Premières Expériences Diagnostiques sur Séquenceur Roche GS Junior

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1 Premières Expériences Diagnostiques sur Séquenceur Roche GS Junior Tonio Lovecchio Institut de Prestations Communes. Plateforme de Prestations Communes de Biologie Moléculaire. Centre de Biologie Pathologie. CHRU de Lille. Cancéropôle Nord-Ouest Deauville 16 décembre 2011

2 Premières Expériences Diagnostiques sur Séquenceur Roche GS Junior Enjeux de l intégration Principe du GS Junior Roche Les Projets en cours de développement Conclusions

3 Enjeux de l intégration Le Centre de Biologie Pathologie de Lille : regrouper les thématiques pour partager les ressources technologiques. Maladies Rares (hors cancer) -Retard mental (Dr. J.Andrieux) -Syndromes malformatifs d origine génétique (Dr. F.Escande) -Maladies hémorragiques familiales (Dr. C. Zawadski) -Maladies héréditaires du métabolisme lipidique (Dr. P. Benlian) -Maladies neurosensorielles héréditaires (Dr. C.M. Dhaenens, Pr. F. Broly) -Mucoviscidose et autres maladies inflammatoires héréditaires (Dr. G. Lalau) -Maladies Neurologiques héréditaires (Pr B. Sablonnière, Drs. I. Vuillaume, S. Schraen, N. Rouaix) -Arythmies Cardiaques, Cytopathies mitochondriales (Dr. C.M. Dhaenens) -Maladies héréditaires rares du métabolisme (Drs M. Balduyck, M.F. Odou, Pr. N. Porchet) Cancers Familiaux -Oncogénétique digestive (Drs. M.P. Buisine, J. Leclerc) -Oncogénétique endocrinienne (Pr P. Pigny, Pr. N. Porchet, Dr. M.F. Odou) Pharmacogénétique - Génétique moléculaire des accidents thérapeutiques (Pr. F. Broly) Biologie Moléculaire des Tumeurs -Tumeurs hématologiques (Pr. C. Preudhomme) -Tumeurs solides (Drs F. Escande, M.P. Buisine, F. Zerimech, F. Révillon, C. Descarpentries, ) -Pathologie Moléculaire (Pr. M.C. Copin) HLA-Greffes (Pr. M. Labalette)

4 Enjeux Enjeux de l intégration De nombreuses thématiques de diagnostic moléculaire 25 Biologistes, 9 Ingénieurs et plus de 60 Techniciens Maladies Rares Hors Cancer Cancers Familiaux P.P.C.B.M Pharmacogénétique Biologie Moléculaire des Tumeurs HLA-Greffes Un Plateau de Prestations communes en Biologie moléculaire regroupant les ressources technologiques en biologie moléculaire.

5 Enjeux Enjeux de l intégration Un Plateau de Prestations communes en Biologie moléculaire regroupant Les ressources en biologie moléculaire. Une plateforme de Séquençage Capillaire Une plate-forme de PCR Temps réel Un Pyroséquençeur Une plate-forme de Robotique

6 Enjeux Enjeux de l intégration Permettre d augmenter les débits par rapport au séquençage classique, tout en maitrisant les coûts d analyse. Rechercher des variations causales dans des séquences de gène inaccessibles au séquençage classique. Rechercher des populations minoritaires. Créer une plate-forme de diagnostic moléculaire approfondi

7 Le GS Junior : historique du choix. Enjeux de l intégration Dès l été 2010 Recherche d une solution de séquençage haut débit Le GS Junior vient de faire son apparition sur le marché. Il est présenté comme une adaptation de la technologie GS FLEX à destination des laboratoires de diagnostic. Mise en application simplifiée Ressources humaines moindres Jusqu à 70 Mb par Run Reads d une moyenne de 400 pb Le GS Junior arrive en mai 2011 Le Plateau est pleinement opérationnel en septembre 2011

8 Premières Expériences Diagnostiques sur Séquenceur Roche GS Junior Enjeux de l intégration Principe du GS Junior Roche Les Projets en cours de développement Conclusions

9 Principe du GS Junior Roche EmPCR (amplification clonale) Préparation de la Librairie Séquençage Analyse des données

10 Origine variable de l ADN

11 Préparation des Librairies Principe du GS Junior Roche LR-PCR Capture Fragmentation Ligation T Des adaptateurs T A A T T T Amplicons Purification par billes magnétiques Contrôle qualité par Bioanalyseur Amplification par amorces contenant les adaptateurs Amplicons ~ 500 pb Adaptateurs = sites de fixation aux billes de capture + site de fixation des amorces de séquencage + M.I.D (Barcode d identification des échantillons) Quantification par fluorométrie, normalisation LIBRAIRIE PRETE POUR L empcr

12 EmPCR Principe du GS Junior Roche Capture sur billes POINT CRITIQUE : RATIO du nombre de molécules de la librairie / nombre de billes Emulsion PCR clonale Enrichissement UNE BILLE = 1 CLONE = 1 PUITS Chargement sur PTP pour séquençage

13 Principe du GS Junior Roche Séquençage Pyroséquençage: Circulation (flux) des 4 nucléotides pendant 200 cycles Pyrogramme = 1 séquence Incorporation de base = génération d un signal chemoluminescent Traitement du signal détermine la séquence

14 Premières Expériences Diagnostiques sur Séquenceur Roche GS Junior Enjeux de l intégration Principe du GS Junior Roche Les Projets en cours de développement Conclusions

15 Les Projets en cours de développement Projet Amplicons : Evaluation de la technique. Objectifs : Prise en main de la technique de Sequençage haut débit 3 Runs d essai avec une librairie de quelques amplicons (n=10) afin de: -S approprier la technologie. -Vérifier le matériel et les réactifs -Evaluer le workflow et le logiciel d analyse. -Dans cette librairie 6 ADN porteurs chacun d un SNV ou d une indel dans l un des amplicons. Conclusions : -Nombreuses étapes. Robotique nécessaire dès que le nombre d amplicons sera important -100% des SNV testés sont retrouvés, mais -Le Logiciel AVA ne détecte pas les indels de petite taille. correctif en cours de test

16 Les Projets en cours de développement Projet 1 Projet Amplicons : Evaluation pour analyse de gènes impliqués dans les tumeurs endocrines familiales. Objectif: Analyser les séquences codantes et introniques flanquantes de deux groupes de 3 gènes (pour un panel de 8 patients pour chaque groupe) : NEM1 (10 exons) AIP (6 exons) HRPT2 (17 exons) SDHB (8 exons) SDHC (6 exons) SDHD (4 exons) Nouveau design d amorces nécessaire : équilibrer la librairie 408 amplifiats par run, 816 amorces. Cette libraire nous permettra de tester le workflow robotique Elle sera optimisée par la suite en fonction de la profondeur atteinte.

17 Les Projets en cours de développement Projet 1 Projet Amplicons : Evaluation pour analyse de gènes impliqués dans les tumeurs endocrines familiales. Perspectives : En Pré-PCR : Programmes permettant de conduire les amplifications. En Post-PCR : Double purification des amplicons. Quantification et Normalisation des amplicons. Mise en place du module REMe pour permettre l automatisation de l étape d enrichissement. Afin de réduire les coûts, une solution de multiplexage des amplicons est envisagée. Partenariat avec une société prestataire de service? Externaliser le design et la mise au point des étapes de préparation de la librairie amplicon?

18 Les Projets en cours de développement Projet 2 Projet Shotgun: Evaluation pour analyse de gènes impliqués dans les cancers du côlon familiaux par LR-PCR. Objectif: Séquencer des gènes dans leur intégralité. A terme créer des protocoles de préparation de librairies pour analyser dans un même Run: MLH1/PMS2 MSH2/MSH6 APC/MUTYH Approche par LR-PCR : amplifier des fragments chevauchants de grande taille recouvrant l ensemble du gène. Alternative aux amplicons?

19 Les Projets en cours de développement Projet 2 Projet Shotgun: Evaluation pour analyse de gènes impliqués dans les cancers du côlon familiaux par LR-PCR. Premiers essais sur une librairie recouvrant le gène MLH1 : NT_ EPMAIP1 MLH1 LRRFIP2 5 Patients apparentés 11 kb Famille dans laquelle a été mise en évidence une hyperméthylation constitutive du promoteur de MLH1 Recherche d une anomalie pouvant expliquer l origine de cette hyperméthylation.

20 Les Projets en cours de développement Projet 2 Résultats : Ratio du nombre de molécules / billes : 0.7 trop faible ~ séquençes ont passé les filtres soit 24 Mb de données disponibles. Déséquilibre dans le nombre de séquences disponibles pour chaque patient : Patient 1 : séquences Patient 2 : Patient 3 : Patient 4 : 1784 Patient 5 : Couverture et profondeurs inégales sur l ensemble de l étude : Certaines avec peu de profondeur (20x) Certaines plus couvertes (jusqu à 300x) En partie à cause du chevauchement! Réévaluer la quantité de chaque produit de long range pour assurer une couverture suffisante et uniforme

21 Les Projets en cours de développement Projet 3 Projet Capture : Evaluation pour l application au diagnostic du retard mental. Screening de gènes décrits comme associés au retard mental chez des patients : - Sans anomalies de caryotype - Sans anomalies en CGH-Array Objectif: Séquencer des régions non contigües réparties sur tous les chromosomes: 117 Gènes dans la première version d évaluation de la technique (Soit 1975 exons répartis sur l ensemble du génome) comparer les différentes solutions de capture (coût, efficacité ) évaluer la couverture de la zone capturée multiplexer les patients (rentabilité)

22 Les Projets en cours de développement Projet 3 Projet Capture : Evaluation pour l application au diagnostic du retard mental. Choix technologique testé : Capture en milieu liquide NimbleGen + Design réalisé par le fournisseur (gain de temps) Prise en main facile de la technique Peu d équipements supplémentaires requis Bon rendement / junior (>50 MB) - capture = Workflow assez long (mini 1 semaine) Taux de couverture parait faible (seulement 15x en moyenne) Analyse compliquée avec les outils et connaissances actuelles.

23 Premières Expériences Diagnostiques sur Séquenceur Roche GS Junior Enjeux de l intégration Principe du GS Junior Roche Les Projets en cours de développement Conclusions

24 Conclusions Permettra d augmenter les débits Optimisation permettra aussi de diminuer les coûts. Devrait permettre la détection d événements supplémentaires par rapport au séquençage classique Représente un défi pour l adaptation au diagnostic: Workflow différent de celui du séquençage Sanger, N en est qu au début de son optimisation. Analyse des résultats plus difficile : Outil informatique remplace la visualisation des électrophérogrammes Nécessité d avoir confiance en cet outil : -Bioinformaticien -Plusieurs logiciels pour combler les défauts (algorithmes différents pour les alignements, la détection des SNP, des indels )

25 Remerciements Le Centre Régional Hospitalier Universitaire de Lille Le Cancéropôle Nord Ouest Les Prs. N. Porchet, P. Pigny, C. Preudhomme, Les Drs M.P Buisine, M.F Odou, J. Leclerc. Les Ingénieurs impliqués dans le Projet : C. Grutzmacher S. Geffroy C. Thuillier M. Crepin La société Roche