I-1 SOUCHES BACTERIENNES ETUDIEES

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1 I/ MISE AU POINT DE LA MICROMETHODE I- SOUCHES BACTERIENNES ETUDIEES Nous avons eu à tester lors de notre étude 20 souches de bacilles à Gram négatif non fermentaires qui ont été isolées au niveau des laboratoires de bactériologie de l Hopital Aristide Le Dantec et de l Institut Pasteur (voir tableau XIV). Les souches ont été isolées depuis 997 dans des tubes Dunk contenant le bouillon cœur-cervelle. Le choix de ces 20 souches s explique par leur stabilité biochimique et par leur forte implication dans les infections nosocominales [28]. Tableau XIV : Répartition des souches bactériennes étudiées Souches bactériennes Nombre Pseudomonas aeruginosa 5 Pseudomonas putida Pseudomonas fluorescens Pseudomonas stutzeri Acinetobacter baumannii Flavobacterium breve TOTAL 20 A partir d une colonie de 24 heures sur milieu de Mac Conkey, les souches ont été identifiées avec les microplaques après des tests préliminaires que sont l état frais, la coloration de Gram, le test à l oxydase et la détermination du type respiratoire.

2 I-2 CARACTERES BIOCHIMIQUES D IDENTIFICATION Les caractères biochimiques et enzymatiques suivants ont été retenus lors de la mise au point de lamicrométhode. - La non fermentation de glucose, du xylose, du mannitol, du sorbitol et du lactose. - La synthése d arginine dyhdrolase, de nitrate réductase - L hydrolyse de l esculine et l utilisation du citrate dans le milieu de Christensen et de Simmons. I-3 CHOIX DES INDICATEURS COLORES La microméthode repose sur des réactions chromogéniques d identification. Elle nécessite l utilisation d indicateurs colorés dont la zone de virage coincide le plus possible avec les variations du ph des différents milieux lorsque les réactions sont positives. Le rouge de phénol et le bleu de bromothymol qui ont été employés ont répondu à ce critère. I-4 DELAI DE LECTURE Les résultats obtenus lors de l étude du délai minimal de lecture peuvent être représentés dans le tableau ci-dessous. Tableau XV : Concordance (%) de l identification en fonction du temps d incubation Délai de lecture Identification Caractères 24 heures 00 94, 48 heures 00 00

3 Dès la 24 ème heure, l identification des bacilles à Gram négatif non fermentaires a été effectuée avec un taux de 00% et les caractères ont présenté une concordance de l ordre de 94,% (6 caractères sur 7), la nitrate réductase étant négative lors de cette première lecture. Dès la 48 ème heure, l identification était toujours faite avec 00% de concordance et les caractères ont abouti à une concordance de 00% car le nitrate avait alors viré. A partir de la 72 ème heure, les profils obtenus ininterprétables. Il résulte de cette étude que dès la 24 ème heure, l identification des bacilles à Gram négatif non fermentaires par la microméthode est possible après une incubation à 37 C avec un risque faible de mauvaise identification et un risque nul à la 48 ème heure d identification.

4 Tableau XVI : Caractères d identification NIT ESC ADH Urée GEL CS CC H 2 S IND MAL PDA ONPG GLU LAC XYL SOR MAN ESPECES [+] Pseudomonas aeruginosa Pseudomonas putida Pseudomonas fluorescens Pseudomonas stutzeri + [-] [+] Acinetobacter baumannii Acinetobacter lwoffii Burkolderia cepacia Burkolderia pseudomallei [+] Flavobacterium odoratum Flavobacterium breve - [+] Stenotrophomonas maltophilia [+] Alcaligenes faecalis Alcaligenes denitrificans + : positive - : négative [+] : majorité positive [-] : majorité négative

5 I-5 EVALUATION Sur les 20 souches testées toutes ont été aisément identifiées. Certes il nous est quelques rares fois arrivé de reprendre l identification pour cause souillure mais aucune souche n a donné de résultats ininterprétables. Toutes les identifications faites avec la microméthode ont été confirmées par la minigalerie et le BBL CRYSTAL E/NF.ID Rappelons que la microméthode utilise 7 caractères biochimiques pour l identification contre caractères en général (glucose, lactose, phénylalanine, mannitol, indole, SH 2, urée, ADH, ONPG, acide phényl puryvique, mobilité) pour la minigalerie et contre 30 caractères pour le BBL CRYSTAL E/NF.ID. Cependant des tests préliminaires (état frais, coloration de Gram, réaction des oxydases, détermination du type respiratoire) ont été faits avant d utiliser la microméthode. II/ CONTROLE DE QUALITE II- STERILITE Le milieu nouvellement préparé fait l objet d un test de stérilité, s il y a un virage de l indicateur coloré dans la cupule témoin non ensemencée, le milieu est éliminé car considéré comme non stérile. Lors de notre étude tous les milieux ont été stériles. II-2 EFFICACITE Le milieu stérile a été soumis à un contrôle d efficacité avec des souches de contrôle. Tous les milieux avaient une bonne efficacité.

6 II-3 REPETABILITE Il a été procédé à six (6) tests différés avec chaque milieu, dont trois (3) pour le témoin positif et trois (3) pour le témoin négatif. Pour tous les tests faits il y a eu 00% de concordance. II-4 STABILITE Le test de stabilité a été effectué chaque semaine sur les milieux conservés à 4 C. Les milieux ont été stables pendant les deux (2) mois de nos manipulations. III/ ETUDE COMPARATIVE Sur un total de 20 souches de bacilles à Gram négatif non fermentaires identifiées par la microméthode comme le montre le tableau XVII, il existe une concordance qui correspond à un taux de 00% lors de l identification par la minigalerie classique (20souches) et à 00% lors de l identification par le BBL CRYSTAL E/NF.ID (20 souches).

7 Tableau XVII : Distribution (%) des souches de bacilles à Gram négatif non fermentaires en fonction de la méthode d identification Méthodes Espèces Microméthode Pseudomonas aeruginosa 5 Pseudomonas fluorescens Pseudomonas putida Pseudomonas stutzeri Flavobacterium breve Acinetobacter baumannii BBL-CRYSTAL E/NF. ID 5 Minigalerie classique 5 Total indéterminé Discordance Aucune souche n a donné un profil ininterprétable lors de l identification avec les trois méthodes utilisées. Toutes les souches qui ont été identifiées par la minigalerie classique et la microméthode ont été confirmées par le BBL CRYSTAL E/NF.ID. Sur les 7 caractères de la microméthode, seuls étaient testés par la minigalerie classique. Nous avons ensuite exprimé le pourcentage de concordance des caractères étudiés par la minigalerie classique, la microméthode et le BBL CRYSTAL E/NF.ID pour chaque espéce.