LA RESPIRATION DES MITOCHONDRIES ISOLEES

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1 LA RESPIRATION DES MITOCHONDRIES ISOLEES Fiche sujet - élève On cherche à déterminer quel(s) substrat(s) est (ou sont) utilisé(s) par la respiration mitochondriale. Matériel : 00g de carottes ou navets coupés en petits morceaux, 1 mixer, petits béchers, 1 entonnoir, papier absorbant, compresses de gaze, 1 centrifugeuse et tubes à centrifugation, solution de glucose, solution de succinate de sodium (produit dérivé de l'acide pyruvique), eau à 0 C, seringues de 1mL avec aiguille coudée et cathéter, 1 seringue de 10mL, une pipette de 10 ml graduée, une pro-pipette, un tube à essais, une chaîne de mesure ExAO avec sonde oxymétrique étalonnée, enceinte, logiciel d'acquisition, imprimante. Activités et déroulement des activités Capacités et principaux critères d'évaluation Barème 1. Justifier l utilisation d une sonde à dioxygène et le choix du glucose comme substrat dans le protocole. (Répondre à la question 1 pendant les temps d'attente, après avoir pris connaissance du sujet).. Réaliser une suspension de mitochondries en suivant les indications qui figurent sur la fiche technique. Appeler l examinateur pour obtenir une suspension préparée 3. Réaliser le montage en suivant les consignes de la fiche technique. Appeler l examinateur pour faire contrôler le montage. Démarrer la mesure de la concentration en dioxygène dans la suspension de mitochondries en respectant les conditions indiquées dans le protocole fourni. 5. Ajuster l affichage de façon optimale. Appeler l'examinateur pour vérification, puis imprimer (obtenir un résultat de secours en cas de besoin) 6. Titrer et légender le graphe obtenu ou le document de secours. Indiquer nom et prénom. 7. Déterminer le substrat utilisé par les mitochondries pour la respiration. Justifier la réponse. Adopter une démarche explicative Réaliser une manipulation d après un protocole Réaliser une manipulation d après un protocole Utiliser une chaîne EXAO utilisation maîtrisée des fonctionnalités du logiciel Utiliser des modes de représentation des sciences expérimentales adaptation de l échelle des axes aux phénomènes Adopter une démarche explicative 3 5

2 LA RESPIRATION DES MITOCHONDRIES ISOLEES. Fiche technique élève 1/ OBTENTION DE MITOCHONDRIES A PARTIR DE CELLULES VEGETALES Mixer dans 160 cm 3 de tampon phosphate des morceaux de carottes ou navets. Filtrer le jus sur une compresse. Lancer la centrifugation à 3000 tours pour 10 minutes. Appeler l'examinateur pour obtenir un tube contenant le résultat d une centrifugation Récupérer après les 10 minutes le surnageant avec une seringue. Il contient la suspension de mitochondries (NB : celle-ci ne sera pas utilisée pour la manipulation). REALISATION DU MONTAGE EXAO Placer de l eau à 0 C autour de l enceinte. Introduire la suspension de mitochondries (obtenue auprès de l examinateur) bien oxygénée. Fermer l enceinte. Lancer l agitation. Mettre la sonde en place. PREPARATION PREALABLE Préparer les seringues d injection des différents produits. Appeler l'examinateur pour faire contrôler le montage MESURE DE LA CONSOMMATION DE DIOXYGENE DE LA SUSPENSION DE MITOCHONDRIES Paramétrer le logiciel et lancer la mesure pour une durée de 6 minutes. A t = 1 mn, injecter 0, ml de la solution de glucose à 50 g.l -1 dans l'enceinte. A t = mn 30, injecter 0, ml de la solution de pyruvate (ou équivalent). A la fin de la manipulation sauvegarder et imprimer les résultats. Ranger le poste de travail.

3 Fiche technique élève / Préparation de l'enceinte L'enceinte doit être remplie de suspension, fermé et sans bulle d air. L agitation est lancée à vitesse modérée. Capteurs la sonde à dioxygène doit : - être présente - plonger dans la suspension A vérifier avant de lancer l acquisition Conditions de mesures Paramètres imposés : - temps de mesure - indication graphique des conditions expérimentales et de leurs variations Présentation des résultats - adaptation des échelles des axes aux phénomènes

4 LA RESPIRATION DES MITOCHONDRIES ISOLEES Fiche réponse élève ETABLISSEMENT : Classe : Nom : Prénom : A rendre à l issue de l épreuve

5 Fiche Document de secours LA RESPIRATION DES MITOCHONDRIES ISOLEES. Résultat obtenu en respectant le protocole de la fiche technique. NOM : Prénom : Document à titrer et légender et à rendre avec la fiche réponse élève

6 LA RESPIRATION DES MITOCHONDRIES ISOLEES. Capacités et exigences évaluées (en gras, évaluation pendant la séance) Fiche barème d évaluation Nom des candidats 1. Justifier l utilisation de la sonde à dioxygène et du glucose dans le protocole. 3. Réaliser une manipulation d après un protocole - respect des différentes étapes du protocole : mixage, filtration, centrifugation - prélèvement du surnageant après centrifugation 3. Respect des différentes étapes du protocole de montage de la chaîne ExAO - remplissage du réacteur - absence de bulle d air - mise en fonction de l'agitateur - mise en place de la sonde. Utiliser une chaîne ExAO - Injection du glucose et du succinate - Gestion maîtrisée des fonctionnalités du logiciel - Paillasse bien organisée et matériel rangé en fin de manipulation Utiliser des modes de représentation des sciences expérimentales - adaptation de l'échelle des axes aux phénomènes pour obtenir la représentation graphique la plus lisible - utilisation de la fonction d impression - titre (la formulation y = f(x) est attendue) et légende ( moment de l'injection du glucose, moment de l'injection du succinate) 6. Adopter une démarche explicative - Les mitochondries isolées consomment du dioxygène lorsqu on leur fournit du succinate mais ne consomment pas de dioxygène lorsqu on leur fournit du glucose. - La respiration mitochondriale peut utiliser comme substrat le succinate et non le glucose. Barème Note /0 Fiche de Laboratoire 1/

7 LA RESPIRATION DES MITOCHONDRIES ISOLEES Matériel par poste: - 00 g de carottes ou navets coupés en petits morceaux, - 1 mixer, petits béchers, - 1 entonnoir, compresses de gaze, - 1 centrifugeuse et tubes à centrifugation, - 10 ml de suspension de mitochondries isolées conservée au froid (voir ci-dessous), - solution succinate de sodium à 00 mmol.l -1 à ph = 7,, - solution de glucose à 50 g.l -1 dilué dans la solution tampon - eau à 0 C, - seringues de 1mL avec aiguille coudée et cathéter, - 1 seringue de 10 ml, - une pipette de 10 ml graduée, une pro-pipette, un tube à essais, - une chaîne de mesure ExAO avec sonde oxymétrique étalonnée, enceinte, logiciel d'acquisition - imprimante. Remarque : des différences existant entre les dispositifs et logiciels des divers constructeurs, il est peut-être nécessaire d'adapter la fiche protocole au matériel disponible au laboratoire. Il est rappelé que toute modification doit recevoir l accord de l IA-IPR. A vérifier: - le bon fonctionnement du PC, - étalonnage de la sonde oxymétrique, - l'état de la paillasse entre chaque candidat. Obtention de mitochondries de cellules végétales Tampon d extraction : - préparer une solution de phosphate monopotassique à 9.08 g KH PO par litre, - préparer une solution de phosphate disodique à 9.7 g Na HPO par litre, - mélanger 3 ml de la solution de phosphate disodique et 78mL de la solution de phosphate monopotassique pour obtenir 00 ml de solution tampon à ph = 7., Protocole d'extraction des mitochondries : - Eplucher 00 g de carottes ou navets puis les couper en morceaux. - Mixer dans 160 cm 3 de tampon d'extraction. - Filtrer le jus sur une compresse et le centrifuger à 3000 tours par minute pendant 10 minutes. - Récupérer le surnageant avec une seringue. Il contient la suspension de mitochondries (le jus peut-être préparé la veille et conservé au froid avant centrifugation). Protocole d obtention du succinate ph = 7. Si on dispose de succinate de sodium, faire simplement une solution à 0 g.l -1 ; contrôler le ph et l'amener éventuellement à 7.. Si on dispose d'acide succinique : - faire 10 ml de solution à une concentration de 00 mmol.l -1 (acide succinique C H 6 O, PM = 118g), - amener à ph = 7. avec de la soude à 30%, en contrôlant au phmètre.