Tiphaine, Germaine, Monique, Yvonne BRULIN

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1 ÉCOLE NATIONALE VETERINAIRE D ALFORT Année 2004 Suivi clinique de l infection par le virus de la diarrhée virale bovine / Maladie des muqueuses (BVD/MD). Suivi en élevage et exemples du Groupe de Défense Sanitaire (GDS) de la Somme (80). THESE Pour le DOCTORAT VETERINAIRE Présentée et soutenue publiquement devant LA FACULTE DE MEDECINE DE CRETEIL le 23 septembre 2004 par Tiphaine, Germaine, Monique, Yvonne BRULIN Née le 2 juin 1979 à Amiens (Somme) JURY Président : Mme. Isabelle DURAND ZALESKI Professeur à la Faculté de Médecine de CRETEIL - Epidémiologie Membres Directeur : Mr. Renaud MAILLARD Maître de conférences Pathologie du bétail Assesseur : Mr. Pascal ARNE Maître de conférences Zootechnie Invités : Mr. Denis MARTIAL laboratoire INTERVET Mr. Jean-Michel BONCZAK directeur du GDS 80

2 Merci à Mme Isabelle DURAND ZALESKI président de thèse. Merci à M. Renaud Maillard et à M. Pascal Arné pour leur précieuse aide dans la réalisation de ce travail. Merci à M. Jean Michel Bonczak, directeur du GDS 80, sans qui la réalisation pratique de cette étude n aurait pu s effectuer. Merci au laboratoire Intervet, et en particulier à M. Denis Martial, pour leur soutien financier. Merci aux éleveurs de la Somme qui m ont chaleureusement accueillie et mis leurs animaux à disposition pour ce travail. Merci à mes parents, de m avoir aidé à réaliser mes projets et de me soutenir dans chacun d entre eux. Merci à Bruno, pour son soutien quotidien.

3 TABLE DES MATIERES INTRODUCTION...17 PREMIERE PARTIE : L INFECTION PAR LE VIRUS BVDV I : GENERALITES 21 A : Définition... B : Synonymie... C : Historique.. D : Répartition géographique... E : Importance économique II : ETUDE DU VIRUS BVD/MD (BVDV) 27 A : Taxonomie... B : Caractéristiques structurales et chimiques a : Morphologie b : Génome et protéines virales c : Souches cytopathogènes / non-cytopathogènes d : Diversité antigénique e : Résistance

4 C : Caractéristiques biologiques... a : Multiplication virale b : Tropisme viral et pouvoir pathogène c : Transmission interspécifique III : PATHOGENIE DU SYNDROME BVD/MD 37 A : Infection d un bovin par une souche NCP.... a : Bovin non gravide b : Vache gravide B : Infection d un bovin par une souche CP..... C : Caractéristiques des animaux IPI... D : Pathogénie de la maladie des muqueuses IV : EPIDEMIOLOGIE DU SYNDROME BVD/MD 43 A : Epidémiologie descriptive... a : Espèces et types d animaux concernés b : Répartition géographique et fréquence de l infection c : Importance de l infection B : Epidémiologie analytique a : Animaux excréteurs b : Sources d infection c : Modalité de contagion Transmission horizontale directe Transmission horizontale indirecte Modalité de contagion

5 C : Epidémiologie synthétique a : Origine de la contamination d un élevage b : Persistance de la contamination au sein de l élevage V : TABLEAU CLINIQUE ET LESIONNEL DU SYNDROME BVD/MD 51 A : Maladie des muqueuses... a : Maladie des muqueuses aiguë b : Maladie des muqueuses chronique B : BVD aiguë a : Avortements b : Troubles de la reproduction Mortalité embryonnaire retour en chaleur Momification du fœtus Infertilité femelle Infertilité mâle Taux de rétention placentaire c : Syndrome du veau faible retard de croissance d : Anomalies congénitales e : Pathologies néonatales f : Diarrhée aiguë contagieuse g : Chute de production h : Autres C : BVD : les souches virulentes.... D : Quand penser à une infection par le BVDV au sein de l élevage?

6 E : Diagnostic différentiel a : Affections associant diarrhées et lésions buccales Intoxications Coryza gangréneux Syndrome de déficience d adhésion des leucocytes bovins (BLAD) b : Affections s exprimant essentiellement par des lésions de la cavité buccale Parasitisme Salmonellose Paratuberculose Carence en cuivre, en sélénium, en cobalt Amyloïdose rénale c : Affections s exprimant par de la diarrhée en l absence de lésions de la cavité buccale Fièvre aphteuse Stomatite papuleuse Stomatite nécrotique Fièvre catarrhale du mouton VI : ANALYSES DE LABORATOIRE 65 A : Les outils du diagnostic de laboratoire a : Tests virologiques Isolement viral Détection des antigènes viraux Cytométrie en flux Mise en évidence du génome viral Interprétation des tests virologiques

7 b : Tests sérologiques Tests de séroneutralisation Tests ELISA Tests d immunofluorescence indirecte Interprétation des tests sérologiques c : Méthodes alternatives Recherche d anticorps dans le lait de mélange Recherche du génome viral par RT-PCR dans le lait de mélange d : Caractéristiques des méthodes d analyses B : Utilisation pratique de ces analyses a : Interprétation de la virologie et de la sérologie couplées b : Diagnostic individuel c : Diagnostic de troupeau d : Diagnostic lors d avortements e : Diagnostic lors d infertilité-infécondité VII : STRATEGIES DE LUTTE 83 A : Prophylaxie sanitaire a : Dépistage et élimination des IPI b : Suivi des troupeaux c : Contrôle à l introduction d : Contrôle des taureaux e : Autres mesures sanitaires B : Prophylaxie médicale a : Les différents types de vaccins existant sur le marché Les vaccins vivants modifiés Les vaccins inactivés

8 b : Efficacité des vaccins existant en France et durée de l immunité Mucosiffa Mucobovin Rispoval Bovilis c : Les protocoles de vaccination Prévention de la naissance d IPI Prévention de l immunodépression des jeunes bovins (JBV) en lot Mucosiffa Mucobovin Rispoval Bovilis d : Vaccins et analyses C : Exemples de plan de lutte

9 DEUXIEME PARTIE : Etude expérimentale I : ETUDE DE L ENVIRONNEMENT 99 A : Le département de la Somme... B : Un milieu hétérogène. a : A l Est : le Santerre b : Au centre : le Plateau Picard c : Au Nord-ouest : le Ponthieu d : A l Ouest : le Marquenterre e : Au Sud-ouest : le Vimeu II : MATERIEL ET METHODES 103 A : Population d étude.... B : Constitution de l échantillon d étude a : Détermination de la taille de l échantillon b : Tirage aléatoire de l échantillon C : Obtention des données a : Modalités et méthodes de prélèvements b : Analyses des prélèvements c : Enquête par questionnaire D : Données générales..... a : Proportion d élevage mixte, laitier ou allaitant b : Effectif moyen des cheptels

10 c : Pratiques d élevage Pratiques de pâturage Pratiques d achat d : Connaissances sur le BVD III : RESULTATS 115 A : Bilan sanitaire des troupeaux... a : Principaux problèmes dans les élevages pouvant être liés au BVDV b : Proportion des élevages effectuant la vaccination Protocoles mis en place Pourcentage d élevage ayant mis en place cette vaccination après un passage de BVDV dans le troupeau B : Les sérologies a : Interprétation des sérologies b : Prévalence des élevages contenant au moins un IPI C : Etude sur les animaux IPI. a : Caractéristiques des animaux IPI Répartition des IPI par classes d age Différence d age entre les IPI Descendance ou fratrie d IPI Répartition par sexe Devenir des IPI b : Nombre d IPI par élevage

11 IV : DISCUSSION GENERALE 127 A : Les élevages infectés a: Ces résultats sont-ils en relation avec les symptômes observés? b : Ces résultats sont-ils en relation avec la pratique de vaccination? c : Ces résultats sont-ils en relation avec la pratique d achat? d : Ces résultats mettent-ils en évidence une zone à risque? B : Les élevages contenant au moins un IPI. a: Quels sont les signes cliniques les plus fréquents? b : Quelle a été la réaction de l éleveur face à ce diagnostic? Pourcentage de dépistage et d élimination des IPI Pourcentage de vaccination c : Ces résultats mettent-ils en évidence une cause prépondérante? d : Répartition géographique des élevages hébergeant au moins un IPI CONCLUSION

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13 LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES Tableaux relatifs à la synthèse bibliographique : Tableau 1 : prévalence du BVD au sein de différents pays entre Tableau 2 : coût estimé des pertes liées au BVDV dans un élevage Tableau 3 : caractéristiques des polypeptides des pestivirus Tableau 4 : principales différences entre les souches cytopathogènes et non cytopathogènes Tableau 5 : tropisme cellulaire des souches cytopathogènes et non cytopathogènes Tableau 6 : nombre de bovins IPI détectés et (réformés) par catégorie d animaux en 1999 Tableau 7 : répartition des IPI selon la différence d âge Tableau 8 : répartition des IPI selon la différence d âge entre le plus jeune et le plus âgé Tableau 9 : diagnostic clinique, nécropsique et différentiel de la maladie des muqueuses aiguë Tableau 10 : diagnostic clinique, nécropsique et différentiel de la maladie des muqueuses chronique Tableau 11 : anomalie congénitales associées au BVD Tableau 12 : interprétation des tests virologiques Tableau 13 : interprétation des test sérologiques Tableau 14 : interprétation selon le pourcentage d inhibition du lait individuel Tableau 15 : caractéristiques des méthodes d analyses Tableau 16 : interprétation des couplages sérologie-virologie Tableau 17 : interprétation des résultats sérologiques lors d avortements Tableau 18 : protection fœtale homologue lors de primo-infection au Mucobovin suivie de vaccination au Mucosiffa Tableau 19 : innocuité du vaccin Rispoval Tableau 20 : protection fœtale du vaccin Bovilis

14 Tableaux relatifs à la partie expérimentale : Tableau 21 : répartition des élevages de l enquête selon le type d élevage Tableau 22 : répartition des élevages selon la taille du cheptel Tableau 23 : pratiques de pâturage Tableau 24 : distance maximale entre l élevage et les pâtures Tableau 25 : attitude des éleveurs vis à vis des achats Tableau 26 : connaissances générales des éleveurs sur la BVD/MD Tableau 27 : sources d information sur la BVD/MD citées par les éleveurs Tableau 28 : symptômes principaux de la BVD/MD Tableau 29 : pourcentage d avortement dans les élevages Tableau 30 : protocole de vaccination : animaux vaccinés Tableau 31 : protocole de vaccination : spécialités utilisées Tableau 32 : répartition des IPI par classe d âge Tableau 33 : différence d âge entre IPI du même élevage Tableau 34 : répartition des IPI par sexe Tableau 35 : répartition des IPI selon leur devenir Tableau 36 : nombre d IPI par élevage Tableau 37 : pratique de vaccination dans les cheptels infectés Tableau 38 : répartition géographique des élevages infectés Tableau 39 : distance maximale entre deux élevages infectés Tableau 40 : symptômes principaux de la BVD/MD dans les élevages contenant au moins un IPI. Tableau 41 : pratique de vaccination dans les cheptels contenant au moins un IPI. Tableau 42 : répartition géographique des foyers d IPI dans la Somme Tableau 43 : distance minimale entre deux foyers comportant au moins un IPI

15 Figures relatives à la synthèse bibliographique : Figure 1 : pertes économiques liées à une infection par une souche peu virulente Figure 2 : pertes économiques liées à une infection par une souche très virulente Figure 3 : représentation schématique du génome du BVDV Figure 4 : comparaison de la structure génomique d une souche NCP et de 7 souches CP de BVDV montrant les réarrangements à l origine de la synthèse de la protéine NS3 Figure 5 : arbre phylogénique partiel fondé sur une séquence N terminale du gène E2 Figure 6 : épidémiologie du BVD Figure 7 : pathogénie de la maladie des muqueuses Figure 8 : présentation dichotomique des tableaux cliniques associés à des souches BVD de type 1 et 2 Figure 9 : motifs d appels des plans BVD Figure 10 : conduite du diagnostic épidémio-clinique par le BVDV Figure 11 : technique ELISA appliquée à la détection d antigènes viraux Figure 12 : limites de l ELISA indirect en diagnostic de la BVD-MD Figure 13 : principe de l ELISA Blocking Figure 14 : démarche diagnostique générale Figure 15 : évolution des anticorps neutralisants après une injection de Mucossifa Figure 16 : leucopénie après épreuve virulente sur veaux vaccinés avec Mucossifa Figure 17 : contrôle d activité de Mucobovin Figure 18 : évolution des anticorps au cours de la gestation chez les vaches vaccinées et témoins Figure 19 : virémie après épreuve de virulence Figure 20 : infection leucocytaire

16 Figures relatives à la partie expérimentale : Figure 21 : répartition géographique des élevages entrant dans l étude sérologique Figure 22 : répartition des élevages de l enquête selon le type d élevage Figure 23 : répartition des élevages selon la taille du cheptel Figure 24 : pratiques de pâturage Figure 25 : distance maximale entre l élevage et les pâtures Figure 26 : attitude des éleveurs vis à vis des achats Figure 27 : connaissances générales des éleveurs sur la BVD/MD Figure 28 : sources d information sur la BVD/MD citées par les éleveurs Figure 29 : symptômes principaux de la BVD/MD Figure 30 : pourcentage d avortement dans les élevages Figure 31 : protocole de vaccination : animaux vaccinés Figure 32 : protocole de vaccination : spécialités utilisées Figure 33 : répartition des IPI par classe d age Figure 34 : différence d age entre IPI du même élevage Figure 35 : répartition des IPI par sexe Figure 36 : répartition des IPI selon leur devenir Figure 37 : nombre d IPI par élevage Figure 38 : pratique de vaccination dans les cheptels infectés Figure 39 : répartition géographique des élevages «sérologiquement infectés» Figure 40 : répartition des élevages infectés Figure 41 : distance maximale entre deux élevages infectés Figure 42 : symptômes principaux de la BVD/MD dans les élevages contenant au moins un IPI. Figure 43 : pratique de vaccination dans les cheptels contenant au moins un IPI. Figure 44 : répartition géographique des foyers d IPI dans la Somme Figure 45 : répartition géographique des foyers contenant au moins un IPI. Figure 46 : distance minimale entre deux foyers comportant au moins un IPI

17 LISTE DES ANNEXES Annexe 1 : Principe de la technique de détection des anticorps Annexe 2 : Questionnaire sur le BVD Annexe 3 : Questionnaire des éleveurs ayant eu au moins IPI dans leur cheptel 1 7 9

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19 LISTE DES ABREVIATIONS Ac : ACP : ARN : BDV : BLAD : Bv : BVD/MD : BVDV : Co : Cp : CP : Cu : DI : EDTA : ELISA : GDS : IA : IBR : IPI : Kb : Kd : MD : Mo : NCP : n.d : Anticorps Amplification en chaîne par la polymérase Acide RiboNucléique Border Disease Virus Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency Bovin Bovine Viral Disease/Mucosal Disease Bovine Viral Disease Virus Cobalt Caprin Cytopathogène Cuivre Particules défectives interférentes Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Groupement de défense sanitaire Insémination artificielle Rhinotrachéite infectieuse bovine Infecté Permanent Immunotolérant Kilobase Kilodalton Mucosal Disease Molibdène Non cytopathogène Non diffusé

20 Ov : P : PI3 : PCR : PPC : RSV : RT-PCR : Se : SNC : C : Ovin Porcin Parainfluenza 3 Polymérase Chain Reaction Peste Porcine Classique Respiratory Syncytial Virus Reverse transcriptase polymerase chain reaction Selenium Système Nerveux Central Degré Celsius

21 INTRODUCTION Le syndrome Diarrhée Virale Bovine Maladie des Muqueuses, également connu sous le nom de BVD (Bovine Viral Diarrhea) est une affection cosmopolite fréquemment rencontrée par les vétérinaires praticiens. Evoluant souvent à bas bruit, cette maladie infectieuse virale des bovins causée par un Pestivirus est caractérisée par des symptômes polymorphes, une pathogénie complexe et une importance économique non négligeable. Depuis quelques années, des stratégies de lutte efficaces mais aussi économiquement envisageables sont mises en place sur le terrain. Jusqu à présent, les actions entreprises sont limitées au niveau départemental ou régional notamment en raison du rapport coût / bénéfice d une telle mesure. Après une synthèse bibliographique récapitulant les connaissances actuelles sur le syndrome BVD/MD, nous étudierons plus particulièrement l épidémiologie descriptive de ce syndrome à travers une enquête menée au cours de l année dans le département de la Somme. Cette étude expérimentale, réalisée en collaboration avec le Laboratoire Départemental Vétérinaire et le Groupement de Défense Sanitaire de la Somme, vise à établir les fondations nécessaires à l élaboration d un plan de lutte départemental. L enquête a pour but de fournir une image objective de la situation dans ce département en déterminant notamment la prévalence de l infection par le virus BVD et en analysant l influence de divers paramètres d élevage. Il s agit d une enquête sérologique basée sur la détection des anticorps spécifiques anti BVD/MD. D autre part, une enquête a été menée dans les exploitations ayant présenté un ou plusieurs IPI entre septembre 2000 et juillet 2003 afin d étudier les conséquences en élevage ainsi que la mise en œuvre sur le terrain des différentes mesures d éradication.

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23 PREMIERE PARTIE : L INFECTION PAR LE VIRUS BVDV I : GENERALITES A - Définition L infection des troupeaux par le virus de la diarrhée virale bovine (BVDV) fut décrite pour la première fois par Olafson en 1946 (83, 84). Ses différentes conséquences en élevage : troubles de la reproduction, avortement, chute de production, mortalité subite furent découvertes par la suite. Il fallut attendre quarante ans pour que la relation causale entre l infection par le BVDV dans le premier tiers de la gestation et la formation d un animal infecté permanent immunotolérant (IPI) soit montrée (19, 21). Bien que la prévalence soit variable d un pays à l autre, l infection par le BVDV est cosmopolite et endémique dans la plupart des pays. Ainsi de nombreuses mesures ont été prises pour la limiter. Depuis les dernières décennies, des mesures de contrôle reposant sur la vaccination ou sur le dépistage des IPI et des mesures de biosécurité ont été prises. B - Synonymie La diversité des termes utilisés depuis une cinquantaine d années est à relier à la distinction des deux composantes du syndrome et à leur grande variabilité d expression clinique.

24 Ainsi, la maladie a été nommée successivement «Viral Diarrhea» par OLAFSON et al. (83, 84), «X disease» la même année puis «Virus diarrhea», «Epizootic Enteritis», «Erosive Gastroenteritis», «Muzzle Disease», «Atypisk Katarrh Fever», «Cow Cholera». Depuis PRITCHARD en 1963 (90), le sigle BVD/MD est le plus couramment utilisé. C - Historique La connaissance du syndrome BVD/MD a demandé de nombreuses décennies : - en 1946, OLAFSON et al. ont décrit une gastro-entérite contagieuse chez les bovins, appelée diarrhée virale bovine, en 1947 ils reproduisent expérimentalement la maladie et mettent en évidence le virus (83, 84). - en 1953, RAMSEY et CHIVERS décrivirent une maladie mortelle chez les bovins touchant principalement les jeunes, la maladie des muqueuses (92). - en 1961, pour la première fois, GILLEPSY et al. démontrèrent la parenté antigénique entre les agents viraux responsables de ces deux affections (39). - en 1963, les virus impliqués dans ces deux affections ont été regroupés au sein du complexe BVD/MD (90). - en 1973, la relation pathogénique entre les deux affections a été introduite par LIESS (64). - en , BROWNLIE et BOLIN introduisent la notion d animal infecté permanent (IPI) et reproduisent expérimentalement la maladie des muqueuses (13, 14, 17, 21). - en , RENARD, grâce à l obtention d anticorps monoclonaux, séquence le génome viral (95). Malgré cette évolution, une grande part du syndrome BVD/MD reste inconnue. Ainsi, de nombreux travaux se poursuivent afin d approfondir la pathogénie, l épidémiologie de cette affection ainsi que les méthodes de lutte pouvant être mises en place contre ce virus (35, 37).

25 D - Répartition géographique Le virus BVD/MD est répandu sur les cinq continents, dans la plupart des pays avec un pourcentage d individus séropositifs compris entre 18% et 89% selon la localisation géographique (86). Ces prévalences entre 1990 et 2003 sont regroupées au sein du tableau suivant : Pays Prévalence Ac Prévalence IPI Royaume.-Uni 64,9 % 1,8 % Danemark 64 % 1,1 % Suède 41 % 1,3 % Norvège 18,5 % Quasi éradiqué. Suisse 56 % 0,5 % France (Rhône-Alpes) 56,6% 0,8 % U.S.A % 1,7 % Chili 74 % - Nouvelle-Zélande 63 % - Tableau 1 : prévalence du BVD au sein de différents pays entre (40) E - Importance économique Les pertes économiques sont difficiles à chiffrer puisqu elles comprennent la baisse de production laitière, l infécondité, les problèmes respiratoires, les avortements, les mortalités, les malformations et les retards de croissance. De plus, elles dépendent du statut immunologique de la population et de la pathogénicité de la souche virale. HOUE (47) a ainsi montré que les souches faiblement virulentes provoquaient un maximum de pertes lorsque le taux d incidence était de 45%. En effet, à une incidence supérieure les pertes sont moins importantes puisque de nombreux animaux présentent

26 des anticorps avant leur premier vêlage et diminuent ainsi le risque de créer des animaux IPI (cf. infra). La figure 1 montre la répartition des pertes en fonction du taux d incidence lors d une infection par une souche faiblement virulente. Pertes économiques pour mille vêlages en k$ Pertes totales Animaux IPI Anomalies fœtales Infection aiguë Incidence annuelle du risque d infection (%) Fig. 1 : pertes économiques liées à une infection par une souche peu virulente (47) Par contre, les souches hautement virulentes provoquent un maximum de pertes économiques lorsque le taux d incidence est de 65% (47). Les souches hautement virulentes augmentent considérablement le risque de mort subite de 0,25% lors de souche «classique» à 10%, le risque d avortement de 5-20% à 10-40% selon le stade de gestation, les pertes laitières de 10% à 20% et les problèmes respiratoires de 2% à 5% (47). La figure 2 montre la répartition des pertes en fonction du taux d incidence lors d une infection par une souche hautement virulente.

27 Pertes économiques pour mille vêlages en k$ 70 Pertes totales Animaux IPI 60 Anomalies fœtales Infection aiguë Incidence annuelle du risque d infection (%) Fig. 2 : pertes économiques liées à une infection par une souche très virulente (47) Ainsi, en considérant un taux annuel d incidence de 34% (cas du Danemark), HOUE (47) est arrivé aux évaluations suivantes : - les pertes suite à une infection par une souche faiblement virulente s élèveraient à 20 millions de dollars par million de vêlages. - les pertes suite à une infection par une souche hautement virulente s élèveraient à 57 millions de dollars par million de vêlages. Dans une autre étude Rault (93) a estimé les pertes en prenant en considération les élevages sur un département fictif de élevages dont 51% laitiers et 49% allaitants contenant au total bovins dont vaches. Les pertes prises en compte pour le calcul sont les pertes directes liées à la maladie des muqueuses d animaux IPI, les pertes directes liées aux maladies néonatales, les pertes liées aux avortements, y compris les pertes de lait, les pertes liées aux retour en chaleur et les pertes liées à la

28 réforme des IPI. Au total, les pertes liées à cette maladie dans ce département fictif sont de 11 par vache et par an. Le détail de ce coût est résumé dans le tableau 2. Nature des pertes Coût estimé (en k ) Traitement des animaux IPI 430 Réforme prématurée des IPI Morbidité des maladies néonatales Mortalité des maladies néonatales 180 Avortements 215 Retour en chaleur Total Tableau 2 : coût estimé des pertes liées au BVDV dans un élevage (93) A ces pertes s ajoute le coût du programme de contrôle et d éradication qui dépend également du risque d infection et de la souche virale. Malgré des coûts d analyses (ELISA antigénémie ou anticorps ~ 7,60, séroneutralisation ~ 9,10, immunofluorescence sur coupe ~ 18,25 (85)) et des coûts de vaccination (de 4 à 7,5 la dose) relativement élevés, ces programmes sont économiquement satisfaisants. En effet, les dépenses du Danemark pour ces programmes sur trois ans se sont élevées à 27 millions de dollars, contre des pertes annuelles de 20 millions de dollars minimum (47). En France, l évolution comparée du coût de la maladie sur 20 ans et du coût de mise en place du plan de maîtrise a mis en évidence un retour financier qui ne deviendrait positif qu à partir, au minimum, de la seizième année d éradication (93), cependant un plan d éradication vient d être initié par les groupements de défense sanitaire (GDS) bretons.

29 II : ETUDE DU VIRUS BVD/MD (BVDV) A - Taxonomie Le BVDV appartient au genre pestivirus de la famille des Flaviviridae (famille dans laquelle on retrouve les virus de la fièvre jaune et de l hépatite C chez l homme). Classés auparavant dans la famille des Togaviridae, les pestivirus s en distinguent par l absence d ARN subgénomique et d une queue polyadénylée à leur extrémité 3, ainsi que par leur organisation génomique (106). D autres virus bien connus appartiennent à ce même genre : - le virus de la peste porcine classique ou Hog Cholera Virus (HCV) - le virus de la maladie de la frontière du mouton ou Border Disease (BDV). B - Caractéristiques structurales et chimiques a - Morphologie Le BVDV est un petit virus sphérique (40-60 nm de diamètre), constitué d une capside icosaédrique et d une enveloppe. b - Génome et protéines virales Le génome est constitué par un brin d ARN monocaténaire de polarité positive. Comme tous les pestivirus, il ne possède qu une seule phase de lecture ouverte qui couvre la quasi-totalité du génome (12-13 kb) pour une longueur codée de 450 kd. Cette phase de lecture est encadrée par une séquence 5 non codante de 385 nucléotides

30 environ et par une séquence 3 non codante variant entre 186 et 224 nucléotides selon les souches (37, 39). La totalité du génome a été séquencé et cloné dès 1988 par Renard et al. La figure 3 schématise l ensemble de la phase de lecture (77, 86) Protéines structurales p125 Npro C E0 E1 E2 NS2-3 NS4 A NS4B NS5A-B p20 p14 gp48 gp25 gp53 NS2 NS3 NS5A NS5B p80 Fig. 3: représentation schématique du génome du BVDV (86) Les protéines E 2 (anciennement nommée gp53) et E 0 (gp48) sont les principales protéines structurales, elles constituent une partie de l enveloppe du virus. La glycoprotéine E 2, très immunogène, induit après infection l apparition de forts taux d anticorps neutralisants. Elle jouerait également un rôle important dans l attachement aux cellules et leur infection. E 0 serait impliquée dans le phénomène d immunodépression en induisant l apoptose cellulaire. Les protéines NS 2-3 (gp125) et NS 3 (p80) sont les principales protéines non structurales. NS 2-3 est synthétisée lors de la multiplication virale. Lors d infection cellulaire par une souche cytopathogène (cf. infra c), NS 2-3 est clivée en NS 3 et NS 2. Ces deux protéines entraînent une forte production d anticorps non neutralisants n intervenant pas dans l élimination du BVDV mais étant de très bons marqueurs de l infection (34, 77).

31 Le tableau 3 reprend les fonctions des protéines virales. Ancien nom Rôle Immunogénicité N pro p20 (Auto) protéase - C p14 Protéine de la nucléocapside + compactage ARN+ signal de la translocation de la protéine E0 E0 gp48 Glycoprotéine d enveloppe +ARNase homodimère E1 gp25 Glycoprotéine d enveloppe ARNase hétérodimères avec E2 E2 gp53 Glycoprotéine d enveloppe ARNase (transmembranaire) + rôle dans l adsorption du virus (?) + cible des Ac neutralisant p7 p7 Maturation des glycoprotéines et morphogenèse du virion NS2/3 p125 Pas d induction d apoptose + NS2 p54 Hydrophobe + domaine «doigt de zinc» NS3 p80 Hélicase, NTPase, protéase sérique, Induction de l apoptose - + NS4A p10? - NS4B p32 Cofacteur de NS3 - NS5A p58? - NS5B p75 ARN-polymérase ARN dépendante - Tableau 3 : caractéristiques des polypeptides des pestivirus (30, 33, 77).

32 Auparavant ces polypeptides étaient désignés par leur masse moléculaire car leur rôle était inconnu, maintenant la nouvelle nomenclature permet la comparaison avec les autres pestivirus (30). c - Souches cytopathogènes / non-cytopathogènes L étude approfondie du génome permet de différentier deux biotypes du BVDV : la souche cytopathogène (CP) et la souche non cytopathogène (NCP). La souche cytopathogène a un effet lytique sur la culture cellulaire. La mort cellulaire provient par apoptose suite à un stress oxydatif cellulaire. Selon DEHAN et al. (30) les monocytes infectés participeraient également à l apoptose des autres types cellulaires. La souche NCP est responsable de la quasi-totalité des manifestations cliniques chez les animaux non infectés permanents immunotolérants. Elle est également la seule responsable des infections transplacentaires : avortements, malformations congénitales, formation de veau infectés permanents immunotolérants (IPI) Les IPI n hébergent donc que les souches NCP. Sur les animaux atteints cliniquement de maladie des muqueuses on isole à la fois des souches cytopathogènes et des souches noncytopathogènes (34, 86). Les souches CP dériveraient des souches NCP hébergées par les porteurs asymptomatiques. Les mutations à l origine du biotype CP peuvent être : - insertion d une séquence d ARN - duplication et remaniement du génome viral dans la zone incriminée - production de particules défectives interférentes (DI) constituées d un mini génome sans protéines structurales. Il n y a pas de formation de virions mais ces DI sont à l origine de l expression de protéine NS 3 (30). Ces hypothèses de mutation sont renforcées par l existence d une protéine précurseur de 120 kd (NS2-3) chez les deux souches, dont dériverait une protéine non structurale de 80 kd (NS3) présente uniquement chez la souche CP. La mutation se situerait toujours au niveau du gène codant la protéine non structurale NS2-3. Elle apparaîtrait

33 de manière aléatoire et entraînerait un clivage de la protéine NS2-3 en NS3. A l exception de cette protéine, les deux biotypes codent les mêmes protéines (86). La deuxième hypothèse est la recombinaison entre l ARN cellulaire de l animal et le génome viral : celle-ci provoquerait une modification de la protéine de 120 kd. L existence d une séquence nucléotidique supplémentaire chez la souche CP confirmerait cette hypothèse. De plus, cette séquence serait quasi identique à celle de l ubiquitine animale (30). C E0 E1 E1 NS2-3 NS4B NS5 C E0 E1 E1 NS2 NS4B NS5 BVDV NCP CP7 C E0 E1 E1 NS2 NS4B NS5 NADL C E0 E1 E1 NS2 NS4B NS5 C E0 E1 E1 NS2-3 NS4B NS5 Osloss CP1 C E0 E1 E1 NS2-3 NS4B NS5 Pe 515 N pro Ubiquitine Séquence cellulaire Insertion courte NS4B NS5 CP9 NS4B NS5 CP BVDV-2 Fig. 4 : comparaison de la structure génomique d une souche NCP et de 7 souches CP de BVDV montrant les réarrangements à l origine de la synthèse de la protéine NS3 (30)

34 Le tableau 4 résume les principales différences entre ces deux types de biotypes. Souches cytopathogènes (CP) Souches non cytopathogènes (NCP) Apparition d anticorps 25 e jour post-infection 14 e jour post-infection neutralisants Taux maximal d anticorps faible Taux maximal d anticorps élevé Virémie rare fréquente Portage asymptomatique non oui Passage de la barrière placentaire non oui Tableau 4 : principales différences entre les souches cytopathogènes et non cytopathogènes (59) d - Diversité antigénique La diversité antigénique entre les différentes souches est très importante. Elle serait due à la transmission horizontale du virus provoquant une infection aiguë. La protéine E 2 impliquée dans l immunité protectrice a une variabilité marquée. Les protéines non structurales sont beaucoup plus conservées. Les souches NCP seraient antigéniquement et génétiquement stables. Par comparaison des séquences de nucléotides de certaines souches comme NADL, Oslo (CP) et SD-(NIP) il a été remarqué une similarité de 78 à 88% sur la totalité du génome. Les régions conservées comme la région 5 UTR avait une similarité de 86 à 93%. D autres souches nouvellement isolées, dites de type 2, ne présentent dans ces régions 5 UTR que 75% d homologie avec les souches «classiques», de type 1, contre 90% d homologie entre elles (33, 96, 97). Le plus grand degré de variabilité antigénique entre ces deux types de BVDV est observé dans la séquence de la glycoprotéine E2 (29). Ces nouvelles souches de type 2 ont d abord été isolés dans des élevages vaccinant contre le BVDV de type 1 (29). Ces nouvelles souches sont responsables d épidémies hypervirulentes aux Etats-Unis alors que la plupart de ces souches trouvées en Europe sont de virulence modérée à faible (45, 58).

35 D autre part, il existe une forte parenté antigénique entre les pestivirus. DARBYSHIRE (28) a été le premier à remarquer la proximité antigénique entre le virus de la peste porcine classique et le BVDV lors de réaction croisée sur des gels de diffusion. Par la suite, de nombreuses réactions croisées ont été montrées dans différents tests : neutralisation, fixation du complément, immunofluorescence (87) Puis, la séroneutralisation (utilisation d anticorps spécifiques à E2) a été fortement utilisée pour montrer les différences et les similitudes entre pestivirus. Par la suite des séquences de pestivirus ont été publiées. Il y a en effet conservation d un bloc de séquences d aminoacides dans les protéines non structurales (33, 55, 76). De plus les virus BVD, BDV et HC sont très proches ( 67% de similarité entre le BVDV et HC) (33), comme le montre la figure 5, ce qui tendrait à prouver que ces trois virus sont des mutants de spectre d hôtes (34, 86). L adaptation après transmission à différents hôtes ainsi que l échappement à différents systèmes immunitaires auraient augmenté la diversité de ces pestivirus (105).

36 A -h Deer G -b SH9 -b 519 -b -r SingerA -e NAD -f Oregon -p -r 1138 SD1 -g Pe -c -b 515 C86 CULI -i -b b-721 BD 112 -r L -h B -h Hastings -e A1263 -r CP7 -q Korevaar -r Osloss -d BVDV-1 HC Aveyronit SF4 -t BD78 -s Sil Lk -e Q140 -t e SCP -b 890 -u -t Q r BVDV-2 Alfor -m X818 -a Weybridge -n Chinese -y B -31 -v BDV Fig. 5 : arbre phylogénique partiel fondé sur une séquence N terminale du gène E2 (109) Cependant, la virulence ne peut pas être reliée aux ressemblances génétiques ou antigéniques puisque par exemple la souche de BVDV de type 2 BD78 extrêmement virulente est très proche de la souche peu virulente (109). e - Résistance Le BVDV bien qu enveloppé est relativement résistant puisqu il persiste jusqu à 10j dans le fumier, 6j à 4 C dans les tissus infectés. Il n est pas détruit par la congélation (-20 C) pendant plusieurs mois, le risque persiste donc lors d insémination artificielle. D ailleurs sa conservation au laboratoire s effectue à -70 C. Par contre, il est inactivé rapidement par la chaleur (56 C), les rayons ultraviolets, les détergents ioniques et non

37 ioniques tels que l eau de Javel, la soude, le formol, le chloroforme, les iodophores, la chlorhexidine (23, 59). Par ailleurs, une diminution considérable de l infectiosité est obtenue en traitant des suspensions de BVDV avec de la trypsine (0,5 mg/ ml, 37 C, 60 min.) (63). Le ph «idéal» est de 7,4 mais le virus est relativement stable entre 5,7 et 9,3. Au dessus de 9,3 la dégradation est rapide (63). C - Caractéristiques biologiques a - Multiplication virale Seules les cultures cellulaires des Artiodactyles (Bv, Ov, Cp, P) permettent la multiplication du BVDV. Une seule cellule peut produire de 100 à 1000 virions. Dix heures après l infection, des virions ont été détectés dans l espace extracellulaire, ce qui prouve la rapidité du cycle viral (34). Expérimentalement, les systèmes les plus couramment utilisés sont les lignées cellulaires de type FBK (Fœtal Bovine Kidney) et les cellules primaires de testicule de veau (23). b - Tropisme viral et pouvoir pathogène Le BVDV a un tropisme pour les tissus réticulolymphoplasmocytaires : leucocytes sanguins, cellules endothéliales, cellules épithéliales kératinisées, et les organes lymphoïdes (23). Alors que les souches cytopathogènes ont un tropisme relativement étroit pour le tractus digestif, les souches non cytopathogènes ont un tropisme beaucoup plus large au sein de l organisme. Le tableau 5 résume ces deux situations (17, 86).

38 Souches cytopathogènes (CP) Souches non cytopathogènes (NCP) Localisation Majoritaires dans le tractus digestif : Cellules sanguines Duodénum, jéjunum, rumen, réseau. Organes associés à la circulation sanguine Tractus respiratoire Système nerveux central (IPI) Tableau 5 : Tropisme cellulaire des souches cytopathogènes et non cytopathogènes (17, 86) c - Transmission interspécifique La spécificité d hôte est relativement faible. Seule l espèce dont le virus est issu permet de classer le virus en biotype ovin ou bovin. En effet, l infection par le BVDV induit chez le mouton des symptômes comparables à la Border Disease et inversement (23). La transmission interspécifique est donc très fréquente et ne s arrête pas qu aux ovins, elle peut également atteindre les porcins et les autres ongulés sauvages (cerfs, chevreuils, buffles, gazelles ) (59).

39 III : PATHOGENIE DU SYNDROME BVD/MD A : Infection d un bovin par une souche NCP Les souches NCP sont responsables de la quasi-totalité des manifestations cliniques chez les animaux non IPI. a - Bovin non gravide La transmission du BVD est horizontale directe : elle s effectue généralement par contact direct, par aérosol, par contact avec des sécrétions infectées. Après une phase initiale de multiplication nasopharyngée, en particulier dans les tonsilles pharyngées, le virus envahit l organisme par voie sanguine (24, 100). Cette phase virémique transitoire dure généralement 3 à 10 jours mais peut se prolonger jusqu à 30 jours. La première infection entraîne une réaction immunitaire classique, les anticorps apparaissent dès 15 jours dans le sang, avec un pic vers la cinquième semaine. Les animaux deviennent alors séropositifs. Cette séropositivité peut persister pendant plusieurs années (33).Une fois la réaction immunitaire installée, les animaux résistent à de nouvelles infections par ce même virus. Ainsi la séroconversion avant la gestation permettrait d éviter les conséquences d une infection en cours de gestation (111). b - Vache gravide La gestation des bovins de 280j en moyenne s effectue en différents stades : - du 19 e j au 40 e j s effectue la nidation embryonnaire. - à partir de j le fœtus acquiert son immunocompétence. Avant, il ne peut distinguer les anticorps du soi et ceux du non soi. Ainsi

40 aucun anticorps n est dirigé contre les antigènes viraux lors de contamination à ce stade. - vers 150j l organogenèse se termine. Ainsi l infection pendant la gestation a différentes conséquences selon le stade de gestation : - de la mort embryonnaire à l avortement en début de gestation - des effets tératogènes sur le fœtus jusqu à la formation de veau infecté permanent immunotolérant pendant une grande partie de cette gestation. - à une infection intra-utérine qui peut être bénigne à la fin de la gestation. Les quatre premiers mois de gestation semblent être les plus importants car c est pendant ces premiers mois qu apparaissent les signes les plus graves de l infection au BVDV (24, 35, 86, 101).

41 La figure 6 résume cette situation. Malformations Naissance de veaux non virémiques possédant des Anticorps colostraux possédant des Naissance des veaux IPI implantation acquisition de la tolérance maturation du système immunitaire embryonnaire (8-20) immune vis à vis du BVD Gestation Mortalité et résorption embryonnaire Mortalité fœtale, Avortement direct ou différé Fig. 6 : épidémiologie du BVD (24, 87) B : Infection d un bovin par une souche CP Si l animal est infecté par une souche cytopathogène, les conséquences de l infection fœtales sont nettement moins importantes. Ces souches pourraient également traverser la barrière placentaire mais sans provoquer d avortement ou de veau IPI, les cellules cibles n étant pas différenciées avant la période d immunocompétence. Cette infection

42 pourrait tout de même entraîner des mortinatalités, et si l infection a lieu après le 110 e jour de gestation une séroconversion du veau (24). C : Caractéristiques des animaux IPI Lorsqu une vache est infectée pendant sa gestation par une souche NCP, le virus peut traverser la barrière placentaire et contaminer le fœtus. Certaines souches CP peuvent traverser la barrière placentaire mais ne sont pas pathogènes pour le fœtus. Une vache au statut immun : sérologie négative, infectée par une souche virulente NCP entre 40 et 125 j de gestation peut donner naissance à un veau IPI. Ce veau n ayant pas encore acquis l immunotolérance, subit une virémie généralisée et excrète continuellement le virus dans l environnement et peut ainsi contaminer le reste du troupeau (35, 86, 101). Ces IPI seront donc toujours virologiquement positifs car porteurs du virus, mais malgré l absence de synthèse d anticorps contre la souche infectante ils peuvent présenter une sérologie positive. En effet, le colostrum d une vache infectée pendant sa gestation peut contenir des anticorps spécifiques contre le BVDV, ainsi le veau IPI peut présenter une sérologie positive pendant 4 à 6 mois après la naissance (24, 86). De plus, le système immunitaire d un IPI reste actif contre les autres souches de BVDV, ainsi un IPI peut séroconvertir. En plus d excréter continuellement du virus, une vache IPI par transmission placentaire va obligatoirement donner naissance à un IPI, un transfert d embryon à partir d une vache donneuse IPI peut plus rarement donner naissance à un IPI. Un taureau IPI peut aussi transmettre le virus par son sperme (24, 101). Il serait alors facile d éviter l apparition de nouveaux IPI si ils étaient facilement détectables. On considère souvent que les IPI sont des veaux chétifs, aux poils ébouriffés, ayant des troubles de croissance mais ils peuvent être tout à fait normaux, à croissance normale ce qui rend beaucoup plus difficile leur détection clinique sur le terrain.

43 D : Pathogénie de la maladie des muqueuses La maladie des muqueuses fut tout d abord qualifiée comme une maladie mortelle chez les bovins, puis elle intégra le complexe BVD/MD lorsque la similitude entre les deux virus fut admise. Il s agit donc du même virus BVDV qui est à l origine de ces deux maladies. Lors de BVD «classique» sur les non IPI, sont souvent isolées des souches NCP, sur les IPI on isole également le plus souvent des souches NCP. Sur les animaux ayant déclaré la maladie des muqueuses on isole pas une mais deux souches pathogènes : généralement une NCP et une CP antigéniquement proches, et plus rarement deux souches NCP antigéniquement proches. Il a été également montré que seuls les animaux IPI déclaraient cette maladie des muqueuses (16, 17, 23, 87). La maladie des muqueuses provient d une nouvelle infection par le BVDV chez des IPI. Mais elle n interviendra que si la nouvelle souche infectante est antigéniquement proche de la souche NCP hébergée par l animal. Si il s agit de deux souches de type différent : NCP et CP, l animal débutera une maladie des muqueuses classique avec une issue fatale en deux jours jusqu à 3 semaines. Alors que si il s agit de deux souches NCP, l animal débutera une maladie des muqueuses d évolution chronique appelée également «runting disease» qui aboutit à une issue fatale en deux à neuf semaines (17, 86). Ces différentes situations sont résumées dans la figure suivante.

44 «Homologie» «Hétérologie» «Homologie partielle» CPA CPB CPA NCPA NCPA NCPA 2-3 semaines 2-3 semaines 3-4 mois post surinfection Maladie chronique 1-2 mois NCPA CPA NCPA Anticorps anti CPB NCPA CPA Maladie des muqueuses Réponse immune Runting disease Fig. 7 : pathogénie de la maladie des muqueuses (20) On admettait généralement que les souches surinfectantes CP ou NCP provenaient de mutation de la souche NCP hébergée par l animal au vu de ressemblance antigénique (29, 49, 74). Plus récemment, une deuxième hypothèse apparaît : celle de la recombinaison entre l ARN cellulaire de l animal et le génome viral provoquant ainsi une modification de la protéine 120 kd (30).

45 IV : EPIDEMIOLOGIE DU SYNDROME BVD/MD A : Epidémiologie descriptive a - Espèces et types d animaux concernés Généralement, ce sont les bovins les plus touchés par le syndrome BVD/MD, mais d autres espèces animales telles que les ovins, les caprins, les porcins et des ongulés sauvages et même peut-être l homme (49) peuvent être infectés par le BVDV (21). Les animaux d un même élevage ne sont pas tous sensibles de la même façon à la circulation virale. En effet, il a été montré que seules 48% des génisses seraient séropositives après une seule circulation virale contre 78% des vaches multipares-3 veaux, contre 91% des vaches multipares-5veaux, toutes ces vaches étant comparables sur leur statut immunologique vis-à-vis du BVDV à l origine de l étude (97). Comme nous l avons déjà précisé auparavant, seuls les animaux IPI peuvent exprimer une maladie des muqueuses. Celle-ci se développe selon deux formes : la forme aiguë qui touche des animaux entre 3 semaines et 3 mois avec une évolution rapide vers la mort en 2 à 3 jours jusqu à 2 ou 3 mois, et la forme d évolution chronique qui touche la même classe d âge d animaux mais évolue plus lentement en 2 à 9 semaines (35, 101). Ainsi on peut remarquer le plus souvent que la maladie des muqueuses ne touche que des animaux IPI appartenant à la classe des animaux entre 3 mois et 3 ans. Cela peut s expliquer aisément par la répartition des IPI selon les classes d âge : près de 78% étant des animaux entre 6 mois et 3 ans, seul 7% atteignant l âge adulte. Le tableau 6 résume cette situation (50).

46 Sérologie + Sérologie - Total %+ % parmi les IPI.Vaches ,5% 7,21%.Génisses (>6 m) ,6% 69%.Mâles (>6 m) ,2% 7,8%.Veaux (<6m) ,3% 16% Total ,9% Tableau 6 : nombre de bovins IPI détectés et (réformés) par catégories d animaux en 1999 (50). Le faible pourcentage d IPI adultes s explique par une espérance de vie très courte (24-36 mois), 50% des IPI mourant dans leur première année, et seulement 10% des génisses de remplacement IPI intégrant le troupeau de production (34, 43). Généralement, une infection par le BVDV ayant entraîné l apparition d un veau IPI entraîne l apparition d autres veaux IPI se répartissant en deux groupes d âge. HOUE (48) a analysé dans une étude les différences d âge entre deux veaux IPI au sein du même troupeau résumé dans le tableau 7, et les différences d âge entre l IPI le plus jeune et le plus vieux du même troupeau résumé dans le tableau 8 : Différence d âge Pourcentage Différence d âge entre l IPI Pourcentage entre deux IPI le plus jeune et le plus âgé Moins de 2 mois 81,5% Moins de 2 mois 26,3% 2 mois-12 mois 13% 6 mois-14 mois 52,7% 1 an- 2 ans 4,6% 14 mois-22 mois 6,9% 2 ans-3 ans 0,9% Plus de 22 mois 13,9% Tableau 7 : répartition des IPI selon la différence d âge entre eux (48). Tableau 8 : répartition des IPI selon la différence d âge entre le plus jeune et le plus âgé (48). Ces répartitions peuvent s expliquer par différents mécanismes. Tout d abord, un fort pourcentage, ou relativement élevé, des veaux répartis dans des classes de moins

47 de deux mois de différence d âge peut s expliquer par la présence de vaches au même stade de gestation (40-120j) lors de l infection. Cette classe n est pas la plus représentée dans la répartition du plus jeune et du plus âgé, puisque généralement cette première génération d IPI va infecter d autres vaches en gestation de 40 à 120 jours sur plusieurs cycles successifs. Lors de la naissance de la deuxième vague d IPI, généralement les conséquences connues du BVD se sont largement développées. L éleveur prend alors des mesures, ce qui explique une troisième vague (14-22 mois) beaucoup moins conséquente. Une différence d âge plus importante entre le plus jeune et le plus âgé, supérieure à 22 mois, s explique par la naissance de veau IPI issus de mères ellesmêmes IPI. Il n y a pas de veaux IPI entre 2 et 6 mois de différence d âge car les vaches dont la gestation est plus avancée (supérieure à 120j) ne vont pas donner naissance à des veaux IPI. b - Répartition géographique et fréquence de l infection Le virus BVD/MD est répandu sur les cinq continents avec une prévalence individuelle comprise entre 36 et 88% selon la localisation géographique. Cette prévalence est difficile à chiffrer, mais elle serait environ de 34% au Danemark et de 50% en France (16, 47, 40). Aussi même si les IPI ne représentent qu un faible pourcentage de la population bovine (entre 0-2%), il y aurait 15% des troupeaux qui en hébergeraient aux USA, 53% au Danemark, 45% en Allemagne et entre 20 et 30% dans l ouest de la France (16, 47, 101). Aussi, le BVD continue sans cesse de circuler car il y aurait entre 70 et 95% des troupeaux qui hébergeraient des bovins séropositifs (101). De plus, la prévalence des animaux séropositifs serait de 87% (pouvant même atteindre 100%) dans des troupeaux renfermant des IPI contre 43% dans les élevages n en refermant pas (16). Il y aurait alors un risque annuel de néo-infection de 30% environ avec un taux d incidence individuelle de 52% au Danemark et de 8-12% en Suède (47).

48 c - Importance de l infection Il a été montré dans des expériences précédentes que 30 à 50% des femelles soumises au risque d infection au sein d un troupeau et qui se trouvent dans une période sensible avortent. Pourtant le risque d avortement lié au BVD n est pas le plus important l année de l infection mais dans les années qui suivent. En effet, le risque d avortement est multiplié par 2,6 dans l année qui suit l introduction du virus et multiplié par 11 la deuxième année (24). Même si les avortements semblent être une part importante du tableau clinique du BVD seuls 1 à 7% des avortements sont dus au BVD seul (112). Le BVDV apparaît également comme un facteur prédisposant d avortements induits par d autres pathogènes. Ainsi, il a été retrouvé associé aux champignons Actinobacterium pyogenes dans 33% des avortements imputés à ces champignons. Lors de ces avortements, seul 10 à 20% des fœtus serait infectés par le BVDV (24). L immunité maternelle semble minimiser les pertes liées à l avortement. En effet, le taux de gestation à j 21 des femelles ayant été inséminées avant leur séroconversion (22%) est nettement inférieur à celui des femelles ayant été inséminées au cours de leur séroconversion (8-15 j après l infection : 44%), lui même nettement inférieur à celui des femelles ayant été inséminées après leur séroconversion (77%) (73). Les veaux faibles et chétifs sont un autre aspect du tableau clinique du BVD. Cet aspect est un peu plus représentatif de l état virologique ou sérologique de l animal puisque dans 60% des veaux faibles le BVDV est impliqué. Mais tout veau faible n est pas un IPI, et tout IPI n est pas systématiquement un veau faible (24). Les IPI, véritables bombes à retardement au sein des troupeaux, ne représentent que 1-2% des bovins. Un IPI naît à la suite d une infection maternelle par une souche NCP pendant le premier tiers de gestation chez une vache séronégative, ou naît d une vache IPI elle-même. Le plus important dans la formation d un IPI est donc le statut immunologique de la mère et le moment de l infection.

49 Ainsi, il a été montré (54) que si l infection avait lieu : - entre 4 et 11 jours après l insémination artificielle (IA), on obtenait 36% de veau IPI. - à 18 jours après l IA, on obtenait 86% de veau IPI. - entre 30 et 34 jours après l IA, on obtenait 100% de veau IPI. B : Epidémiologie analytique a - Animaux excréteurs L excrétion du virus s effectue par les animaux infectés de façon transitoire ou définitive. Ainsi, les animaux infectés de façon transitoire, qu il s agisse de bovins ou des autres espèces potentiellement porteuses, excrètent une faible charge virale dans un laps de temps limité : entre le quatrième et le dixième jour après la contamination. Les IPI eux sont considérés comme «des bombes à virus» puisqu ils excrètent une charge virale considérable, toute leur vie mais en quantité variable. Un animal IPI infecterait 90% du troupeau en moins de 3 à 4 mois (47). b - Sources d infection Les matières infectantes potentielles sont les fèces, le jetage, la salive, le sang, l urine, le sperme, les sécrétions utérines et le placenta (59). Le sperme d un animal IPI est bien une source d infection puisque à la suite d une insémination par ce sperme il a été retrouvé de fort taux de mortalité embryonnaire, d avortement, mais seulement 3% d IPI, l immunité maternelle limitant de nouveau les pertes. Chez la vache séronégative inséminée avec du sperme d un animal IPI, on retrouve un titre en anticorps supérieur à 1:128 comparable à une protection acquise. Ce taux de séroconversion est très faible lors d insémination avec du sperme d animaux infectés transitoires (24, 75).

50 Aussi, la longue persistance du virus dans l appareil génital (jusqu à 53 jours) rend possible une contamination du fœtus au cours du cycle suivant (74). c - Modalité de contagion Le BVDV peut se transmettre par différentes voies au sein d un même troupeau. transmission horizontale directe Cette transmission s effectue par contact direct avec un animal infecté ou avec des matières infectantes. Cette transmission peut également se faire à partir des autres ongulés : ruminants sauvages, ovins, porcs, caprins. Les voies d infection peuvent être respiratoire, orale et vaginale (59, 86). transmission horizontale indirecte Cette transmission est possible par des vecteurs animés ou inanimés tels que les aiguilles hypodermiques, le matériel médical (57), les insectes piqueurs, les produits biologiques : milieu de transfert d embryon pouvant contenir du sérum de veau fœtal contaminé, des vaccins vivants BVD atténués, des vaccins contaminés (59). Il a également été montré que des mouches piqueuses sont capables de transmettre le BVDV et que le virus pouvait survivre sur ces espèces de mouches pendant 96 heures (44). L air pourrait également apparaître comme contaminant sur quelques mètres (47). transmission verticale Cette transmission s effectue généralement par passage trans-placentaire du virus lors d une infection transitoire chez une femelle gravide, ou chez une femelle elle même IPI (86). Cette transmission peut également s effectuer directement par le sperme de taureaux IPI ou infectés transitoires, la charge virale étant plus abondante dans le premier cas.

51 C : Epidémiologie synthétique a - Origine de la contamination d un élevage Plusieurs causes peuvent être à l origine de l introduction du BVD au sein de l élevage : - les achats : les achats d un animal ou d animaux IPI, de génisses ou de vaches pleines d un veau IPI, d animaux infectés transitoires. La prévalence des animaux IPI étant de 2%, le risque (P) d introduire des animaux IPI par achat sans test à l introduction est : P=1- (0,98) n, n étant le nombre d animaux achetés (47). De la même façon, le risque annuel de néo-infection étant environ de 30%, 50% de la population possédant des anticorps et la virémie persistant pendant 10 jours (2,7% de l année), le risque (P ) d introduire un animal virémique transitoire est : P = 0,3x0,5x0,025=0,4%. On a donc P=1- (0,996) n, n étant le nombre d animaux achetés (47). - les reproducteurs : taureau ou sperme d un animal IPI ou infecté transitoire ; - le voisinage : lors de contact de pâtures avec des animaux IPI ou infectés transitoires, avec des animaux sauvages porteurs du virus, ou lors de cohabitations multiespèces domestiques (artiodactyles) ; - les marchés et foires. b - Persistance de l infection au sein de l élevage La persistance de l infection par le BVDV au sein d un élevage peut-être due à deux causes majeures. Tout d abord, il peut s agir de réinfection régulière du cheptel par voisinage ou par achat. La cause la plus fréquente reste tout de même la persistance d un animal IPI dans le troupeau. Cet IPI contamine sans cesse ces congénères et permet

52 la formation de nouveaux IPI qui maintiennent eux aussi la charge virale dans l élevage. Cette notion importante sera évidemment prise en compte dans les mesures de lutte.

53 V : TABLEAU CLINIQUE ET LESIONNEL DU SYNDROME BVD/MD A : Maladie des muqueuses La maladie des muqueuses (MD) a tout d abord était définie comme étant une maladie bovine mortelle puis on a par la suite découvert que seuls les animaux IPI étaient susceptibles de l exprimer. Ensuite, deux types de MD ont été découverts (86). a - Maladie des muqueuses aiguë Elle apparaît lors d une nouvelle infection par une souche CP antigéniquement comparable à la souche NCP hébergée par l animal. Ces cas sont donc le plus souvent sporadiques. Cette maladie se traduit cliniquement par un syndrome fébrile, une diarrhée nauséabonde parfois hémorragique ou nécrofibrineuse et une stomatite ulcéreuse s accompagnant de ptyalisme. Le diabète sucré de type I peut parfois s ajouter à ce tableau clinique (35). Les lésions caractéristiques de cette affection sont : (35, 101) - des ulcères sur l ensemble du tractus digestif : cavité buccale, œsophage, piliers du rumen, et caillette. - une proctite conjonctivo-hémorragique, typhlocolite mucoïde hémorragique ou nécrofibrineuse. - une nécrose focale des plaques de Peyer - des lésions cutanées ulcératives interdigitées, sur la vulve et sur le trayon. Cependant ce tableau clinique n est pas toujours aussi net, ainsi le diagnostic différentiel avec une diarrhée parasitaire : (fasciolose, œstertagiose), une diarrhée

54 infectieuse : ( salmonellose, coryza gangréneux), paratuberculose, une diarrhée carentielle : ( Cu, Se, Co), une diarrhée toxique : ( Mo)b est parfois délicat (35). Le tableau 9 résume cette situation. Symptômes : Age des animaux : Lésions : Diagnostic Maladie des.syndrome fébrile 3 semaines à 3 ans Sur le tractus différentiel : muqueuses.diarrhée évolution : digestif,.diarrhées parasitaires (MD) nauséabonde 2-3j à 2 semaines surtout stomatite.diarrhées infectieuses aiguë.ptyalisme Névrose focale des.diarrhées carentielles plaques de Peyer.diarrhées toxiques Tableau 9 : diagnostic clinique, nécropsique et différentiel de la maladie des muqueuses aiguë (35). b - Maladie des muqueuses chronique Cette forme de la maladie apparaît lors d une nouvelle infection par une souche NCP antigéniquement comparable à la souche NCP hébergée par l animal. Elle se traduit cliniquement par une diarrhée intermittente ou continue entraînant un amaigrissement progressif jusqu à la cachexie (35, 101). Les lésions caractéristiques de cette affection sont : (35, 101) - une stomatite en fin d évolution - des lésions cutanées : ulcères de l espace interdigité et de la sphère génitale, alopécie et hyperkératinisation Le diagnostic différentiel doit s effectuer avec toutes les affections cachectisantes, les diarrhées chroniques parasitaires, infectieuses, carentielles, ou encore une maladie génétique telle que le BLAD (Bovine Leukocyte Adhesion Deficiency)(35).

55 Cette situation est résumée dans le tableau 10. Symptômes : Age des Lésions : id que MD Diagnostic Maladie.amaigrissement animaux : aiguë différentiel : des progressif 3 semaines à 3.stomatite en fin.diarrhées chroniques muqueuses.puis cachexie ans d évolution.blad chronique.diarrhée intermittente évolution :.ulcération cutanée.affections 2 à 9 semaines.alopécie cachectisantes.hyperkératinisation Tableau 10 : diagnostic clinique, nécropsique et différentiel de la maladie des muqueuses chronique (35). B : BVD aiguë Une infection par le BVD entraîne généralement une diarrhée bénigne et transitoire, une hyperthermie transitoire, une leucopénie passagère et une chute de production laitière provisoire mais cette infection peut entraîner de nombreuses conséquences au sein de l élevage à plus ou moins long terme (35). a - Avortements Ces avortements apparaissent généralement pendant les deux premiers tiers de gestation, 9 à 30 jours après l infection pouvant intervenir jusqu au 125 e jour de gestation. De temps en temps, ces avortements peuvent également intervenir plus tardivement (60, 101). Le virus peut atteindre directement le fœtus par voie transplacentaire ou créer une placentite perturbant les échanges fœto-placentaires (86, 112). Généralement, aucune lésion spécifique n est retrouvée sur le placenta et le fœtus (24). On peut tout de même retrouver un retard de croissance intra-utérine (24), une atrophie thymique, une déplétion du tissu lymphoïde associée au tube digestif, une

56 pneumonie, une inflammation ou nécrose du myocarde, une nécrose ou hémorragie vasculaire pulmonaire, ou une hypomyélinisation (112). Trois avortements ou plus regroupés sur quelques semaines au sein d un même élevage doivent suggérer un passage du BVDV dans le dernier mois (101). b - Troubles de la reproduction mortalité embryonnaire - retour en chaleur Cette mortalité embryonnaire passe souvent inaperçue au sein de l élevage, et se traduit par de nombreux retours en chaleur plus ou moins tardifs. Elle constitue en fait des avortements très précoces liés à une infection contemporaine de l insémination ou de la saillie (24, 101). Cette mortalité embryonnaire ou non fécondation peuvent être reliées à trois causes : - une diminution du taux de fécondation des ovocytes (41) - des effets délétères directs sur l embryon (8, 9) - un milieu utérin hostile dû aux infiltrations lymphocytaires et plasmocytaires de l endomètre (2). La contamination du milieu utérin peut s effectuer par deux voies : oronasale ou intra-utérine. Généralement, lors de passage de BVDV la baisse de fécondité est transitoire, par contre lors d utilisation d un mâle IPI ce trouble de fécondité persiste (35). Lors d une progression lente du virus, les vaches s infectent entre les gestations ce qui provoque une évolution subclinique, se séroconvertissent et se protègent progressivement. Alors que lors d une introduction d un IPI, l expression clinique est grave (24). Mais le BVDV est rarement responsable de «repeat-breading» : il y a une augmentation du nombre d IA pour avoir l IA fécondante sur de nombreux animaux et non pas une augmentation très importante du nombre d IA sur quelques animaux (24).

57 momification du fœtus Généralement, aucune lésion caractéristique n est associée aux avortements, mais parfois les fœtus peuvent être momifiés (16, 35). Les mécanismes de cette momification fœtale ne sont pas encore connus. infertilité femelle Cette infertilité femelle est due à une anomalie du fonctionnement ovarien pouvant s expliquer par : - une ovarite interstitielle diffuse entraînant une perturbation de la croissance folliculaire. On remarque une diminution du nombre des follicules tertiaires, pré ovulatoires ou atrésiques (49) ainsi qu une diminution du diamètre maximal et du rythme de croissance des follicules (24). - une ovulation anormale, seul 17% des follicules ayant ovulés (51), due à des profils hormonaux anormaux : une augmentation du taux du cortisol supprimant la libération de LH (74). - une diminution du nombre de corps jaunes directement liée à la chute du taux d ovulation (51). Ces anomalies ont pour conséquences une fertilité très faible chez les vaches IPI, une intensité d expression des chaleurs beaucoup plus faible chez les femelles infectées ou IPI (51), et une réponse diminuée au traitement de super ovulation chez ces mêmes animaux (24). infertilité mâle La fertilité des taureaux IPI est très variable, certains spermes étant tout à fait normaux, d autres semences étant de mauvaise qualité avec une faible motilité, une faible concentration et de nombreuses anomalies des spermatozoïdes (52, 53, 72, 75). Lors d infection aiguë, il y a une détérioration de la qualité du sperme 7 jours après infection jusqu à 30 à 50 jours. Il y a une diminution du volume, une diminution de la motilité et de la concentration, une augmentation du pourcentage des spermatozoïdes morts et anormaux (88).

58 Histologiquement, on remarque une dégénérescence et une nécrose des tubules séminifères, un œdème modéré des testicules, et une infiltration lymphocytaire des glandes annexes réversibles après 80 jours (24). taux de rétention placentaire Le risque de rétention placentaire est multiplié par trois lors d infection par le BVDV au sein d un élevage (60). c - Syndrome du veau faible retard de croissance Souvent, lors d une infection in utero par le BVDV dans les 150 premiers jours de gestation, le veau subit un retard de croissance remarquable dès la naissance. Ces veaux généralement chétifs, présentant une faiblesse généralisée, meurent dans la plupart des cas dans les 3 premiers jours. Certains de ces veaux sont des IPI, mais tous les IPI n ont pas de retard de croissance et inversement tous ces veaux ne sont pas des IPI (35, 101). d - Anomalies congénitales Une infection par le BVDV pendant la gestation entre le 100 et le 150 jours peut entraîner de nombreuses malformations néonatales. Cette période correspond, en effet à l organogenèse. Ces malformations atteignent différents systèmes : nerveux, immunitaire, musculo-squelettique, respiratoire, oculaire et cutané, mais en général au sein d un même élevage les anomalies sont de même nature (35, 101). Les lésions nerveuses sont très fréquentes et variables dans leur nature et leur intensité allant de la démyélinisation, d une réaction inflammatoire jusqu à la réduction discrète ou totale de certains types cellulaires. Cette diversité peut s expliquer par la pathogénicité et le tropisme des souches virales, le génotype de l hôte, le stade de l infection Elles touchent préférentiellement l hippocampe, le cortex cérébral et le cervelet. Cela se traduit cliniquement par des veaux faibles, ataxiques, tremblants, présentant un nystagmus, parfois une amaurose, incapables de se lever et de téter (10, 82, 101)

59 Ces veaux présentent généralement une stature trapue, courte, des malformations faciales (24). Le tableau 11 rassemble les différentes malformations associées au BVD. SYSTEME NERVEUX (80-120j de Microencéphalie, porencéphalie, hydrocéphalie, gestation) hydranencéphalie, hypoplasie cérébelleuse, hypomyélinogenèse médullaire. ŒIL (80-160j de gestation) Atrophie et dysplasie rétiniennes, névrite optique, cataracte uni- ou bilatérale, microphtalmie, kératite interstitielle, amaurose. SYSTEME IMMUNITAIRE Aplasie et hypoplasie thymique PEAU Hypotrichose, alopécie, hirsutisme SYSTEME MUSCULO-SQUELETTIQUE Brachygnatie, retard de croissance, arthrogrypose, anomalies osseuses, syndrome du veau faible, torticolis, opisthotonos. APPAREIL RESPIRATOIRE Aplasie et hypoplasie pulmonaire Tableau 11 : Anomalies congénitales associées au BVD (35, 101). Tous ces troubles apparaissent suivant le moment de l infection au cours de la gestation. e - Pathologie néonatale Une étude a montré que l infection conjointe des virus RSB (respiratoire syncytial bovin) et BVDV a reproduit une affection clinique visible et a provoqué des lésions plus graves et plus étendues que dans le cas de chaque infection simple. L histologie a révélé que le BVDV potentialise l action du virus RS sur l épithélium respiratoire (19). En augmentant, la fréquence et la gravité des diarrhées et pneumopathies, le BVDV apparaît comme un facteur favorisant au moins les co-infections suivantes : BHV1, PI3, RSV, rotavirus, Pasteurella hemolytica (4, 60, 89,98, 101, 108).

60 f - Diarrhée aiguë contagieuse Le BVD peut également se traduire par une diarrhée aiguë contagieuse touchant essentiellement les animaux de 6 à 18 mois (35, 108). Cette diarrhée très contagieuse présente une morbidité élevée mais une létalité faible : 10 à 20% (101). g - Chute de production La chute de production pouvant atteindre 10% transitoirement est liée au pic fébrile accompagné plus ou moins d une leucopénie. Cette chute peut persister 10 jours puis le niveau de production augmente sans jamais retrouver le niveau antérieur (24, 35, 79). Ces symptômes infra-cliniques sont très fréquents puisque 70 à 90% des infections se déroulent sans manifestation clinique visible (1). h - Autres Parfois le BVDV est lié à d autres symptômes tels que l hydropisie des enveloppes fœtales, ou encore l augmentation de la fréquence des mammites (+7,1% en Norvège) de par son effet immunosuppresseur (110). Cependant l infection est infra-clinique et représenterait 60 à 90% des cas. Elle se traduit par une hyperthermie modérée et transitoire accompagnant une leucopénie, une réduction de l appétit et un ramollissement des bouses qui passe souvent inaperçu (16). C : BVD : les souches virulentes Les souches virulentes isolées sont des souches non-cytopathogènes de type 2 en Amérique du Nord mais certaines souches virulentes de type 1 ont été isolées en Europe (35). Ces souches sont à l origine d un syndrome hémorragique d évolution rapide (fatale dans 50% des cas en moins de deux jours) qui touche essentiellement les jeunes (26).

61 Cliniquement, ces animaux présentent une forte hyperthermie, une hématurie et des fèces hémorragiques, un épistaxis et des saignements aux sites d injection. Histopathologiquement, on remarque un allongement du temps de saignement, un taux d hémoglobine inférieur à 90g/l, d hématocrite inférieur à 20%, et une numération plaquettaire inférieure à 50000/mm 3. Il s agit alors d une anémie microcytaire hypochrome périphérique associée à une thrombocytopénie marquée (4, 26, 27, 35, 61, 94, 101). Lors de l autopsie de ces animaux, on remarque des hémorragies et un purpura sur l ensemble des muqueuses, sur le caecum, le mésentère, l épiplon, la sous-muqueuse œsophagienne et l épicarde (27, 35, 61, 94). Cet aspect de l infection par le BVDV se rapproche beaucoup plus des symptômes qu entraînent les autres pestivirus : ceux de la peste porcine et de la border disease que de la BVD classique. La figure suivante résume les différentes situations pré-citées.

62 Infection par le BVDV Type I Type II Asymptomatique Diarrhée Légère / sévère Rarement : o Ulcères gastro-intestinaux o Troubles respiratoires Si infection pendant la gestation (par une souche NCP) Identique au type I Non Hypervirulence Oui Syndrome hémorragique Forte mortalité Atteinte respiratoire souvent associée 30 ème au 120 ème jour de gestation Autre période Veau Infecté Permanent Immunotolérant (IPI) normal ou anormal Surinfection par souche cytopathogène (CP) Non Oui Résorption fœtale Avortement Veau anormal o Anomalie SNC o Lésions oculaires o Lésions des phanères Veau normal séropositif IPI (1% du cheptel) Maladie des muqueuses (mortalité : 100%) Fig. 8 : présentation dichotomique de l infection par le BVDV (30) D : Quand penser à une infection par le BVDV au sein d un élevage? Selon une étude menée par les GDS bretons (3, 7), trois formes principales représentent à elles seules plus de 90% des motifs d appels des plans BVD : un ou plusieurs cas de maladie des muqueuses (40%), les retards de croissance (10%), et les avortements et mortalités embryonnaires (40%).

63 10% Motifs d'appel des plans BVD 2% 2% 2% 4% Maladie des muqueuses Mortalités embryonnaires et avortements Retards de croissance 40% diarrhées néonatales diarrhées des adultes Malformations 40% Divers Fig. 9 : motifs d appels des plans BVD (3, 7). Les motifs d appels secondaires sont : la diarrhée virale bovine, les malformations congénitales, le syndrome hémorragique, les infections respiratoires. D autre part, la circulation du BVD dans un élevage est soupçonnée lorsque celui-ci présentent un ou plusieurs signes évocateurs. Ces signes peuvent être classés en majeurs ou mineurs.

64 Signes évocateurs majeurs.cas de MD.avortement, fœtus momifiés.anomalies congénitales en série.syndrome hémorragique.retards de croissance Signes évocateurs mineurs.retours en chaleur.chute de production.pic fébrile.diarrhée aiguë contagieuse.pathologie néonatale Présomption de circulation de BVDV dans l élevage Diagnostic de laboratoire Fig. 10: conduite du diagnostic épidémio-clinique par le BVDV (35, 101). Les aspects cliniques divers de l infection par le BVD peuvent suggérer une infection par le BVDV mais rendent difficiles l établissement d un diagnostic avec certitude. Les outils du diagnostic de laboratoire sont donc nécessaires pour le confirmer. E : Diagnostic différentiel (18). Nous évoquerons ici uniquement les affections s accompagnant de troubles digestifs a - Affections associant diarrhées et lésions buccales. Intoxications On rencontre de telles affections lors d intoxications par des végétaux ou des toxiques comme le sureau, les glands ou l arsenic

65 Coryza gangréneux Syndrome de déficience d adhésion des leucocytes bovins (BLAD) b - Affections s exprimant essentiellement par des lésions de la cavité buccale Fièvre aphteuse Stomatite papuleuse Stomatite nécrotique Fièvre catarrhale du mouton (Blue Tongue) c - Affections s exprimant par de la diarrhée en l absence de lésions de la cavité buccale Parasitisme Salmonellose Paratuberculose Carences en cuivre, sélénium ou cobalt Amyloïdose rénale

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67 VI : ANALYSES DE LABORATOIRE A : Les outils du diagnostic de laboratoire a - Tests virologiques Isolement viral L isolement viral est la méthode de référence. Celle-ci s effectue in vitro sur des cultures primaires de cellules embryonnaires de cornets nasaux ou de cellules testiculaires bovines. La mise en évidence de souche cytopathogène est rapide car il y a une altération cellulaire en moins de 48h. L identification virale est par la suite réalisée par séroneutralisation et la souche peut être déterminée à l aide d un panel d anticorps monoclonaux spécifiques (35). La mise en évidence de souches non cytopathogènes est moins aisée puisqu elles n entraînent aucun effet sur la culture cellulaire. On identifie donc le virus directement par immunofluorescence ou par un test à l immunoperoxydase après isolement (18). La première méthode, de par sa rapidité et sa précision, est considérée comme la méthode de référence. Cependant, l immunoperoxydase effectuée en 5 à 7 jours peut s effectuer sur un plus grand nombre d échantillons, entraîne moins de frais et demande une technicité bien moins importante (pas de matériel spécifique, pas de qualification spécifique du personnel) (18). Mais les risques de faux positifs sont plus importants, les péroxydases existant dans les cellules de nombreux tissus. Pour effectuer cette recherche, de nombreux prélèvements sont possibles : sérum, sang total, sécrétion nasale, semence chez les animaux vivants ou les organes lymphoïdes tels que la rate, les plaques de Peyer, les nœuds lymphatiques mésentériques et le thymus sur un cadavre (35).

68 Détection des antigènes viraux L identification des antigènes viraux sur coupes d organes congelés s effectue par immunohistochimie, immunofluorescence, ou immunoperoxydase (18, 35, 105). L inconvénient majeur de cette technique est que l on ne peut faire la différence entre une virémie transitoire et un état immunotolérant avec infection persistante. A partir de prélèvements sanguins, on utilise un test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Cette technique peut également être utilisée à partir de caillots, d extraits leucocytaires ou encore de broyats d organes lymphoïdes traités par un tampon lytique (65). Des travaux sont en cours sur les matières fécales et les premiers résultats sont encourageants (99). Ces échantillons sont déposés sur des cupules tapissées d un mélange d anticorps monoclonaux dirigés contre différent épitopes de la protéine NS2/3 (80/125). D autres tests du même type sont réalisés avec un ou plusieurs anticorps monoclonaux dont p80/125 (99). L ajout successif de sérum, de réactif et de substrat, comme le montre la figure 12 (105), permet de révéler le complexe formé. La quantité d antigène viral est alors proportionnelle à la densité optique obtenue (101, 105). Tampon de lyse ETAPE 1 Sang de l animal IPI ETAPE 3 Conjugué chèvre anti Ig-G de lapin/peroxydase Plaque sensibilisée avec Ac monoclonaux anti- p80 Apport de l échantillon et capture de la p80 /125 ETAPE 2 Sérum de lapin anti-p80 Amplification immunologique Substrat ETAPE 4 Révélation immunologique Développement (substrat) puis lecture

69 Fig. 11 : technique ELISA appliquée à la détection d antigènes viraux (105). Les titres viraux des animaux IPI est très élevé. La sensibilité de ce test (la sensibilité étant l aptitude d un test à fournir une réponse positive chez un individu infecté) est très bonne (supérieure à 90-95%) (101). Pour THIBAULT et al. (105) elle atteint 97,6% sur des échantillons de sang de total et 100% sur les leucocytes et les broyats d organes. Cette sensibilité reste tout de même médiocre lors d infection transitoire, les titres viraux étant faibles. Pour ce cas, on préférera donc l isolement viral (101). La spécificité de ce test (la spécificité étant l aptitude d un test à fournir une réponse négative chez un individu indemne) est excellente quelle que soit la nature de l échantillon puisque 100% des animaux non IPI ont présenté un seuil inférieur à celui de positivité (105). Ce test permet un résultat rapide à moindre coût et permettant de traiter un grand nombre d échantillon simultanément. Toutefois, la valeur prédictive positive de ce test (la valeur prédictive positive étant la proportion des vrais positifs parmi l ensemble des réponses positives fournies par un test de dépistage) dépend de la prévalence de l infection (1-2% d animaux IPI), celle-ci est donc moyenne : 50% environ. Il ne sera astucieux dès lors d utiliser ce test que sur des animaux suspects après étude clinique et couplé à une sérologie. Cytométrie de flux Cette technique consiste à trier les cellules infectées des non-infectées après marquage spécifique. Les performances sont comparables à l isolement viral mais il persiste de nombreuses contraintes matérielles qui ont tendance à laisser ces méthodes dans le domaine des laboratoires spécialisés. De plus, on ne peut distinguer qu une seule souche virale à la fois et on ne peut isoler la souche en cause (45, 105). Mise en évidence du génome viral Cette technique fait appel à une phase d amplification du génome viral par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) suivie d une révélation du produit de cette amplification et permet de détecter l ARN génomique viral sans interférer avec les anticorps neutralisants. Ce test s effectue à partir de sérums, d homogénats de

70 poumons, rate ou placenta et d écouvillons nasaux et amygdaliens. Il se déroule sur deux jours (99, 105). La spécificité de ce test est nettement supérieure à celle de l isolement viral. De même, la sensibilité est 10 à 1000 fois supérieure à celle de l isolement viral (45). Ce test n interférant pas avec les anticorps colostraux est tout à fait indiqué pour la recherche du statut des jeunes veaux, et des veaux à venir après élimination du dernier IPI (99). Ce test permet également de différencier les IPI des animaux virémiques transitoires. De plus, cette méthode est utilisable sur des échantillons de 20 sérums. Actuellement, se développe la PCR temps réel. Il s agit de la même méthode utilisant une sonde Taqman la révélation se faisant en même temps que l amplification. Les résultats sont visualisables sur un écran informatique relié à l appareil et sont quantifiables par le Ct (nombre de cycles) qui permet d atteindre un niveau de fluorescence spécifique de la sonde. Elle permet également de différencier des animaux IPI des virémiques transitoires, la différence de Ct étant de l ordre d un facteur 10 (la différence de charge virale de 2 10 ). Cette dernière méthode est encore plus sensible et spécifique grâce à l utilisation de sondes marquées fluorescentes en complément des amorces (103). Ainsi, la PCR devient plus rapide et facile, plus spécifique et sensible, et diminue le risque de contamination lors d amplification. FULTON et al. (38) ont montré que la méthode de RT-PCR (reverse-transcriptase polymerase chain reaction) permet de détecter et de différencier différents types de pestivirus. Leur étude portait sur : - des souches de référence du BVDV ; - des isolats de BVDV provenant d analyses ; - des souches vivantes CP modifiées de BVDV provenant de vaccins ; - des souches de références du virus de Border Disease. Une première épreuve d amplification en chaîne par la polymérase (PCR) a permis de mettre en évidence 25 ARN de pestivirus sur 30. Une deuxième épreuve de PCR spécifique de type a permis de mettre en évidence les 30 ARN et de les différencier les uns des autres. Ce test est très intéressant pour l identification et la caractérisation du BVDV puisqu il présente à la fois une excellente spécificité et sensibilité, et puisqu il n interfère pas avec la vaccination éventuelle.

71 Interprétation des tests virologiques Les animaux présentant un test virologique positif sont soit des animaux IPI soit des animaux infectés transitoires. Les animaux IPI présentent une virémie présente toute la vie de l animal avec un titre très élevé variant dans le temps. Dans le cas des animaux infectés transitoires, la virémie est intermittente avec un titre beaucoup plus faible. Les deux cas peuvent être différenciés par un second test trois semaines un mois après : l IPI reste viropositif alors que l infecté transitoire est redevenu vironégatif. Un test négatif signifie que l animal n est pas porteur du virus au moment des prélèvements. Animal IPI Animal infecté Animal non contaminé transitoire 1 er test virologique e test virologique (3 à 4 semaines après) Tableau 12 : interprétation des tests virologiques (18). b - Tests sérologiques Ils consistent à détecter les anticorps spécifiques des antigènes viraux du BVDV dans le sérum de l hôte. Test de séroneutralisation Ce test sérologique de référence nécessite environ 3 à 5 jours pour être réalisé. Le point faible de cette méthode est qu il n y a pas de standardisation entre les différents laboratoires, aucune comparaison n est alors possible (45) : - il n y a pas de souche virale de référence, les laboratoires en utilisent plusieurs : NADL, Singer, Oregon C24V. Selon le degré

72 d homologie entre la souche du test et la souche infectante, les titres en anticorps sont plus ou moins élevés. - Les types de techniques varient également d un laboratoire à l autre : le type cellulaire utilisé, le nombre de passage sur les cellules Test ELISA Ce test pour la recherche des anticorps totaux est très fiable et peu coûteux. Il s effectue sur un échantillon de sérum individuel et constitue le test le plus couramment utilisé en routine (45). Le test ELISA indirect utilise des structures bien conservées telle que NS2/3 (p80/125), mais il y a une incertitude quant à la présence quasi systématique de quelques épitopes variables pouvant révéler une séroconversion plus ou moins importante chez les IPI recontaminés (105). Ces IPI reconvertis présentent généralement une faible séropositivité (99). La Figure 12 résume cette situation. -Animal vacciné ou contaminé -IPI recontaminé par souche B épitopes «type A» épitopes «type B» Présence d anticorps anti-bvd-md Fixation des antiglobulines de bovins marquées Réaction colorée - animal séro O + protégé - «IPI +» O S Substrat S Fig.12 : limites de l ELISA indirect en diagnostic de la BVD-MD (106)

73 L ELISA dite de compétition ou «Blocking ELISA» apporterait une meilleure spécificité. Cette technique ne prendrait en compte qu un seul épitope commun à tous les pestivirus et faisant partie du complexe structural NS2/3 (p80/125). Ainsi les animaux IPI resteraient séronégatifs (105). La Figure 13 montre cette méthode. Virus A Virus B Sérum d IPI recontaminé par un virus Protéine p80 purifiée est un épitope partagé par toutes les souches de BVD conter lequel l IPI ne fabriquera jamais d anticorps Fixation au site resté libre S Apport du conjugué : Ac monoclonal marqué dirigé contre l épitope commun Apport du substrat : une réaction colorée traduit ici un animal séronégatif S (vis-à-vis de ) Séronégatif = animal jamais contaminé ou = IPI Fig. 13 : principe de l ELISA Blocking (105). THIBAULT et al. (105) ont montré que ce test présente une excellente spécificité de l ordre de 99%, et une très bonne sensibilité de l ordre de 95%. En effet, 98,8% des IPI ont présenté une sérologie inférieure au seuil de positivité, 100% des animaux immunocompétents non vaccinés non contaminés ont présenté une sérologie négative et 95% des animaux naturellement infectés ont présentés une sérologie positive. Le test spécifique NS3 (p80) est nettement moins courant à cause des difficultés techniques et de son manque de sensibilité 15% des IPI seraient séropositifs (105).

74 Test d immunofluorescence indirecte Ce test est maintenant très peu utilisé en pratique. Interprétation des sérologies L interprétation est résumée au sein du tableau 13. Cette interprétation est générale à toutes ces méthodes, seul le blocking ELISA indique comme séronégatif les IPI recontaminés. SEROLOGIE POSITIVE - Animal immunocompétent ou contaminé - Animal vacciné par un vaccin vivant - Présence d anticorps colostraux - (IPI recontaminé par une souche différente de la souche d origine) SEROLOGIE NEGATIVE - Animal sain, jamais contaminé - Animal en cours de séroconversion - Animal IPI non recontaminé Tableau 13 : interprétation des tests sérologiques (18) Le statut sérologique définitif d un animal est généralement établi au bout de 2 tests sérologiques distants de 3 semaines. Cette sérologie n est pas interprétable pour les animaux de moins de 6 mois à cause de la présence d anticorps colostraux. En effet, les veaux ayant reçu du colostrum dans les heures suivant la naissance présentent une montée du titre en anticorps rapide et intense. Chez les veaux IPI les anticorps disparaissent progressivement pour aboutir à une séronégativation entre le 3 e et le 4 e mois, alors qu un veau non IPI présente une disparition beaucoup plus lente des anticorps colostraux avec une séroconversion vers 6 mois minimum. La sérologie est également difficilement interprétable pour les animaux vaccinés avec un vaccin vivant, le virus vaccinal entraînant une séroconversion durable mais moins intense (105).

75 c - Méthodes alternatives Recherche d anticorps dans le lait de mélange par le test ELISA (5, 6, 56, 80, 81) Le principe de ce test est de réaliser une compétition entre les anticorps du BVDV des échantillons à tester et une solution contenant des anticorps monoclonaux dirigés contre la protéine NS3 (p80). Dans le cas d un échantillon positif, les anticorps anti-bvd contenus dans cet échantillon se lient à l antigène et empêche la fixation des anticorps monoclonaux. Dans le cas d un échantillon négatif, les anticorps monoclonaux peuvent alors se fixer sur les sites antigéniques restés libres. Le matériel non fixé est éliminé par lavage. Les anticorps monoclonaux sont révélés par coloration. Cette méthode permet de faire la relation entre la prévalence des animaux positifs dans le troupeau et le pourcentage d inhibition du lait de tank en tenant compte de l effet potentiel des autres variables explicatives. Il a été montré que ces deux variables étaient liées par l équation suivante : P+ = β 0 +β 1 xinh+taille+primi+nbre de traite+e Avec P+ = prévalence des animaux positifs, β 0 = l ordonnée à l origine, β 1 = la pente de la courbe, Inh = pourcentage d inhibition du lait de tank, taille = effet du nombre de prélèvements réalisés dans le troupeau, Primi = effet du pourcentage de primipares dans le troupeau, Nbre de traite = effet du nombre de traites dans le tank au moment du prélèvement, e = erreur. Le pourcentage d inhibition étant calculé par la relation suivante : Inh = 100(OD contrôle -OD échantillon )/OD contrôle Où OD = densité optique mesurée par réfractomètre à 450 nm. De même la relation entre le pourcentage d inhibition du lait de tank et la circulation virale récente dans le troupeau est traduite dans l équation suivante : Ln [p/(1-p)] = β 0 +Inh+taille+primi+e

76 Où p = probabilité d existence d au moins une vache primipare positive dans le troupeau. Ainsi au niveau individuel un animal est considéré positif si le taux d inhibition est supérieur à 50%. Les valeurs seuil et l interprétation associée des pourcentages d inhibition du lait individuel sont regroupées dans le tableau suivant : Inh individuel Interprétation <30% Négatif 30-50% Douteux >50% Positif Tableau 14 : interprétation selon le pourcentage d inhibition du lait individuel (5, 6, 56) Ce test est beaucoup plus utilisé dans les interprétations collectives sur le lait de tank. Ainsi, un troupeau ayant un taux d inhibition du lait de tank inférieur à 30% comporte en général moins de 20% d animaux positifs, alors que ceux présentant un taux supérieur à 70% auraient plus de 70% de leurs animaux positifs. Cependant, étant donnée la faible prévalence des troupeaux avec une circulation virale récente (15%) la valeur prédictive de ce test reste faible. Ce qui signifie que seuls les troupeaux présentant un taux supérieur à 80% seraient caractérisés de façon quasi certaine par une circulation virale récente. De plus, si l on ne prend pas en compte le facteur taille on surestime la prévalence des animaux positifs du troupeau dans ceux contenant plus de 20 bovins. Si l on ne prend pas en compte le faible pourcentage des primipares (<25%) on sous-estime cette prévalence. Il est également important de prendre en compte le statut vaccinal des troupeaux puisque les troupeaux vaccinés présentent un taux d inhibition du lait de tank supérieur à 60%, les différences selon les spécialités commerciales et les protocoles étant inconnues à ce jour. La sensibilité et spécificité de ce test varient d une publication à l autre de 65% (56) à 97% (5). Kramps et al (56) expliquent ce manque de sensibilité par la faiblesse du taux d immunoglobines vingt fois plus faible dans le lait que dans le sang.

77 Recherche du génome viral par RT-PCR dans le lait de mélanges Après extraction des cellules somatiques du lait par centrifugation la technique d amplification et d hybridation ou de révélation en temps réel est la même que sur le sérum. Cette méthode permet d identifier les troupeaux infectés et ceux contenant un IPI de façon très sure puisque la sensibilité est 14,6 fois celle de l isolement virale et permet ainsi de détecter un IPI ou un virémique transitoire dans un tank de 400 vaches. Ainsi, un résultat positif indique la présence de l infection mais un résultat négatif ne certifie pas l absence de l infection à cause des vaches dont le lait n est pas testé (vaches taries, vaches traitées ou fraîchement vêlées, élèves ) (91). De plus, sur le lait individuel on peut différencier les IPI des virémiques transitoires la différence des charges virales étant d un facteur 10 2 (soit deux log) (91). d - Caractéristiques des méthodes d analyses Le tableau 15 résume les grandes caractéristiques de ces tests.

78 AVANTAGES INCONVENIENTS PRELEVEMENTS DETECTION IPI Isolement viral -Différenciation souches CP/NCP - 48h-15j -Sensible que si Sérum, sang total, semence, organes Non pas de différenciation d avec les virémiques transitoires -Identification de la souche possible -Spécifique passages multiples -Petites séries -Installation lymphoïdes Ag immunohistochimie Coupe d organes 2 e examen à 15j Ag ELISA -Rapide 1-3j -Sensibilité Sang total, extrait 2 e examen à 15j -Faible coût -Grande série -Spécificité -Pas d isolement -Manipulation complexe leucocytaire, broyats d organes lymphoïdes, fèces Cytométrie en flux -Spécifique -Pas d isolement 2 e examen à 15j -Une seule souche virale à la fois -Matériel PCR -2j -Spécificité et sen sibilité>isolement viral -Pas interférence avec Ac colostraux Sérum, placenta homogénat de poumon, rate, écouvillons 2 e examen à 15j -Mélange de 20 sérums possible Séroneutralisation -3-5j -Réponse quantitative -Pas de standardisation des labos, pas de Sérum Ne différencie pas les IPI recontaminés comparaison Ac ELISA totaux -1j -Spécifique -Peu coûteuse -Sensibilité varie -Souche dépendant Sérum Ne différencie pas les IPI recontaminés -Grande série -Le + utilisé Ac ELISA p80/125 -Spécifique -Sensible -Grande série -Ac non protecteur Sérum Tous les IPI recontaminés ou non sont séro négatifs -Souche indépendant Immunofluorescence -1j -Non spécifique -Petite série -Souche dépendant Sérum Ne différencie pas les IPI recontaminés Ac ELISA lait -Facile -Bon résultats de -VPP faible -Peu d intérêt pour Lait Estimation du pourcentage IPI au sein du troupeau troupeau l individuel RTPCR lait -Facile, rapide -Excellente sensibilité et spécificité Lait Détection des élevages infectés. -Grand échantillon 400 Vaches Tableau 15 : caractéristiques des méthodes d analyses (5, 6, 56,71, 91)

79 B : Utilisation pratique de ces analyses a - Interprétation de la sérologie et de la virologie couplées Cette interprétation est résumée dans le tableau 16 SEROLOGIE - + VIROLOGIE INTERPRETATION Sain ou en Début d infection, Animal immunisé, incubation IPI IPI de moins de 6 mois ayant bu du colostrum de Vaches séroconverties Animal infecté transitoire, IPI vacciné ou surinfecté, IPI de moins de 6 mois ayant bu du colostrum de vaches séroconverties 2 e TEST IPI Infecté transitoire Si sérologie faiblement positive : IPI Tableau 16 : interprétation des couplages sérologie-virologie (18) En couplant la sérologie et la virologie, la détection des animaux IPI entre 0 et 6 mois devient plus sensible puisque 89% des IPI peuvent être alors détectés (50). Un animal de moins de 6 mois, IPI ayant bu du colostrum de vache récemment séroconvertie peut présenter une sérologie positive et une virologie négative. La sérologie s explique par la présence des anticorps maternels. La virologie négative peut s expliquer par une sensibilité moindre du test, en effet lors d une forte concentration d anticorps colostraux ceux-ci peuvent se fixer sur les antigènes et ainsi les masquer.

80 b - diagnostic individuel Le diagnostic peut être individuel lors d une suspicion clinique d animal IPI. Celui-ci s effectue tout d abord par une analyse sérologique à partir d un prélèvement sur tube sec, puis si celle-ci est négative on réalise une virologie sur un échantillon prélevé sur tube hépariné, sec ou EDTA. Si la sérologie est positive on peut la réaliser de nouveau jours après pour s assurer qu il s agit bien d un infecté transitoire. Ce diagnostic peut également s effectuer post-mortem ou lors d avortement. Ce diagnostic peut aussi s effectuer par une seule prise de sang quel que soit l âge de l animal par analyse PCR. Sur les animaux de moins de 6 mois le prélèvement doit se faire impérativement sur tube EDTA, pour les animaux de plus de 6 mois sur tube EDTA ou sur tube sec. c - diagnostic de troupeau Lors de diagnostic d un animal IPI au sein d un élevage ou lors de suspicion de passage du BVDV, on réalise un diagnostic de troupeau. Ces analyses se font très rarement sur l ensemble des bêtes car cela serait non seulement très contraignant mais également coûteux. Des plans de dépistage ont alors été mis en place. Généralement on effectue une sérologie sur les 6-12 mois et sur les vaches n ayant pas de descendance testée. Une antigénémie est réalisée sur les animaux dont la sérologie est négative et sur les mères de veaux porteurs de virus. Une deuxième virologie est réalisée sur ces animaux dont la première virologie est positive (68). Les taureaux sont également testés sérologiquement et virologiquement si nécessaire (40). Cette démarche diagnostique générale peut être résumée dans la figure suivante.

81 Suspicion clinique de BVD Suspicion d échec vaccinal IPI déclaré Sérologies - Suspicion clinique : sur malades et voisins par sérologies couplées à 3 semaines d intervalle. - Recherche des IPI : 5 PS par lot d animaux de plus de 6 mois élevés ensemble ou tous les animaux de 6 à 24 mois Virologie ou Antigénémie Elimination des IPI Lot mixte - Recherche des IPI parmi les séronégatifs. - ou contrôle 1 mois plus tard Forte majorité de séropositifs Si >80% : présence probable d un IPI parmi les séronégatifs. Séronégatifs Si >80% : présence d un IPI peu probable Sérologie Chercher une séroconversion Virologie ou Antigénémie Elimination des IPI Prophylaxie médicale Fig. 14 : démarche diagnostique générale (69)

82 Les animaux dont les deux virologies sont positives sont des IPI. Par contre la présence d au moins une sérologie positive montre un passage récent du BVDV avec peut-être de nouveaux IPI à naître donc à contrôler ultérieurement. Ce plan de dépistage présente à la fois une très bonne valeur prédictive VPP=0,98, sensibilité Se=0,99 et spécificité Sp=0,995 ce qui explique l utilisation à grande échelle de cette méthode (50). Ces tests peuvent être utilisés dès 6 mois d âge malgré la persistance éventuelle des anticorps colostraux. Ces anticorps disparaissant très rapidement chez les animaux IPI, la probabilité qu un IPI présente une sérologie positive est infime. La probabilité qu un non-ipi présente à cet âge une sérologie positive est également faible : 3-4%. L interprétation au niveau du lot ne sera donc pas modifiée (50). Chez ces animaux la recherche est effectuée le plus rapidement possible. Cette détection grâce aux techniques PCR va maintenant être simplifiées et surtout moins coûteuses puisque un IPI ou un animal virémique transitoire peut être détecté sur un échantillon de lait de tank pour 400 vaches, ou sur un échantillon contenant 20 sérums. d - diagnostic lors d avortements Lors d avortement, on effectue généralement des sérologies couplées sur la vache avortée et sur une dizaine d autres vaches (primipares et multipares) du même lot avec deux prises de sang à 3-4 semaines d intervalles. La sérologie de la seule vache avortée n apporte pas d éléments diagnostiques de certitude puisque de façon générale une forte proportion de bovins sont séropositifs (68, 85). Dans 43% des cas où l avortement est lié au BVDV on a un taux d anticorps circulants multiplié par 4 dans les 4 premières semaines qui suivent l avortement (68). Dans les cas où l infection a eu lieu plusieurs semaines avant l expulsion, le taux d anticorps est très élevé dès la première prise de sang. On effectue aussi une recherche virale sur les organes de l avorton : rate, thymus, ganglions, poumons, sang cardiaque, foie et rein (68).

83 Le tableau suivant résume les conclusions des différents résultats sérologiques : FAIBLE SUSPICION D AVORTEMENT A BVD - une ou plusieurs vaches ayant avorté sont séro - un ou plusieurs animaux du même lot séro surtout des primipares on peut soumettre les animaux séro à une autre sérologie 3-4 semaines plus tard, si il n y a pas de séroconversion l hypothèse BVD doit être rejetée FORTE SUSPICION D AVORTEMENT A BVD - la quasi totalité des vaches ayant avorté sont séro+ avec en séroneutralisation des taux élevés pour celles ayant avorté depuis plus de 6 semaines - une forte proportion d animaux séro + dans les congénères du même lot - une grande proportion de veau séro + ou IPI Tableau 17 : interprétation des résultats sérologiques lors d avortements (86) e - diagnostic lors d infertilité-d infécondité L objectif est de prouver une circulation virale par sérologie ou par analyse du lait de tank dans le troupeau reproducteur et l absence du virus dans le cheptel de renouvellement (68). Après le diagnostic de circulation virale au sein d un troupeau, de nombreuses mesures sont à mettre en place afin d assainir ce troupeau et de maintenir cette situation le longtemps possible.

84 VII : LES STRATEGIES DE LUTTE A : Prophylaxie sanitaire a - dépistage et élimination des IPI La rupture du cycle d infection est essentielle pour diminuer le plus rapidement possible l incidence de l infection au sein du troupeau. Il faut donc détecter tous les animaux IPI et les éliminer le plus rapidement possible (35). b - suivi des troupeaux Après élimination des IPI il est indispensable de contrôler que l élimination des IPI a été totale et de s assurer que le troupeau ne soit pas soumis à une nouvelle contamination. Ces contrôles s effectuent sur le lait de tank ou sur un pool de sérum des jeunes animaux (6 mois-2 ans) (99). Il est également indispensable de vérifier le statut des veaux à naître le plus rapidement possible. c - contrôle à l introduction Généralement, on effectue en pratique une sérologie pns2/3 (p80/125) couplée d une virologie si la sérologie ressort négative. S il s agit d une vache gravide le contrôle est doublé par le contrôle du produit à la naissance ou à 6 mois. Généralement, les vaches porteuses d IPI ont des taux d anticorps très élevés lorsqu elles ne sont pas IPI elles-même, ce qui permet une bonne détection (18). Une quarantaine de trois semaines est indispensable puisque des virémiques transitoires peuvent être considérés comme sains. En effet, le test ELISA de détection

85 d antigène viral détecte le plus grand nombre d IPI tout en laissant négatifs les animaux non virémiques ou quelques virémiques transitoires (59, 68). Dans cette situation également, la PCR est utilisable afin de détecter à la fois les animaux IPI et virémiques transitoires. Seul le statut des fœtus des génisses gravides n est pas déterminé. L évolution vers la qualification, comme s en approchent les bretons, faciliterait la résolution de ces cas plus complexes. En effet, une vache gravide provenant d un élevage au statut A (3 laits de tank négatifs et dont le test PCR est négatif) donne une garantie maximale à l acheteur. d - contrôle des taureaux Ce contrôle peut s effectuer au cours d un examen morphologique de semence par antigénémie. Dans les centres d insémination artificielle, ils subissent une quarantaine de deux mois avec deux antigénémies à 4 semaines d intervalle (68). e - autres mesures sanitaires D autres mesures peuvent ensuite s ajouter aux précédentes telles que : - la séparation des différents cheptels : bovins, porcins, ovins au sein d une même exploitation ; - l optimisation des conditions de pâturage : éviter les contacts avec les autres cheptels, munir les pâtures jouxtant un autre élevage de clôtures électrifiées composées de deux fils séparés de quelques mètres ; - le contrôle des animaux participant à chaque regroupement ou concours ; - le contrôle des donneuses et des receveuses lors de transplantation embryonnaire ; - des mesures d hygiène strictes sur le matériel d injection et d insémination (59).

86 Ces mesures de contrôle et mesures sanitaires conduisent à une classification des élevages et certainement à terme vers une certification ou une qualification des cheptels. B : Prophylaxie médicale a - Les différents types de vaccins existant sur le marché Il existe plus de 140 vaccins aux Etats-Unis. Les principales qualités recherchées sont l efficacité : assurer une bonne protection immunitaire et l innocuité : ne pas induire de troubles après administration. Les vaccins vivants modifiés (11, 62, 66) Il s agit généralement de virus de souche CP atténués par passages successifs sur des cellules ou mutés par thermosensibilisation. Ils existent sous forme lyophilisée et se présentent dans les formes commerciales soit sous une seule valence soit avec d autres valences virales ou bactériennes. Ces vaccins présentent de nombreux avantages. En effet, un petit nombre de particules virales suffit pour induire une immunité du fait de la réplication virale dans l organisme. Ainsi, lors de la primovaccination une seule injection est nécessaire et l immunité à médiation cellulaire est rapide à se mettre en place, environ 3 semaines et persiste longtemps, 1 an au minimum voire plusieurs années selon les cheptels. Cependant, un stockage inapproprié ou une mauvaise utilisation du vaccin entraverait le pouvoir immunogène ou pourrait engendrer une maladie post vaccinale, la virulence du vaccin se trouvant augmentée. Un risque de contamination du vaccin existe également. Aussi, il persiste un risque de déclencher une maladie des muqueuses sensu stricto chez les IPI 1 à 4 semaines après vaccination ou, de provoquer une recombinaison génétique avec l acide nucléique d un autre virus ou avec les cellules de l animal vacciné et d aboutir à la création d un virus déclenchant une maladie des muqueuses. La contre-indication majeure de ces vaccins est l utilisation pendant les six premiers mois de gestation par crainte d infection fœtale bien que la formation d IPI soit improbable puisque ces vaccins renferment des souches CP dont la capacité à

87 traverser la barrière placentaire est nulle. Par ailleurs, une brève immunodépression favoriserait l émergence d agents infectieux. Les vaccins inactivés (11, 15, 46) Il s agit habituellement de vaccins bivalents contenant une souche CP et une souche NCP avec un adjuvant qui renforce le pouvoir immunogène. Les risques d induire une maladie vaccinale en utilisant ces vaccins sont négligeables car la production de ceux-ci nécessite l intervention de différents produits tuant le virus ainsi que tout autre agent viral ou bactérie opportuniste. Ainsi ils peuvent être utilisés sur des vaches gravides, le virus tué ne pouvant infecter le fœtus. De plus ils ne peuvent induire ni immunodépression ni recombinaison génétique. Cependant une réaction au point d injection, un choc anaphylactique ou une chute de production laitière peuvent se produire juste après vaccination. L immunité induite par ces vaccins est plus longue à se mettre place et entraîne une protection immunitaire de courte durée (parfois moins d un an) ce qui pose de nombreux inconvénients en milieu contaminé. De plus, la primo vaccination nécessite deux injections avec ainsi une manipulation supplémentaire des animaux et un coût augmenté. b - Efficacité des vaccins existant en France et durée de l immunité A ce jour, quatre vaccins sont commercialisés en France. Mucosiffa [Mérial] (16, 22, 31) Il s agit d un vaccin à virus vivant modifié, contenant la souche CP C24 V Oregon, commercialisé en France depuis une quinzaine d année sous forme lyophilisée de 2ml injectable en intramusculaire. L innocuité de ce vaccin a été prouvée par les différentes expériences suivantes : - l injection d une ou de dix doses en intramusculaire n a entraîné aucun signe clinique sur les bovins ; - tous les essais de mise en évidence de transmission de la souche vaccinale vers les animaux témoins se sont révélés négatifs ;

88 - les animaux vaccinés avec cette spécialité et préalablement immunodéprimés avec de l Endoxan (cyclophosphamide) durant 12 jours n ont montré aucune modification de leur réactivité lymphocytaire pendant 21 jours après vaccination. Cependant, il reste une contre indication majeure de ce vaccin utilisé seul dans les six premiers mois de gestation bien que seules les souches NCP semblent capables de traverser la barrière placentaire. L efficacité clinique de ce vaccin a également été prouvée. En effet, à la suite d une injection d une dose en intramusculaire à des veaux de deux mois sans anticorps et non virémiques, il y a comme le montre la figure 15 une séroconversion en jours avec atteinte du maximum de la concentration en anticorps en 1 à 2 mois suivie d une lente diminution. Fig.15 : évolution des anticorps neutralisants après une injection de Mucossifa (16). Ces mêmes animaux ont été soumis à des épreuves de virulence à J7, J30, et J180 après vaccination. Les animaux témoins ont présenté des signes cliniques d hyperthermie, de leucopénie alors que les animaux vaccinés ont présenté moins de signes et très frustes comme le montre la figure 16.

89 Fig.16 : leucopénie après épreuve virulente sur veaux vaccinés avec Mucosiffa (16). Il existe hors AMM un nouveau protocole de vaccination associant une vaccination avec Mucosiffa et une primo injection de Mucobovin. Ce protocole permettrait d obtenir une protection efficace et durable ainsi qu une protection fœtale contre le virus BVDV homologue ou hétérologue (36, 42, 78). Huit génisses témoins ont reçu une primo injection de Mucobovin à l âge de 4 mois, une primo vaccination de Mucosiffa à l âge de 5-6 mois et un rappel de Mucosiffa 1 à 2 mois avant l insémination. Ces 8 génisses ainsi que 2 génisses témoins non vaccinées ont subi entre le 60 e et le 80 e jour de gestation une épreuve par inoculation intra nasale avec la souche homologue NCP Toutes vaches vaccinées et veaux issus de ces veaux sont virologiquement négatifs et ne présentent pas de signes cliniques. Les génisses témoins sont toutes deux virologiquement positives ainsi que leur veaux. Ces résultats sont résumés dans le tableau suivant (36, 78)

90 virémie sérologie clinique Lot Vaches Négatif Positif RAS vacciné Veaux Négatif Négatif RAS Lot Vaches Positif J5-J10 témoin Veaux Positif Négatif 1 mort né, 1 IPI Tableau. 18 : protection fœtale homologue lors de primo-infection au Mucobovin suivie de vaccination au Mucosiffa (36, 79). Neuf génisses témoins ont reçu une primo injection de Mucobovin et une primo vaccination de Mucosiffa 30 jours plus tard et 4 semaines avant la saillie. Ces 9 génisses ainsi que six génisses témoins non vaccinées ont subi entre le 30 e et le 120 e jour de gestation une épreuve par inoculation intra nasale avec un mélange de virus BVDV- 1 (souche 22146) et de virus BVDV-2 (souche CS 8644). Les génisses témoins sont toutes virémiques à partir du 5 e jour, alors que toutes les génisses vaccinées sont restées négatives pendant la période d observation exceptée une génisse positive transitoire en BVDV-2 le 5 e jour post inoculation. Les veaux issus des génisses témoins sont tous virémiques : 1veau étant mort né, 1 autre veau mort à 2 jours et les 4 autres chétifs et malformés, alors que tous les veaux issus de mères vaccinées sont parfaitement sains, négatifs en sérologie et en virologie (42). Mucobovin [Mérial] (31, 32) Il s agit d un vaccin inactivé contenant deux souches NCP : New York et Aveyron. Cette spécialité se présente sous forme prête à l emploi à injecter en sous-cutané. Ce vaccin a été testé en deux doses par voie sous-cutanée en une seule injection sur un lot de bovin et en trois doses à sept jours d intervalle sur un autre lot sans provoquer d hyperthermie ni de réaction locale. Il s est également avéré efficace puisque : - les animaux ayant reçu une injection (la primovaccination nécessitant en fait deux injections à trois semaines d intervalle) et ayant

91 subi une épreuve virulente 171 jours après n ont présentés ni hyperthermie ni virémie transitoire alors que le lot témoin non vacciné a présenté une virémie primaire avec hyperthermie comme le montre la figure Taux d Ac en SN (moy. En log) 3 2 NEW NEWYORK AUCUN VIREMIQUE TRANSITOIRE 1 Témoins TOUS VIREMIQUES 0 TRANSITOIRES J Fig.17 : contrôle d activité de Mucobovin (32). EPREUVE VIRULENTE - des vaches saines ont été inséminées neuf mois après la première injection. A deux mois de gestation, ces vaches ont été en contact étroit avec des IPI. Ces vaches ne présentent aucune trace de virémie et aucun veau n est IPI. Par contre les veaux de mères non vaccinées et soumis à la même épreuve sont tous IPI.

92 Taux d Ac en SN (moy.en log) 4 3 MUCOBOVIN TEMOINS VEAUX NON IPI 2 1 GESTATION EPREUVE I.A. VIRULENTE Par contact avec l IPI 0 0 J+6Mois MISE BAS VEAUX IPI MISE BAS et PRISE COLOSTRALE Evolution des anticorps chez les vaches vaccinées (naissance de veaux non I.P.I.) Evolution des anticorps chez les vaches témoins (naissance de veaux I.P.I.) Fig.18 : évolution des anticorps au cours de la gestation chez les vaches vaccinées et témoins (32). La vaccination des futures gravides réduit le risque de contamination fœtale et de naissance de veaux IPI. Rispoval [Pfizer] (12, 67) Il s agit d un vaccin à virus vivant de souche CP RIT 4350 modifié par thermosensibilisation car ne pouvant plus se multiplier au delà de 39,5 C. Il se présente sous forme monovalente ou bivalente associé avec le vaccin atténué du virus respiratoire syncytial bovin. L innocuité de ce vaccin a évidemment été prouvée puisque : - l injection d une ou de dix doses en intramusculaire n a entraîné aucun signe clinique sur les bovins ;