TABLE DES MATIÈRES. 2.1 Choix de la source de lignine Échantillonnage et préparation de la biomasse 6

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1 TABLE DES MATIÈRES RÉSUMÉ REMERCIEMENTS TABLE DES MATIÈRES LISTE DES HGURES LISTE DES TABLEAUX li iv v vu x CHAPITRE I INRODUCTION 1 CHAPITRE II MATÉRIEL ET MÉTHODE Choix de la source de lignine Échantillonnage et préparation de la biomasse Extraction alcaline Purification de la lignine alcaline par précipitation avech2so Biotransformations Chromatographie d'exclusion sur gel Spectroscopie infrarouge Spectroscopie RMN Spectroscopie RMN 13 C à l'état solide Spectroscopie RMN en solution Spectroscopie RMN en une dimension Spectroscopie RMN en deux dimensions 25 Technique TOCSY 25 Technique ROESY 26

2 V 1 Technique HMQC Spectroscopie de masse à bombardement par atome rapide (FAB/MS) 27 CHAPITRE III RÉSULTATS ET DISCUSSION Généralités Composition élémentaire Analyses spectroscopiques infrarouge Analyses spectroscopiques RMN Distribution des groupements fonctionnels Spectres RMN 13 C à l'état solide (CP/MAS) Spectre RMN 13 C en solution Spectre RMN ] H en solution Spectre RMN-2D HMQC de la lignine alcaline Spectre RMN-2D ROESY de l'a lignine alcaline Spectre RMN-2D TOCSY de la lignine alcaline Biotransformation 88 CHAPITRE IV CONCLUSION 102 BIBLIOGRAPHIE 105 ANNEXE 1 117

3 Vil LISTE DES FIGURES FIGURE 1 Protocole d'extraction de la lignine alcaline 7 FIGURE 2 Schéma de l'autoclave 11 FIGURE 3 Courbe d'étalonnage pour la chromatographie 21 FIGURE 4 Biosynthèse de la lignine chez les plantes 31 FIGURE 5 Unités monomériques de base de la lignine 33 FIGURE 6 Mécanisme de polymérisation radicalaire 34 FIGURE 7 Formation de dilignols 35 FIGURE 8 Dimères de base de la lignine de type B-O-4', 6-5' et 8-1' 36 FIGURE 9 Dimères de base de la lignine de type B-B',5-5' et 4-O-5' 37 FIGURE 10 Spectre infrarouge du bois brut de l'épinette noire 41 FIGURE 11 Spectre infrarouge du bois pré-extrait de l'épinette noire 42 FIGURE 12 Spectre infrarouge de la lignine alcaline de l'épinette noire 43 FIGURE 13 Comparaison des spectres RMN 13 C à l'état solide du bois brut, sans extractible et de la lignine alcaline de l'épinette noire 53 FIGURE 14 Spectre RMN 13 C en solution dans le DMSO de la lignine alcaline de l'épinette noire 60 FIGURE 15 Identification d'un fragment de 4 unités de type 8-O-4' et 8-5' de masse moléculaire égal à FIGURE 16 Identification d'un fragment de 4 unités de type B-O-4' et 8-5' de masse moléculaire égal à FIGURE 17 Identification d'un fragment de 6 unités de type B-O-4' et 8-5' de masse moléculaire égal à

4 VI11 FIGURE 18 Spectre RMN l H en solution dans le DMSO-d6 de la lignine alcaline de l'épinette noire 70 FIGURE 19 Structures confirmées par le spectre RMN [ H en solution dans le DMSO-d6 de la lignine alcaline de l'épinette noire 71 FIGURE 20 Spectre RMN-2D HMQC de la lignine alcaline de l'épinette noire 76 FIGURE 21 Spectre RMN-2D ROESY de la lignine alcaline de l'épinette noire 80 FIGURE 22 Spectre RMN-2D TOCSY de la lignine alcaline de l'épinette noire 84 FIGURE 23 Chromatogramme de la lignine alcaline de l'épinette noire entre 0 et 48 heures de biotransformation 89 FIGURE 24 Chromatogramme de la lignine alcaline de l'épinette noire entre 96 et 144 heures de biotransformation 90 FIGURE 25 Chromatogramme de la lignine alcaline de l'épinette noire entre 168 et 240 heures de biotransformation 91 FIGURE 26 Spectre de masse avec atome rapide (FAB/MS) de la lignine alcaline après 58 heures de biotransformation 95 FIGURE 27 Fragments retrouvés dans la lignine alcaline après 58 heures de biotransformation d'après le spectre de masse 96 FIGURE 28 Produits les plus communs retrouvés dans la fraction de faible masse moléculaire après la dégradation du bois d'épinette par Phanerochaete chrysosporium 98 FIGURE 29 Fragment de masse moléculaire égale à 714 pour la lignine alcaline après 58 heures de biotransformation 99 FIGURE 30 Fragment de masse moléculaire égale à 801 pour la lignine alcaline après 58 heures de biotransformation 100

5 IX FIGURE 31 Fragment de masse moléculaire égale à pour la lignine alcaline après 58 heures de biotransformation 101

6 LISTE DES TABLEAUX TABLEAU I TABLEAU II TABLEAU III TABLEAUIV TABLEAU V TABLEAU VI TABLEAU VII TABLEAU VIII Milieu de culture et de fermentation 14 Conditions d'analyse par chromatographie d'exclusion sur gel 18 Caractéristiques des échantillons standards 20 Condi tons d'analyse des spectres RMN 13 C à l'état solide 24 Conditions d'analyse pour la spectrométrie de masse 28 Composition élémentaire de la lignine 39 Interprétation du spectre infrarouge du bois brut de l'épinette noire.46 Interprétation du spectre infrarouge du bois sans extractible de l'épinette noire 47 TABLEAU IX Interprétation du spectre infrarouge de la lignine alcaline de l'épinette noire précipitée à l'acide sulfurique 48 TABLEAU X Structures monomériques issues de la lignine alcaline de l'épinette noire. Spectre RMN 13 C (CP/MAS) et spectre de masse 55 TABLEAU XI Sructures dimériques de type B-O-4' issues de la lignine alcaline de l'épinette noire. Spectre RMN 13 C en solution dans le DMSO et du spectre de masse 56 TABLEAU XII Structures dimériques de type 13-5' (phénylcoumarane) issues de la lignine alcalinede l'épinette noire. Spectre RMN 13 C (CP/MAS) et spectre de masse 58 TABLEAU XIII Structures dimériques de type B-O-4' issues de la lignine alcaline de l'épinetle noire. Spectre RMN 13 C en solution dans le DMSO-d6 et du spectre de masse 61

7 XI TABLEAU XIV Structures dimériques de type B-5' issues de la lignine alcaline de l'épinette noire. Spectre RMN 13 C en solution dans le DMSO-d6 et du spectre de masse 63 TABLEAU XV Structures dimériques de type résinol issues de la lignine alcaline de l'épinette noire. Spectre RMN 13 C en solution dans le DMSO et du spectre de masse 64 TABLEAU XVI Interprétation du spectre RMN l H en solution de la lignine alcaline de l'épinette noire 72 TABLEAU XVII Interprétation du spectre RMN-2D HMQC de la lignine alcaline de l'épinette noire 77 TABLEAU XVIII Interprétation du spectre RMN-2D ROESY de la lignine alcaline de l'épinette noire 81 TABLEAU XIX Interprétation du spectre RMN-2D TOCSY de la lignine alcaline de l'épinette noire 86 TABLEAU XX Distribution des masses moléculaires de la lignine alcaline de l'épinette noire lors de la biotransformation par Phanerochaete chrysosporium 93