détecteur Signal
33 couplée à une Détection Barrette de Diodes (LC/DAD) ex du sang d un patient : 1 pics Mélange 8 BDZ + 2 métabolites mau DAD1 A, Sig=23,1 Ref=55,1 (212A3A.D) Norm *DAD1, 6.95 (15 mau,dn1) Ref=5.51 of 212 *BROMAZEPAM Norm *DAD1, (13.1 mau,up2) Ref=5.51 of 21 *NITRAZEPAM 1 Norm *DAD1, (39.9 mau,up2) Ref=5.51 of *LORAZEPAM Norm *DAD1, (9.5 mau,dn1) Ref=5.51 of *ALPRAZOLAM 4 3 Norm *DAD1, 1.13 (4.3 mau,apx) Ref=1.21 of 21 1 *FLUNITRAZEPAM Norm nm 2 *DAD1, (18 mau,apx) Ref=1.21 of *NDM DIAZEPAM Norm nm *DAD1, (387 mau,apx) Ref=1.21 of *CLOBAZAM Norm nm *DAD1, (11.1 mau,apx) Ref=1.21 of *LORMETAZEPAM Norm nm nm nm nm nm Area: *DAD1, 9.64 (23.6 mau,up2) Ref=5.51 of 21 *NDM CLOBAZAM nm min
34 GC couplée à une détection par Spectrométrie de Masse (GC/MS) ex d une urine hydrolysée - Datura Abundance TIC: 152.D 9.44 N CH A N CH 3 35 CH 2 OH O CH C O Atropine A met A-H 2 O 8.73 S-H 2 O S 1.2 O CH 2 OH O CH C O Scopolamine Abundance Abundance m/z--> Abundance Time--> Scan 621 (9.436 min): 151.D (-) m/z--> Abundance 42 Scan 678 (1.2 min): 152.D (-) m/z--> #167: ATROPINE m/z--> #17: SCOPOLAMINE
35 LC couplée à une détection par Spectrométrie de Masse (LC/MS (n) Mode Simple MS Identification : General Unknow Screening (GUS) bibliothèque (Humbert et al.) Quantification : Selective Ion Monitoring (SIM) (n) ) Mode Tandem MS/MS Identification : Enhanced Product Ion scan (EPI) bibliothèque (Sauvage et al. Clin. Chem. 26) Quantification : Multiple Reaction Monitoring (MRM)
36 Spectrométrie de MASSE Multiple Reaction Monitoring (MRM) : transition Sélectivité détection - quantification Sélection ion parent Fragmentation Sélection ion fils M 1 H+ M 2 H+ I 1 + M 3 H+ M 4 H+ M 5 H+ M 6 H+ M 3 H+ I 2 + I 2 + I 3 + Q1 fixe Q2 Q3 fixe
37 Cas n 4, enfant intox oxazépam : 45 mg/l bonne tolérance => exposition chronique? Analyse capillaire de 5 segments (LC/MS/MS) bl cheveux uplc souchi % % % % % % Quattro Premier VAA Mar-26-14:56:34 1: MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e Zolpidem Time Blanc S5 4cm S4 2cm S3 2cm S2 1cm S1 1,5cm racine bl cheveux uplc souchi % % % % % % Oxazépam Quattro Premier VAA Mar-26-14:56:34 2: MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e uplc souchi : MRM of 12 Channels ES > e Time
38 Notion de seuil de détection Pour chaque couple substance/méthode 1 seuil de détection Ex du bromazépam technique Immunochimie 3 CLHP/DAD 3 CLHP/SM 3 CLHM/SM/SM.3 seuil moyen en µg/l
39 Difficultés du Biologiste Toxicologue 1 Se procurer les produits de référence et les métabolites Les industriels doivent nous aider! Collaboration avec des chimistes Recueillir le maximum de données cliniques initiales pour le meilleur prélèvement et la meilleure stratégie analytique Collaboration clinico-biologique essentielle
40 Difficultés du Biologiste Toxicologue 2 Connaître les limites des méthodologies utilisées Favoriser le travail en réseau de laboratoires S évaluer grâce à des contrôles de qualité externes et progresser Evoluer vers des Technologies de plus en plus sophistiquées
41 Difficultés du Biologiste Toxicologue 3 Interpréter la concentration en tenant compte des données - toxicocinétiques - et toxicodynamiques de la substance identifiée et par exemple Comment distinguer la limite entre un usage thérapeutique justifié et un usage toxicophile d un médicament psychotrope?
42 Conclusion Toxicologie Clinique Toxicologie Professionnelle Toxicologie Fondamentale Toxicologie Analytique Toxicologie Médico-légale Pharmacovigilance (CRPV, CEIP) Toxicologie Epidémiologique Toxicovigilance (CAP)
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