Le criblage toxicologique dans un LABM: expérience du CHU de Clermont-Ferrand.
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- Virginie Denis
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1 Le criblage toxicologique dans un LABM: expérience du CHU de Clermont-Ferrand. Service de Pharmacologie Médicale Unité de Pharmacologie et Toxicologie Biologique CHU CLERMONT FERRAND INSERM - UMR 1107 Damien RICHARD drichard@chu-clermontferrand.fr
2 1. OBJECTIFS DU LABORATOIRE Projet Hospitalier, sept. 2010: «Développement et validation d une nouvelle méthode de Criblage Toxicologique». Screening avec et sans a priori... Choix d outils analytiques de pointe: sensibilité et spécificité Facilité d utilisation: Analyses 24h / 24. Analyse qualitative et/ou quantitative Echantillons Biologiques et NON Biologiques Applications: Hospitalière & Médico-légale
3 2. PRESENTATION DU MATERIEL ANALYTIQUE Association de méthodes séparatives: +/- +/- HPLC / UV (DAD) GC / MS LC / HRMS
4 2. PRESENTATION DU MATERIEL ANALYTIQUE Méthodes chromatographiques: HPLC / DAD: Colonne chromatographique: Nucleosil C18 (Phénoménex) 150 x 4,6 mm GC / MS: Colonne chromatographique: 5-MS UI 30m, ID 0,25mm, Film 0,25µm LC / HRMS: Colonne de purification: Cyclone P + Cyclone MAX + C18 XL 0,5 x 50 mm Colonne chromatographique: Betasil Phényl-Hexyl 100 x 3,0 mm (3µm) Tps total du run: 34,08 min Standards internes: Clomipramine D3 Halopéridol D4 Morphine D3 Phénobarbital D5 Prazépam D5
5 3. DÉVELOPPEMENT DE LA MÉTHODE Optimisation protocole de traitement des échantillons: 100 ng/ml Amitryptiline Atenolol Amiodarone Bromazepam Diazepam Digoxine Ethosuximide Fentanyl Glibenclamide Halopéridol Imipenem Lidocaine Meprobamate Metformine Morphine Risperidone THC COOH Valproic acid Venlafaxine CPG-SM Sans extraction HPLC- DAD LC- HRMS CPG-SM Extrelut HPLC- DAD LC- HRMS CPG-SM Oasis MCX HPLC- DAD LC- HRMS CPG-SM Oasis HLB HPLC- DAD LC- HRMS Déprotéinisation ACN CPG-SM HPLC- DAD LC- HRMS Déprot Ac. Perchlori que LC- HRMS Total (Légende : rouge: molécule jamais détectée, blanc: molécule non détectée, vert foncé: molécule détectée, vert clair: l HPLC/DAD trouve une benzodiazépine mais ne l identifie pas correctement)
6 3. DÉVELOPPEMENT DE LA MÉTHODE Optimisation protocole de traitement des échantillons: Validation: Molécules en stock: 654 molécules d intérêts...
7 3. DÉVELOPPEMENT DE LA MÉTHODE Optimisation protocole de traitement des échantillons: Validation: Molécules en stock: 654 molécules d intérêts Matrices biologiques: Plasma, Sang total, Urines Détermination des Limites De Détections Concentrations en ng/ml Niveau 1 Niveau 2 Niveau 3 G G G G G G GC /MS + HPLC / DAD TLX LC / HRMS - G1 G2 G2 - G3 G4 G4 - G5 G6 G6 LDD concentration la plus faible permettant l identification de la molécule.
8 3. DÉVELOPPEMENT DE LA MÉTHODE Optimisation protocole de traitement des échantillons: Validation: Molécules en stock: 654 molécules d intérêts Matrices biologiques: Plasma, Sang total, Urines Détermination des Limites De Détections Critères d identification de la molécule: HPLC / DAD: Tr, Tr relatif, superposition spectrale GC/MS: Tr, Tr relatif, superposition spectrale (Full Scan) LC/HRMS: Tr, m, «peak score», pattern isotopique, fragments.
9 3. DÉVELOPPEMENT DE LA MÉTHODE Optimisation protocole de traitement des échantillons: Validation: Molécules en stock: 654 molécules d intérêts Matrices biologiques: Plasma, Sang total, Urines Détermination des Limites De Détections Validation: panel de 14 molécules de référence PhT-ANA-COM-IN-002 v7- Vérification et Validation des méthodes Benzodiazépines (Midazolam, diazépam) et dérivés (zolpidem), barbiturique (phénobarbital), antidépresseurs (imipramine, venlafaxine), anti-psychotique (halopéridol), neuroleptique (clozapine), antalgiques (paracétamol, morphine, tramadol, fentanyl), un stupéfiant (l amphétamine), et un bétabloquant (aténolol). Validation qualitative: matrice urinaire LDD n = 5 Validation quantitative: matrice sanguine (plasma, sang total)
10 3. DÉVELOPPEMENT DE LA MÉTHODE Optimisation protocole de traitement des échantillons: Validation: Résultats: HPLC / DAD: 95 % molécules détectées avec LDD > 100 ng/ml
11 3. DÉVELOPPEMENT DE LA MÉTHODE Optimisation protocole de traitement des échantillons: Validation: Résultats: GC / MS: 98 % molécules détectées avec LDD > 100 ng/ml
12 3. DÉVELOPPEMENT DE LA MÉTHODE Optimisation protocole de traitement des échantillons: Validation: ND 6% Résultats: LC / HRMS: D 94% 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Pourcentage de molécules détectées par LC/HRMS selon les différentes gammes dans le sérum Gamme 1 Gamme 2 Gamme 3 ND G6 G5 G4 G3 G2 G1 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Pourcentage de molécules détectées par LC/HRM S selon les différentes gammes dans les urines Gamme 1 Gamme 2 Gamme 3 ND G6 G5 G4 G3 G2 G1 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% Pourcentage de molécules détectées par LC/HRMS selon les différentes gammes dans le sang total Gamme 1 Gamme 2 Gamme 3 63 % molécules détectées avec LDD 5 ng/ml 95 % molécules détectées avec LDD > 500 ng/ml ND G6 G5 G4 G3 G2 G1
13 3. DÉVELOPPEMENT DE LA MÉTHODE Bibliothèque HPLC / DAD
14 3. DÉVELOPPEMENT DE LA MÉTHODE Bibliothèque GC / MS
15 3. DÉVELOPPEMENT DE LA MÉTHODE Bibliothèque LC / HRMS
16 4. ACTIVITÉ DE TOXICOLOGIE BIOLOGIQUE Anamnèse Screening Immuno-analyse Screening Méthodes séparatives Dosage ciblé et quantitatif
17 4. ACTIVITÉ DE TOXICOLOGIE BIOLOGIQUE Screening toxicologique Matrices Extraction SPE Déprotéinisation HPLC / DAD GC / MS TLX -LC / HRMS
18 4. ACTIVITÉ DE TOXICOLOGIE BIOLOGIQUE Matériel Bibliothèque Avantages Inconvénients HPLC / DAD 800 composés Biblio interne (281/654) Maitrise Facilité retraitement Tps acquisition Spécificité Sensibilité GC/MS Pfleger Maurer Weber Nist Biblio interne (281/654) Maitrise Facilité retraitement Spécificité spectrale Molécules thermolabiles Sensibilité (+/-) Co-élution LC/HRMS Biblio interne (616/654) «infini» Ttt échantillon Vol. échantillon Tps acquisition Mode d acquisition Full information Sensibilité / Spécificité Interprétationbio. semi-quantitative Trop d information? ± Lourdeur du rettt
19 4. ACTIVITÉ DE TOXICOLOGIE BIOLOGIQUE Cas n 1
20 4. ACTIVITÉ DE TOXICOLOGIE BIOLOGIQUE Cas n 1
21 4. ACTIVITÉ DE TOXICOLOGIE BIOLOGIQUE Cas n 2
22 4. ACTIVITÉ DE TOXICOLOGIE BIOLOGIQUE Cas n 2
23 4. ACTIVITÉ DE TOXICOLOGIE BIOLOGIQUE Cas n 3
24 4. ACTIVITÉ DE TOXICOLOGIE BIOLOGIQUE Cas n 3
25 5. ÉTUDE ÉPIDÉMIOLOGIQUE Répartition mensuelle en 2013 (n=662) Répartition mensuelle en 2014 (n=958) Répartition mensuelle en 2015 (n=1201)
26 5. ÉTUDE ÉPIDÉMIOLOGIQUE
27 5. ÉTUDE ÉPIDÉMIOLOGIQUE
28 5. ÉTUDE ÉPIDÉMIOLOGIQUE Résultats POSITIFS (moy 90% des dossiers) Nombre identifications LC/DAD seule 150 5% 199 4% 123 2% LC/DAD + GC/MS 97 3% 66 1% 57 1% GC/MS seule 221 7% 292 6% 277 4% LC/DAD + GC/MS +LC/MS % % % GC/MS + LC/MS % % % LC/DAD + LC/MS % % % LC/MS seule % % % LC/DAD % % % GC/MS % % % LC/MS % % % Nombre de molécules différentes
29 5. ÉTUDE ÉPIDÉMIOLOGIQUE GC/MS 277 (4%) 57 (1%) LC/DAD 123 (2%) GC/MS + Exactive 1055 (15%) GC/MS + LC/DAD + Exactive 780 (11%) LC/DAD + Exactive 672 (10%) Exactive 3860 (57%) Distribution des résultats Positifs en fonction des techniques analytiques; année 2015
30 5. ÉTUDE ÉPIDÉMIOLOGIQUE Molécules Total 1 Paracétamol Oxazepam Midazolam Nordiazepam Laudanosine 78 6 Etomidate 77 7 Propofol 74 8 Cetirizine 73 9 OH-Midazolam Lidocaine THC-COOH Hydroxyzine EDDP Methadone Diazepam Cyamemazine Morphine Amoxicilline Bromazepam Tramadol Zolpidem Codeine Alprazolam Zopiclone Thiopental Fentanyl Citalopram Loxapine Ibuprofene Venlafaxine 24 Molécules Total 1 Oxazepam Paracetamol Midazolam Nordiazepam Cetirizine OH midazolam Methadone Laudanosine Etomidate EDDP Hydroxyzine Propofol THC-COOH Diazepam Morphine Cyamemazine Zopiclone Codeine Lidocaine Alprazolam Citalopram Amoxicilline Bromazepam Fentanyl Norcitalopram Benzoylecgonine Acide Valproique Venlafaxine Norvenlafaxine Levetiracetam 40 Molécules Total 1 Oxazepam Paracetamol Nordiazepam Midazolam THC-COOH Diazepam Cetirizine Laudanosine OH Midazolam Propofol Etomidate Hydroxyzine Cyamemazine Methadone EDDP Atracurium Morphine Lidocaine Alprazolam Temazepam Codeine Citalopram Tramadol Norcitalopram Omeprazole Norhydroxyzine Nortramadol Amoxicilline Benzoylecgonine Zopiclone 54
31 5. ÉTUDE ÉPIDÉMIOLOGIQUE Molécule [Toxique] Nb de fois % de toxique qd identifié identifié 1 Alprazolam % 2 Zopiclone % 3 Nordiazepam % 4 Oxazepam % 5 Hydroxyzine % 6 Bromazepam % 7 Diazepam % 8 Tramadol % 9 Citalopram % 10 Zolpidem % 11 Codeine % 12 Baclofène % 13 Doxylamine % 14 Paracetamol % 15 Verapamil % 16 Mirtazapine % 17 Paroxetine % 18 3-OH bromazepam % 19 Lorazepam % 20 Levetiracetam %
32 5. ÉTUDE ÉPIDÉMIOLOGIQUE Molécules [Supra-théra] Nb de fois % de supra-théra qd identifié identifié 1 Nordiazepam % 2 Amitriptyline % 3 Diazepam % 4 Amoxicilline % 5 Paracétamol % 6 Loxapine % 7 Oxazepam % 8 Alprazolam % 9 Amlodipine % 10 Cetirizine % 11 Zopiclone % 12 Clomipramine % 13 Citalopram % 14 Bromazepam % 15 Lormetazepam % 16 Buprenorphine % 17 Mirtazapine % 18 Nortriptyline % 19 Fentanyl % 20 Prazepam %
33 6. CONCLUSION et PERSPECTIVE Application nouvelle méthode de criblage dans le laboratoire Couplage de trois méthodes analytiques. Validation qualitative de la méthode Passage CQI et EEQ (SFTA) Application quotidiennement. Intérêt de l interprétation biologique +++ Criblage ciblé à l aide de bibliothèques spectrales N accréditation : Liste des site(s) et portée(s) disponible(s) sur Evolutions: bibliothèques spectrales, recherche d inconnus Merci pour votre attention.
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