Intérêt du séquençage à haut débit dans le. myéloblastiques
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- Gustave Malo
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1 Intérêt du séquençage à haut débit dans le génotypage des leucémies aigües myéloblastiques. O Nibourel; T. Boyer, M Figeac; C Villenet; S Quief; F Leprêtre; C Roumier; S Geffroy ; A Marceau; A Renneville ; P Peyrouze; M Cheok; C Preudhomme
2 Leucémie Aigue Myéloblastique Pathologie très hétérogène sur le plan moléculaire Nombreux gènes atteint de manière récurrente. NPM1, FLT3, CEBPa, IDH1, IDH2, TET2, AML1,. Recherche étendue des mutations: dépassement des capacités de séquençage par technique classique
3 Objectifs de l'étude Evaluation des techniques de séquençage à haut débit pour la détection de mutations acquises dans les LAM Evaluation de la méthode sur un ensemble de gènes préalablement étudiés par séquençage direct Validation des variations détectées sur les autres gènes.
4 Patients et méthode Patients 21 échantillons obtenus au diagnostic de patients atteints de LAM Méthode Gènes étudiés 43 gènes impliqués dans les leucémies aigues Constitution de la librairie par Capture Agilent SureSelect Séquençage: Solid 4 Détection des variations Bfast, Pileup et VarScan. Validation des variations chromosome chr1 chr2 chr4 chr5 chr6 chr7 chr8 chr9 chr11 chr12 chr13 chr15 chr16 chr17 chr19 chr20 chr21 chr22 chrx gènes JAK1, MPL, NRAS IDH1 FBXW7, KIT, PDGFRA, TET2 CSF1R, NPM1, PDGFRB DEK HIPK2, IKZF1 NOV, RUNX1T1 ABL1, CDKN2A, CDKN2B, JAK2, NOTCH1, NUP214, PAX5 CBL, MLL, WT1 ETV6, KRAS, PTPN11 FLT3, RB1 IDH2 MYH11 NF1, RARA, TP53 CDKN2D, CEBPA ASXL1 RUNX1 BCR GATA1 Sequençage direct
5 Patients et méthode Patients 21 échantillons obtenus au diagnostic de patients atteints de LAM Méthode Gènes étudiés 43 gènes impliqués dans les leucémies aigues Constitution de la librairie par Capture Agilent SureSelect Séquençage: Solid 4 Detection des variations Bfast, Pileup et VarScan. Validation des variations Sequençage direct
6 Séquençage à haut débit
7 Séquençage à haut débit
8 Résultats: couverture et profondeur de séquençage Profondeur de séquençage Nombre de lecture de chaque base Couverture Proportion d une région avec un nombre suffisant de lecture Profondeur Couverture
9 Résultats: couverture et profondeur de séquençage Profondeur de séquençage 80% des exons avec une profondeur moyenne supérieure à 500 Couverture 95% des exons avec une couverture >98% Profondeur et couverture du gène RUNX1
10 Résultats: gènes préalablement séquencés NPM FLT3 CEBPa IDH2 WT1 RUNX1 TET2 Gènes Mutation NPM FLT3-TKD FLT3-ITD C-terminale P29R V218M N338Fs G355D P363L M1701I I1718L I1721W I1762V Mutation: R1354G 21 substitutions et 5 insertions/délétions distinctes Toutes retrouvées sauf 1 insertion dans gène Runx1 (A115LfsX3, 342_343insCTTG) 2 duplications de FLT3 non retrouvées Patients 1 et 2: insertion de 47 et 23 bp
11 Mutations Patient 14: FLT3 D835Y Patient 15 FLT3 D835H
12 Résultats: 36 gènes non séquencés au préalable Single nucléotide Polymorphism (SNP): 39 SNP distincts observés dans 16 gènes Base dbsnp 135 Absence d association avec des pathologies connues 162 évènements au total Nombre de patients par SNP 1 à 21 patients Gène SNP browser Position Nombre de Patients rs chr rs chr rs chr JAK1 rs chr rs chr rs chr rs chr PDGFRA rs chr rs chr KIT rs chr TET2 rs chr rs chr CSF1R rs chr PDGFRB rs chr RUNX1T1 rs chr NOV rs chr JAK2 rs chr rs chr ABL1 rs chr rs chr NUP214 rs chr rs chr rs chr rs chr rs chr NOTCH1 rs chr rs chr rs chr rs chr CBL rs chr rs chr PTPN11 rs chr rs chr MYH11 rs chr rs chr rs chr rs chr ASXL1 rs chr rs chr
13 Résultats: 36 gènes non séquencés au préalable Single nucléotide variation (SNV) 20 SNV distincts observés dans 13 gènes Non rapportés dans la Base dbsnp évènements au total Nombre de patients par SNV 1 à 7 patients Insertion/délétion 4 insertion délétions détectée Nombre Patients Chrom position Gène variation 1 chr NRAS G/T Q61K 1 chr KIT A/G I539V 1 chr PDGFRB C/T N103S 5 chr HIPK2 A/C W859C 1 chr RUNX1T1 A/C L189F 1 chr NOTCH1 A/G T2382T 1 chr NOTCH1 A/G N1469N 1 chr NOTCH1 A/G R913W 1 chr NOTCH1 A/G S341R 1 chr PTPN11 C/T A72V 1 chr PTPN11 A/G V490I 3 chr IDH2 A/G R149W 1 chr MYH11 A/G P1933L 1 chr TP53 A/G R196* 1 chr NF1 A/G H2123R 1 chr ASXL1 A/G A12T 7 chr BCR A/G R1072H 5 chr BCR C/T R1080C 3 chr BCR C/T M1119T 3 chr BCR A/T T1127S Nombre Patients Chrom Position Gène exon Indel 4 chr ABL1 11 */+C 19 chr NUP */-A 1 chr NF1 57 */-GTAGT 5 chr BCR 19 */+CCGG
14 Résultats: 36 gènes non séquencés au préalable Faux positif Ex: Variation R1072H du gène BCR GTGAGAGAGGTCCAAGGTGCCCTACATCGTGCACCAGTGCGTGGAGGAGA Idem pour ABL, BCR, PTPN11
15 Résultats: 36 gènes non séquencés au préalable Single nucléotide variation (SNV) 20 SNV distincts observés dans 13 gènes Non rapportés dans la Base dbsnp évènements au total Nombre de patients par SNV 1 à 7 patients Insertion/délétion 4 insertion délétions détectée Nombre Patients Chrom position Gène variation 1 chr NRAS G/T Q61K 1 chr KIT A/G I539V 1 chr PDGFRB C/T N103S 5 chr HIPK2 A/C W859C 1 chr RUNX1T1 A/C L189F 1 chr NOTCH1 A/G T2382T 1 chr NOTCH1 A/G N1469N 1 chr NOTCH1 A/G R913W 1 chr NOTCH1 A/G S341R 1 chr PTPN11 C/T A72V 1 chr PTPN11 A/G V490I 3 chr IDH2 A/G R149W 1 chr MYH11 A/G P1933L 1 chr TP53 A/G R196* 1 chr NF1 A/G H2123R 1 chr ASXL1 A/G A12T 7 chr BCR A/G R1072H 5 chr BCR C/T R1080C 3 chr BCR C/T M1119T 3 chr BCR A/T T1127S Nombre Patients Chrom Position Gène exon Indel 4 chr ABL1 11 */+C 19 chr NUP */-A 1 chr NF1 57 */-GTAGT 5 chr BCR 19 */+CCGG
16 Résultats: 36 gènes non séquencés au préalable Single nucléotide variation (SNV) 20 SNV distincts observés dans 13 gènes Non rapportés dans la Base dbsnp évènements au total Nombre de patients par SNV 1 à 7 patients Insertion/délétion 4 insertion délétions détectée Nombre Patients Chrom position Gène variation 1 chr NRAS G/T Q61K 1 chr KIT A/G I539V 1 chr PDGFRB C/T N103S 5 chr HIPK2 A/C W859C 1 chr RUNX1T1 A/C L189F 1 chr NOTCH1 A/G T2382T 1 chr NOTCH1 A/G N1469N 1 chr NOTCH1 A/G R913W 1 chr NOTCH1 A/G S341R 1 chr PTPN11 C/T A72V 1 chr PTPN11 A/G V490I 3 chr IDH2 A/G R149W 1 chr MYH11 A/G P1933L 1 chr TP53 A/G R196* 1 chr NF1 A/G H2123R 1 chr ASXL1 A/G A12T 7 chr BCR A/G R1072H 5 chr BCR C/T R1080C 3 chr BCR C/T M1119T 3 chr BCR A/T T1127S Nombre Patients Chrom Position Gène exon Indel 4 chr ABL1 11 */+C 19 chr NUP */-A 1 chr NF1 57 */-GTAGT 5 chr BCR 19 */+CCGG
17 Mutations Patient 16: NRAS Q61K Caryotype: 46,XX,inv(16)(p13;q22)[3] 46,XX,inv(16)(p13;q22),del7(q32;q36)[17]
18 Mutations Patient 19: PTPN11 A72V
19 Mutations Patient 7: Caryotype: 43,X,-Y,add(5)(q?15), +13,der(14;15)(q10;q10), -16,-17,-18, -21,+22,+mar1 [12]
20 Résultats: 36 gènes non séquencés au préalable Single nucléotide variation (SNV) 20 SNV distincts observés dans 13 gènes Non rapportés dans la Base dbsnp évènements au total Nombre de patients par SNV 1 à 7 patients Insertion/délétion 4 insertion délétions détectée Nombre Patients Chrom position Gène variation 1 chr NRAS G/T Q61K 1 chr KIT A/G I539V 1 chr PDGFRB C/T N103S 5 chr HIPK2 A/C W859C 1 chr RUNX1T1 A/C L189F 1 chr NOTCH1 A/G T2382T 1 chr NOTCH1 A/G N1469N 1 chr NOTCH1 A/G R913W 1 chr NOTCH1 A/G S341R 1 chr PTPN11 C/T A72V 1 chr PTPN11 A/G V490I 3 chr IDH2 A/G R149W 1 chr MYH11 A/G P1933L 1 chr TP53 A/G R196* 1 chr NF1 A/G H2123R 1 chr ASXL1 A/G A12T 7 chr BCR A/G R1072H 5 chr BCR C/T R1080C 3 chr BCR C/T M1119T 3 chr BCR A/T T1127S Nombre Patients Chrom Position Gène exon Indel 4 chr ABL1 11 */+C 19 chr NUP */-A 1 chr NF1 57 */-GTAGT 5 chr BCR 19 */+CCGG
21 SNV Patient 12: KIT I1539V Caryotype: 46,XX,t(3;17)(p13;p13),inv(16)(p13q22)[7] 46,XX,t(3;17)(p13;p13),inv(16)(p13q22)[7] / 46,XX[1]
22 SNV Patient 12: KIT I1539V Caryotype: 46,XX,t(3;17)(p13;p13),inv(16)(p13q22)[7] 46,XX,t(3;17)(p13;p13),inv(16)(p13q22)[7] / 46,XX[1]
23 SNV Patient 10: RUNX1T1 (ETO): L189F Caryotype: 46-49,XX,r(21),+(0-3)mar[20cell]
24 SNV Patient 20: NF1: H2123R Caryotype: 45,XX,-7,del(12)(p11p12),t(17;18)(q24;,q11)[20]
25 SNV Patient 20: NF1: H2123R Caryotype: 45,XX,-7,del(12)(p11p12),t(17;18)(q24;,q11)[20]
26 Résultats Parmi les 21 patients: 9 variations Identifiées chez 8 patients 6 mutations sans signification clinique claires 3 mutations déjà rapportées TP53, PTPN11, RAS 3patients distincts: Pas de mutation des gènes préalablement séquencé mutation chez les 3 patients Gènes NPM FLT3-TKD FLT3-ITD CEBPa IDH2 WT1 RUNX1 TET2 NRAS PTPN11 KIT TP53 RUNX1T1 NF1 PDGFRB MYH11 ASXL1
27 Conclusion Obtention d une profondeur et couverture de séquençage permettant l analyse des 43 gènes simultanément Concordance entre le séquençage à haut débit et le séquençage classique sur 96% des mutations préalablement détectées Détection d une mutation avec une signification clinique déjà rapportée chez 3 des 21 patients Le séquençage à haut débit pourrait faciliter un screening étendu des mutations au moment du diagnostic des patients atteints de LAM
28 Perspectives Augmentation du nombre de gènes Optimisation de la spécificité du séquençage évolution des techniques permettant d obtenir des séquences plus longues Constitution des librairies par des approches plus ciblées: PCR multiplex
29 Remerciements CHRU Lille T. Boyer R. Dulery C Roumier S Geffroy A Marceau A Renneville C Preudhomme IRCL, Plateforme Génomique M Figeac C Villenet S Quief F Leprêtre C Roumier P Peyrouze M Cheok
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