BIOLOGIE MOLECULAIRE

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1 UE LV-372 : BIOLOGIE MOLECULAIRE et GENETIQUE 2 (BMG2) BIOLOGIE MOLECULAIRE Corrigé de l examen écrit 1 ère Session Lundi 30 mai 2012 Durée de l'épreuve : 1h

2 Les expériences détaillées ci-dessous ont été faites afin d'étudier la régulation de la transcription de deux gènes dans des cellules humaines. Les promoteurs de transcription de ces deux gènes, NFC et BIX, ont été identifiés et soumis à une analyse génétique et bioinformatique. Deux régions de régulation ont été identifiées dans le promoteur du gène NFC et trois dans celui du gène BIX (figure 1A en annexe). i) L'élément core est localisé à proximité du point d'initiation de la transcription (figure 1A en annexe). ii) Les éléments B sont situés à 300 nucléotides en amont de la séquence core et présentent des identités de séquences de 80% entre eux. iii) La séquence A, spécifique du gène BIX, est localisée à 1500 nucléotides en amont de la région core BIX. Question de cours 1 et 2 : rappel La région core située autour du point de démarrage de la transcription permet de recruter les facteurs de transcription généraux (GTF) et la RNA polymérase (voir cours) L'énoncé indiquait déjà qu'il s'agissait de régions de régulation qui ne faisaient pas partie de la région core: Région B: La région de régulation proximale, située généralement à une distance de 50 à 200 nucléotides du point d'initiation de la transcription permet de recruter des facteurs qui modulent l'expression du gène Région A: La région de régulation distale, située à une plus grande distance (jusqu'à plusieurs milliers de nucléotides) en amont ou en aval du point d'initiation de la transcription module également la transcription (enhancer ou silencer). Question 1: Quels sont les divers éléments de régulation que l'on peut retrouver dans une région core? (Attention toute mauvaise réponse conduira à un décompte de points) bonnes réponses mauvaises réponses (liste non exhaustive) boite -10 TATA box (boite TATA) boite -35 région inr enhancer / Silencer région DPE séquence UP BRE shine dalgarno région TSS acceptée également séquence de Kozack Boite CAAT: ne fait pas partie de la région CORE Question 2: Quelle pourrait être la fonction des régions A et B? Au vu de l'organisation de ces deux promoteurs, les régions B sont des séquences régulatrices proximales alors que la région A est une séquence régulatrice distale (silencer ou enhancer) Le fragment de restriction Hind III-Ava III du promoteur de transcription NFC est cloné dans un vecteur en amont du gène rapporteur luciférase. Une expérience similaire est effectuée avec le fragment BamH I-Pst I du gène BIX (Figure 1A en annexe). A partir de ces deux plasmides, divers mutants ont été construits (Figure 1B en annexe) Les diverses constructions décrites dans la figure 1B sont introduites dans des cellules du colon. Vingt quatre heures après transfection, l'activité luciférase est évaluée (figure 1B en annexe, colonne de gauche "colon") Question 3: en vous référant à votre cours et aux résultats de cette expérience, quelles seraient les fonction des régions core et des région B de ces deux gènes? Justifiez votre réponse 1/ La région core permet une transcription de base supérieure au bruit de fond pour les deux promoteurs: 600 en moyenne versus 130 pour le bruit de fond -> recrutement des GTF 2/ Avec la région B, le promoteur a une activité très supérieure ( environ) qui retombe à l'activité de base (600) lorsqu elle est délétée -> recrutement d'une ou plusieurs protéines activatrices. 3/ La région B est donc bien une séquence activatrice proximale qui stimule la transcription à partir de la région core 4/ La région A n'a aucun effet particulier dans ces cellules 5/Les deux promoteurs se comportent donc de la même façon dans les cellules coliques

3 Une analyse de la littérature suggère que l'élément B pourrait être reconnu par la protéine UBI. Afin de vérifier ce point, on utilise une approche de gel retard (figure 2) Figure 2: Analyse des divers éléments par une approche de gel retard. La nature des sondes utilisées est indiquée au-dessus des pistes (NFC-B ou BIX-B ou BIX-A). Le contenu du milieu réactionnel (sonde, extrait protéique ou anticorps) est indiqué au-dessus de l'autoradiographie. La taille de chaque sonde est de 28 paires de bases. Question 4: Interprétez ce gel retard. Quel(s) renseignement(s) supplémentaire(s) apporte-t-il par rapport à l'expérience précédente? Ce résultat était-il attendu? 1/ La protéine UBI se fixe de manière spécifique sur la région B des deux promoteurs 2/ Elle ne se fixe pas sur la région A La région A n'a aucun effet particulier dans ces cellules Dans une seconde série d'expériences, les divers plasmides décrits dans la figure 1B en annexe ont été introduits dans des hépatocytes (cellules matures du foie). Vingt quatre heures après transfection, l'activité luciférase est évaluée (figure 1B colonne de droite) Question 5: Interprétez les résultats de cette expérience. 1/La région core permet une transcription de base supérieure au bruit de fond pour les deux promoteurs: 600 en moyenne versus 130 pour le bruit de fond 2/ Avec la région B, le promoteur a une activité très supérieure ( environ) qui retombe à l'activité de base (600) lorsqu elle est délétée. 3/ La région B est donc également une séquence activatrice proximale dans ces cellules hépatiques qui stimule la transcription à partir de la région core 4/La région A du promoteur BIX à un effet activateur qui est spécifique des cellules hépatiques. Sa délétion entraine une activité similaire à celle du promoteur NFC (20 000) 5/ Un promoteur NFC chimérique avec une séquence BIX-A se comporte comme le promoteur BIX indiquant que cette séquence est un enhancer qui confère une expression tissu-spécifique (cellules de foie) à tous promoteurs qui la contient Question 6: En vous référant à votre cours et aux résultats de cette expérience, quelle serait la fonction de la région A? Séquence enhancer conduisant à une expression tissue spécifique Une analyse par gel retard avec un extrait de cellules hépatiques (hépatocytes) ou de colon a été effectuée (figure 3). Figure 3: Analyse des divers éléments par une approche de gel retard. La nature des sondes utilisées est indiquée au-dessus des pistes (BIX-B ou BIX-A). Pour les pistes 7 et 8, les deux sondes ont été mélangées. La taille de chaque sonde est de 28 paires de bases. Le contenu du milieu réactionnel (sonde et extrait protéique) est indiqué au-dessus de l'autoradiographie.

4 Question 7: interprétez ce gel retard. Quelles informations apporte-t-il sur la régulation de ces deux gènes dans les cellules hépatiques? Ce résultat est-il conforme à l'analyse fonctionnelle? Pistes 1, 2 et 3: il y a un facteur présent dans les cellules hépatiques qui reconnait spécifiquement la séquence BIX-A. Ce facteur est absent des cellules coliques. Piste 4, 5 et 6: la protéine reconnaissant la région régulatrice proximale BIX-B est présente dans les cellules hépatiques et coliques Piste 7 et 8: les protéine se fixant sur chaque sonde interagissent entre elles (voir schéma) En utilisant la région BIX-A comme ligand fixé sur une colonne de chromatographie d'affinité, la protéine cellulaire SPE a été purifiée à partir d extrait protéique d hépatocytes. L'expression de cette protéine a été analysée par une approche de western-blot dans des extraits protéiques de cellules coliques ou d hépatocytes (figure 4, pistes 1et 2). Figure 4 : Analyse des cellules par une approche de western-blot (immunoblot). Piste 1: extrait protéique de cellules de colon; piste 2: extrait protéique d'hépatocytes; piste 3: extrait protéique d'hépatopblastes (précurseurs des cellules hépatiques qui se différencient en hépatocytes). L anticorps utilisé pour cette analyse est spécifique de la protéine SPE. Les protéines ont été séparées sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE) Question 8: L'analyse des pistes 1 et 2 du western blot de la figure 4 est-elle compatible avec votre hypothèse précédente? Justifiez. La protéine SPE n'est exprimée que dans les cellules hépatiques donc cela explique la tissu-spécificité de l'expression du gène BIX -> hypothèse confirmée

5 Partie II Les hépatocytes sont issues de la différenciation de cellules précurseurs, les hépatopblastes. L'expression de la protéine SPE est analysée dans des hépatopblastes (Figure 4, piste 3) par une approche de western blot. Question 9: Interprétez la piste 3. La protéine est synthétisée sous une forme précurseur de haut poids moléculaire donc plus longue. Parallèlement au western blot, une analyse immunocytochimique sur ces cellules est effectuée afin de tester la localisation de la protéine SPE (Figure 5). Figure 5 : Immunolocalisation de la protéine SPE. Après fixation sur une lame, les cellules sont perméabilisées et incubées avec un anticorps dirigé contre la protéine SPE (A et B). La figure C correspond aux cellules témoin après fixation mais sans anticorps (quel que soit le type de cellules, on observera le même profil). A: hépatopblastes (précurseurs des hépatocytes); B: hépatocytes. N: Noyau; Cy: Cytoplasme; Ex: Milieu extracellulaire. Question 10: À partir de ces expériences, donnez un modèle permettant d'expliquer simplement la régulation de l'expression du gène BIX au cours de la différentiation hépatique. La protéine est localisée dans la fraction membranaire des hépatopblastes et dans le noyau des cellules matures les hépatocytes. On peut penser que cette localisation membranaire pour la protéine précurseur doit conduire à une absence de fixation sur la région BIX-A et donc une transcription de base (activité ). Lors de la différentiation hépatique, la protéine subit une maturation qui conduit à une protéine plus petite qui migre dans le noyau et peut stimuler la transcription (activité ) Question bonus Les divers plasmides décrits dans l'annexe 1B sont introduits par transfection dans des hépatopblastes. Donnez une estimation de l'activité luciférase qu on obtiendrait dans cette expérience. Le profile sera identique à celui des cellules du colon