Plateforme de génétique moléculaire des cancers Aquitaine-Réunion

Transcription

1 Plateforme de génétique moléculaire des cancers Aquitaine-Réunion Dr Charline Caumont Service Biologie des Tumeurs-Pr Merlio Hôpital Haut-Lévêque-CHU Bordeaux Angoulême, le 12 Mai 2017

2 La PGMC Aquitaine-Réunion PGMC offrir aux patients l accès aux tests moléculaires d intérêt diagnostique, pronostique ou théranostique CHU de Bordeaux Institut Bergonié SBT Pr Merlio Hématologie Dr James Dr Soubeyran Lymphomes Myeloïde Mélanome Lymphoïde Tumeurs Cérébrales Cancer du Poumon (70%) Cancer Colorectal (30%) Thyroïde, Cancer du sein Sarcomes GIST Cancer du Poumon (30%) Colorectal cancer (70%) Thyroïde, Ovaire,

3 Evolution de l activité Evolution du nombre de patients et d'analyses entre 2009 et nb patients nb patients nb analyses nb analyses IB - I Soubeyran Hémato - C James SBT - JP Merlio

4 Répartition des mutations 40,0% 35,0% 30,0% Taux de mutations détectées dans le cancer du poumon au CHU et à l'institut Bergonié en ,8% 30,6% 25,0% 20,0% 15,0% 10,0% 5,0% 0,0% 15,4% 13,2% 6,7% 6,3% 0,8% 1,9% EGFR KRAS BRAF HER2 CHU IB Exon 21 38% Taux de mutations EGFR par exon en 2016 au CHU et à l'institut Bergonié Exon 18 5% Exon 19 44% Exon 20 13%

5 Service Biologie des Tumeurs-Tumorothèque Biologie moléculaire (mutations somatiques, méthylation) FISH cytogénétique SBT Analyses de clonalités lymphocytaires Développement de nouvelles technologies (NGS, PCR digitale)

6 En pratique sur la PGMC Aquitaine-Réunion Cancer du poumon IHC ALK, ROS1 PDL1 Fiche de prescription PGMC* Tumeur pulmonaire non épidermoïde non à petites cellules (stade avancé/métastatique) FISH ALK/ROS1 Sélection/Extraction ADN Mutations/NGS (EGFR, BRAF, KRAS, PIK3CA, ERBB2, MET)

7 Tissu fixé et inclus Prénalytique 1- La qualité préanalytique (délai de fixation, durée) 2- Economie du matériel par pathologiste

8 Pourquoi le NGS en oncologie?

9 NGS en panel hotspot: Recherche de multiples cibles actionnables Stratégie : Panel de gènes custom (exons entiers et hotspots) Construction de la librairie par ampliseq (amplicons) Amplification par PCR en émulsion Séquençage sur S5 IonTorrent

10 Panel NGS Liste des cibles actionnables tumeurs solides (selon recommandation INCA) Panel de 82 amplicons, 15 gènes

11 Compte-rendu biologique

12 En 2016 : PGMC Aquitaine-Réunion MET (dont mutations d épissage exon 14) c.3069_3082del Cortot et al J Natl Cancer Inst May

13 Développement NGS : CNV Visualisation sur le Plot coverage Amplification EGFR Amplification HER2 Confirmation en FISH Génération d un fichier bioinformatique MET ALK ERBB2 BRAF KIT EGFR PDGFRA HRAS Outil QUANDICO ONCOCNV QUANDICO ONCOCNV QUANDICO (+fake ampl) ONCOCNV QUANDICO (+fake ampl) ONCOCNV QUANDICO ONCOCNV QUANDICO ONCOCNV QUANDICO ONCOCNV QUANDICO (+fake ampl) ONCOCNV Contrôles tissu normal run baseline tissu normal amplicon fake tissu normal run baseline tissu normal amplicon fake tissu normal run baseline tissu normal amplicon fake tissu normal run baseline tissu normal amplicon fake tissu normal run baseline tissu normal amplicon fake tissu normal run baseline tissu normal amplicon fake tissu normal run baseline tissu normal amplicon fake tissu normal run baseline tissu normal amplicon fake AH139F unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged 1,5 unchanged unchanged unchanged unchanged 1.4 ~ 1.7 unchanged 1,5 1,5 unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged 1,5 1,5 2.8 ~ ~ 3.5 unchanged unchanged AH131C 1.5 ~ ~ 1.5 unchanged unchanged 3.2 ~ ~ 3.2 unchanged unchanged 3.6 ~ ~ 4.1 unchanged unchanged 1.4 ~ 1.7 unchanged unchanged unchanged 1.5 ~ 1.8 unchanged unchanged unchanged 2.7 ~ 3.4 unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged 5.9 ~ ~ 6.8 unchanged unchanged AH123F unchanged 1.6 ~ 1.8 unchanged unchanged 2.6 ~ 3.5 unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged 1.5 ~ 1.7 unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged 3.0 ~ ~ 3.8 unchanged unchanged AH143F unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged 1.4 ~ 1.6 unchanged unchanged 1.4 ~ ~ 1.6 unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged 1.5 ~ 1.6 unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged AH122F 2.3 ~ ~ 2.4 unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged AH141F unchanged 1.6 ~ 1.8 unchanged unchanged 2.9 ~ ~ 3.2 unchanged unchanged 2.5 ~ ~ 2.7 unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged 2.9 ~ ~ 3.1 unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged 1.2 ~ ~ 1.7 unchanged 1,75 AH140F 2.3 ~ ~ 2.3 unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged 1,5 1.4 ~ ~ 1.5 unchanged 1,5 unchanged unchanged unchanged unchanged 1.0 ~ ~ 1.4 1, ~ ~ 2.6 unchanged unchanged 1.1 ~ ~ 1.3 1,5 1 unchanged unchanged unchanged unchanged AH128F 2.2 ~ 2.4 unchanged 2,5 unchanged 2.5 ~ 3.0 unchanged 2,5 2,5 1.5 ~ ~ 1.7 unchanged unchanged unchanged unchanged 2,5 unchanged unchanged unchanged unchanged 1, unchanged unchanged 2,5 unchanged unchanged unchanged unchanged 1,5 unchanged unchanged unchanged unchanged AH138F 2.2 ~ ~ 2.2 unchanged unchanged unchanged 1.6 ~ 1.7 unchanged unchanged 1.2 ~ ~ 1.4 unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged 1.3 ~ ~ 1.7 unchanged unchanged AH126F unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged 1.5 ~ ~ 1.7 unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged 2.3 ~ 2.5 unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged 1.2 ~ ~ 1.6 unchanged unchanged AH135F unchanged unchanged 1, unchanged unchanged unchanged unchanged 2,5 1.2 ~ ~ 1.3 unchanged unchanged unchanged unchanged 1,5 unchanged unchanged 2.4 ~ 2.6 unchanged 2,5 unchanged 1.5 ~ 1.7 unchanged unchanged unchanged 2.4 ~ 2.6 unchanged 2,5 1.1 ~ ~ 1.4 unchanged unchanged AH129F unchanged unchanged 2,5 unchanged 1.2 ~ ~ 1.3 unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged 1,5 unchanged unchanged 2,5 unchanged 1.3 ~ ~ 1.8 unchanged 1,5 2.3 ~ 3.2 unchanged unchanged unchanged 1.2 ~ ~ 1.7 unchanged 1,5 unchanged unchanged unchanged unchanged AH127F unchanged 1.7 ~ 1.8 unchanged unchanged 2.6 ~ 3.3 unchanged unchanged unchanged 1.5 ~ ~ 1.6 unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged AH125F unchanged 1.7 ~ 1.9 unchanged unchanged 2.7 ~ ~ 3.2 unchanged unchanged 37.9 ~ ~ 42.7 unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged 0.9 ~ ~ 1.4 1,5 unchanged 3.1 ~ ~ 4.2 unchanged unchanged 1.1 ~ ~ 1.6 1,5 unchanged 6.5 ~ ~ 8.7 unchanged unchanged AH124F 1.6 ~ ~ 1.8 unchanged unchanged 2.5 ~ 3.2 unchanged unchanged unchanged 2.4 ~ ~ 2.8 unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged 2.7 ~ ~ 2.9 unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged 3.8 ~ ~ 4.7 unchanged unchanged AH137F 2.4 ~ ~ 2.4 unchanged unchanged 2.8 ~ ~ 2.8 unchanged unchanged 1.6 ~ ~ 1.7 unchanged 1,5 unchanged unchanged unchanged unchanged 1.3 ~ ~ 1.6 1,5 1,5 2.5 ~ 3.1 unchanged unchanged unchanged unchanged unchanged 1,5 1,5 unchanged unchanged unchanged unchanged

14 ADN circulant PGMC Aquitaine-Réunion Fiche de prescription Identification prescripteur/préleveur /patient Renseignements cliniques et anapath Indications de analyse Date et heure de prélèvement Documents à joindre Informations relatives au prélèvement

15 Biopsie liquide-adn circulant Quel tube? CIRCUIT COURT Tube EDTA 7mL 1 tube bien rempli CIRCUIT LONG Tube Cell- Free DNA Collection* Acheminement <3h après prélèvement à T ambiante EDTA K3 Conservation : Plasma à -80 C ADN circulants extraits à -80 C Eviter les cycles de décongélationrecongélation répétés Acheminement 3-4j après prélèvement à T ambiante EDTA K3 + conservateur cellulaire Pas de centrifugation/congélation au niveau du site préleveur Coût +++ (9,36 euros/tube) *CE-IVD Cell-Free DNA Collection Tube (Roche) Référence : (x50)/ (x1200)

16 ADN circulant Circuit des tubes PGMC Aquitaine-Réunion Tube spécifique* ou Tube EDTA * Tubes spécifiques : A demander au RCA : Mme Nadège Brazzalotto Envoi par le RCA aux cliniciens Envoi et transport des tubes par coursier/navette* organisés par le clinicien/établissement prescripteur Délai de 3-4j pour tube spécifique et <3h pour tube EDTA T ambiante * réception des tubes EDTA avant 13h CHU Bordeaux Service Biologie des Tumeurs Pr Merlio Institut Bergonié Unité de Biologie Médicale Dr Durrieu Choix de la plateforme par le clinicien

17 ADN circulant PCR spécifique d allèle Test de PCR en temps réel pour la détection qualitative et l'identification de mutations dans les exons 18, 19, 20 et 21 du gène de l'egfr; Amplification ciblée. Détermination semi-quantitative de mutations et monitoring des patients cobas EGFR Mutation Test v2 42 mutations détectées Exons Exon 18 Exon 19 Exon 20 Exon 21 Mutations détectées G719X (G719A, G719C et G719S) délétions et mutations complexes (intéressant la région comprenant les codons 745 à 753) T790M, S768I et insertions L858R et L861Q Coût : 145 euros/patient Durée de l analyse : 3h

18 Compte-rendu biologique Renseignements cliniques : Matériel envoyé le 30/03/2016 par Prélèvement reçu le 30/03/2016 à 13h Nature du prélèvement : 2 tubes de sang EDTA Diagnostic : non précisé Préleveur : Analyses moléculaires : Référence ADN extrait : PLR0002 Date de l'analyse : 07/04/2016 Technique utilisée : cobas z 480 analyzer et kit cobas EGFR Mutation Test v2 Méthode d'extraction de l'adn génomique tumoral : cobas cfdna Sample Preparation Kit Recherche de mutations du gène de l EGFR : (NM_005228) Exon Mutations de l EGFR Résultats 18 G719X absence de la mutation G719X Délétion exon 19 (intéressant la région comprenant les codons 745 à 753) T790M S768I Insertion exon 20 L858R L861Q présence d une délétion (intéressant la région comprenant les codons 745 à 753) présence de la mutation T790M absence de la mutation S768I absence d insertion absence de la mutation L858R absence de la mutation L861Q Conclusion : Mise en évidence d'une mutation de l'exon 19 du gène de l'egfr. Mise en évidence de la mutation p.t790m dans l'exon 20 du gène de l'egfr. L association de ces mutations a été décrite comme résistante ou de moindre sensibilité aux inhibiteurs classiques de l activité tyrosine kinase de l'egfr mais pouvant répondre à certains inhibiteurs de tyrosine kinase de nouvelle génération.

19 A l arrivée à la PGMC Réalisation d un prélèvement Rendu de résultat interprété et validé biologiquement Phase pré-analytique Phase analytique Phase post-analytique Réception échantillon Extraction ADN (tissu, biopsie liquide) Analyses moléculaires Interprétation Compte-rendu NGS : 10 jours à réception du prélèvement ADN circulant : 7 jours à réception du prélèvement

20 PCR digitale Recherche de mutations ciblées Préparation du mix de réaction ddpcr ADN, amorces, sondes, supermix fabricant Génération des gouttelettes Transfère mix dans la cartouche 8x gouttelettes générées Distribution randomisée Amplification PCR 4h Transfère les gouttelettes dans plaque PCR Cycles de PCR Lecture et analyse Analyse individuelle des gouttelettes générées Système de détection optique à 2 couleurs/2 canaux

21 Liens PGMC et RCA Déploiement de la Messagerie Sécurisée Santé depuis 2016 Mise en place des RCP moléculaires onco-thoracique (CHU et IB) Importance du RCA pour la communication avec cliniciens et pathologistes (Nadège Brazzalotto) Développement nouvelles technologies et nouveaux marqueurs moléculaires

22 Merci de votre attention