Pregnenolone ELISA. Test immuno-enzymatique pour le dosage quantitatif direct de la Prégnénolone dans le sérum humain.

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1 Fiche technique Pregnenolone ELISA Test immunoenzymatique pour le dosage quantitatif direct de la Prégnénolone dans le sérum humain. DB C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBLInternational.com D22335 Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 BUT DU TEST Pour la détermination quantitative directe de la prégnénolone par test immunoenzymatique dans le sérum humain. Pour utilisation de diagnostic in vitro uniquement. PRINCIPE DU TEST Le principe du test immunoenzymatique suivant suit le scénario typique de liaison compétitive. La compétition a lieu entre un antigène non marqué (présent dans les standards, le contrôle et les échantillons des patients) et un antigène marqué par une enzyme (conjugué) pour un nombre limité de sites de liaison des anticorps sur la plaque de microtitration. Les procédures de lavage et de décantation éliminent les matériaux non liés. Après l'étape de lavage, le substrat d'enzyme est ajouté. La réaction enzymatique est arrêtée par addition de la solution d'arrêt. L'absorbance est mesurée sur un lecteur de plaques de microtritation. L'intensité de la couleur qui s'est formée est inversement proportionnelle à la concentration de prégnénolone dans l'échantillon. Un ensemble de standards est utilisé pour tracer une courbe standard à partir de laquelle la quantité de prégnénolone dans les échantillons de patients et les contrôles peut être lue directement. APPLICATIONS CLINIQUES La prégnénolone (3βhydroxypregn5en20one) est le premier stéroïde à être dérivé du cholestérol dans la voie de la stéroïdogenèse, et c'est le précurseur commun de tous les stéroïdes surrénaliens et gonadiques. Sa production se produit dans la mitochondrie par clivage de la chaîne latérale C20 du cholestérol par l'enzyme P450SCC. Une fois produite, la prégnénolone peut être utilisée par deux voies de la stéroïdogenèse. La prégnénolone peut être convertie soit en 17OH prégnénolone par l'action enzymatique de la 17αhydroxylase, soit en progestérone par l'action enzymatique de la 3βhydroxystéroïde déshydrogénase. Des taux élevés de prégnénolone surviennent dans des formes de l'hyperplasie congénitale des surrénales (HCS) due à une insuffisance en déshydrogénase 3βhydroxystéroïde ou en 17αhydroxylase. Des taux plus élevés ont également été rapportés chez des femmes atteintes d'hirsutisme idiopathique. Les études sur les taux de prégnénolone en ce qui concerne les différences de sexe et d'âge indiquent que les taux maximaux sont observés à l âge d environ 17 et 16 ans pour les femmes et les hommes, alors que les taux minimaux le sont à l âge d environ 37 et 38 ans pour les femmes et les hommes, respectivement. En général, les femmes ont des valeurs légèrement plus élevées que les hommes dans ces études. De nombreux domaines de la physiologie de la prégnénolone restent à étudier. Les recherches actuelles indiquent que la détermination de la prégnénolone dans le sérum peut être utile pour l'étude de son métabolite, le sulfate de prégnénolone, qui a été rapporté pour avoir différents effets dans le cerveau et le système nerveux central des mammifères. NOTES POUR LA PROCEDURE ET AVERTISSEMENTS 1. Les utilisateurs doivent avoir une connaissance approfondie de ce protocole pour pouvoir utiliser ce kit avec succès. Des performances fiables ne seront obtenues qu'en respectant strictement et scrupuleusement les instructions fournies. 2. Des matériaux de contrôle ou des pools de sérums doivent être inclus dans chaque série à un niveau haut et bas pour évaluer la fiabilité des résultats. 3. Lorsque l'utilisation de l'eau est spécifiée pour la dilution ou la reconstitution, utiliser de l'eau déminéralisée ou distillée. 4. Afin de réduire l'exposition à des substances potentiellement nocives, il faut porter des gants lors de la manipulation de réactifs du kit et d'échantillons humains. 5. Tous les réactifs et les échantillons du kit doivent être portés à température ambiante et mélangés doucement, mais complètement avant utilisation. Éviter de congeler et de décongeler de manière répétée les réactifs et échantillons. 6. Une courbe d'étalonnage doit être établie pour chaque série. 7. Le contrôle doit être inclus dans chaque série et rester dans les limites de confiance établies. 8. De mauvaises techniques procédurales, un pipetage imprécis, un lavage incomplet ainsi qu'à un stockage inapproprié des réactifs peuvent se refléter lorsque les valeurs de dosage pour le contrôle ne sont pas comprises dans les fourchettes établies. 9. Lors de la lecture de la microplaque, la présence de bulles dans les micropuits aura une incidence sur les densités optiques (DO). Retirer délicatement toutes les bulles avant de procéder à l'étape de lecture. V4.31 / August 09, / 6

3 10. La solution de substrat (TMB) est sensible à la lumière et doit rester incolore si elle est stockée correctement. Son instabilité ou sa contamination peuvent être indiquées par le développement d'une couleur bleue, auquel cas elle ne doit pas être utilisée. 11. Lors de la distribution du substrat et de la solution d'arrêt, ne pas utiliser des pipettes dans lesquelles ces liquides entrent en contact avec des pièces métalliques. 12. Pour éviter la contamination des réactifs, utiliser un nouvel embout de pipette jetable pour la distribution de chaque réactif, échantillon, standard et contrôle. 13. Ne pas mélanger des numéros de lots différents de composants du kit dans un test et ne pas utiliser les composants audelà de la date de péremption imprimée sur l'étiquette. 14. Les réactifs du kit doivent être considérés comme des déchets dangereux et être éliminés conformément aux réglementations nationales. LIMITES D UTILISATION 1. Tous les réactifs du kit sont calibrés pour la détermination directe de la prégnénolone dans le sérum humain. Le kit n'est pas calibré pour la détermination de la prégnénolone dans la salive, le plasma ou d'autres échantillons d'origine humaine ou animale. 2. Ne pas utiliser de sérum visiblement hémolysé, visiblement lipémique, ictérique ou stocké dans de mauvaises conditions. 3. Les échantillons ou sérums de contrôles contenant de l'azoture ou du thimérosal ne sont pas compatibles avec ce kit, car ils peuvent conduire à des résultats erronés. 4. Seul le calibrateur A peut être utilisé pour diluer des échantillons sériques élevés. L'utilisation de tout autre réactif peut conduire à des résultats erronés. 5. Les résultats obtenus avec ce kit ne doivent jamais être utilisés comme base unique de diagnostic clinique. Par exemple, l'apparition d'anticorps hétérophiles chez les patients régulièrement exposés à des animaux ou des produits d'origine animale peut potentiellement causer des interférences dans les tests immunologiques. Par conséquent, le diagnostic clinique doit inclure tous les aspects du contexte d'un patient, y compris la fréquence de l'exposition à des animaux / produits, si de faux résultats sont suspectés. AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONS DE SÉCURITÉ MATÉRIEL POTENTIELLEMENT DANGEREUX Le sérum humain qui peut être utilisé dans la préparation des standards et du contrôle a été testé et s'est avéré comme étant non réactif pour l'antigène de surface de l hépatite B. Il a également été testé pour la présence d'anticorps antivhc et le virus d'immunodéficience humaine (VIH) et s'est avéré être négatif. Cependant, aucune méthode ne peut offrir l'assurance complète que le VIH, le VHC et le virus de l'hépatite B ou d'autres agents infectieux sont absents. Les réactifs doivent être considérés comme un danger biologique potentiel et manipulés avec les mêmes précautions que celles appliquées à n'importe quel échantillon de sang. RISQUES CHIMIQUES Éviter tout contact avec des réactifs contenant du TMB, du peroxyde d'hydrogène et de l'acide sulfurique. En cas de contact avec l'un de ces réactifs, laver abondamment avec de l'eau. Le TMB serait cancérogène. COLLECTE ET STOCKAGE DES ÉCHANTILLONS Environ 0.2 ml de sérum est nécessaire pour la détermination en double. Recueillir 45 ml de sang dans un tube correctement étiqueté et laisser coaguler. Centrifuger et retirer soigneusement la couche de sérum. Conserver à 4 C pendant 24 heures ou à 10 C ou moins si l'analyse doit être effectuée à une date ultérieure. Considérer tous les échantillons possibles de l'homme comme matériaux biologiques susceptibles de présenter un risque et prendre les précautions adéquates lors de leur manipulation. PRÉTRAITEMENT SPÉCIMEN Ce test est un système direct; aucun traitement préalable du spécimen n'est nécessaire. RÉACTIFS ET MATÉRIEL REQUIS MAIS PAS FOURNIS 1. Pipettes de précision pour délivrer 50, 100, 150 et 300 μl 2. Embouts de pipette jetables 3. Eau distillée ou déminéralisée 4. Agitateur orbital (600 tr/min) (p.e. EAS 2/4, SLT) ou agitateur linéaire (200 tr/min) 5. Lecteur de microplaques avec un jeu de filtres à 450 nm et à une limite DO supérieure de 3.0 ou plus * (voir étape 10 de la procédure de test). V4.31 / August 09, / 6

4 RÉACTIFS FOURNIS 1. Puits sécables d'une plaque de microtritration recouverts d'anticorps anti prégnénolone de lapin Prête à l emploi. Contenu: Une plaque de micropuits de 96 puits (12x8) recouverts d'anticorps polyclonaux dans un sachet refermable contenant un agent desséchant. Stockage: Réfrigérer à 28 C 2. Conjugué Prégnénolone Peroxydase du Raifort (HRP) Concentré X50 Contenu: Conjugué prégnénolonehrp dans un tampon à base de protéines avec un agent de conservation sans mercure. Volume: 300 μl/flacon Stockage: Réfrigérer à 28 C Préparation: Diluer à 1:50 dans un tampon de test avant utilisation (p. ex., 40 μl de HRP dans 2 ml de tampon de test). Si toute la plaque doit être utilisée, diluer 240 μl de HRP dans 12 ml de Tampon pour Essai. Jeter tout ce qui reste. 3. Calibrateurs de Prégnénolone Prête à l emploi. Contenu: Six flacons contenant de la prégnénolone dans un tampon à base de protéines avec un agent de conservation sans mercure. Préparé en enrichissant un tampon avec une quantité définie de prégnénolone. * Voici la liste des concentrations approximatives, veuillezvous référer aux étiquettes des flacons pour connaître les concentrations exactes. Calibrateur Concentration Volume/Flacon Calibrateur A 0 ng/ml 2.0 ml Calibrateur B 0.1 ng/ml 1.0 ml Calibrateur C 0.4 ng/ml 1.0 ml Calibrateur D 1.6 ng/ml 1.0 ml Calibrateur E 6.4 ng/ml 1.0 ml Calibrateur F 25.6 ng/ml 1.0 ml Stockage: Réfrigérer à 28 C Stabilité: 12 mois dans le flacon fermé ou comme indiqué sur l'étiquette. Une fois ouverts, les standards doivent être utilisés dans les 14 jours ou aliquotés et congelés. Éviter de multiplier les cycles de congélation/décongélation. 4. Contrôles Prête à l emploi. Contenu: Deux flacons contenant de la prégnénolone dans un tampon à base de protéines avec un agent de conservation sans mercure. Préparé en enrichissant un tampon avec une quantité définie de prégnénolone. Reportezvous à l'étiquette du flacon pour la valeur attendue et la plage acceptable. Volume: 1.0 ml/flacon Stockage: Réfrigérer à 28 C Une fois ouverts, le contrôle doit être utilisé dans les 14 jours ou aliquotés et congelés. Éviter de multiplier les cycles de congélation/décongélation. 5. Tampon de Lavage Concentré X10 Contenu: Deux bouteilles contenant un tampon avec un détergent non ionique et un agent de conservation sans mercure. Volume: 50 ml/bouteille Stockage: Réfrigérer à 28 C Préparation: Diluer à 1:10 dans de l'eau distillée ou déminéralisée avant utilisation. Si toute la plaque doit être utilisée, diluer 50 ml de concentré de Tampon de Lavage dans 450 ml d'eau. V4.31 / August 09, / 6

5 6. Tampon pour Essai Prête à l emploi. Contenu: Un flacon contenant un tampon à base de protéines avec un agent de conservation sans mercure. Volume: 17 ml/ flacon Stockage: Réfrigérer à 28 C 7. Substrat TMB Prête à l emploi. Contenu: Une bouteille contenant du tétraméthylbenzidine et du peroxyde d'hydrogène dans un tampon nondmf ou contenant du DMSO. Volume: 18 ml/ bouteille Stockage: Réfrigérer à 28 C 8. Solution d Arrêt Prête à l emploi. Contenu: Un flacon contenant 1 M d'acide sulfurique. Volume: 8 ml/ flacon Stockage: Réfrigérer à 28 C PROCÉDURE DE TEST Prétraitement de l'échantillon: Aucun. Tous les réactifs doivent atteindre la température ambiante avant l utilisation. Calibrateurs, contrôles et échantillons de spécimen doivent être dosés en double exemplaire. Une fois que la procédure a été commencé, tous les étapes doivent être remplies sans interruption. 1. Préparer les solutions de travail de Conjugué HRPPrégnénolone et de Tampon de Lavage. 2. Sortir le nombre requis de barrettes de micropuits. Refermer le sac et remettre les bandes inutilisées au réfrigérateur. 3. Pipeter 50 μl de chaque Calibrateur, Contrôle et échantillon de spécimen dans les puits étiquetés correspondants en double. 4. Pipeter 100 μl de la Solution de Travail du Conjugué dans chaque puits (nous vous recommandons d'utiliser une pipette multicanaux). 5. Incuber 60 min à TA (1825 C) sur un agitateur orbital (env. 600 tr/min) ou agitateur linéaire (env. 200 tr/min). 6. Laver les puits 3 fois avec 300 μl de Tampon de Lavage dilué par puits, puis appuyer la plaque contre du papier absorbant fermement pour s'assurer qu'elle est bien sèche (l'utilisation d'une laveuse est recommandée). 7. Pipeter 150 μl de Substrat TMB dans chaque puits à intervalles programmés. 8. Incuber 1015 min à TA (1825 C) sur un agitateur orbital (env. 600 tr/min) ou agitateur linéaire (env. 200 tr/min) ou jusqu au moment que l étalon A atteind le couleur. 9. Pipeter 50 μl de Solution d'arrêt dans chaque puits, aux mêmes intervalles programmés que dans l étape Lire la plaque sur un lecteur de microplaques à 450 nm dans les 20 minutes suivant l'addition de la solution d'arrêt. * Si la DO dépasse la limite supérieure de détection ou si l'on ne dispose pas de filtre de 450 nm, il est possible d'utiliser un filtre de 405 ou de 415 nm. Les densités optiques seront plus faibles, cela n affectera pas les résultats des échantillons de patients / contrôle. CALCUL DES RESULTATS 1. Calculer la densité optique moyenne de chaque double de calibrateur. 2. Tracer une courbe d'étalonnage sur du papier semilogarithmique avec les densités optiques moyennes sur l'axe des ordonnées et les concentrations d'étalonnage sur l'axe des abscisses. Si un logiciel de test immunologique est utilisé, une courbe à 4 paramètres est recommandée. 3. Calculer la densité optique moyenne de chaque double inconnu. 4. Lire les valeurs des inconnues directement à partir de la courbe d'étalonnage. 5. Si la lecture d'un échantillon est supérieure à 25.6 ng/ml diluer avec un étalon A à une dilution de 1:8 au plus. Le résultat obtenu doit être multiplié par le facteur de dilution. V4.31 / August 09, / 6

6 DONNÉES TABULAIRES TYPES EXEMPLE TYPIQUE DE COURBE ÉTALON Exemple. Ne pas utiliser pour vos calculs! Calibrateur DO 1 DO 2 DO Valeur Moyenne (ng/ml) A B C D E F Inconnu nm D O Pregnenolone (ng/ml) CARACTERISTIQUES DU TEST SENSIBILITÉ La limite inférieure de détection est calculée à partir de la courbe standard en déterminant la concentration résultant de la DO moyenne du calibrateur A (basée sur 10 analyses répliquées) moins 2 DS. Par conséquent, la sensibilité du kit Pregnenolone ELISA (dosage direct) est de 0.05 ng/ml. SPÉCIFICITÉ (RÉACTION CROISÉE) Les composés suivants ont été testés pour leur réactivité croisée avec le kit Pregnenolone ELISA, avec une réaction croisée à 100 %. Stéroïdes % Réaction Croisée Prégnénolone 100 Progestérone 6.0 Déhydroisoandrostérone 5.2 5αandrostanédiol 4.7 Épiandrostérone 1.0 Sulfate de Prégnénolone 0.4 Androstandione 0.3 5αandrostérone 0.3 DHEAS 0.2 Étiocholanolone 0.1 Les stéroïdes suivants ont été testés, mais avec une réaction croisée à moins de 0.1 %: adrénostérone, aldostérone, androstènedione, cholestérol, corticostérone, 5αDHT, 17βestradiol, estriol et testostérone. PRÉCISION INTRAESSAI Trois échantillons ont été testés dix fois chacun sur la même courbe d'étalonnage. Les résultats (en ng/ml) sont reportés dans le tableau cidessous: Échantillon Moyenne SD CV % PRÉCISION INTERESSAI Trois échantillons ont été testés dix fois sur une période de quatre semaines. Les résultats (en ng/ml) sont donnés dans le tableau cidessous: Échantillon Moyenne SD CV % V4.31 / August 09, / 6

7 RÉCUPÉRATION Des échantillons enrichis ont été préparés en ajoutant des quantités définies de prégnénolone à quatre échantillons de sérum de patients. Les résultats (en ng/ml) sont reportés dans le tableau cidessous: Échantillon Résultat Obs. Résultat Att. Récupération % 1 non enrichi non enrichi non enrichi non enrichi LINEARITÉ Trois échantillons de sérum de patients ont été dilués avec le calibrateur A. Les résultats (en ng/ml) sont reportés dans le tableau cidessous: Echantillon Résultat Obs. Résultat Att. Récupération % 1 1:2 1:4 1: :2 1:4 1:8 3 1:2 1:4 1: VALEURS ATTENDUES Comme pour tous les dosages cliniques, chaque laboratoire doit collecter des données et établir sa propre gamme de valeurs normales attendues. Groupe N Moyenne Abs. Gamme (ng/ml) (ng/ml) Masculin Féminin LITTERATURE DE REFERENCE SUR LE PRODUIT 1. Abraham, G.E., et al. Radioimmunoassay of Plasma Pregnenolone. J. Clin. Endocrinol. Metab. 37(1):40, Hill, M., et al., Age Relaitonships and Sex Differences in Serum Levels of Pregnenolone and 17 hydroxypregnenolone in Healthy Subjects; Clin Chem Lab Med 37(4):439, Robel, P., et al., Biosynthesis and Assay of Neurosteroids in Rats and Mice. J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 53:335, Weusten, J.J., et al., Early Time Sequence in Pregnenolone Metabolism to Testosterone in Homogenates of Human and Rat Testis. Endocrinlogy 120:1909, Akwa, Y, et al., Neurosteroids: Biosynthesis, Metabolism and Function of Pregnenolone and Dehydroepiandrosterone in the brain. J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 40(13):71, McKenna, T.J. and Brown, R.D., Pregnenolone in Man: Plasma Levels in States of Normal and Abnormal Steroidogenesis. J. Clin. Endocrinol. Metab. 38(3):480, McKenna, T.J., et al., Pregnenolone, 17OHPregnenolone, and Testosterone in Plasma of Patients with Congenital Adrenal Hyperplasia. J. Clin. Endocrinol. Metab. 42(5):918, McKenna, T.J., et al., Plasma Pregnenolone in Patients with Adrenal Tumors, ACTH Excess, or Idiopathic Hirsutism. J. Clin. Endocrinol. Metab. 44(2):231, Wilson, J.D. and Foster, D.W. Williams Textbook of Endocrinology 8 th Edition. W.B. Saunders Company, London. pp , Check, J.H., et al, Falsely elevated steroidal assay levels related to heterophile antibodies against various animal species. Gynecol Obstet Invest 40:139140, V4.31 / August 09, / 6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύμβολα REF LOT CONC LYO IVD Cat.No.: / Kat.Nr.: / No. Cat.: / Cat.No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / ΑριθμόςΚατ.: LotNo.: / ChargenBez.: / No. Lot: / LotNo.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθμός Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιμοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθμός εξετάσεων: Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συμπύκνωμα Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασμένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / InvitroDiagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για InVitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται μακριά από θερμότητα και άμεση επαφή με το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύμβολα των συστατικών του κιτ συμβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. COMPLAINTS: Complaints may be submitted initially written or vocal. Subsequently they need to be filed including the test performance and results in writing in case of analytical reasons. WARRANTY: The product is warranted to be free from material defects within the specific shelf life and to comply with product specifications delivered with the product. The product must be used according to the Intended use, all instructions given in the instructions for use and within the product specific shelf life. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. LIMITATION OF LIABILITY: IN ALL CIRCUMSTANCES THE EXTENT OF MANUFACTURER S LIABILITY IS LIMITED TO THE PURCHASE PRICE OF THE KIT(S) IN QUESTION. IN NO EVENT SHALL MANUFACTURER BE LIABLE FOR ANY INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL DAMAGES, INCLUDING DAMAGES FOR LOST PROFITS, LOST SALES, INJURY TO PERSON OR PROPERTY OR ANY OTHER INCIDENTAL OR CONSEQUENTIAL LOSS. IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany Tel.: + 49 (0) Fax: 11 IBL@IBLInternational.com WEB: Symbols Version 4.5 /