MORT CELLULAIRE ET CANCER

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1 CCO Médecine moléculaire 26/11/12 Pr Le Bras Ronéotypeuse: Rebecca Tuil Ronéolectrice: Nora Béguin MORT CELLULAIRE ET CANCER 1/14

2 Sommaire Introduction - Différents types de mort cellulaire - Gènes et cancer I/Apoptose - Voie extrinsèque - Voie intrinsèque - Techniques de détéction II/ Autophagie III/ Mort cellulaire: comparaison IV/ Mort cellulaire: polémique V/ Stratégies thérapeutiques 2/14

3 Introduction: Différents types cellulaires Petit rappel sur le cancer : Définition du cancer Le cancer est une maladie génétique ou épigénétique, avec dérégulation de l'expression de certains gènes. Cela se fait par des altérations directes ou par une délétion ou un tronquage du gène. Actuellement on regarde aussi l'aspect épigénétique, c est à dire les situations où il n'y a pas de mutation directe du gène mais une modulation de l'expression de ce gène par des modifications épigénétiques. Le processus de cancérogénèse concerne le développement et la prolifération incontrôlés des cellules transformées et qui acquièrent un avantage prolifératif. Ce sont en général des anomalies acquises (qui n existent pas au cours du développement), quelques unes sont transmises dans les tumeurs de l'enfant (le cancer héréditaire est rare, la tumeur survient alors précocement). Une mutation p53 très tôt dans la vie peut générer des tumeurs. Facteurs de promotion et d'initiation tumorale Facteurs endogènes : - génétiques (hérédité, altérations chromosomiques) - hormonaux : tumeurs hormono-dépéndantes (sensibilité aux hormones : cancer du sein, prostate etc) - immunitaires : le statut immunitaire du patient peut favoriser un processus tumoral (patients immunodéprimés) - activation oncogénique - perte de gènes suppresseurs de tumeur - âge Facteurs exogènes : - physiques : radiations ionisantes (UV, rayons X), exposition accidentelle (Tchernobyl) - carcinogènes chimiques - virus oncongéniques: lien entre tumorigénèse et virus ( un virus peut être impliqué dans des tumeurs. Exemple : papilloma virus dans le cancer du col de l'utérus). Un processus multi-étapes 3/14

4 Les premières anomalies génétiques sont silencieuses mais mitose après mitose il y a un avantage sélectif de ces cellules anormales expansion clonale (localement on a un clone = cellules aux mêmes particularités génétiques) activation d'oncogène instabi- lité génétique qui mène enfin à l accroissement du potentiel agressif. L instabilité génétique constitue en elle-même un avantage prolifératif supplémentaire. Quelles sont les transformations que subit une cellule cancéreuse? Immortalisation : C est un phénomène irréversible. Dans un tissu normal, le cycle cellulaire et la mort cellulaire sont contrôlés. Une cellule normale fait un nombre de cycles donné puis meurt. La cellule cancéreuse perd ce contrôle du nombre de cycles, on arrive à une prolifération infinie de ces cellules accumulation de mutations génétiques.. Transformation : - Perte d équilibre entre les molécules pro/anti prolifération - Perte de l'inhibition de contact ( les jonctions entre les cellules inhibent la mitose quand il y a plus de place). Les cellules transformées continuent à cycler même si elles se touchent et on aboutit à la formation d une tumeur. - Rôle des oncogènes et des suppresseurs de tumeur. - Formation de foyers de cellules tumorales tandis que les cellules normales sont en monocouche. Progression : La promotion tumorale correspond à l expression phénotypique des modifications génotypiques. Les agents génotoxiques augmentent la progression tumorale. Migration : On a une perte d'ancrage cellulaire, les cellules passent dans le sang et peuvent faire des métastases : la cellule quitte la tumeur, elle survit dans le sang, s'ancre à la membrane, la traverse et va coloniser d'autres tissus (ce qui pour cellule normale est IMPOSSIBLE). Résumé : processus multi-étapes du développement d une tumeur - autosuffisance (facteurs de croissance) - insensibilité aux signaux anti-prolifératifs - invasion - immortalisation (télomères) - angiogénèse ( pour une tumeur solide) : arbre vasculaire qui va irriguer la tumeur - échappement à la mort par apoptose (autophagie et autres types de morts) Les morts cellulaires 1) Apoptose (type I) Critères morphologiques: - Bourgeonnement (formation de corps apoptotiques) - Condensation nucléaire - Fragmentation de l ADN (régulière : fragments de 200 à 300 pb et pas de réparation possible à ce stade) 4/14

5 C est une mort cellulaire programmée par la cellule, elle ne se fait donc pas n importe comment, ses mécanismes sont bien précis. La cellule qui meurt par apoptose est une cellule qui implose, sans faire de déchets, c est une mort «propre». Le système de nettoyage est prévenu et fait la phagocytose de la cellule détruite. Les critères morphologiques sont très tardifs. Un autre critère morphologique est l exposition de facteurs à l extérieur de la cellule: les phosphatidyl sérine (PS), lipides membranaires mais qui sont cytosoliques en temps normal. En cas d apoptose, on a une inversion des lipides qui s externalisent et qui sont reconnus par les récepteurs du phagocyte. L apoptose est une mort génétiquement contrôlée. C est un processus très conservé au cours de l évolution, qui est indispensable au cours du développement (développement d un individu ou métamorphose des insectes), et indispensable aussi pour l homéostasie tissulaire (rôle important de l apoptose dans le système nerveux et immunologique en post-natal et pour les cellules surnuméraires ou endommagées). Des défauts d apoptose peuvent donc provoquer des problèmes de développement. L apoptose a aussi un rôle dans les pathologies humaines: - augmentation de l apoptose dans le SIDA ou les maladies neuro-dégénératives - diminution de l apoptose dans les maladies auto-immunes et les cancers On a donc le développement de stratégies thérapeutiques pour moduler l apoptose. 2) Autophagie (type II) Critères morphologiques: - Chromatine non-modifiée - Vacuoles d autophagie (autophagosomes) L autophagie est un type de mort cellulaire qui dépend de la susceptibilité de la cellule à l apoptose c est à dire que si la cellule ne fait pas d apoptose alors qu elle en a besoin, elle peut faire de l autophagie. L autophagie implique un gène suppresseur de tumeur, béclin1, délété dans 40 à 75% des cancers de l ovaire et du sein. On ne sait pas vraiment si l autophagie a un rôle sur in vivo sur les gènes Atg (gène de l autophagie), ou si l extinction de ces gènes entraînent une réduction de la mort cellulaire. L induction de l autophagie est parfois réversible. Elle a un lien avec la protéolyse (hydrolyse ou dégradation des protéines par coupure enzymatique. 3) Nécrose (type III) Critères morphologiques: - Pas d implosion (contrairement à l apoptose) mais explosion de la cellule (les organites gonflent) - Rupture de la membrane plasmique - Formation de vésicules intra-cellulaires - Dilatation des mitochondries qui entraîne le relargage des organites en extra-cellulaire En général elle est caractérisée par l absence d apoptose ou d autophagie classique, c est donc aussi une définition par défaut. 5/14

6 Dans les tumeurs solides, l hypoxie (déplétion en ATP) ou la privation de glucose réduit la progression tumorale par nécrose. En effet, l apoptose nécessite de l ATP tandis que la nécrose ne nécessite pas d énergie et se fait pour les cellules en hypoxie ou sans ATP. Enfin, la nécrose s accompagne d une réaction inflammatoire importante, ce n est donc pas une mort «propre». Ce n'est pas un processus sur lequel on va jouer, car pas vraiment de gènes de la nécrose et en plus c'est une mort qui génère beaucoup de déchets, donc ce n'est pas une idée de traitement de la tumeur. Nécrose (sans ATP, à gauche) VS Apoptose (avec ATP, à droite) 1) Autres mécanismes atypiques... - Catastrophe mitotique: des erreurs de mitose successives ou une micro/multi-nucléation entraînent une apoptose ou une nécrose. - Anoikis: perte d ancrage cellulaire - Excitotoxicity: perte d'ancrage spécifique des neurones - Necroptosis: c est une nécrose génétique contrôlée, dépendante de l action de la sérine-thréonine kinase RIP1. Elle est inhibée par de nouveaux agents protecteurs: les nécrostatines. L anoikis et l excitotoxicity ont les mêmes mécanismes d induction que l apoptose. On devrait donc dire LES morts cellulaires plutôt que de parler de LA mort cellulaire. II/ Apoptose Deux voies principales induisent l apoptose: - la voie extrinsèque (type I): via les récepteurs membranaires (TNF, FAS...) où le stimuli est externe à la cellule. - la voie intrinsèque (type II): via les organites cellulaires (RE, mitochondrie, lysosomes) où le stimuli est interne à la cellule. Les deux voies transitent entre elles et communiquent pour induire l apoptose en clivant l ADN (par des DNAses). Pour activer les DNAses, on passe par les caspases dans les deux voies. 6/14

7 Les caspases sont des cystéines aspartate protéases, très conservées chez les procaryotes et eucaryotes. Elle clivent donc des protéines au niveau de sites spécifiques tel qu au niveau du motif DEVD. Elles sont exprimées dans le cytoplasme sous forme de protéine inactive (zymogène): les pro-caspases. Elles sont ensuite activées par clivage du pro-domaine et maturent (par liaison des deux sous-unités) pour ensuite effectuer la protéolyse. C est une machinerie qui est bien conservée phylogénétiquement. On a deux types de caspases: - Les caspases initiatrices à pro-domaine LONG pro-domaine DED pour les caspases 8 et 10 pro domaine CARD pour les caspases 1,2,4,5,9,11,12 - Les caspases effectrices à pro-domaine COURT caspases 3,6,7 Les caspases initiatrices agissent dès l intégration du signal tandis que les casapses effectrices sont celles qui conduisent activement à l apoptose. On a dit plus haut que les caspases se trouvaient à l état basal sous forme de pro-caspases qu il fallait donc activer et maturer pour les rendre actives. Les caspases initiatrices ont une activation qui se fait en une étape avec une modification du pro-domaine ou la fixation d une protéine sur le domaine carboxy-terminal (exemple des caspases 9 et 10) Les caspases effectrices sont quant à elles activées par clivage. Dans la caspase, on a deux sous-unités: p20 et p10. On a un premier clivage entre ces deux sous unités, puis p10 vient se coller à p20: la caspase est alors activée. La maturation de cette caspase correspond au clivage du prodomaine. C est donc la fixation des deux sous-unités de façon spécifique et le clivage du pro-domaine qui permettent l activation de la caspase. Les substrats des caspases sont très nombreux: molécules de structure, molécules de signalisation, de réparation de l ADN etc. Exemple: en cas de stress cellulaire et de dommage de l ADN, on a toute une voie de signalisation qui va être activée. Deux solutions alors: soit on peut réparer et la machine de réparation de l ADN est activée, soit le stress est trop important et la cellule s engage vers l apoptose. On inactive alors la machinerie de réparation, on dégrade les lamines et le noyau change de conformation; tout celà par l intermédiaire des caspases. Donc l activité protéolytique des caspases consiste en: - l inactivation d un substrat ex: PARP, poly ADP ribose polymérase, qui va être inactivée par une coupure au site DEVD par les caspases 3 et 7. - la dégradation d un substrat ex: le réseau de lamines du noyau (coupé par la caspase 6). 7/14

8 1) La voie extrinsèque C est une voie qui nécessite une fixation ligand/récepteur. Les récepteurs sont ceux des voies TNF ou FAS. Cette voie ne fonctionne qu avec des protéines adaptatrices qui se collent au récepteur à sa partie intra-cellulaire grâce à une homologie de domaine (ex: protéines FADD, TRADD, RIP). Ces protéines adaptatrices sont donc une sorte de récepteur sans domaine extracellulaire et transmembranaire; elles sont identiques au domaine intracellulaire du récepteur. Voie FAS Dans une cellule hépatique par exemple, le récepteur FAS fixe le FAS-ligand en extra-cellulaire. S ensuit le recrutement d une protéine adaptatrice (FADD) qui se fixe au récepteur grâce au DD (death domain). L activation du DD entraine le recrutement de la caspase 8 (initiatrice) dans sa forme inactive c est à dire sous forme de pro-caspase. Tout ceci conduit à la formation du complexe DISC (death inducing signaling complex) qui est donc composé du récepteur, du ligand, de la protéine adaptatrice et de la pro-caspase. On a ensuite le clivage du pro-domaine 8 ce qui permet la maturation de la caspase 8. C est cette caspase initiatrice qui active par la suite les caspases effectrices qui quant à elles dégradent le noyau et l ADN. Evidemment, à chaque étape de cette voie on a des inhibiteurs qui permettent de vérifier que la cellule doit bien se diriger vers l apoptose et que cet enchainement n est pas malencontreux. On a donc par exemple les protéines FLIP (2 domaines DED, compétition avec la caspase pour la fixation) qui inhibent l activation de la caspase 8 (initiatrice), ou XIAP qui inhibe l activation des caspases 3 et 7 (effectrices). 8/14

9 Voie TNF Il se passe exactement la même chose que pour la voie RAS. La subtilité cependant est que la protéine adaptatrice joue ici tout son rôle c est à dire qu on n aura pas du tout la même réponse cellulaire en recrutant FADD (apoptose) qu en recrutant RIP (survie cellulaire). Tout ceci est plus complexe et résulte d un équilibre génétique et transcriptionnel qui permet une balance activateur/inhibiteur et qui dicte à la cellule la voie qu elle doit prendre. On a donc une régulation fine à chaque niveau. 2) Voie intrinsèque Elle implique principalement la mitochondrie qui est l intégrateur central et dépend de stimulus intrinsèques variés: p53, calcium, modification des lipides, protéines anormales, modifications redox, oxydation, kinases. Toutes ces modifications ou molécules sont des signaux pour la mitochondrie. La mitochondrie procède donc en 3 étapes: intégration, initiation et dégradation du signal. La famille BCL2 est une grande famille de molécules qui peuvent activer ou inhiber le passage vers l apoptose (car BCL2 est sous le contrôle de p53). - Membres anti-apoptotiques: BCL2, BLX - Membres pro-apoptotiques: PAX, BAK BAD Tous ces membres ont une homologie de séquence, les mêmes domaines fonctionnels entre eux. 9/14

10 Facteurs apoptotiques: On a donc un signal (irradiation, réaction rédox). Si la mitochondrie est endommagée elle change son potentiel de membrane, sa polarité et provoque le relargage de certaines molécules comme le cytochrome C, transporteur libre et mobile qui circule dans l espace intermembranaire de la mitochondrie. BCL2, anti-apoptotique, inhibe la sortie du cyt C de la mitochondrie. Le cyt C sort donc de la mitochondrie, se retrouve dans le cytosol où il est complexé avec APAF1 ce qui provoque la fixation d ATP sur le cyt C. Après recrutement de la procaspase 9, on aboutit à la formation du complexe de l apoptosome (cyt C+ APF1+ procaspase 9) (On voit donc bien que l apoptose est un mécanisme qui ne peut avoir lieu que si la cellule a de l énergie car on a besoin d ATP à ce niveau la). On a ensuite, le clivage de la procaspase 9 qui active une cascade de procaspases effectrices et qui aboutit au clivage de l ADN. Il existe une voie parrallèle, indépendante des caspases, qui ne libère pas de cytochrome C mais d autres facteurs (AIF, Smac, Diabio). Il existe une communication entre les deux voies grâce à une protéine de la famille BCL2: BID. En effet, la voie extrinsèque peut activer la voie intrinsèque grâce à BID qui, clivée, va à la mitochondrie et amplifie le signal. Mécanismes de perméabilité membranaire Le potentiel de membrane de la mitochondrie est contrôlé par des canaux qui permettent ou pas cette perméabilité membranaire. Formation de pores dans la membrane 1) PTPC: complexe situé aux sites de contacts entre la membrane externe et interne (permet un équilibre entre l'extérieur et l'intérieur) 2) Pores de la membrane externe: par les oncogènes ou gènes suppresseurs de tumeurs de la famille Bax/Bcl2 Rupture de la membrane externe mitochondriale 3) Formation de pores lipidiques dans la membrane externe (rafts lipidiques) On a donc 3 mécanismes de perméabilité membranaire: 1) Canaux PTPC (pores de transition mitochondriale) 2) Canaux BAX/ BAK 3) Pores lipidiques Apoptose mitochondriale et pathologies Après une ischémie cérébrale on peut avoir une apoptose massive. La mitochondrie est aussi impliquée dans les maladies neurodégénératives et peut poser des problèmes dans des greffes de foie ou de rein: en effet une différence d oxygénation pendant la greffe peut provoquer un choc ischémique; une apoptose massive est alors possible. 10/14

11 Il y a une modification de la perméabilité des membranes dans la stéatose. 3) Techniques d observation On peut faire une observation au microscope électronique mais en général rare (coût ++). a) Niveau sub cellulaire: Microscopie optique: on peut voir les cellules apoptotiques au MO mais c est peu fréquent et pas toujours facile. Coloration ou marquage: à l hématoxine par exemple. Observation du potentiel de membrane: avec des sondes fluorescentes qui détectent la dépolarisation. Observation de la morphologie du réseau mitochondrial. Pour toutes ces observations, on utilise une méthode comparative (cellule témoin). b) Niveau de l ADN: Observation de la fragmentation génomique avec des échelles d ADN: technique possible seulement à un stade tardif et difficile. Technique TUNEL: nouvelle technique de marquage des extrémités. En effet, lors de la fragmentation, on a de plus en plus de petits bouts d ADN et donc d extrémités que l on peut marquer (le marquage est donc beaucoup plus important dans une cellule en apoptose). Mesure du contenu d ADN: dans la cellule en apoptose on a un pic avant G1, une fraction sub G1 avec de l ADN fragmenté. c) Niveau membranaire: Exposition et marquage des PS avec des fluorochromes spécifiques: marquage à l annexin puis cytométrie de flux. d) Niveau protéique: Observation de l activation des caspaces par Western Blot: migration des caspases en fonction de leur poids moléculaire c est à dire du clivage ou non de leur prodomaine. Relargage du cytochrome c: fractionnement de la cellule, extraction des protéines totales puis séparation des protéines mitochondriales et cytosoliques et Western Blot (on regarde ou est le cyt c si dans le cyto : apoptose). III/ AUTOPHAGIE L autophagie peut être simplement une dégradation lysosomale. Elle peut être impliquée au niveau basal pour le renouvellement et l homéostasie cytoplasmique (protéines, ARN, organites) ou en situation de carence nutritionnelle (on favorise alors la dégradation protéique pour synthétiser de nouveaux acides aminés et compenser la carence). 11/14

12 On a la formation d un autophagosome ou autophagolysosome qui va permettre d augmenter la concentration en acides aminés et de permettre une nouvelle synthèse protéique MAIS il faut revenir ensuite à un état basal. L autophagie induite par carence est un processus auto-régulé en fonction des conditions de survie, il faut toujours ensuite revenir à un état basal. La perte de ce contrôle peut entraîner la mort cellulaire. Attention, l autophagie en cas de carence ne survient que si la carence est durable! Les inducteurs de l autophagie sont divers: carence alimentaire en acides aminés, en carence en facteurs de croissance ou hormones, stress cellulaire, drogues, agents chimiothérapeutiques, infections virales, chocs thermiques ou radiations. On a une trentaine de gènes impliqués : Atg (autophagy gene). L autophagie consiste donc en un repliement membranaire autour de cytosol ou d organites, contrôlé par les gènes Atg, qui conduit à la formation d un autophagolysosome qui a toutes les enzymes nécessaires à disposition ainsi qu un ph très acide. III/ Mort cellulaire: comparaison APOPTOSE Condensation de la chromatine et fragmentation de l ADN Pas d accumulation de vacuoles Condensation du cytoplasme Ouverture de pores de transition mitochondriale (PTC) Activation des caspases AUTOPHAGIE Condensation partielle sans fragmentation de l ADN Accumulation de vacuoles Bourgeonnement de vésicules cytoplasmiques Ouverture possible de pores de transition mitochondriale (PTC) Pas d activation des caspases Cependant, si les mécanismes sont différents, les inducteurs de ces deux types de mort sont les mêmes. On a d'abord un processus d'autophagie temporaire, puis si le choc est trop important : apoptose. IV/ Mort cellulaire: polémiques Ces dernières années, on assiste à une augmentation impressionnante du nombre de publications sur la mort cellulaire. En 2005, un consensus est établi pour calmer le jeu, redéfinir ce qu est la mort cellulaire et où mettre les limites. Comment reconnaître une cellule morte? Une cellule apoptotique? L apoptose peut être prouvée par l activation des caspases (par Western Blot) et l exposition des PS (par marquage à l annexin). 12/14

13 Quel est le point de non-retour? Autrement dit, à partir de quel moment peut-on dire que la cellule est engagée dans l apoptose sans retour possible? Comment être sur que ce que l on voit n est pas transitoire? Le point de non retour est établi lorsqu il y a une activation massive des caspases, une modification du potentiel de membrane, une perméabilité membranaire et une perte de la survie clonogénique en cas de tuméfaction. V/ Stratégies thérapeutiques Si la mort cellulaire est inhibée, on peut réactiver l apoptose de différentes façons. C est ce que l on vise dans les stratégies thérapeutiques. 1) Réactiver l apoptose via la voie extrinsèque Activer le récepteur TRAIL ++ (car il est très exprimé dans les cellules). Les Ac monoclonaux sont capables d activer TRAIL (phase 2 des essais cliniques actuellement) Activer le récepteur TNF - (car le ligand TNF est très toxique) 2) Activer les caspases (initiatrices et effectrices) Par des peptides synthétiques: les peptides RGD liés aux intégrines activent la caspase 3 ou bien utiliser des peptides combinés avec d autres molécules. Par des molécules naturelles: l apoptin, dérivée des virus aviaires. Elle induit les caspases dans les cellules cancéreuses indépendamment de BCL2 (anti-apoptotique surexprimé dans les concers) et p53 (inducteur de l apoptose mais muté dans un cancer sur deux ce qui est problématique) 3) Cibler les régulateurs des caspases: IAPs (inhibiteur) Un niveau élévé de IAPs est un mauvais pronostic car les caspases ne sont plus activées. On cherche donc à bloquer les IAPs. 4) Cibler des protéines de la famille BCL2 Provoquer une réaction pro-apoptotique Inhiber une réaction anti- apoptotique Utiliser un antisense BCL2 (anti-apoptotique) en association avec la chimiothérapie ce qui donne une bonne réponse chez les patients qui ont une bonne extinction de BCL2. Utiliser un agoniste de BCL2 qui inhibe donc l action de BCL2 et BLX (bonne réponse sur les modèles murins) La stratégie anti-bcl2 est la plus avancée au niveau clinique, ce sera bientôt un adjuvant de la chimiothérapie (surtout pour les tumeurs liquides comme les leucémies). 5) Réactiver les fonctions de p53 Réintroduire p53 dans la cellule ou inhiber son inhibiteur mais il faut faire attention s il est muté! 13/14

14 6) Réactiver les mécanismes de l autophagie pour les faire durer Dans des conditions classiques, on limite simplement la casse, la cellule est réparé et on empêche la tumorigénèse. S il n y a pas d autophagie, la cellule est abîmée et on favorise la tumorigénèse. Donc tout dépend de la situation! Stratégies thérapeutiques pour essayer selon les situations de contrôler l autophagie: l activer ou l inhiber (gène ARHI) On a obtenu de bons résultats in vitro avec le gène ARHI, gène impliqué dans les tumeurs ovariennes: sous-exprimé dans une tumeur sur deux. ARHI contrôle l autophagie et la favorise dans les crises aiguës pour augmenter la mort cellulaire. Le but est donc de restaurer l expression de ce gène dans les tumeurs ovariennes pour favoriser la mort de ces cellules. On a donc plusieurs stratégies thérapeutiques visant à rétablir l apoptose mais on en est au début concernant les stratégies thérapeutiques impliquant l autophagie. 14/14