Haemophilus influenzae B IgG ELISA

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1 Fiche technique Haemophilus influenzae B IgG ELISA Test immuno enzymatique pour le dosage des anticorps IgG contre le polyribosylribitolphosphate de l Haemophilus influenzae de type B dans le sérum et plasma humain. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. BUT DU TEST Test immuno enzymatique pour le dosage des anticorps IgG contre le polyribosylribitolphosphate (PRP) de l Haemophilus influenzae de type B dans le sérum et plasma humain. 2. SOMMAIRE ET INTRODUCTION L Haemophilus influenzae de type B (HiB) est un cas de maladie infectieuse critique très fréquent chez les enfants jusqu à six ans. Les symptômes suivant une infection incluent péricardites, ostéomyélites, méningites, encéphalites, pneumonies, sinusites et otites. Dans la plupart des cas, la maladie est mortelle ou provoque des lésions neurologiques qui ne peuvent pas toujours être évitées même avec des antibiotiques. La raison sous-jacente de cette maladie est très souvent une immunodéficience latente accompagnée d une réponse immunitaire humorale particulièrement réduite au polyribosylribitolphosphate (PRP) dans l encapsulation polysaccharide de la bactérie. L autre raison est l immaturité du système immunitaire. Aujourd hui, le terme courant «patients atteints de déficit immunitaire» est employé. Il comprend toutes les immunodéficiences spécifiques en non spécifiques acquises et innées. En conséquence, une vaccination avec différentes sortes de vaccins contenant du PRP est recommandée pour les enfants âgés de trois mois ou plus. Cela pourrait ainsi nettement diminuer le nombre d infections avec l Haemophilus influenzae de type B. Le dosage des anticorps produits grâce à la vaccination peut être utilisé pour confirmer la réussite d une vaccination. L HiB IgG est utilisé pour évaluer le niveau spécifique de PRP et d anticorps IgG après une période de 4 à 6 semaines d immunisation complète pour contrôler le statut de l immunité humorale de l enfant ou d autres individus à risque. Contrôle du statut immunitaire après une vaccination. Vérification du diagnostic d une infection à l Haemophilus influenzae de type B par contrôle renouvelé des concentrations en anticorps. Estimation du risque chez les patients immunodéficitaires ayant subi un échec de vaccination suite à un vaccin contenant du PRP. Ces groupes comprennent : Les enfants de moins de 2 ans atteints d une infection avec l Haemophilus influenzae de type B, Les enfants atteints d infections bactériologiques chroniques ou récurrentes du système respiratoire, Les enfants avec des otites chroniques, Les patients atteints d une déficience immunitaire humorale confirmée (Déficience IgG-2, déficience IgA-), Les patients atteints de déficiences granulocytaires confirmée, Les patients sous chimiothérapie ou sous thérapie cytostatique, Les enfants après une splénectomie Les patients atteints d une anémie falciforme Les patients atteints du syndrome de la trisomie 21 et certains groupes ethniques. 3. PRINCIPE DU TEST Le test IBL HiB-IgG est une méthode ELISA en deux étapes suivant le principe sandwich. Les puits de microplaques sont coatés avec la PRP. Les sérums et échantillons de plasma dilués sont incubés dans les puits (incubation des échantillons). Après une étape de lavage tous les composants non-liés et nonspécifiques sont éliminés. Le conjugué de réaction, un conjugué de peroxydase anticorps anti-igg humain (anti-igg humain-hrp) marque les IgG spécifiques fixés précédemment. Lors d une seconde étape de lavage, le conjugué non-lié est éliminé. La réaction substrat prend place lors d une troisième incubation. La partie peroxydase liée au conjugué oxyde le tétraméthylbenzidine (TMB) en une substance bleue. Cette réaction est arrêtée par ajout d acide sulfurique. La couleur vire alors au jaune. L intensité de la couleur est directement proportionnelle à la concentration des anticorps spécifiques à la PRP. L absorption est mesurée avec un lecteur ELISA à 450 nm. La concentration d anticorps dans l échantillon peut être définie en utilisant une courbe étalon. Version / 6

3 4. PRECAUTIONS D EMPLOI 1. Seulement prévu au diagnostic in-vitro et à l usage professionnel. 2. Lire les instructions complètement et avec attention avant de commencer le test. Utiliser la version valide de la fiche technique incluse dans le kit. S assurer que tout a été bien compris. 3. Dans le cas de dommages importants de l emballage du kit, veuillez contacter IBL ou votre fournisseur sous forme écrite, une semaine au plus tard après avoir reçu le kit. N utilisez pas les composants abîmés pour un test, mettez-les de côté et en sécurité pour les besoins éventuels liés à la plainte. 4. Suivez le numéro du lot et la date de péremption. Ne pas mélanger les réactifs de différents lots. Ne pas utiliser de réactifs périmés. 5. Suivre les bonnes pratiques de laboratoire et les directives de sécurité. Porter des blouses de laboratoire, gants en latex à usage unique et lunettes de protection si nécessaire. 6. Les réactifs de ce kit contiennent du matériel dangereux pouvant irriter les yeux et la peau. Consulter le MATERIEL FOURNI et les étiquettes pour les détails. Les Fiches de Données de Sécurité pour ce produit sont disponibles sur le site internet IBL ou sur demande particulière à IBL. 7. Les réactifs chimiques préparés ou utilisés doivent être traités comme matériel dangereux en accord avec les directives et règlements nationaux de sécurité pour tout matériel à risque. 8. Le personnel de nettoyage doit être formé par des professionnels en ce qui concerne les risques potentiels et la manipulation des produits. 9. Eviter tout contact avec la solution d arrêt. Elle peut provoquer des irritations et brûlures cutanées. 10. Tous les réactifs de ce kit contenant des sérums ou plasma humains ont été testés et confirmés négatifs à anti-hiv I/II, HbsAg et anti-hcv. Tous les réactifs doivent être considérés comme potentiellement contaminants et utilisés en tant que tel. 5. STOCKAGE ET STABILITE Le kit est envoyé à température ambiante et doit être stocké entre 2 C et 8 C. À conserver à l abri de la chaleur ou de la lumière directe. Le stockage et la stabilité des échantillons et réactifs préparés sont indiqués dans les chapitres correspondants. Les barrettes de la microplaque sont stables jusqu à 6 mois, stockées à 2 8 C dans un sachet ouvert mais bien refermé. 6. COLLECTE ET STOCKAGE DES ECHANTILLONS Sérum humain, Citrate-, EDTA- ou Héparine-Plasma. Observer les précautions habituelles de prises de sang. Il est important de préserver l intégrité chimique d un échantillon sanguin, de sa collecte jusqu à son analyse. Ne pas utiliser d échantillons fortement hémolysés, ictériques ou lipémiques. Les échantillons d apparence turbide doivent être centrifugés avant analyse pour éliminer toute particule gênante. Stockage: 2-8 C -20 C (Aliquots) À conserver à l abri de la chaleur ou de la lumière directe. Stabilité: 6 semaines 6 mois Eviter tout cycles de congélation / décongélation répétés. Version / 6

4 7. MATERIEL FOURNI Quantité Symbole Composant 1 x 12 x 8 MTP 1 x 0.3 ml ENZCONJ CONC 5 x 0.35 ml CAL x 0.35 ml POS LL, POS HL 2 x 75 ml DILBUF 1 x 100 ml WASHBUF CONC 1 x 15 ml TMB SUBS Microplaque Puits coatés contenant PRP du virus de l Haemophilus influenzae de type B. Prêts à l emploi. Conjugué Enzymatique, Concentré Anti-humain IgG conjugué à la peroxydase; coloré en bleu. Diluer avant emploi! CAL 1-5, Concentré (NISBC code 09/222) Contient: sérum humain, stabilisateurs, conservateurs. Les concentrations sont spécifiques au lot et sont indiquées sur les étiquettes des flacons. Diluer avant emploi! Control LL+HL, Concentré Contrôle positif Sérum, LL, Low Level, HL, High Level. Contient: sérum humain, stabilisateurs, conservateurs. Les concentrations sont spécifiques au lot et sont indiquées sur les étiquettes des flacons. Diluer avant emploi. Tampon Diluant 0.01 M Tris/HCl; ph 7.4.; contient: détergent; 0.01 % (w/v) thimerosal; coloré en rouge. Prêt(e) à l emploi. Tampon de Lavage, Concentré (10x) Contient: Tampon phosphate Solution Substrat TMB Contient: TMB (tetramethylbenzidine). Prêt(e) à l emploi. 1 x 15 ml TMB STOP Solution d Arrêt TMB Contient: 0.5 M d acide sulfurique. Prêt(e) à l emploi. 2 pieces FOIL Feuille Adhésive Note: Le tampon de lavage, la solution de substrat et d arrêt sont interchangeables avec les produits suivants: TBE /FSME IgG (RE57401), TBE / FSME IgM (RE57411), Tetanus (RE57441) et la Diphtherie (RE57431). 8. MATERIEL NECESSITE MAIS NON FOURNI 1. Pipettes (Multipette Eppendorf ou matériel similaire, CV < 3 %) Volumes: 20; 100; 500; 1000 µl 2. Vortex 3. Tubes pour la dilution des échantillons 4. Micropipette à 8-canaux avec réservoirs pour réactifs 5. Bouteille pour lavage, système automatique ou semi-automatique pour le lavage de microplaque 6. Lecteur de microplaque capable de lire l absorbance à 450 nm (longueur d onde de référence nm) 7. Eau bidistillée ou désionisée 8. Papier absorbant, embouts de pipette et chronomètre 9. NOTES POUR LA PROCEDURE 1. Toute manipulation impropre des échantillons ou modification de la procédure du test peut influencer les résultats. Les volumes indiqués pour pipeter, les temps d incubation, températures et étapes de prétraitement doivent être strictement suivis selon les instructions. N utiliser que des pipettes et appareils calibrés. 2. Une fois que le test a commencé, toutes les étapes doivent être suivies sans interruption. S assurer que les réactifs, matériels et appareils nécessaires soient prêts au moment approprié. Amener tous les réactifs et échantillons à température ambiante (18-25 C) et mélanger doucement en tournant chaque flacon de réactif liquide et d échantillon avant emploi. Mélanger les réactifs sans former de mousse. 3. Eviter toute contamination des réactifs, pipettes et puits/tubes. Utiliser des nouveaux embouts de pipette en plastique pour chaque réactif, étalon ou échantillon. Ne pas interchanger les bouchons. Toujours refermer les flacons non utilisés. Ne pas réutiliser les puits/tubes ou réactifs. 4. Il est recommandé de doser les échantillons en double pour pouvoir identifier d éventuelles erreurs de pipetage. 5. Utiliser un schéma de pipetage pour vérifier la répartition appropriée de la plaque. Version / 6

5 6. Le temps d incubation affecte les résultats. Tous les puits doivent être manipulés dans le même ordre et au même intervalle de temps. Il est recommandé d utiliser une micropipette à 8-cannaux pour pipeter une même solution dans tous les puits. 7. Le lavage de la microplaque est important. Des puits mal lavés provoqueront des résultats erronés. Il est recommandé d utiliser une pipette multicanaux ou un système de lavage de microplaque automatique. Ne pas laisser sécher les puits entre les incubations. Ne pas gratter les puits coatés pendant le rinçage ou l aspiration. Rincer et ajouter les réactifs avec précaution. Lors du rinçage, vérifier que tous les puits soient régulièrement remplis avec le tampon de lavage, et qu aucun reste ne soit ensuite visible. 8. L humidité affecte les puits/tubes coatés. Ne pas ouvrir le sachet avant que celui-ci n ait atteint la température ambiante. Les puits/tubes inutilisés doivent être rangés immédiatement dans le sachet refermé avec le dessiccateur. 10. PREPARATIONS PREALABLES AU TEST Préparation des Composants Le contenu du kit pour 96 dosages peut être divisé en 3 analyses différentes. Les volumes indiqués ci-dessous sont pour un test avec 4 barrettes (32 dosages). Diluer / dissoudre Composant avec Diluant Relation Remarques Stockage Stabilité 60 µl ENZCONJ CONC 6 ml DILBUF 1: ml WASHBUF CONC 270 ml Aqua dest. 1: Dilution des Etalons, Contrôles et Echantillons CAL 1-5 CONTROL LL CONTROL HL Mélanger avec précaution. Mélanger avec précaution. 2-8 C 2-8 C doit être dilué avec Relation Remarques 1 heure 8 semaines en général DILBUF 1:26 par ex. 20 µl µl Sérum / Plasma en général DILBUF 1:26 par ex. 20 µl µl Pour la détermination par la courbe de l étalon on utilise les calibrateurs 1 à 5 et les sérums de contrôles. 11. PROCEDURE DU TEST 1. Pipeter 100 µl des Etalons dilués, Contrôles dilués et échantillons dilués dans les puits respectifs de la microplaque. 2. Couvrir la plaque avec une feuille adhésive. Incuber 1 h à TA (18-25 C). 3. Retirer la feuille adhésive. Jeter la solution d incubation. Laver la plaque 3 x avec 250 µl de Tampon de Lavage dilué. Egoutter l excès de solution en frappant la plaque retournée sur du papier absorbant. 4. Pipeter 100 µl de Conjugué Enzymatique dilué dans chaque puits. 5. Couvrir la plaque avec une feuille adhésive. Incuber 1 h à TA (18-25 C). 6. Retirer la feuille adhésive. Jeter la solution d incubation. Laver la plaque 3 x avec 250 µl de Tampon de Lavage dilué. Egoutter l excès de solution en frappant la plaque retournée sur du papier absorbant. 7. Utiliser une micropipette à 8 canaux si possible pour l ajout des Solutions Substrat et d Arrêt. Pipeter ces solutions à la même cadence. Utiliser un déplacement positif et éviter la formation de bulles d air. 8. Pipeter 100 µl de Solution Substrat TMB dans chaque puits. 9. Incuber 30 min à TA (18-25 C). 10. Arrêter la réaction substrat en ajoutant 100 µl de Solution d Arrêt TMB dans chaque puits. Mélanger rapidement le contenu en agitant la plaque. 11. Mesurer la densité optique avec un photomètre à 450 nm ± 10 nm (longueur d onde de référence: nm) dans les 10 min suivant l ajout de la Solution d Arrêt. Version / 6

6 12. CONTROLE QUALITE Les résultats du test ne sont valides que si le test a été réalisé en suivant les instructions. De plus, l utilisateur doit strictement se conformer aux règles BPL (bonnes pratiques de laboratoire) ou directives comparables. L utilisateur et/ou le laboratoire doivent disposer d un système validé pour établir un diagnostic conformément aux principes de BPL. Tous les étalons et contrôles du kit doivent être trouvés dans les gammes acceptables indiquées sur les étiquettes et dans le certificat de Contrôle Qualité (CQ). Si ces critères ne sont pas remplis, le test est non valide et il doit être répété. Chaque laboratoire devrait utiliser des échantillons connus comme contrôle supplémentaire. Il est recommandé de participer aux programmes de contrôle qualité appropriés. En cas de déviation des résultats, vérifier les origines éventuelles techniques: dates de péremption des réactifs (préparés), conditions de stockage, pipettes, appareils, conditions d incubation et méthodes de lavage. 13. CALCUL DES RESULTATS Les densités optiques (DO) des étalons (axe y, linéaire) sont reportées en fonction de leurs concentrations (axe x, logarithmique) soit sur papier graphique semi-logarithmique soit en utilisant une méthode automatisée. Axe-x (log): Concentration en [µg/ml] Axe-y (lin): Absorption (densité optique) Une bonne analyse est obtenue avec les méthodes cubic spline, Logistics 4 Paramètres ou Logit-Log (exemple: Paramètre 4, équation 1). Equation 1: Y = d+(a-d)/(1+(x/c) b ) Pour le calcul de la courbe étalon, utiliser chaque signal des étalons (une valeur apparemment fausse d un double dosage peut ne pas être prise en compte et peut être remplacée par une valeur plus plausible). La concentration des échantillons peut être lue à partir de la courbe étalon. Les échantillons montrant une concentration supérieure à celle de l étalon le plus concentré doivent être dilués avec un tampon diluant. Les résultats mesurés doivent être multipliées par le facteur de dilution pour obtenir des résultats corrects. La concentration des valeurs obtenues à partir de plasma citraté doivent être multipliées par 1.1 Validation des critères de qualité : Voir le certificat Q-C. 14. INTERPRETATION DES RESULTATS Le dosage des anticorps spécifiques au PRP indique le niveau de réaction immunitaire humorale après une immunisation avec un vaccin contenant du PRP ou une infection apparente ou inapparente de l Haemophilus influenzae de type B. Lorsque ce test est négatif et que le patient appartient à groupe à risque (cf «indications»), un risque d infection par l Haemophilus influenzae de type B existe. Les réactions immunitaires humorales suite à une infection non typique par l Haemophilus influenzae ne sont pas détectables avec la méthode HiB IgG. L échec d une séroconversion après vaccination montre la capacité de réagir face aux antigènes carbohydrates des bactéries. Une immunodéficience spécifique aux polysaccharides peut être observée chez les patients atteints de bronchites chroniques, de pneumonie récurrente, d asthme bronchique intrinsèque ou une bronchiectasie de genèse. Comme reportée dans différentes publications [2, 8, 9, 10, 11], une concentration en anticorps inférieure à 0.15 µg/ml fournit une protection insuffisante contre l Haemophilus influenzae de type B. Des concentrations en anticorps comprises entre 0.15 et 1.0 µg/ml indiquent que le patient à été immunisé avec le PRP ou a eu une infection avec HiB. Seulement une concentration en anticorps supérieure à 1.0 µg/ml représente une immunité naturelle suffisante ou une immunité acquise suite à la troisième vaccination. Version / 6

7 15. PERFORMANCE Variation intraessai: 2 échantillons compris dans la gamme de concentration des étalons ont été dosés 20 fois chacun avec un même lot. La variation intra-essai était 10%. Variation interessai: Les contrôles POS HL et POS LL ont été dosés en double dans 20 tests et à des jours différents avec un même lot de kit. La précision inter-essai était respectivement située entre 9 and 12 %. Limitede détection inférieure: 0.1 µg/ml (spécifique au lot). 16. LITTERATURE DE REFERENCE DU PRODUIT 1. Barra, A. et al.: Measurement of Anti-Haemophilus influenzae type B capsular polysaccharide antibodies by ELISA. J. Immunol. Meth. 115, 111 (1988) 2. Claesson, BA. et al.: Development of serum antibodies of the immuno-globulin G class and subclasses against the capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae type B in children and adults with invasive infections. J. Clin. Microbiol. 26, 2549 (1988) 3. Dolan, K.T. et al.: An enzyme-linked immunosorbent assay for quantitation of Haemophilus influenzae type B polysaccharide-specific IgG1 and IgG2 in human and infant rhesus monkey sera. J. Immunoassay 12, 543 (1991) 4. Hetherington, S.V. et al.: Correlation between antibody affinity and serum bactericidal activity in infants. J. Infect. Dis. 165, 753 (1992) 5. Isaacs, D.: Infectious diseases. Editorial overview. Curr. Opin. Pediat. 4, 45 (1992) 6. Kristensen, K., Weis Bentzon, M.: Relation between enzyme-linked immunosorbent assay and radioimmunoassay for the detection of antibodies to the capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae type B. Acta. path. microbiol. immunol. scand. Sect. C 100, 142 (1992) 7. Lagergard, T. et al.: Comparison between radioimmunoassay and direct and indirect enzymelinked immunosorbent assay for determination of antibodies against Haemophilus influenzae type B capsular polysaccharide. J. Clin. Microbiol. 26, 2554 (1988) 8. Käyhty, H. et al.: Antibodies response to capsular polysaccharides of groups A and C Neisseria meningitis and Haemophilus influenzae type b during bacteremic disease. Infect. Dis. 143, 32 (1981) 9. Anderson, P.: The protective level of serum antibodies to the capsular polysaccharide of Haemophilus influenzae type B. J. Infect. Dis. 149, 1034 (1984) 10. Zielen, S. et al.: Untersuchung zur Effektivität der Haemophilus-influenzae-B-Diphtherie- Konjugatimpfung bei deutschen Kindern. Monatsschr. Kinderheilkunde 140, 852 (1992) 11. Zielen, S., Ahrens, P.: Haemophilus influenzae Typ B-Impfserologie. Ellipse 11, 15 (1994) 12. Togni, G. u. a.: Präanalytik. Schweiz. Med. Forum. 6, (2002) Version / 6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /