Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR

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1 Décembre 2016 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 24 Version 1 Utilisation prévue pour le diagnostic in vitro Pour utilisation avec l instrument Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM QIAGEN Manchester Ltd, Skelton House, Lloyd Street North, Manchester, M15 6SH, Royaume-Uni R FR Sample & Assay Technologies

2 Technologies d échantillonnage et de dosage QIAGEN QIAGEN est le premier fournisseur de technologies novatrices d échantillonnage et de dosage permettant d isoler et de détecter le contenu de n importe quel échantillon biologique. Nos produits et services avancés de haute qualité garantissent le succès, de l échantillon jusqu au résultat. QIAGEN fixe les normes en matière de : Purification d ADN, d ARN et de protéines Dosages d acides nucléiques et de protéines Recherche micro-arn et ARNi Automatisation des technologies d échantillonnage et de dosage Notre mission consiste à permettre à notre clientèle de réussir et d accomplir des progrès décisifs. Pour plus d informations, visiter 2 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

3 Contenu Utilisation prévue 4 Résumé et explication du test 4 Principe de la procédure 5 Réactifs 8 Matériel fourni 11 Contenu du kit 11 Matériel nécessaire mais non fourni 12 Avertissements et précautions 13 Informations de sécurité 13 Précautions générales 13 Stockage et manipulation des réactifs 14 Prélèvement d échantillons, préparation à l analyse et stockage 15 Procédure 16 Extraction d ADN 16 Protocoles : Évaluation des échantillons d ADN 17 Détection des mutations KRAS 28 Interprétation des résultats 40 Guide de dépannage 41 Messages du logiciel therascreen KRAS Assay Package 42 Contrôle qualité 47 Limitations 48 Résultats attendus 48 Caractéristiques des performances 49 Performances analytiques 49 Variabilité liée à la manipulation des échantillons 70 Interchangeabilité des lots 71 Références 72 Symboles 74 Coordonnées 74 Annexe : Installation du logiciel therascreen KRAS Assay Package 75 Pour commander 78 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016 3

4 Utilisation prévue Le kit therascreen KRAS RGQ PCR est une analyse qualitative de PCR en temps réel, utilisée sur l instrument Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM, pour détecter sept mutations somatiques de l oncogène KRAS humain, à l aide de l ADN extrait de tissu du cancer colorectal (CRC) fixé au formaldéhyde et inclus en paraffine (FFPE). Le kit therascreen KRAS RGQ PCR permet d aider le clinicien à identifier les patients présentant un cancer colorectal qui ne peuvent pas suivre une thérapie anti-regf (récepteur de facteur de croissance épidermique), telle que le traitement au panitumumab ou au cétuximab. Résumé et explication du test Les mutations de l oncogène KRAS apparaissent fréquemment dans les cancers humains (1 4). La présence des ces mutations est mise en corrélation avec un manque de réponse à certains traitements anticancéreux inhibiteurs de REGF chez les patients atteints de cancer colorectal métastatique (5 19). Grâce aux technologies Scorpions et ARMS (système de mutation réfractaire par amplification) (20, 21), le kit therascreen KRAS RGQ PCR permet de détecter, dans un bruit de fond d ADN génomique de type sauvage, sept mutations dans les codons 12 et 13 de l oncogène KRAS (voir tableau 1). S appuyant sur des données de la base COSMIC 2016 v72), les sept mutations détectées par le kit therascreen KRAS RGQ PCR représentent plus de 95 % de l ensemble des mutations KRAS rapportées chez les patients atteints de CRC (21). Tableau 1. Liste des mutations et des identifiants COSMIC* Mutation Changement de base ID COSMIC GLY12ALA (G12A) GGT>GCT 522 GLY12ASP (G12D) GGT>GAT 521 GLY12ARG (G12R) GGT>CGT 518 GLY12CYS (G12C) GGT>TGT 516 GLY12SER (G12S) GGT>AGT 517 GLY12VAL (G12V) GGT>GTT 520 GLY13ASP (G13D) GGC>GAC 532 * Les identifiants COSMIC sont tirés du Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (22) (catalogue des mutations somatiques associées au cancer, 4 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

5 Le test permet la détection d un faible pourcentage d ADN mutant dans le bruit de fond d un ADN de type sauvage. À condition qu il y ait suffisamment de copies d ADN, la détection de 0,8 % à 6,4 % de mutants dans le bruit de fond d un ADN génomique de type sauvage est possible (pour de plus amples informations sur la limite de détection pour chaque mutation, voir «Caractéristiques des performances», page 49). Principe de la procédure Le kit therascreen KRAS RGQ PCR permet huit réactions distinctes d amplification par PCR : sept réactions spécifiques à la mutation dans les codons 12 et 13 de l exon 2 de l oncogène KRAS, et un témoin de type sauvage dans l exon 4. Les principaux composants du kit sont détaillés ci-dessous. Mélanges réactionnels de mutation Chaque mélange réactionnel de mutation utilise une amorce ARMS spécifique à la mutation pour amplifier de façon sélective l ADN ayant subi une mutation, puis une amorce Scorpions pour détecter le produit de l amplification. ARMS L amplification spécifique d allèle s effectue par le biais du système ARMS (système de mutation réfractaire par amplification), qui exploite la capacité de la Taq ADN polymérase à établir une distinction entre un appariement et un mésappariement à l extrémité 3' d une amorce de PCR. Lorsque l amorce est entièrement appariée, l efficacité de l amplification est maximale. Lorsque la base 3' est mésappariée, seule une amplification entraînant un faible bruit de fond se produit. Une séquence mutée est alors sélectionnée pour être amplifiée, même pour des échantillons où la majorité de l ADN ne contient pas la mutation. Scorpions La détection de l amplification s effectue par le biais de la technologie Scorpions. Les Scorpions sont des molécules bi-fonctionnelles contenant une amorce de PCR qui comporte une liaison covalente avec une sonde. La sonde intègre la carboxyfluorescéine (fluorophore noté FAM ) et un quencher. Ce dernier diminue la fluorescence du fluorophore. Lorsque la sonde s hybride à l amplicon ARMS au cours de la PCR, le fluorophore et le quencher se séparent, entraînant une augmentation détectable de la fluorescence. Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016 5

6 Réaction témoin Le mélange réactionnel témoin (CTRL) utilise une amorce Scorpions et une amorce non marquée pour amplifier une courte séquence de l exon 4 du gène KRAS. La réaction témoin détermine si un niveau approprié d ADN amplifiable est présent dans l échantillon et constitue un facteur utilisé dans les calculs analytiques servant à déterminer l état mutationnel. Témoin interne Chacun des huit mélanges réactionnels contient un témoin interne conçu pour détecter un échec de la réaction (dû par exemple à la présence d inhibiteurs). Le témoin interne utilise une séquence cible d oligonucléotides non liés au gène KRAS, une amorce non marquée et une amorce Scorpions marquée avec de l hexachlorofluorescéine (HEX ) afin de la distinguer des amorces Scorpions marquées FAM dans les réactions témoin et de mutation. Témoin positif Le kit therascreen KRAS RGQ PCR contient également le témoin positif KRAS (PC). Le témoin positif est un mélange d oligonucléotides synthétiques représentant chacune des mutations détectées par le kit. La détection du témoin positif confirme le bon fonctionnement de chacun des mélanges réactionnels du kit. Témoin négatif Le kit therascreen KRAS RGQ PCR contient de l eau sans nucléase pour le témoin négatif (NTC) à utiliser pour la réaction de témoin négatif (NTC). Le NTC sert de témoin négatif et évalue la contamination potentielle durant la configuration du test. Taq ADN polymérase La Taq ADN polymérase est l enzyme de la réaction en chaîne par polymérase utilisée par le kit therascreen KRAS RGQ PCR. Plate-forme et logiciel Le kit therascreen KRAS RGQ PCR est spécialement conçu pour une utilisation avec l instrument Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM. L instrument Rotor-Gene Q est programmé pour différents paramètres de cycle, ou «analyses» par le logiciel therascreen KRAS Assay Package 3.0. Lo logiciel therascreen KRAS Assay Package se compose de deux modèles : «therascreen KRAS QC Locked Template» (pour l évaluation des échantillons d ADN) et «therascreen KRAS Locked Template» (pour la détection des mutations KRAS). Ces modèles contiennent les paramètres d analyse par PCR et 6 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

7 calculent les résultats. Les mêmes paramètres d analyse sont utilisés à la fois pour l évaluation des échantillons d ADN avec le mélange réactionnel témoin et pour la détection des mutations KRAS à l aide des mélanges réactionnels de mutation : 1. Attente à 95 C pendant 15 minutes pour activer la Taq ADN polymérase. 2. PCR pour 40 cycles de 95 C pendant 30 secondes pour la dénaturation, et de 60 C pendant 1 minute pour l hybridation et l élongation Le cycle de PCR pendant lequel la fluorescence d une réaction particulière correspond à la valeur seuil prédéfinie par le logiciel therascreen KRAS Assay Package est défini comme la valeur CT. En utilisant la réaction témoin pour évaluer l échantillon d ADN, il est possible, à partir des valeurs CT obtenues, de déterminer si les échantillons contiennent des niveaux d ADN pouvant être analysés, et quels échantillons nécessitent une dilution avant l analyse. L évaluation de l échantillon à l aide des différents mélanges réactionnels de mutation pour déterminer leurs valeurs CT respectives permet au logiciel therascreen KRAS Assay Package d effectuer un calcul pour déterminer la valeur CT de l échantillon selon l équation suivante : CT = [valeur CT test de mutation] [valeur CT test témoin] À partir des valeurs CT et CT analytiques prédéterminées, le logiciel Rotor- Gene Q détermine de manière qualitative l état mutationnel des échantillons d ADN et indique quels échantillons comportent quelle mutation.* * Dans de rares cas, une tumeur peut contenir plusieurs mutations. C est alors la mutation correspondant à la valeur C T la plus faible qui est identifiée. Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016 7

8 Réactifs Les mélanges réactionnels sont doubles et contiennent des réactifs marqués FAM pour détecter les cibles, ainsi qu un témoin interne marqué HEX. Les mélanges réactionnels et les réactifs témoins positifs contiennent un tampon Tris EDTA, et le témoin positif contient l ARN porteur polyadénylé. Tableau 2. Réactifs fournis dans le kit therascreen KRAS RGQ PCR Réactif Mélange réactionnel témoin Ingrédients Amorce témoin non marquée, amorce Scorpions témoin, amorce non marquée témoin interne, amorce Scorpions témoin interne, matrice témoin interne, désoxynucléotides triphosphates, chlorure de magnésium, tampon Tris EDTA, tampon PCR 2 tubes de 600 µl Mélange réactionnel 12ALA Mélange réactionnel 12ASP Mélange réactionnel 12ARG Amorce 12ALA ARMS, amorce Scorpions, amorce non marquée témoin interne, amorce Scorpions témoin interne, matrice témoin interne, désoxynucléotides triphosphates, chlorure de magnésium, tampon Tris EDTA, tampon PCR Amorce 12ASP ARMS, amorce Scorpions, amorce non marquée témoin interne, amorce Scorpions témoin interne, matrice témoin interne, désoxynucléotides triphosphates, chlorure de magnésium, tampon Tris EDTA, tampon PCR Amorce 12ARG ARMS, amorce Scorpions, amorce non marquée témoin interne, amorce Scorpions témoin interne, matrice témoin interne, désoxynucléotides triphosphates, chlorure de magnésium, tampon Tris EDTA, tampon PCR 1 tube de 600 µl 1 tube de 600 µl 1 tube de 600 µl Suite du tableau sur la page suivante 8 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

9 Tableau 2. Réactifs fournis dans le kit therascreen KRAS RGQ PCR (suite) Réactif Mélange réactionnel 12CYS Mélange réactionnel 12SER Mélange réactionnel 12VAL Mélange réactionnel 13ASP Témoin positif KRAS Taq ADN polymérase Ingrédients Amorce 12CYS ARMS, amorce Scorpions, amorce non marquée témoin interne, amorce Scorpions témoin interne, matrice témoin interne, désoxynucléotides triphosphates, chlorure de magnésium, tampon Tris EDTA, tampon PCR Amorce 12SER ARMS, amorce Scorpions, amorce non marquée témoin interne, amorce Scorpions témoin interne, matrice témoin interne, désoxynucléotides triphosphates, chlorure de magnésium, tampon Tris EDTA, tampon PCR Amorce 12VAL ARMS, amorce Scorpions, amorce non marquée témoin interne, amorce Scorpions témoin interne, matrice témoin interne, désoxynucléotides triphosphates, chlorure de magnésium, tampon Tris EDTA, tampon PCR Amorce 13ASP ARMS, amorce Scorpions, amorce non marquée témoin interne, amorce Scorpions témoin interne, matrice témoin interne, désoxynucléotides triphosphates, chlorure de magnésium, tampon Tris EDTA, tampon PCR Matrice témoin, matrice 12ALA, matrice 12ASP, matrice 12ARG, matrice 12CYS, matrice 12SER, matrice 12VAL, matrice 13ASP, ARN polyadénylé, tampon Tris EDTA Taq polymérase : 50 % glycérol/eau 1 tube de 600 µl 1 tube de 600 µl 1 tube de 600 µl 1 tube de 600 µl 1 tube de 250 µl 1 tube de 80 µl Eau pour NTC Eau sans nucléase 1 tube de 1,9 ml Eau pour dilution de l échantillon Eau sans nucléase 1 tube de 1,9 ml Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016 9

10 Plates-formes Le kit therascreen KRAS RGQ PCR est spécialement conçu pour une utilisation avec l instrument Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM installé avec le logiciel Rotor- Gene Q version 2.3 ou supérieure, et avec le logiciel therascreen KRAS Assay Package version 3.0, disponible séparément sur CD (QIAGEN, n de réf ). Consulter le manuel de l utilisateur de l instrument pour toute information concernant l instrument. Consulter l «Annexe : Installation du logiciel therascreen KRAS Assay Package», page 75, pour obtenir des instructions sur l installation du logiciel therascreen KRAS Assay Package. L instrument Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM doit être entretenu conformément aux exigences du manuel d utilisation de l instrument. 10 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

11 Matériel fourni Contenu du kit Kit therascreen KRAS RGQ PCR (24) N de référence Nombre de préparations 24 Couleur Rouge Violet Orange Rose Vert Jaune Gris Bleu Beige Menthe Blanc Blanc Désignation Control Reaction Mix (mélange réactionnel témoin) 12ALA Reaction Mix (mélange réactionnel 12ALA) 12ASP Reaction Mix (mélange réactionnel 12ASP) 12ARG Reaction Mix (mélange réactionnel 12ARG) 12CYS Reaction Mix (mélange réactionnel 12CYS) 12SER Reaction Mix (mélange réactionnel 12SER) 12VAL Reaction Mix (mélange réactionnel 12VAL) 13ASP Reaction Mix (mélange réactionnel 13ASP) KRAS Positive Control (témoin positif KRAS) Taq DNA Polymerase (Taq ADN polymérase) Water for NTC (eau pour NTC) Water for Sample Dilution (eau pour dilution de l échantillon) Identification du tube therascreen KRAS RGQ PCR Kit Handbook (manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR) (anglais) Volume 1 CTRL 2 x 600 µl 2 12ALA 600 µl 3 12ASP 600 µl 4 12ARG 600 µl 5 12CYS 600 µl 6 12SER 600 µl 7 12VAL 600 µl 8 13ASP 600 µl 9 PC 250 µl Taq NTC Dil. 80 µl 1,9 ml 1,9 ml 1 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

12 Matériel nécessaire mais non fourni Lors de la manipulation des produits chimiques, toujours porter une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection adéquats. Pour plus d informations, consulter les fiches de données de sécurité (FDS) appropriées, disponibles auprès du fournisseur du produit. Barrettes de tubes et de capuchons de 0,1 ml à utiliser avec un rotor de 72 puits (de QIAGEN, n réf ou ) Tubes de microcentrifugeuse stériles pour la préparation des master mix Pointes de pipette stériles avec filtres anti-aérosols Marqueur permanent Instrument Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM avec canaux de fluorescence jaune et vert (pour détecter FAM et HEX, respectivement) Logiciel Rotor-Gene Q version 2.3. Remarque : le logiciel therascreen KRAS Assay Package ne fonctionne qu avec la version logicielle 2.3. CD de therascreen KRAS Assay Package version 3.0 (de QIAGEN, n réf ) Bloc de chargement de tubes de 72 x 0,1 ml : bloc en aluminium pour préparation de réaction manuelle (QIAGEN, n réf ) Pipettes dédiées* (adaptables) pour la préparation des échantillons Pipettes dédiées* (adaptables) pour la préparation du master mix PCR Pipettes dédiées* (adaptables) pour la distribution de l ADN matrice Thermomixeur, incubateur orbital chauffé, bloc chauffant ou bain-marie capable d incuber à 56 C et 90 C* Centrifugeuse de paillasse* avec rotor pour tubes de 1,5 ml Agitateur de paillasse* Kit QIAamp DSP DNA FFPE Tissue (de QIAGEN, n réf ; voir «Extraction d ADN», page 16) Xylène Éthanol ( %) * Avant utilisation, s assurer que les instruments ont été vérifiés et calibrés conformément aux recommandations du fabricant. Ne pas utiliser d alcool dénaturé, qui contient d autres substances, telles que le méthanol ou la méthyléthylcétone. 12 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

13 Avertissements et précautions Utilisation prévue pour le diagnostic in vitro. Réservé à un usage professionnel. Informations de sécurité Lors de la manipulation des produits chimiques, toujours porter une blouse de laboratoire, des gants jetables et des lunettes de protection adéquats. Pour plus d informations, consulter les fiches de données de sécurité (FDS) appropriées. Celles-ci sont disponibles en ligne dans un format PDF pratique et compact sur le site répertoriant les FDS imprimables pour chaque kit QIAGEN et chaque composant. Précautions générales Le test est destiné à une utilisation avec des prélèvements de tissu fixé au formaldéhyde et inclus en paraffine. Tous les produits chimiques et biologiques sont potentiellement dangereux. Les prélèvements et échantillons présentent un risque potentiel d infection et doivent être traités comme du matériel présentant un risque biologique. Jeter les échantillons et les tests usagés conformément aux procédures de sécurité locales. Les réactifs du kit therascreen KRAS RGQ PCR sont dilués de manière optimale. Ne pas effectuer de dilution supplémentaire des réactifs : celle-ci pourrait entraîner une baisse des performances. Ne pas utiliser de volume réactionnel (mélange réactionnel + échantillon) inférieur à 25 µl. Tous les réactifs du kit therascreen KRAS RGQ PCR ont été formulés pour être utilisés spécifiquement avec les tests fournis dans le kit therascreen KRAS RGQ PCR. Tous les réactifs fournis dans le kit therascreen KRAS RGQ PCR sont destinés à être utilisés uniquement avec les autres réactifs fournis dans le même kit therascreen KRAS RGQ PCR. Ne pas remplacer les réactifs du kit therascreen KRAS RGQ PCR entre les kits therascreen KRAS RGQ PCR, au risque d en affecter les performances. Utiliser uniquement la Taq ADN polymérase (Taq) fournie dans le kit therascreen KRAS RGQ PCR. Ne pas la remplacer par la Taq ADN polymérase d autres kits du même type ou de type différent, ou par de la Taq ADN polymérase d un autre fournisseur. Consulter le manuel d utilisation de l instrument Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM pour plus d informations sur les avertissements, précautions et procédures. Ne pas utiliser de composants périmés ou mal conservés. Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

14 Remarque : faire preuve d une extrême vigilance pour éviter la contamination des réactifs des mélanges réactionnel et témoin avec le matériel synthétique contenu dans le réactif témoin positif. Remarque : utiliser des pipettes individuelles et dédiées pour préparer les mélanges réactionnels et ajouter les réactifs témoins positifs. Remarque : effectuer la préparation et la distribution des mélanges réactionnels dans une zone séparée de celle de l ajout du témoin positif. Remarque : ne pas ouvrir l instrument Rotor-Gene Q avant la fin de l analyse. Remarque : ne pas ouvrir les tubes Rotor-Gene Q une fois l analyse terminée. Remarque : faire preuve de prudence pour garantir un test correct des échantillons. Une attention toute particulière doit être accordée aux mauvaises entrées d échantillons ainsi qu aux erreurs de chargement ou de pipetage. Stockage et manipulation des réactifs Le kit therascreen KRAS RGQ PCR est expédié sur un lit de glace sèche. Si un des composants du kit therascreen KRAS RGQ PCR n est pas congelé dès l arrivée, que l emballage extérieur a été ouvert au cours du transport, que le colis ne contient pas de notice d emballage, de manuel ou de réactifs, prière de contacter l un des départements de support technique ou l un des distributeurs locaux de QIAGEN (voir quatrième de couverture ou visiter le site Le kit therascreen KRAS RGQ PCR doit être stocké dès réception à une température comprise entre 30 C et 15 C dans un congélateur à température constante et à l abri de la lumière. Lorsqu il est stocké dans les conditions de conservation spécifiées, le kit therascreen KRAS RGQ PCR est stable jusqu à la date de péremption indiquée. Une fois ouverts, les réactifs peuvent être conservés dans leur emballage d origine à une température comprise entre 30 et 15 C jusqu à la date de péremption indiquée sur l emballage. Éviter la congélation et décongélation à répétition. Ne pas dépasser un maximum de 6 cycles de congélation/décongélation. Les réactifs doivent être décongelés à température ambiante pendant 1 à 4,5 heures. Une fois les réactifs prêts à l utilisation, les PCR peuvent être configurées. Les tubes Rotor-Gene Q, qui contiennent les master mix et les échantillons d ADN, peuvent être immédiatement chargés sur l instrument Rotor-Gene Q. La durée totale précédant l analyse une fois les PCR configurées ne doit pas excéder : 7 heures en cas de conservation à température ambiante Remarque : cette durée inclut la configuration et le stockage de la PCR. 14 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

15 18 heures en cas de conservation au réfrigérateur (entre 2 et 8 C) Remarque : cette durée inclut la configuration et le stockage de la PCR. Remarque : les molécules Scorpions (comme toutes les molécules marquées en fluorescence) présentes dans les réactifs du mélange réactionnel sont photosensibles. Placer les réactifs de témoins et du mélange réactionnel à l abri de la lumière afin d éviter tout photoblanchiment. Les réactifs du kit therascreen KRAS RGQ PCR ont été dilués de façon optimale et aucune purification ou aucun traitement supplémentaire ne sont requis avant l analyse, conformément au manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR. Il est important de respecter les dates de péremption et les conditions de conservation imprimées sur les boîtes et les étiquettes de tous les composants. Ne pas utiliser de composants périmés ou mal conservés. Prélèvement d échantillons, préparation à l analyse et stockage Le kit therascreen KRAS RGQ PCR est destiné à une utilisation avec des échantillons d ADN extraits de tissu tumoral fixé au (FFPE) prélevé sur des patients atteints de cancer colorectal (CRC). Les tumeurs sont hétérogènes en termes de génotype et de phénotype. Les tumeurs présentant une mutation peuvent contenir de l ADN de type sauvage et, de façon similaire, l histologie peut indiquer des zones de tissu non tumoral. Tous les échantillons de tissu doivent être considérés comme potentiellement dangereux. Pour préparer des échantillons de tissu à l extraction d ADN : À l aide de méthodes et de matériel standard, fixer le prélèvement de tissu à 10 % de formaldéhyde neutre tamponné et l inclure en paraffine. À l aide d un microtome, faire des coupes sériées de 5 µm dans le bloc de paraffine et les placer sur des lames en verre. Solliciter un professionnel expérimenté (par ex. un pathologiste) pour évaluer une coupe colorée à l hématoxilyne-éosine afin d y déceler un contenu tumoral et d en déterminer la surface. Marquer la lame colorée pour distinguer le tissu tumoral du tissu sain. Utiliser les coupes sériées pour l extraction d ADN. Utiliser des coupes comportant plus de 20 % de contenu tumoral par zone pour un traitement sans macro-dissection (voir ci-dessous). Pour les coupes contenant moins de 20 % de contenu tumoral par zone, effectuer une macro-dissection d une ou plusieurs coupes. Éliminer le tissu non tumoral. Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

16 Pour les coupes dont la surface est inférieure à 4 mm 2, traiter deux ou trois coupes pour augmenter la zone tumorale totale afin qu elle atteigne 4 mm 2 (s applique aux échantillons avec et sans macro-dissection). Éliminer le tissu non tumoral. Nettoyer l excédent de paraffine du tissu en grattant avec un scalpel stérile. Remarque : utiliser des scalpels secs. Ne pas effectuer cette étape dans une hotte de laboratoire ou à flux d air laminaire. Gratter le tissu tumoral des coupes et le placer dans des tubes de microcentrifugeuse marqués. Utiliser un nouveau scalpel pour chaque échantillon. Marquer, manipuler et conserver les prélèvements tumoraux, blocs, lames, échantillons et tubes de microcentrifugeuse prêts à l extraction de manière contrôlée conformément aux procédures locales. Conserver les blocs et lames FFPE à température ambiante. Les lames peuvent être conservées à température ambiante jusqu à 4 semaines avant l extraction d ADN. L ADN génomique peut être conservé à une température comprise entre 2 et 8 C pendant la semaine suivant l extraction, puis à une température comprise entre 25 et 15 C jusqu à 8 semaines avant utilisation. Procédure Extraction d ADN Utiliser le kit QIAamp DSP DNA FFPE Tissue (QIAGEN, n de réf ) pour la purification de l ADN génomique d échantillons préparés à partir de prélèvements de tissu du cancer colorectal (CRC) fixés au formaldéhyde et inclus en paraffine (FFPE). Remarque : le kit therascreen KRAS RGQ PCR a été validé à l aide d ADN extrait au moyen du kit QIAamp DSP DNA FFPE Tissue. Ne pas utiliser d autre produit d extraction d ADN. Procéder à l extraction de l ADN conformément aux instructions du manuel du kit QIAamp DSP DNA FFPE Tissue (QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Handbook) en prenant en compte les remarques suivantes : Consulter le manuel du kit QIAamp DSP DNA FFPE Tissue (QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Handbook) pour la préparation des échantillons avant l extraction de l ADN. Le kit QIAamp DSP DNA FFPE Tissue doit être utilisé manuellement uniquement. Ne pas utiliser le protocole automatique pour le QIAcube. 16 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

17 Ne pas effectuer l étape de RNase décrite dans le manuel du kit QIAamp DSP DNA FFPE Tissue (QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Handbook). Ne pas utiliser de solution de déparaffinisation QIAGEN. Pour la déparaffinisation, utiliser uniquement la méthode au xylène ou à l éthanol décrite dans le manuel du kit QIAamp DSP DNA FFPE Tissue (QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Handbook). La digestion de la protéinase K (étape 11 du manuel du kit QIAamp DSP DNA FFPE Tissue (QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Handbook)) doit être effectuée pendant 1 heure. Les échantillons doivent être élués dans 200 µl de tampon d élution (tampon ATE) du kit QIAamp DSP DNA FFPE Tissue. Conserver l ADN génomique à une température comprise entre 2 et 8 C pendant la semaine suivant l extraction, puis à une température comprise entre 25 et 15 C jusqu à 8 semaines avant utilisation. Protocole : évaluation des échantillons d ADN Ce protocole est destiné à l évaluation de l ADN amplifiable total présent dans les échantillons. Points importants avant de commencer Le mélange réactionnel témoin (CTRL) disponible permet d évaluer un maximum de 24 échantillons. Utiliser le mélange réactionnel témoin (CTRL) pour évaluer l ADN avant le test. Remarque : il est important d utiliser le mélange réactionnel témoin (CTRL) comme décrit ci-dessous pour cette évaluation et non la spectrophotométrie ou toute autre méthode. L ADN fortement dégradé peut ne pas s amplifier, même si les amorces génèrent de courts fragments d ADN. Pour une utilisation efficace des réactifs du kit therascreen KRAS RGQ PCR, regrouper au maximum les échantillons d ADN pour créer des analyses complètes. Tester les échantillons individuellement ou par petits groupes consomme plus de réactifs et réduit la quantité totale d échantillons pouvant être testés avec un seul kit therascreen KRAS RGQ PCR. Ne pas faire passer la Taq ADN polymérase (Taq) ou tout autre mélange contenant de la Taq ADN polymérase dans l agitateur : l enzyme risquerait d être désactivée. Pipeter la Taq ADN polymérase en plaçant avec précaution la pointe de la pipette juste sous la surface du liquide pour éviter le risque d enrobage de la pointe dans une quantité excessive d enzyme. À effectuer avant de commencer Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

18 Avant la première utilisation de l instrument Rotor-Gene Q, s assurer que le logiciel therascreen KRAS Assay Package est installé (voir «Annexe : Installation du logiciel therascreen KRAS Assay Package», page 75). Avant chaque utilisation, tous les réactifs doivent être mis à décongeler complètement durant au moins une heure à température ambiante (entre 15 et 25 C), mélangés en les retournant 10 fois et passés brièvement à la centrifugeuse pour prélever le contenu au fond du tube. S assurer que la Taq ADN polymérase (Taq) est à température ambiante (entre 15 et 25 C) avant chaque utilisation. Passer brièvement le tube à la centrifugeuse pour pouvoir prélever l enzyme au fond du tube. Procédure 1. Décongeler complètement le mélange réactionnel témoin (CTRL), l eau sans nucléase pour le NTC et le témoin positif (PC) KRAS à température ambiante (entre 15 et 25 C) pendant au moins une heure. Les durées de décongélation des réactifs, de configuration de la PCR et de stockage avant le début de l analyse sont indiquées dans le tableau 3. Une fois les réactifs décongelés, les mélanger en retournant chaque tube 10 fois afin d éviter toute concentration locale de sels, puis les passer brièvement à la centrifugeuse pour prélever le contenu au fond du tube. Tableau 3. Temps de décongélation, temps de configuration de la PCR et températures de stockage Temps de décongélation Minimum Maximum Température de stockage après configuration de la PCR 1 heure 4,5 heures Température ambiante (15 à 25 C) Durée maximale de configuration et de stockage de la PCR 7 heures 1 heure 4,5 heures 2 à 8 C 18 heures Remarque : la configuration de la PCR doit s effectuer à température ambiante. Le terme «Stockage» désigne la durée entre l achèvement de la configuration de la PCR et le début de l analyse par PCR sur l instrument Rotor-Gene Q. Remarque : porter la Taq ADN polymérase (Taq) à température ambiante (15 à 25 C) en même temps que les autres réactifs (voir «Stockage et manipulation des réactifs», page 14). Passer brièvement le tube à la centrifugeuse pour pouvoir prélever l enzyme au fond du tube. 18 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

19 2. Préparer suffisamment de master mix (mélange réactionnel témoin [CTRL] plus Taq ADN polymérase [Taq]) pour les échantillons d ADN, une réaction de témoin positif (PC) KRAS et une réaction d eau sans nucléase pour le témoin négatif (NTC) en respectant les volumes donnés dans le tableau 4. Inclure des réactifs pour 1 échantillon supplémentaire pour disposer d une réserve suffisante pour la préparation de la PCR. Le master mix contient tous les composants nécessaires pour la PCR, excepté l échantillon. Tableau 4. Préparation du master mix du test témoin Composant Mélange réactionnel témoin (CTRL) Taq ADN polymérase (Taq) Volume 19,76 µl x (n+1)* 0,24 µl x (n+1)* Volume total 20,0 µl/réaction * n=nombre de réactions (échantillons plus témoins). Préparer suffisamment de master mix pour 1 échantillon supplémentaire (n+1) afin de disposer d une réserve suffisante pour la préparation de la PCR. La valeur de n ne doit pas dépasser 24 (plus les témoins), 24 étant le nombre maximum d échantillons pour une analyse. Remarque : lors de la préparation du master mix, le volume nécessaire de mélange réactionnel témoin (CTRL) est ajouté en premier au tube correspondant et la Taq ADN polymérase (Taq) est ajoutée en dernier. 3. Placer le nombre approprié de barrettes de 4 tubes de PCR (chaque barrette contient quatre tubes) dans le bloc de chargement comme indiqué au tableau 5. Ne pas boucher les tubes. Remarque : laisser les bouchons dans le conteneur en plastique le temps nécessaire. Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

20 Tableau 5. Agencement de l analyse pour l évaluation des échantillons d ADN dans le bloc de chargement Test Témoin 1 (PC) Témoin 2 (NTC) Témoin Témoin Témoin Témoin Témoin Témoin Chaque tube doit contenir un volume réactionnel total de 25 µl (20 µl de master mix préparé selon le tableau 4, plus 5 µl de NTC/échantillon/PC). Les chiffres indiquent les positions dans le bloc de chargement et la position finale dans le rotor. 4. Remplir une pipette à un volume inférieur au total du mélange réactionnel et bien mélanger le master mix en aspirant l ensemble 10 fois vers le haut et vers le bas. Ajouter immédiatement 20 µl de master mix dans chaque tube de PCR. Remarque : se reporter au tableau 5 pour la disposition des tubes lors de la configuration des mélanges réactionnels. Pour l évaluation des échantillons d ADN, le master mix du test témoin doit être ajouté à un tube PC, un tube NTC et un tube pour chaque échantillon d ADN. 5. Ajouter immédiatement 5 µl d eau sans nucléase pour le témoin négatif (NTC) au tube NTC (position de tube 2) et boucher le tube. 6. Ajouter 5 µl de chaque échantillon d ADN aux tubes d échantillon (positions de tubes 3 à 26) et boucher les tubes. 7. Ajouter 5 µl de témoin positif KRAS (PC) au tube de PC (position de tube 1) et boucher le tube. 8. À l aide d un marqueur permanent, identifier le couvercle des tubes se trouvant dans les positions numériques les plus faibles pour chaque barrette de 4 tubes de PCR (par ex. positions 1, 5 et 9, etc.) pour indiquer l orientation de chargement des tubes dans le rotor à 72 puits de l instrument Rotor-Gene Q. 9. Retourner 4 fois les tubes bouchés pour mélanger l échantillon et le mélange réactionnel. 20 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

21 10. Placer toutes les barrettes de 4 tubes de PCR dans les positions appropriées du rotor à 72 puits selon l agencement de l analyse (tableau 5) en s aidant des marques pour une bonne orientation. Remarque : si le rotor n est pas complètement rempli, placer dans toutes les positions non utilisées un tube vide bouché. Cela permet de maintenir l efficacité thermique de l instrument Rotor-Gene Q. 11. Placer le rotor à 72 puits dans l instrument Rotor-Gene Q. S assurer que la bague de fermeture (fournie avec l instrument Rotor-Gene Q) est placée au-dessus du rotor pour que les tubes ne bougent pas lors de l analyse. 12. Lancer le logiciel Rotor-Gene Q et ouvrir le modèle en même temps en double-cliquant sur l icône «therascreen KRAS QC Locked Template» située sur le bureau de l ordinateur portable connecté à l instrument Rotor-Gene Q (figure 1). Figure 1. Icône «therascreen KRAS QC Locked Template». 13. L onglet «Setup» (configuration) s affiche par défaut (figure 2). S assurer que la bague de fermeture est correctement fixée et cocher la case «Locking Ring Attached» (bague de fermeture fixée). Fermer le couvercle de l instrument Rotor-Gene Q. Figure 2. Onglet «Setup» (configuration) et case «Locking Ring Attached» (bague de fermeture fixée). 1 = onglet «Setup» (configuration), 2 = case «Locking Ring Attached» (bague de fermeture fixée). Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

22 14. Entrer l identifiant de l analyse dans le champ «Run ID» selon la nomenclature locale. Entrer le nom de l échantillon dans le champ «Sample Name» selon la nomenclature locale et appuyer sur Entrée. Le nom de l échantillon est alors ajouté à la liste d échantillons au-dessous et l échantillon se voit attribuer un «Sample ID» (ID échantillon) : 1, 2, 3, etc. En outre, le panneau «Layout of the pipetting adapter» (agencement de l adaptateur de pipette) sur la droite est mis à jour pour afficher le nom de l échantillon (figure 3). Vous pouvez également importer des noms d'échantillons stockés dans le format *.smp (fichier dórigine du Rotor-Gene Q) ou *.csv (Fichier valeurs séparées par des virgules) à l'aide du bouton " Import Samples ". Les noms d'échantillons seront remplis en utilisant cette méthode. Remarque : dans le panneau «Layout of the pipetting adapter» (agencement de l adaptateur de pipette), vérifier que l ajout du nom de l échantillon est mis en évidence par un changement de couleur et que le nom de l échantillon se trouve à l emplacement correspondant (figure 3). Remarque : les noms d échantillons comportant plus de 8 caractères ne s affichent pas entièrement dans le panneau «Layout of the pipetting adapter». Figure 3. Saisie de l identifiant d analyse et du nom d échantillon. 1 = champ «Run ID» (identifiant d analyse), 2 = Import Samples «Importer des échantillons» 3 = champ «Sample Name» (nom de l échantillon), 4 = Liste d échantillons, 5 = panneau «Layout of the pipetting adapter» (agencement de l adaptateur de pipette). 22 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

23 15. Répéter l étape 14 pour saisir les noms de tous les échantillons supplémentaires (figure 4). Remarque : pour modifier un nom d échantillon, cliquer sur «Sample Name» dans la liste d échantillons et l échantillon sélectionné s affichera dans le champ «Sample Name» au-dessus. Modifier le nom de l échantillon selon la nomenclature locale et appuyer sur Entrée pour actualiser le nom. Figure 4. Saisie de nouveaux noms d échantillons dans le champ «Sample Name». 1 = champ «Import Samples» (Importer des échantillons) 2 = champ «Sample Name» (nom de l échantillon), 3 = Liste d échantillons, 4 = panneau «Layout of the pipetting adapter» (agencement de l adaptateur de pipette) avec noms d échantillons supplémentaires. 16. Une fois tous les noms d échantillons saisis, vérifier qu ils sont corrects. Ajouter toute information complémentaire dans le champ «Notes» si nécessaire et cliquer sur le bouton «Start Run» (démarrer l analyse) (figure 5). Remarque : si une position de rotor est inutilisée, un avertissement («Warning») s affiche (figures 5 et 6) pour rappeler à l utilisateur que toutes les positions inutilisées du rotor doivent être occupées par un tube Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

24 vide bouché. Vérifier que toutes les positions inutilisées du rotor sont occupées par un tube vide bouché et cliquer sur OK pour continuer. Figure 5. Champ «Notes», bouton «Start Run» (démarrer l analyse) et avertissement concernant les positions de rotor inutilisées. 1 = champ «Notes», 2 = bouton «Start Run» (démarrer l analyse), 3 = avertissement concernant les positions de rotor inutilisées. Figure 6. Avertissement concernant les positions de rotor inutilisées. 1 = Avertissement concernant les positions de rotor inutilisées. 17. Une fenêtre «Save As» (enregistrer sous) s affiche. Choisir un nom de fichier approprié et enregistrer l analyse de PCR dans un fichier 24 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

25 d analyse *.rex à l emplacement sélectionné, puis cliquer sur «Save» (enregistrer) (figure 7). Figure 7. Enregistrement du fichier d analyse. 1 = fenêtre «Save As» (enregistrer sous), 2 = champs «File name» (nom de fichier) et «save as type. *.rex file» (enregistrer sous type : fichier *.rex), 3 = «Save» (enregistrer). 18. L analyse PCR démarre. Remarque : lorsque l analyse démarre, l onglet «Run Progress» (progression de l analyse) s ouvre automatiquement pour indiquer un suivi de la température et le temps restant de l analyse (figure 8). Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

26 Figure 8. Onglet «Run Progress» (progression de l analyse). 1 = onglet «Run Progress» (progression de l analyse). 19. À la fin de l analyse, l onglet «Analysis» (analyse) s ouvre automatiquement. Remarque : s il ne s ouvre pas, cliquer dessus (figure 9). Remarque : la méthode de calcul est expliquée à la section «Interprétation des résultats», page 40. Figure 9. Onglet «Analysis» et rapport de résultats. 1 = onglet «Analysis», 2 = «Sample QC Result Table» (tableau des résultats de CQ d échantillons). 20. Les résultats de témoin sont rapportés comme suit dans le tableau «Sample QC Result Table» (figure 9). Témoins d analyse (PC et NTC, positions respectives de tube 1 et 2). Si les résultats se trouvent dans des intervalles acceptables, ils sont tous affichés comme «Valid». Dans le cas contraire, la mention «Invalid» s affiche. Une valeur CT de réaction témoin d échantillon >32,00 s affiche comme invalide. La quantité d ADN n est pas suffisante pour l analyse de la mutation. Retester l échantillon. Si la quantité d ADN est toujours insuffisante, extraire davantage de tissu tumoral si possible (voir le «guide de dépannage», page 41). 26 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

27 Une valeur CT de réaction témoin d échantillon <21,92 s affiche comme invalide. La concentration d ADN est trop élevée pour l analyse de la mutation. Diluer avec de l eau sans nucléase pour dilution (Dil.) et refaire le test. Diluer pour obtenir une valeur CT comprise entre 21,92 et 32,00. Une dilution de 1:1 augmente la valeur CT de 1,0 approximativement. Une valeur CT de réaction témoin d échantillon comprise entre 21,92 et 32,00 (21,92 CT témoin 32,00) s affiche comme valide. La concentration d ADN est adaptée à l analyse de la mutation. Remarque : si une nouvelle extraction ou une dilution est nécessaire, répéter la réaction témoin pour confirmer que la concentration d ADN est correcte. 21. Les fichiers de rapports sont accessibles via le bouton «Report». La fenêtre «Report Browser» (navigateur de rapports) s affiche alors. Sélectionner «KRAS Analysis Report» (rapport d analyse KRAS) sous «Templates» (modèles) et cliquer sur le bouton «Show» (afficher) (figure 10) Remarque : il est possible d enregistrer les rapports à un autre emplacement au format archive Web en cliquant sur le bouton «Save As» (enregistrer sous) dans le coin supérieur gauche de chaque rapport. Figure 10. Sélection du «KRAS Analysis Report» (rapport d analyse KRAS). 1 = bouton «Report» (rapport), 2 = fenêtre «Report Browser» (navigateur Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

28 de rapports), 3 = sélection «KRAS Analysis Report» (rapport d analyse KRAS), 4 = bouton «Show» (afficher). Protocole : détection des mutations KRAS Ce protocole est utilisé pour la détection des mutations KRAS. Points importants avant de commencer Une fois l évaluation de l échantillon réussie, ce dernier peut être testé à l aide des tests de mutation KRAS. Pour une utilisation efficace du kit therascreen KRAS RGQ PCR, les échantillons doivent être regroupés en lots de 7 (afin de remplir le rotor de 72 puits). Avec des lots plus petits, moins d échantillons pourront être testés avec le kit therascreen KRAS RGQ PCR. Ne pas faire passer la Taq ADN polymérase (Taq) ou tout autre mélange contenant de la Taq ADN polymérase dans l agitateur : l enzyme risquerait d être désactivée. Pipeter la Taq ADN polymérase en plaçant avec précaution la pointe de la pipette juste sous la surface du liquide pour éviter le risque d enrobage de la pointe dans une quantité excessive d enzyme. À effectuer avant de commencer Avant chaque utilisation, tous les réactifs doivent être mis à décongeler complètement durant au moins une heure à température ambiante (entre 15 et 25 C), mélangés en les retournant 10 fois et passés brièvement à la centrifugeuse pour prélever le contenu au fond du tube. S assurer que la Taq ADN polymérase (Taq) est à température ambiante (entre 15 et 25 C) avant chaque utilisation. Passer brièvement le tube à la centrifugeuse pour pouvoir prélever l enzyme au fond du tube. Protocole 1. Décongeler complètement tous les tubes du mélange réactionnel, l eau sans nucléase pour le NTC et le témoin positif (PC) KRAS à température ambiante (entre 15 et 25 C) pendant au moins une heure. Les durées de décongélation des réactifs, de configuration de la PCR et de stockage avant le début de l analyse sont indiquées dans le tableau 6. Une fois les réactifs décongelés, les mélanger en retournant chaque tube 10 fois afin d éviter toute concentration locale de sels, puis les passer brièvement à la centrifugeuse pour prélever le contenu au fond du tube. 28 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

29 Tableau 6. Temps de décongélation, temps de configuration de la PCR et températures de stockage Temps de décongélation Minimum Maximum 1 heure 4,5 heures Température de stockage après configuration de la PCR Température ambiante (15 à 25 C) Durée maximale de configuration et de stockage de la PCR 7 heures 1 heure 4,5 heures 2 à 8 C 18 heures Remarque : la configuration de la PCR doit s effectuer à température ambiante. Le terme «Stockage» désigne la durée entre l achèvement de la configuration de la PCR et le début de l analyse par PCR sur l instrument Rotor-Gene Q. Remarque : porter la Taq ADN polymérase (Taq) à température ambiante (15 à 25 C) en même temps que les autres réactifs (voir «Stockage et manipulation des réactifs», page 14). Passer brièvement le tube à la centrifugeuse pour pouvoir prélever l enzyme au fond du tube. 2. Marquer huit tubes de microcentrifugeuse (non fournis) selon le mélange réactionnel correspondant, indiqué au tableau 7, page 30. Préparer suffisamment de master mix (mélange réactionnel témoin ou de mutation [CTRL, 12ALA, 12ASP, 12ARG, 12CYS, 12SER, 12VAL ou 13ASP] plus la Taq ADN polymérase [Taq]) pour les échantillons d ADN, une réaction du témoin positif (PC) KRAS et de l eau sans nucléase pour la réaction du NTC selon les volumes indiqués au tableau 7, page 30. Inclure des réactifs pour 1 échantillon supplémentaire pour disposer d une réserve suffisante pour la préparation de la PCR. Les master mix contiennent tous les composants nécessaires pour la PCR, excepté l échantillon. Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

30 Tableau 7. Préparation des master mix de test* Test Tube de mélange réactionnel Volume de mélange réactionnel Volume de la Taq ADN polymérase (Taq) Témoin CTRL 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) 12ALA 12ALA 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) 12ASP 12ASP 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) 12ARG 12ARG 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) 12CYS 12CYS 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) 12SER 12SER 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) 12VAL 12VAL 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) 13ASP 13ASP 19,76 µl x (n+1) 0,24 µl x (n+1) * n=nombre de réactions (échantillons d ADN plus témoins). Préparer suffisamment de master mix pour 1 échantillon supplémentaire (n+1) afin de disposer d une réserve suffisante pour la préparation de la PCR. La valeur de n ne doit pas dépasser 7 (plus les témoins), 7 étant le nombre maximum d échantillons pour une analyse. Remarque : lors de la préparation du master mix, le volume nécessaire de mélange réactionnel témoin (CTRL) ou de mutation est ajouté en premier au tube correspondant et la Taq ADN polymérase (Taq) est ajoutée en dernier. 3. Placer le nombre approprié de barrettes de 4 tubes de PCR (chaque barrette contient quatre tubes) dans le bloc de chargement comme indiqué au tableau 8, page 31. Ne pas boucher les tubes. Remarque : laisser les bouchons dans le conteneur en plastique le temps nécessaire. 4. Remplir une pipette à un volume inférieur au total du mélange réactionnel et bien mélanger les master mix en aspirant l ensemble 10 fois vers le haut et vers le bas. Ajouter immédiatement 20 µl de master mix dans chaque tube de PCR correspondant. Remarque : se reporter au tableau 8 page 33 pour la disposition des tubes lors de la configuration des mélanges réactionnels. Pour la détection des mutations KRAS, les master mix doivent être ajoutés à huit tubes de PC, huit tubes de NTC et huit tubes pour chaque échantillon d ADN. 30 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

31 Tableau 8. Agencement de l analyse pour la détection des mutations KRAS dans le bloc de chargement* Témoins Numéro de l échantillon Test PC NTC Témoin ALA ASP ARG CYS SER VAL ASP * Chaque tube doit contenir un volume réactionnel total de 25 µl (20 µl de master mix préparé selon le tableau 3, plus 5 µl de NTC/échantillon/PC). Les chiffres indiquent les positions dans le bloc de chargement et la position finale dans le rotor. 5. Ajouter immédiatement 5 µl d eau sans nucléase pour le témoin négatif (NTC) aux tubes de NTC (positions de tube 9 à 16) et boucher les tubes. 6. Ajouter 5 µl de chaque échantillon d ADN aux tubes d échantillon (positions de tubes 17 à 72) et boucher les tubes. 7. Ajouter 5 µl de témoin positif KRAS (PC) aux tubes de PC (positions de tube 1 à 8) et boucher les tubes. 8. À l aide d un marqueur permanent, identifier le couvercle des tubes se trouvant dans les positions numériques les plus faibles pour chaque barrette de 4 tubes de PCR (par ex. positions 1, 5 et 9, etc.) pour indiquer l orientation de chargement des tubes dans le rotor à 72 puits de l instrument Rotor-Gene Q. 9. Retourner 4 fois les tubes bouchés pour mélanger l échantillon et le mélange réactionnel. 10. Placer toutes les barrettes de 4 tubes de PCR dans les positions appropriées du rotor à 72 puits selon l agencement de l analyse (tableau 8) en s aidant des marques pour une bonne orientation. Remarque : chaque analyse PCR peut comprendre un maximum de 7 échantillons. Si le rotor n est pas complètement rempli, placer dans toutes les positions non utilisées un tube vide bouché. Cela permet de maintenir l efficacité thermique de l instrument Rotor-Gene Q. Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

32 11. Placer le rotor à 72 puits dans l instrument Rotor-Gene Q. S assurer que la bague de fermeture (fournie avec l instrument Rotor-Gene Q) est placée au-dessus du rotor pour que les tubes ne bougent pas lors de l analyse. 12. Lancer le logiciel Rotor-Gene Q et ouvrir la matrice simultanément en double-cliquant sur l icône «therascreen KRAS Locked Template» située sur le bureau de l ordinateur portable connecté à l instrument Rotor-Gene Q (figure 11). Figure 11. Icône «therascreen KRAS Locked Template». 13. L onglet «Setup» (configuration) s affiche par défaut (figure 12). S assurer que la bague de fermeture est correctement fixée et cocher la case «Locking Ring Attached» (bague de fermeture fixée). Fermer le couvercle de l instrument Rotor-Gene Q. Figure 12. Onglet «Setup» (configuration) et case «Locking Ring Attached» (bague de fermeture fixée). 1 = onglet «Setup» (configuration), 2 = case «Locking Ring Attached» (bague de fermeture fixée). 32 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

33 14. Entrer l identifiant de l analyse dans le champ «Run ID» selon la nomenclature locale. Entrer le nom de l échantillon dans le champ «Sample Name» selon la nomenclature locale et appuyer sur Entrée. Le nom de l échantillon est alors ajouté à la liste d échantillons au-dessous et l échantillon se voit attribuer un «Sample ID» (ID échantillon) : 1, 2, 3, etc. En outre, le panneau «Layout of the pipetting adapter» (agencement de l adaptateur de pipette) sur la droite est mis à jour pour afficher le nom de l échantillon (figure 13). Vous pouvez également importer des noms d'échantillons stockés dans le format *.smp (fichier dórigine du Rotor-Gene Q) ou *.csv (Fichier valeurs séparées par des virgules) à l'aide du bouton " Import Samples ". Les noms d'échantillons seront remplis en utilisant cette méthode. Remarque : dans le panneau «Layout of the pipetting adapter» (agencement de l adaptateur de pipette), vérifier que l ajout du nom de l échantillon est mis en évidence par un changement de couleur et que les huit tests de la colonne située sous le cercle de l échantillon sont en surbrillance (figure 13). Remarque : il est possible d ajouter jusqu à 7 échantillons. Les identifiants d échantillons (dans les cercles d échantillons) sont automatiquement attribués de 1 à 7. Remarque : les noms d échantillons comportant plus de 8 caractères ne s affichent pas entièrement dans le panneau «Layout of the pipetting adapter». Figure 13. Saisie de l identifiant d analyse et du nom d échantillon. 1 = champ «Run ID» (identifiant d analyse), 2 = champ Import Samples (Importer des échantillons), 3 = champ «Sample Name» (nom de l échantillon), 4 = Liste d échantillons, 5 = panneau «Layout of the pipetting adapter» (agencement de l adaptateur de pipette), 6 = cercle de l échantillon en surbrillance au-dessus d une colonne de huit analyses. Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

34 15. Répéter l étape 14 pour saisir les noms de tous les échantillons supplémentaires (figure 14). Remarque : pour modifier un nom d échantillon, cliquer sur «Sample Name» dans la liste d échantillons et l échantillon sélectionné s affichera dans le champ «Sample Name» au-dessus. Modifier le nom de l échantillon selon la nomenclature locale et appuyer sur Entrée pour actualiser le nom. Figure 14. Saisie de nouveaux noms d échantillons dans le champ «Sample Name». 1 = champ «Sample Name» (nom de l échantillon), 2 = Liste d échantillons, 3 = panneau «Layout of the pipetting adapter» (agencement de l adaptateur de pipette) avec noms d échantillons supplémentaires. 34 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

35 16. Une fois tous les noms d échantillons saisis, vérifier qu ils sont corrects. Ajouter toute information complémentaire dans le champ «Notes» si nécessaire et cliquer sur le bouton «Start Run» (démarrer l analyse) (figure 15). Remarque : si une position de rotor est inutilisée, un avertissement («Warning») s affiche (figures 15 et 16) pour rappeler à l utilisateur que toutes les positions inutilisées du rotor doivent être occupées par un tube vide bouché. Vérifier que toutes les positions inutilisées du rotor sont occupées par un tube vide bouché et cliquer sur OK pour continuer. Figure 15. Champ «Notes», bouton «Start Run» (démarrer l analyse) et avertissement concernant les positions de rotor inutilisées. 1 = champ «Notes», 2 = «Start Run» (démarrer l analyse), 3 = avertissement concernant les positions de rotor inutilisées. Figure 16. Avertissement concernant les positions de rotor inutilisées. 1 = Avertissement concernant les positions de rotor inutilisées. Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

36 17. Une fenêtre «Save As» (enregistrer sous) s affiche. Choisir un nom de fichier approprié et enregistrer l analyse de PCR dans un fichier d analyse *.rex à l emplacement sélectionné (figure 17). Figure 17. Enregistrement du fichier d analyse. 1 = fenêtre «Save As» (enregistrer sous), 2 = champs «File name» (nom de fichier) et «save as type. *.rex file» (enregistrer sous type : fichier *.rex), 3 = bouton «Save» (enregistrer). 36 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

37 18. L analyse PCR démarre. Remarque : lorsque l analyse démarre, l onglet «Run Progress» (progression de l analyse) s ouvre automatiquement pour indiquer un suivi de la température et le temps restant de l analyse (figure 18). Figure 18. Onglet «Run Progress» (progression de l analyse). Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

38 19. À la fin de l analyse, l onglet «Analysis» (analyse) s ouvre automatiquement. Remarque : s il ne s ouvre pas, cliquer dessus (figure 19). Remarque : la méthode de calcul est expliquée à la section «Interprétation des résultats», page 40. Figure 19. Onglet «Analysis» et rapport de résultats. 1 = onglet «Analysis» (analyse), 2 = panneau «Run Controls, Positive Control» (témoins d analyse, témoin positif), 3 = panneau «Run Controls, Negative Control» (témoins d analyse, témoin négatif), 4 = tableau «Sample Result Table» (résultats d échantillons), 5 = colonne «KRAS Mutation Status» (état mutationnel du gène KRAS). 20. Les résultats de tests sont rapportés comme suit (figure 19) : Panneau «Run Controls, Positive Control» (témoins d analyse, témoin positif). Si les résultats se trouvent dans un intervalle acceptable, la colonne «Positive Control Status» (état du témoin positif) indique «Valid». Dans le cas contraire, la mention «Invalid» s affiche. Panneau «Run Controls, Negative Control» (témoins d analyse, témoin négatif). Si les résultats du NTC et du témoin interne se trouvent dans un intervalle acceptable, la colonne «Negative Control Status» (état du témoin négatif) indique «Valid». Dans le cas contraire, la mention «Invalid» s affiche. 38 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

39 Panneau «Sample Result Table» (tableau de résultats d échantillons). Les mutations spécifiques sont rapportées pour les échantillons présentant une mutation positive dans la colonne «KRAS Mutation Status» (état mutationnel du gène KRAS). 21. Les fichiers de rapports sont accessibles via le bouton «Report». La fenêtre «Report Browser» (navigateur de rapports) s affiche alors. Sélectionner «KRAS Analysis Report» (rapport d analyse KRAS) sous «Templates» (modèles) et cliquer sur le bouton «Show» (afficher) (figure 20). Remarque : il est possible d enregistrer les rapports à un autre emplacement au format archive Web en cliquant sur le bouton «Save As» (enregistrer sous) dans le coin supérieur gauche de chaque rapport. Figure 20. Sélection du «KRAS Analysis Report» (rapport d analyse KRAS). 1 = bouton «Report» (rapport), 2 = fenêtre «Report Browser» (navigateur de rapports), 3 = sélection «KRAS Analysis Report» (rapport d analyse KRAS), 4 = bouton «Show» (afficher). Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

40 Interprétation des résultats L analyse et les détections de mutations sont effectuées automatiquement par le logiciel therascreen KRAS Assay Package une fois que l analyse est terminée. La section suivante fournit des explications sur l analyse et la détection de mutations par le logiciel therascreen KRAS Assay Package. Le cycle de PCR auquel la fluorescence d une réaction en particulier atteint une valeur seuil est défini comme la valeur CT. Les valeurs CT indiquent la quantité d ADN d entrée spécifique. Des valeurs CT faibles indiquent des niveaux d ADN d entrée élevés, tandis que des valeurs CT élevées indiquent des niveaux d ADN d entrée faibles. Les réactions comportant une valeur CT sont classées comme amplification positive. Le logiciel Rotor-Gene Q interpole les signaux de fluorescence entre deux valeurs enregistrées. Les valeurs CT peuvent alors être tout nombre réel (non limités aux entiers) compris dans un intervalle de 0 à 40. Pour le kit therascreen KRAS RGQ PCR, la valeur seuil est définie à 0,05 unité de fluorescence relative. Cette valeur est configurée dans le logiciel therascreen KRAS Assay Package pour les canaux jaune et vert. La valeur seuil a été définie lors du développement du kit therascreen KRAS RGQ PCR. La valeur CT est déterminée à l aide de l équation suivante : CT = [valeur CT test de mutation] [valeur CT test témoin] Les témoins d analyse (témoin positif, NTC et témoins internes) sont évalués pour assurer que les valeurs CT sont acceptables et que les réactions sont correctes. Les valeurs CT de l échantillon sont calculées sur la base de la différence entre le CT de test de mutation et le CT de test témoin du même échantillon. On estime que les échantillons présentent une mutation positive si leur CT est inférieur ou égal à la valeur CT seuil de ce test. Au-dessus de cette valeur, l échantillon peut soit contenir moins que le pourcentage de mutation détectable par le kit therascreen KRAS RGQ PCR (au-delà de la limite des tests), soit présenter une mutation négative, rapportée comme «No Mutation Detected» (aucune mutation détectée). L absence d amplification dans les réactions de mutation est rapportée en tant que «No Mutation Detected» (aucune mutation détectée). Les valeurs CT calculées à partir de l amplification du bruit de fond sont censés être supérieures aux valeurs CT seuil et l échantillon est classé comme «No Mutation Detected». Les résultats de tests s affichent comme suit : «Mutation Positive», «No Mutation Detected» (aucune mutation détectée), «Invalid» ou, en cas d échec d un témoin d analyse, «Run Control Failed». Pour les échantillons présentant une mutation positive, les mutations spécifiques sont rapportées. Les autres résultats possibles pouvant être affichés sont décrits dans les sections 40 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

41 «Protocole : évaluation des échantillons d ADN», «Protocole : détection des mutations KRAS» et «Guide de dépannage» de ces Instructions d utilisation. Dans de rares cas, une tumeur peut contenir plusieurs mutations. C est alors la mutation correspondant à la valeur CT la plus faible qui est identifiée. Guide de dépannage Ce guide de dépannage peut vous aider à résoudre les problèmes qui pourraient se poser. Pour de plus amples informations, consulter également la foire aux questions dans notre Centre d assistance technique à l adresse suivante : Les scientifiques de l assistance technique de QIAGEN sont toujours heureux de répondre aux questions concernant les informations et les protocoles contenus dans ce manuel ou à propos des technologies d échantillonnage et de dosage (pour les coordonnées, voir la quatrième de couverture ou visiter le site Résultats invalides a) Les conditions de stockage pour au moins un composant ne respectaient pas les instructions données dans «Stockage et manipulation des réactifs», page 14 b) Le kit therascreen KRAS RGQ PCR a expiré Commentaires et suggestions Vérifier les conditions de stockage et la date de péremption (voir l étiquette) des réactifs et utiliser un nouveau kit si nécessaire. Vérifier les conditions de stockage et la date de péremption (voir l étiquette du kit) des réactifs et, si nécessaire, utiliser un nouveau kit therascreen KRAS RGQ PCR. Les échantillons NTC indiquent des résultats positifs dans le canal FAM La contamination s est produite lors de la préparation de la PCR Répéter la PCR avec de nouveaux réactifs. Si possible, fermer les tubes de PCR directement après y avoir ajouté les échantillons à tester. S assurer que l espace de travail et les instruments sont décontaminés régulièrement. Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

42 Messages du logiciel therascreen KRAS Assay Package Le tableau 9 répertorie les messages pouvant être générés par le logiciel therascreen KRAS Assay Package, leur signification et les actions à entreprendre. Tableau 9. Messages du logiciel therascreen KRAS Assay Package Message Signification Action à entreprendre PC_CTRL_ASSAY _FAIL Analyse PCR invalide, CT FAM hors intervalle pour le témoin positif lors de la réaction témoin. Répéter l analyse PCR dans son intégralité. PC_MUTATION _ASSAY_FAIL PC_CTRL _INVALID_DATA PC_MUTATION _INVALID_DATA NTC_INT_CTRL _FAIL Analyse PCR invalide, CT FAM hors intervalle pour au moins une réaction du témoin de mutation. Analyse PCR invalide, impossible d interpréter les données de fluorescence dans le témoin positif (mélange réactionnel témoin). Analyse PCR invalide, impossible d interpréter les données de fluorescence dans le témoin positif (mélange réactionnel de mutation). Analyse PCR invalide, témoin interne au-dessus de l intervalle pour le témoin négatif. Répéter l analyse PCR dans son intégralité. Répéter l analyse PCR dans son intégralité. Répéter l analyse PCR dans son intégralité. Répéter l analyse PCR dans son intégralité. Suite du tableau sur la page suivante 42 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

43 Tableau 9. Messages du logiciel therascreen KRAS Assay Package (suite) Message Signification Action à entreprendre NTC_INT_CTRL _EARLY_CT Analyse PCR invalide, témoin interne audessous de l intervalle pour le témoin négatif. Répéter l analyse PCR dans son intégralité. NTC_INVALID _CT NTC_INVALID _DATA SAMPLE_CTRL _INVALID_DATA SAMPLE_CTRL _HIGH_CONC Analyse PCR invalide, FAM invalide (inférieur à la limite) pour le témoin négatif. Analyse PCR invalide, impossible d interpréter les données de fluorescence dans le témoin négatif. Échantillon invalide, impossible d interpréter les données de fluorescence dans le témoin d échantillon. Échantillon invalide, CT FAM trop faible dans le témoin d échantillon. Répéter l analyse PCR dans son intégralité. Répéter l analyse PCR dans son intégralité. Configurer une nouvelle analyse PCR pour répéter le ou les échantillons concernés. Diluer l échantillon pour augmenter la valeur CT du témoin. Cette dilution doit être calculée d après l hypothèse selon laquelle une dilution de 1:1 dans l eau fournie avec le kit augmente le CT de 1,0. Une fois l échantillon dilué, configurer une nouvelle analyse PCR pour répéter l échantillon. Suite du tableau sur la page suivante Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

44 Tableau 9. Messages du logiciel therascreen KRAS Assay Package (suite) Message Signification Action à entreprendre SAMPLE_CTRL _FAIL Échantillon invalide, CT FAM trop élevé dans la réaction du témoin d échantillon. Configurer une nouvelle analyse PCR pour répéter l échantillon. Si celui-ci demeure invalide lors de la nouvelle analyse PCR, extraire l échantillon d un ou de plusieurs nouveaux tissus FFPE. Configurer une nouvelle analyse PCR pour tester la nouvelle extraction. Si le résultat est toujours invalide, retester cette seconde extraction. Si le résultat n est toujours pas valide après cette analyse, l état mutationnel de l échantillon est indéterminé et aucun test supplémentaire ne doit être effectué. SAMPLE_INT _CTRL_FAIL CT trop élevé (ou aucun CT) pour le témoin interne (HEX), canal FAM présentant une mutation négative. Si l échantillon est désigné comme valide : aucune action. Si l échantillon est désigné comme invalide, configurer une nouvelle analyse PCR pour répéter l échantillon. Si celui-ci demeure invalide lors de la nouvelle analyse PCR, extraire l échantillon d un ou de plusieurs nouveaux tissus FFPE. Configurer une nouvelle analyse PCR pour tester la nouvelle extraction. Si le résultat est toujours invalide, retester cette seconde extraction. Si le résultat n est toujours pas valide après cette analyse, l état mutationnel de l échantillon est indéterminé et aucun test supplémentaire ne doit être effectué. Suite du tableau sur la page suivante 44 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

45 Tableau 9. Messages du logiciel therascreen KRAS Assay Package (suite) Message Signification Action à entreprendre SAMPLE_INT _CTRL_EARLY_CT Tube de mutation invalide, CT HEX trop faible pour l échantillon (témoin interne) Si l échantillon est désigné comme valide : aucune action. Si l échantillon est désigné comme invalide, configurer une nouvelle analyse PCR pour répéter l échantillon. Si celui-ci demeure invalide lors de la nouvelle analyse PCR, extraire l échantillon d un ou de plusieurs nouveaux tissus FFPE. Configurer une nouvelle analyse PCR pour tester la nouvelle extraction. Si le résultat est toujours invalide, retester cette seconde extraction. Si le résultat n est toujours pas valide après cette analyse, l état mutationnel de l échantillon est indéterminé et aucun test supplémentaire ne doit être effectué. Suite du tableau sur la page suivante Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

46 Tableau 9. Messages du logiciel therascreen KRAS Assay Package (suite) Message Signification Action à entreprendre SAMPLE_INVALID _DATA Tube de mutation invalide, impossible d interpréter les données de fluorescence dans le témoin interne. Si l échantillon est désigné comme valide : aucune action. Si l échantillon est désigné comme invalide, configurer une nouvelle analyse PCR pour répéter l échantillon. Si celui-ci demeure invalide lors de la nouvelle analyse PCR, extraire l échantillon d un ou de plusieurs nouveaux tissus FFPE. Configurer une nouvelle analyse PCR pour tester la nouvelle extraction. Si le résultat est toujours invalide, retester cette seconde extraction. Si le résultat n est toujours pas valide après cette analyse, l état mutationnel de l échantillon est indéterminé et aucun test supplémentaire ne doit être effectué. Suite du tableau sur la page suivante 46 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

47 Tableau 9. Messages du logiciel therascreen KRAS Assay Package (suite) Message Signification Action à entreprendre MUTATION _EARLY_CT Tube de mutation invalide, CT FAM trop faible pour l échantillon. Si l échantillon est désigné comme valide : aucune action. Si l échantillon est désigné comme invalide, configurer une nouvelle analyse PCR pour répéter l échantillon. Si celui-ci demeure invalide lors de la nouvelle analyse PCR, extraire l échantillon d un ou de plusieurs nouveaux tissus FFPE. Configurer une nouvelle analyse PCR pour tester la nouvelle extraction. Si le résultat est toujours invalide, retester cette seconde extraction. Si le résultat n est toujours pas valide après cette analyse, l état mutationnel de l échantillon est indéterminé et aucun test supplémentaire ne doit être effectué. SAMPLE_POSITIVE _AND_INVALID Au moins une mutation d un échantillon est valide et positive, et au moins une mutation du même échantillon est invalide (avertissement et non erreur). Aucune. Contrôle qualité Conformément au système de gestion de la qualité certifié ISO de QIAGEN, chaque lot du kit therascreen KRAS RGQ PCR est testé selon des spécifications prédéterminées afin de garantir une qualité constante du produit. Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

48 Limitations Le test est conçu pour détecter 7 mutations dans les codons 12 et 13 du gène KRAS. Les échantillons dont les résultats sont rapportés comme «No Mutation Detected» peuvent présenter des mutations KRAS non détectées par le test (par ex. 13CYS). La détection des mutations dépend de l intégrité des échantillons et de la quantité d ADN amplifiable présent dans le prélèvement. Il est recommandé de répéter la procédure au cas où l évaluation initiale de l ADN de l échantillon indique que la quantité est trop faible ou trop élevée pour l analyse de la mutation. Le kit therascreen KRAS RGQ PCR est utilisé dans le cadre d une procédure de réaction en chaîne par polymérase (PCR). Comme pour toutes les procédures de PCR, les échantillons peuvent être contaminés par des sources externes d ADN dans l environnement du test et par l ADN du témoin positif. Faire preuve de prudence afin d éviter la contamination des échantillons et des réactifs du mélange réactionnel. Le kit therascreen KRAS RGQ PCR n est pas destiné au diagnostic. Le kit therascreen KRAS RGQ PCR est uniquement destiné à distinguer l ADN mutant de l ADN de type sauvage. Le test a été conçu de façon que chacune des réactions mutantes soit le plus sensible à la mutation spécifique mesurée. Toutefois, pour les échantillons pour lesquels une mutation est détectée, une réactivité croisée peut être observée avec d autres réactions de mutation. Si plusieurs réactions mutantes sont positives, le résultat est celui dont le résultat de CT est le plus faible. Le kit therascreen KRAS RGQ PCR n est validé que pour les tissus de cancer colorectal fixés au formaldéhyde et inclus en paraffine. Le kit therascreen KRAS RGQ PCR a été validé pour l utilisation avec le kit QIAamp DSP DNA FFPE Tissue. Seul l instrument Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM a été validé pour une utilisation avec le kit therascreen KRAS RGQ PCR. Résultats attendus Le kit therascreen KRAS RGQ PCR fournit une indication qualitative de la présence de sept mutations dans les codons 12 et 13 de l oncogène KRAS. Les résultats de tests s affichent comme «Mutation Positive», «No Mutation Detected», «Invalid» pour chacune des mutations ou, dans le cas d un échec d un témoin d analyse, «Run Control Failure». En cas de résultat «Mutation Positive» la mutation KRAS détectée est également indiquée. 48 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

49 Caractéristiques des performances Performances analytiques Les caractéristiques de performances spécifiques du kit therascreen KRAS RGQ PCR ont été déterminées par des études impliquant des échantillons de tissu fixé au formaldéhyde et inclus en paraffine (FFPE) prélevés sur des patients atteints de cancer colorectal (CRC) et 8 lignées cellulaires humaines fixées au formaldéhyde et incluses en paraffine (lignées cellulaires FFPE), dont 7 ont présenté des mutations KRAS connues détectées par le test et une un gène KRAS de type sauvage (aucune mutation au niveau des codons 12 et 13). L état mutationnel des échantillons a été confirmé par un séquençage bidirectionnel Sanger. Seuil Deux cent vingt échantillons FFPE ont été testés à l aide d une méthode conforme aux directives du NCCLS EP17-A (2004) afin d établir les seuils du test. L intervalle CT de la réaction témoin a été établi entre 21,92 et 32,00. Les valeurs seuil, fondées sur le CT de la réaction témoin soustrait du CT des réactions mutantes ( CT), sont indiquées dans le tableau 10. Tableau 10. Valeurs seuil établies pour chaque test de mutation Test mutant ( C T ) 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP Seuil ( C T ) 8,0 6,6 8,0 8,0 8,0 7,5 7,5 Limite du blanc Afin d évaluer les performances du kit therascreen KRAS RGQ PCR en l absence de matrice positive mutante, et d assurer qu un blanc d échantillon ne génère pas de signal analytique pouvant indiquer une faible concentration de mutation, les échantillons négatifs ont été évalués. Les résultats n ont révélé aucune valeur CT témoin ou mutante détectable dans les tubes réactionnels témoins ou de mutation (les valeurs CT des témoins internes étaient toutes valides). Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

50 Comparaison avec la méthode de référence analytique Deux études ont été menées pour démontrer la concordance dans l état mutationnel des échantillons CRC testés avec le kit therascreen KRAS RGQ PCR par rapport au séquençage bidirectionnel. Dans la première étude, 350 échantillons tumoraux prélevés sur des patients atteints de CRC ont été sélectionnés à partir de caractéristiques cliniques, démographiques et tumorales. À l aide d une technique d échantillonnage statistique aléatoire, 150 échantillons à l état mutationnel inconnu ont été sélectionnés pour l évaluation. Ces (150) échantillons FFPE ont été testés puis analysés lors de cette étude à l aide de mesures statistiques de concordance/discordance issues des directives CLSI EP12-A2 (2008). Au total, 137 échantillons de FFPE ont présenté des résultats valides à la fois pour le kit therascreen KRAS RGQ PCR et le séquençage bidirectionnel. Les résultats ont démontré que le kit therascreen KRAS RGQ PCR avait rapporté deux échantillons comme négatifs, dont l un était indiqué comme positif pour 12ASP et l autre pour 13ASP par le séquençage bidirectionnel. Au contraire, trois échantillons ont été rapportés comme présentant une mutation KRAS par le kit therascreen KRAS RGQ PCR, non rapportée comme positive par le séquençage bidirectionnel. En outre, un échantillon identifié comme étant 12ARG par le kit therascreen KRAS RGQ PCR a été déterminé comme 12ASP par le séquençage bidirectionnel. 5 échantillons déterminés comme présentant une mutation négative par le séquençage bidirectionnel étaient soit indéterminés (3 échantillons), soit invalides (2 échantillons) selon le kit therascreen KRAS RGQ PCR (données non indiquées). Un échantillon indéterminé par le séquençage bidirectionnel Sanger a été déterminé comme étant 12SER par le kit therascreen KRAS RGQ PCR (données non indiquées). Le tableau 11 page suivante montre l analyse de la concordance entre le kit therascreen KRAS RGQ PCR et le séquençage bidirectionnel. 50 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

51 Tableau 11. Comparaison entre le kit therascreen KRAS RGQ PCR et le séquençage bidirectionnel Sanger Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

52 Les résultats révèlent une concordance positive en pourcentage de 96,3 %, une concordance négative en pourcentage de 96,3 % et une concordance globale en pourcentage de 96,4 %. Les résultats globaux, exceptés 6 échantillons dont le séquençage Sanger a échoué, sont indiqués dans le tableau 12 ci-dessous. Tableau 12. Analyse de la concordance Mesure de la concordance Fréquence (%) Intervalle de confiance (IC) de 95 % Concordance globale en pourcentage 132/137 (96,35) 92,69 98,21 Concordance positive en pourcentage 52/54 (96,30) 89,41 98,77 Concordance négative en pourcentage 80/83 (96,39) 91,30 98,55 Un second ensemble unique d échantillons a été évalué pour compléter les données de la première étude. Un ensemble de 271 échantillons FFPE de CRC a été fourni, dont 250 présentant un état mutationnel inconnu et 21 présentant un état mutationnel connu afin d enrichir les mutations rares. Tous ont été comparés au séquençage bidirectionnel Sanger décrit précédemment. Un total de 13 (~5 %) échantillons nécessitaient une macro-dissection pour l évaluation avec le kit therascreen KRAS RGQ PCR. Sur les 271 échantillons présentant des résultats par séquençage bidirectionnel, 24 ont été indéterminés par le kit therascreen KRAS RGQ PCR (échec de l intervalle CT du témoin, données non indiquées). L analyse de la concordance a été effectuée sur 247 échantillons présentant des résultats valides à la fois selon le séquençage bidirectionnel et le kit therascreen KRAS RGQ PCR. 9 échantillons étaient discordants. Un échantillon sur les 247 présentait un résultat de mutation positif suite au séquençage bidirectionnel mais un résultat «No Mutation Detected» avec le kit therascreen KRAS RGQ PCR. Huit échantillons ont présenté un résultat positif avec le kit therascreen KRAS RGQ PCR mais un résultat négatif avec le séquençage bidirectionnel. La concordance générale était de 96,4 %. Les données indiquent la concordance précise du kit therascreen KRAS RGQ PCR (voir tableaux 13 et 14). Tableau 13. Analyse de la concordance (deuxième étude) Mesure de la concordance Fréquence (%) IC de 95 % Concordance globale en pourcentage 238/247 (96,36) 93,73 98,09 Concordance positive en pourcentage 106/107 (99,07) 95,64 99,95 Concordance négative en pourcentage 132/140 (94,29) 89,93 97,13 52 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

53 Tableau 14. Comparaison entre le kit therascreen KRAS RGQ PCR et le séquençage bidirectionnel Sanger (deuxième étude) Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

54 Limite de détection (LoD) La plage de fonctionnement du kit therascreen KRAS RGQ PCR est fondée sur la quantité d ADN amplifiable dans le prélèvement telle qu elle est déterminée par la valeur CT de la réaction témoin. L intervalle d entrée indiqué pour le test est défini par l intervalle préspécifié du CT témoin de 21,92 à 32,00. La LoD est le pourcentage minimum d ADN mutant pouvant être détecté dans un bruit de fond d ADN de type sauvage lorsque l ADN amplifiable total se situe dans l intervalle d entrée indiqué et au-dessous de la valeur CT seuil. Une étude a été menée pour déterminer la LoD de chacune des sept réactions spécifiques à la mutation intégrées dans le kit therascreen KRAS RGQ PCR. Pour le kit therascreen KRAS RGQ PCR, la limite de détection d ADN mutant dans un bruit de fond d ADN de type sauvage est définie comme le plus faible facteur de dilution auquel 95 % des réplicats de test pour chacun des échantillons positifs à la mutation ont été déterminés comme positifs. Huit lignées cellulaires FFPE, dont sept à l ADN mutant connu et une à l ADN de type sauvage, ont été utilisées pour cette évaluation. La proportion de mutants dans l ADN amplifiable total (pourcentage d ADN mutant) a été déterminée préalablement à l aide d une méthode de séquençage bidirectionnel Sanger à partir de cellules non fixées, suivie d une analyse relative des pics. Pour trois lignées cellulaires, le contenu mutant était de 100 % (l ADN de la lignée cellulaire était mutant homozygote). Les autres lignées cellulaires présentaient une zygosité mixte. Les extractions multiples d ADN de chaque échantillon ont été rassemblées dans un pool pour produire des stocks d ADN. Les stocks d ADN ont ensuite été normalisés pour atteindre les valeurs CT cibles de la réaction témoin. Les extraits d ADN mutant normalisés ont été dilués avec un extrait d ADN de type sauvage normalisé pour créer une série de dilutions d extraits contenant le même niveau d ADN amplifiable total mais différents niveaux d ADN mutant. Les dilutions en série ont ensuite été produites à partir de ces échantillons et analysées dans plusieurs réplicats. La première série de dilutions a été créée pour la valeur CT de la réaction témoin située au milieu de l intervalle (approximativement 26). Neuf réplicats par dilution ont été testés. Le pourcentage de lectures correctes en fonction de la dilution pour chacune des réactions mutantes est indiqué dans le tableau 15. Les cases grisées indiquent les cas où plus de 95 % des réplicats ont produit des lectures correctes. 54 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

55 Tableau 15. Pourcentage de lectures correctes % lectures correctes % dilution de la mutation 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 0, ,3 55,6 22,2 66,7 0 1, , , , , ,7 6, , , ,0 100* * La dilution de la mutation pour cet échantillon était de 40,0 %. Les résultats de la première série de dilutions ont été utilisés pour produire des dilutions afin de confirmer les valeurs de LoD à l aide d intervalles de dilutions de la mutation en pourcentage plus étroits et spécifiques à la réaction, à des niveaux à la fois faibles et élevés, dans l intervalle d entrée du test. Douze réplicats pour chacun ont été évalués pour la série de dilutions à des niveaux élevés. Le pourcentage de lectures correctes en fonction de la dilution pour la série de dilutions à des niveaux élevés (valeurs cibles approximativement CT 23 24) est indiqué dans le tableau 16 ci-dessous. Les cases grisées indiquent les cas où plus de 95 % des réplicats ont produit des lectures correctes. Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

56 Tableau 16. Pourcentage de lectures correctes (élevées) % dilution de la mutation (élevée) 12ALA 0,13 0,27 0,54 1,08 2,15 4,30 % lectures correctes , ASP 0,56 1,13 2,25 4,50 9,00 18,00* % lectures correctes ,3 83, ARG 0,16 0,33 0,65 1,30 2,60 5,20 % lectures correctes 0 0 8, CYS 0,12 0,24 0,49 0,98 1,95 3,90 % lectures correctes 0 0 8,3 83, SER 0,31 0,63 1,25 2,50 5,00 10,00 % lectures correctes ,3 66, VAL 0,17 0,34 0,69 1,38 2,75 5,50 % lectures correctes , ASP 0,63 1,25 2,50 5,0 10,0 20,0 % lectures correctes * Onze réplicats valides. Vingt-quatre réplicats ont été utilisés pour la dilution des séries faibles, sauf indication contraire. Le pourcentage de lectures correctes en fonction de la dilution pour la série de dilutions faibles (valeur cible approximativement CT 31) est indiqué dans le tableau 17 ci-dessous. 56 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

57 Tableau 17. Pourcentage de lectures correctes (faibles) % dilution de la mutation (faible) 12ALA 0,27 0,54 1,08 2,15 4,30 8,60 12,90 % lectures correctes 12,5 20,8 33,3 83, ASP 0,56 1,13 2,25 4,50 9,0 18,0 27,0 % lectures correctes 0 16,7 29,2 58, ARG* 0,33 0,65 1,30 2,60 5,20 10,4 15,6 % lectures correctes 8,3 4,2 29,2 52,2 95, CYS 0,24 0,49 0,98 1,95 3,90 7,80 11,7 % lectures correctes 8,3 4,2 20,9 54,2 83, SER 0,63 1,25 2,50 5,0 10,0 20,0 30,0 % lectures correctes 0 0 8,3 33,3 70,9 83, VAL 0,34 0,69 1,38 2,75 5,50 11,00 16,50 % lectures correctes 4,3 16,7 46,7 75, ASP 0,63 1,25 2,5 5,0 10,0 20,0 30,0 % lectures correctes 0 4,2 8,3 33,3 70, * À une dilution de 2,60, le nombre de réplicats valides s élevait à 23. Les nombres de réplicats valides dans les séries s élevaient à 23, 24, 15, 16, 13, 12 et 19 pour 12VAL. Des modèles de régression logistique ont été appliqués à chaque test individuellement pour les ensembles de données d ADN d entrée faible et élevé. Dans ces modèles, la variable d intérêt était binaire, avec pour résultats possibles la détection de la mutation (détection = 1) ou l absence de détection (détection = 0). La variable explicative continue était de log2 % de dilution de la mutation. Les LoD ont été calculées comme le pourcentage de dilution de la mutation donnant une probabilité prédictive de détection de 0,95. Les LoD déterminées par les séries de dilution commençant par les valeurs CT faibles ou élevées sont indiquées dans le tableau 18 ci-après. Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

58 Tableau 18. Données de régression logistique pour les séries de dilutions CT faibles et élevées Test Faible Élevée 12ALA 4,25 0,56 12ASP 10,23 6,43 12ARG 7,27 0,87 12CYS 6,90 1,21 12SER 25,75 4,20 12VAL 5,17 0,90 13ASP 18,83 4,16 Les LOD finales obtenues utilisant des lignées cellulaires FFPE lorsque la valeur CT d entrée se trouve approximativement entre 22 et 27 CT sont indiquées dans le tableau 19 ci-dessous. À la limite inférieure de l intervalle d entrée CT, la sensibilité du test diminue, étant donné que la quantité d ADN d entrée ne contient pas nécessairement assez de copies pour égaler les ratios en pourcentage d ADN mutant dans l ADN de type sauvage observés à la limite supérieure et au milieu de l intervalle. Tableau 19. Valeurs LoD pour chaque test de mutation utilisant des lignées cellulaires FFPE Test LOD C95 (% d ADN mutant dans l ADN de type sauvage) 12ALA 0,8 12ASP 6,4 12ARG 2,6 12CYS 1,5 12SER 5,6 12VAL 1,6 13ASP 6,4 58 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

59 Effet de l ADN d entrée Lorsque des échantillons de niveaux totaux d ADN différents contiennent la même proportion d ADN mutant, les valeurs CT mesurées sont censées demeurer cohérentes. L objectif de l étude était de démontrer que les performances du kit therascreen KRAS RGQ PCR étaient cohérentes sur tout l intervalle d entrée d ADN (CT témoin) du test. L ADN extrait de 8 lignées cellulaires FFPE a été utilisé pour préparer des pools d ADN avec le CT de réaction témoin le plus faible possible. Les stocks d ADN concentrés ont ensuite été dilués pour générer de l ADN couvrant toute la plage de fonctionnement (total de 5 dilutions comprenant le stock concentré initial). Pour chaque point de la plage de fonctionnement, un matériel suffisant a été préparé pour effectuer 6 tests de réplicats. L intervalle de dilution pour chaque réaction de mutation et la valeur CT moyenne obtenue à partir des résultats sont indiqués dans le tableau 20 ci-dessous. Pour chacune des mutations détectées par le kit therascreen KRAS RGQ PCR, les valeurs CT mesurées à différents niveaux d entrée d ADN couvrant la plage de fonctionnement du test ont validé le critère d acceptation prédéfini de l étude. Malgré une légère augmentation de CT à mesure de l augmentation de l entrée d ADN, les valeurs CT ont dans l ensemble été cohérentes sur la plage de fonctionnement du kit therascreen KRAS RGQ PCR au sein du critère d acceptation prédéfini. Tableau 20. Effet de l entrée d ADN sur les valeurs CT au sein de l intervalle CT de la réaction témoin d entrée lignées cellulaires FFPE Dilution 1 ~20 21 CT Dilution 2 ~23 24 CT Nombres de réplicats Dilution 3 ~26 27 CT Dilution 4 ~29 30 CT Dilution 5 ~32 33 CT Mutation CT CT CT CT CT 12ALA 1,56 1,25 1,16 1,14 1,27 12ASP* 2,46 2,18 2,11 2,11 1,75 12ARG 1,18 0,63 1,08 0,94 1,06 12VAL 0,29 0,25 0,15 0,26 0,1 ADN ~22 23 CT ~24 25 CT ~27 28 CT ~29 30 CT ~32 33 CT 12SER 2,91 2,21 2,15 2,15 2,08 12CYS 0,98 0,71 0,58 0,81 0,67 13ASP 3,57 2,84 2,54 2,46 2,62 * Le nombre total de réplicats pour 12ASP s élevait à 27. Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

60 Linéarité/efficacité de l amplification en fonction de l entrée d ADN La linéarité et l efficacité de l amplification de la PCR a été démontrée pour chaque réaction de mutation, par rapport à la réaction témoin, sur toute la plage de fonctionnement du kit therascreen KRAS RGQ PCR. L efficacité de l amplification a été calculée pour chacune des réactions de mutation et pour la réaction témoin comme [2( 1/pente)] 1. L efficacité de l amplification du témoin comparé à la réaction de mutation indique que la valeur CT, et donc la détection de mutations, est cohérente pour toute la plage de fonctionnement du test. La plus grande différence dans l efficacité de l amplification entre la réaction témoin et une réaction de mutation a été observée pour le test 13ASP avec une différence moyenne d environ 14,5 %. Les données sont reprises dans le tableau 21 ci-après. 60 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

61 Tableau 21. Efficacité de l amplification Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

62 Linéarité/efficacité de l amplification en fonction de la mutation en pourcentage L objectif de cette étude était d évaluer l effet d échantillons positifs mutants dilués en série sur l efficacité de l amplification, sur toute la plage de fonctionnement du kit therascreen KRAS RGQ PCR, à partir de niveaux d entrée de CT d environ 22 23CT. Les extraits d ADN des lignées cellulaires FFPE ont d abord été évalués par la valeur de DO avant la réalisation de la PCR avec le kit therascreen KRAS RGQ PCR. Les stocks d ADN ont ensuite été préparés à un CT de réaction témoin correspondant à environ 23 CT. Les stocks ont été dilués en séries de deux à l aide d ADN de type sauvage, afin de maintenir constant le niveau total d ADN de type sauvage tout en faisant varier le pourcentage d ADN mutant dans la matrice. Ainsi, chacune des matrices générées comportait la même quantité absolue et la même concentration d ADN mais différents ratios d ADN mutant par rapport à l ADN de type sauvage. Des pools d ADN suffisants pour 6 réplicats par mutation ont été préparés. Les données de CT et CT ont été calculées pour chaque mutation à chaque point de dilution. Les valeurs CT de la réaction de mutation ont été reportées et les efficacités calculées. Les valeurs CT de la réaction témoin étaient cohérentes sur la série de dilution de chacune des mutations. Pour chaque échantillon dont la valeur CT de la réaction témoin se trouvait dans l intervalle spécifié (21,92 à 32,00), les valeurs CT ont été calculées. Un modèle de régression linéaire représente le CT de la réaction de mutation par rapport au log2 de la dilution d entrée d ADN. La pente et les intervalles de confiance à 95 % ont été rapportés. L étude a montré que la dilution des mutations dans un bruit de fond de concentration constante d ADN de type sauvage avait abouti à une efficacité d amplification ne variant pas de façon tangible hors des valeurs déterminées dans l étude de linéarité ci-dessus ; l efficacité d amplification différant de moins de ±10 % (tableau 22). 62 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

63 Tableau 22. Efficacité de l amplification Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

64 Substances interférentes Cette étude visait à évaluer l impact des substances potentiellement interférentes sur les performances du kit therascreen KRAS RGQ PCR. Elle a été réalisée en analysant l impact de chaque substance, via des procédés par ajout connu avec deux concentrations, sur les valeurs CT et l état de mutation des échantillons de test. Les concentrations sont indiquées dans le tableau 23. Tableau 23. Quantité de substances interférentes testées dans chaque test (à savoir, 1x) Substance interférente Cire de paraffine (dans le xylène) Quantité élevée réelle (µl/200 µl d éluat) Quantité faible réelle (µl/200 µl d éluat) 2,00 x ,00 x 10 5 Xylène 2,00 x ,00 x 10 5 Éthanol 1,35 x ,38 x 10 4 Tampon ATL 5,40 x ,35 x 10 4 Protéinase K 1,32 x ,30 x 10 6 Tampon AL 1,33 x ,33 x 10 5 Tampon de lavage AW1 Tampon de lavage AW2 0,50 1,25 x ,00 1,25 Aucune substance potentiellement interférente, évaluée dans des concentrations susceptibles d être rencontrées dans le cadre d une utilisation normale, n affecte la capacité du kit therascreen KRAS RGQ PCR à distinguer des échantillons de mutation positive de ceux de mutation négative. Outre l étude des substances interférentes, l effet potentiel de nécrose dans les échantillons cliniques a été évalué pour déterminer si de hauts niveaux de tissus nécrotiques dans les échantillons tumoraux pouvaient affecter la capacité à générer des données valides. Sur un total de 421 échantillons évalués dans le cadre d études de comparaison avec la méthode de référence analytique, 29 présentaient une nécrose à un niveau > 50 %, selon l examen pathologique. Parmi ces 29 échantillons, 28 ont présenté des résultats valides concordant avec le séquençage bidirectionnel Sanger. Un seul résultat s est avéré invalide en raison d une insuffisance d ADN. 64 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

65 Contamination croisée Cette étude visait à déterminer, à l aide du kit therascreen KRAS RGQ PCR, l étendue de la contamination croisée entre les échantillons d ADN, susceptible d entraîner des faux positifs. Les sources potentielles de contamination croisée comprennent : prélèvement d échantillon (p. ex., grattage de lames) ; pipetage d échantillons ; fermeture («capping») des tubes d échantillon ; contamination des réactifs de kit lors de l utilisation ; chargement des tubes à essai sur l instrument Rotor-Gene Q. Pour cette étude, des échantillons standard FFPE ont été utilisés : de type sauvage et 12ALA (la réaction du 12ALA étant celle avec la LoD la plus faible dans le kit). L étude consistait en 10 analyses PCR conçues pour étudier le potentiel de contamination au cours des analyses sur l instrument Rotor-Gene Q et entre celles-ci. Lors de ces analyses de test, les tubes contenant de l ADN de type sauvage ont été utilisés pour tester la contamination depuis un ADN mutant. Les résultats de cette étude n ont révélé aucune contamination détectable dans chacun des extraits d ADN de type sauvage destinés à la détection d une contamination croisée. Exclusivité/réactivité croisée Le kit therascreen KRAS RGQ PCR est constitué de 8 réactions distinctes : une réaction témoin pouvant détecter une zone non polymorphique du gène KRAS et sept réactions spécifiques à la mutation. Aucune réaction ne mesure en particulier la séquence KRAS de type sauvage dans les codons 12 ou 13. Le résultat KRAS «No Mutation Detected» (aucune mutation détectée) (c.-à-d. de type sauvage) est déterminé par l absence de l une des 7 mutations entraînant un résultat de mutation positif. Par conséquent, il est nécessaire de démontrer la quantité d amplification non spécifique ou de réactivité croisée se produisant dans chaque réaction au moyen de quantités excessives d ADN de KRAS de type sauvage afin d éliminer tout faux positif. De la même manière, l amplification non spécifique des mutations KRAS que la réaction n est pas censée détecter est évaluée afin de démontrer que la quantité de réactivité croisée entre les réactions mutantes n entraîne pas d erreur dans la détection des mutations en présence de quantités excessives d ADN mutant. L entrée d ADN de ce test étant fondée sur l intervalle CT (21,92 à 32,00), la plus forte concentration d entrée d ADN est fondée sur une valeur CT témoin d environ 22. Les échantillons cliniques FFPE ont été utilisés pour cette évaluation, tout comme l ADN de lignées cellulaires FFPE. Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

66 Amplification non spécifique/réactivité croisée : ADN KRAS de type sauvage Afin de traiter la quantité d amplification non spécifique d ADN de type sauvage par des mélanges réactionnels conçus pour amplifier les mutations spécifiques, soixante (60) réplicats d ADN de lignées cellulaires FFPE de type sauvage ou d ADN extrait de tissu tumoral CRC à concentration maximale de niveau d entrée d ADN amplifiable ont été évalués à l aide du kit therascreen KRAS RGQ PCR. Pour l ADN extrait des lignées cellulaires FFPE, les valeurs CT témoin s élevaient à environ Les valeurs CT témoin pour trois échantillons CRC de type sauvage se situaient entre 24 et 25. Les résultats ont prouvé que les valeurs CT dépassaient les seuils établis. Les valeurs CT moyennes et/ou minimales observées pour chacune des réactions sont indiquées dans le tableau 24 ci-dessous. Tableau 24. Valeurs CT moyennes/minimales observées pour les échantillons de type sauvage dans les réactions mutantes Réaction mutante Seuil Valeur CT minimale observée 12ALA 8 12,76 Moyenne valeur CT échantillon 1 (minimale) 18,00 (11,40) Moyenne échantillon 2 (minimale) 18,62 (11,50) Moyenne échantillon 3 (minimale) 20,03 (19,36) 12ASP 6,6 10,35 10,90 (9,62) 10,34 (8,84) 10,68 (9,01) 12ARG 8 14,26 20,33 (12,94) 20,02 (13,20) 20,03 (19,36) 12CYS 8 13,66 20,62 (17,38) 20,29 (19,62) 20,03 (19,36) 12SER 8 11,97 17,26 (11,14) 17,90 (11,42) 18,05 (10,44) 12VAL 7,5 11,81 14,87 (11,46) 16,27 (11,50) 18,68 (11,36) 13ASP 7,5 10,94 12,35 (9,08) 13,68 (10,69) 14,82 (9,97) 66 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

67 Amplification non spécifique/réactivité croisée/exclusivité : mutation positive de l ADN KRAS Les échantillons mutants présentant une forte concentration d ADN d entrée ont été soumis à tous les mélanges réactionnels au moyen d une préparation des échantillons d ADN à partir de chacune des lignées cellulaires FFPE de façon que le CT de la réaction témoin corresponde approximativement à 23. Six réplicats de chaque échantillon de mutation ont été évalués. Le pourcentage de mutation de l échantillon était régi par le pourcentage de mutants dans l ADN des lignées cellulaires. Les valeurs CT moyennes sont présentées dans le tableau 25 ci-dessous et démontrent une réactivité croisée entre les réactions de mutation. La mutation 12ALA a été amplifiée et a généré des valeurs CT audessous des seuils CT pour les réactions 12CYS, 12SER et 12VAL. La mutation 12VAL a été amplifiée et a généré une valeur CT au-dessous du seuil CT pour la réaction 12ALA. Toutefois, dans tous les cas, les résultats démontrent que la mutation correcte a été détectée avec la réaction de mutation correspondante (la valeur CT la plus faible représentait la détection de mutation correcte). Dans tous les autres cas de tests, les mutations n étaient pas détectées ou se situaient en dehors du seuil CT. Tableau 25. Réactivité croisée de CT entre les réactions de mutation au moyen d ADN de lignées cellulaires FFPE dans l intervalle d entrée élevé* Seuil 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 12ALA 8 1,42 12,66 5,81 2,78 6,31 13,21 12ASP 6,6 12,56 2,42 13,44 11,21 13,55 ADN mutant 12ARG 8 13,12 11,56 1,12 11,42 13,43 12,66 12CYS 8 14,2 12,48 9,23 0,98 7,96 12,88 12SER 8 13,39 13,31 3,02 12,99 13,97 12VAL 7,5 6,83 13,38 0,28 13,74 13ASP 7,5 13,29 13,89 14,36 4,5 * Les valeurs C T des réactions correspondantes sont indiquées en gras. Les cellules vierges indiquent l absence de réaction croisée. Les valeurs C T des réactions croisées au-dessous du seuil sont en surbrillance. Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

68 Répétabilité et reproductibilité La précision du kit therascreen KRAS RGQ PCR a été déterminée à l aide d un protocole intégrant les aspects des normes CLSI EP12-A et EP5-A2. Des échantillons cliniques de CRC ont été utilisés pour cette évaluation. Un ADN de type sauvage et un échantillon pour chaque mutation ont été testés avec le kit therascreen KRAS RGQ PCR : deux opérateurs travaillant sur chacun des 3 sites ont testé tous les échantillons et les témoins sur trois lots de kits therascreen KRAS RGQ PCR, chaque jour pendant cinq jours, à raison de deux analyses par jour avec deux réplicats par échantillon pour chaque analyse. Les valeurs CT et CT obtenues pour chaque réaction dans chaque échantillon ont également été évaluées par une analyse de composante de variance. Des échantillons mutants de faible niveau (3 x LoD) et des échantillons de type sauvage ont permis de mettre en évidence la reproductibilité du kit therascreen KRAS RGQ PCR, avec au moins 39/40 détections de mutation correctes, dans chacun des tests avec de multiples lots, instruments et opérateurs, tant au cours des expériences de laboratoire qu entre celles-ci. Des estimations de variance démontrées (équivalant à une fois l écart type), à l aide d échantillons C50 et 3xLoD, sont présentées dans les tableaux 26 et 27. Tableau 26. Estimations de la précision de la reproductibilité %CV pour CT %CV pour CT mutant %CV pour CT témoin Test 3xLoD C50 3xLoD C50 3xLoD C50 Type sauvage 12ALA 13,14 8,32 1,87 2,02 0,97 1,12 1,12 12ASP 12,86 5,87 1,11 1,00 0,90 0,90 1,04 12ARG 10,79 8,04 1,59 1,96 1,24 1,51 1,15 12CYS 17,61 10,83 1,86 2,02 1,54 1,22 1,15 12SER 13,97 10,43 1,71 2,11 0,94 1,19 1,15 12VAL 9,66 15,47 1,52 1,65 1,11 3,74 1,26 13ASP 13,73 9,35 1,91 2,08 1,11 1,41 1,19 68 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

69 Tableau 27. Estimations de la précision de la répétabilité %CV pour CT %CV pour CT mutant %CV pour CT témoin Test 3xLoD C50 3xLoD C50 3xLoD C50 Type sauvage 12ALA 10,71 7,51 1,69 1,76 0,77 0,90 0,79 12ASP 10,16 4,08 0,93 0,89 0,80 0,76 0,76 12ARG 9,83 8,04 1,21 1,76 0,84 1,33 0,90 12CYS 13,15 8,80 1,31 1,76 1,40 1,01 0,76 12SER 6,76 6,18 1,10 1,48 0,80 0,90 0,90 12VAL 9,21 15,32 1,40 1,42 0,91 3,49 0,94 13ASP 8,67 7,01 1,30 1,65 0,91 1,19 0,97 La proportion estimée d échantillons 3xLoD testant les échantillons mutants et de type sauvage a été rapportée de manière générale et pour chacun des sites. Pour tous les tests et toutes les combinaisons d échantillons, au moins 79 réplicats sur 80 ont présenté la détection de mutation correcte. La proportion globale de détections correctes était de 99,6 % (1 115/1 120) ; 99,6 % (558/560) pour les échantillons positifs à la mutation (3xLoD) et 99,5 % (557/560) pour les échantillons n ayant pas présenté de détection de mutation (type sauvage) (voir tableau 28, page 69). Tableau 28. Détections correctes dans l ensemble Mutation 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP Échantillons 3xLoD Total 79/80 80/80 80/80 79/80 80/80 80/80 80/80 Échantillons de type sauvage (faible) Total 80/80 80/80 79/80 80/80 79/80 79/80 80/80 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

70 Variabilité liée à la manipulation des échantillons Afin d évaluer la variabilité liée à la manipulation des échantillons dans le cadre du processus de test par le kit therascreen KRAS RGQ PCR, 30 coupes séquentielles de 5 µm ont été prélevées sur chacun des 10 échantillons FFPE de CRC (3 de type sauvage et 1 par mutation). Les coupes ont été randomisées dans l un des trois sites de test de telle sorte que chaque site a reçu 10 coupes par échantillon FFPE (100 coupes au total). Sur les 300 extractions d ADN testées, 298 échantillons étaient valides. La concordance des détections de mutation KRAS entre les trois sites s élevait à 99,33 %. La variance des valeurs CT de chaque test a été estimée, et la contribution des sources inter- et intralaboratoires a été estimée à l aide d un modèle de composante de variance ANOVA. La variance des sites dans les tests était le plus élevée pour 12ASP (0,30). La variance des sites entre les tests était le plus élevée pour 12SER (0,05). Une comparaison par site des valeurs CT moyennes avec l écart type correspondant pour les échantillons mutants et de type sauvage a révélé une très nette concordance des résultats (voir tableaux 29 et 30). Les résultats révèlent la concordance de la procédure d extraction de l ADN et du traitement des échantillons conjointement avec le kit therascreen KRAS RGQ PCR. Tableau 29. Comparaison par site des valeurs CT moyennes (écart type) pour les échantillons de type mutant Site 1 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 2,44 (0,1) 3,03 (0,6) 2,62 (0,3) 2,24 (0,1) 2,34 (0,3) 2,51 (0,1) 3,93 (0,4) Site 2 2,44 (0,2) 3,01 (0,7) 2,52 (0,4) 2,29 (0,2) 2,10 (0,4) 2,44 (0,5) 4,15 (0,7) Site 3 2,67 (0,6) 3,07 (0,5) 2,52 (0,2) 2,29 (0,2) 2,74 (0,5) 2,56 (0,2) 3,95 (0,3) 70 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

71 Tableau 30. Comparaison par site des valeurs CT moyennes (écart type) pour les échantillons de type sauvage Site 1 12ALA 12ASP 12ARG 12CYS 12SER 12VAL 13ASP 12,46 (0,3) 10,37 (0,4) 11,84 (0,4) 12,36 (0,5) 11,11 (0,6) Site 2 12,09 (0,6) 10,17 (0,5) 13,07 (0,2) 11,71 (0,7) 12,20 (0,6) 11,00 (0,9) Site 3 12,07 (0,2) 10,61 (0,4) 11,94 (0,3) 12,28 (0,6) 11,82 (0,5) Remarque : indique une valeur manquante en raison d une absence de percée. Interchangeabilité des lots Le potentiel de variabilité d un lot à l autre et son effet sur la détection de mutations a été évalué. Dans cette étude, trois lots de kits QIAamp DSP DNA FFPE Tissue et therascreen KRAS RGQ PCR ont été évalués avec chacun des lots du kit d extraction FFPE. L ADN a été extrait de lignées cellulaires fixées au formaldéhyde et incluses en paraffine au moyen de 3 lots du kit d extraction FFPE afin d obtenir des échantillons d ADN présentant des valeurs CT témoin cibles d environ 23, 26 et 31. Ces valeurs CT ont été sélectionnées pour couvrir la plage de fonctionnement définie de niveau total d entrée d ADN pour le kit therascreen KRAS RGQ PCR (CT témoin entre 21,92 et 32,00). Six extractions de réplicats à chacune des valeurs CT cibles ont été testées par chacun des 3 lots de kit therascreen KRAS RGQ PCR indépendants. Les valeurs CT et les détections de mutations ont été rassemblées pour tous les échantillons de test. Les objectifs prédéfinis de l étude ont été remplis, la détection de mutation correcte ayant été observée dans 100 % des tests valides, confirmant ainsi que la détection de mutations d échantillons n était pas affectée par l utilisation de différents lots de kits d extraction FFPE et/ou de kits therascreen KRAS RGQ PCR. Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

72 Références 1. Hilger, R.A., Scheulen, M.E., Strumberg, D. (2002) The Ras-Raf-MEK-ERK pathway in the treatment of cancer. Onkologie 25, Bachireddy, P., Bendapudi, P.K., Felsher, D.W. (2005) Getting at MYC through RAS. Clin Cancer Res. 11, Han, S.-W. et al. (2006) Optimization of patient selection for gefitinib in non-small cell lung cancer by combined analysis of epidermal growth factor receptor mutation, K-ras mutation, and AKT phosphorylation. Clin Cancer Res. 12, Pao, W. et al. (2005) KRAS mutations and primary resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib. PloS Medicine 2, Lievre, A. et al. (2006) KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66, Benvenuti, S. et al. (2007) Oncogenic activation of the RAS/RAF signaling pathway impairs the response of metastatic colorectal cancers to anti-epidermal growth factor receptor antibody therapies. Cancer Res. 67, De Roock, W. et al. (2007) KRAS mutations preclude tumor shrinkage of colorectal cancers treated with cetuximab. J Clin Oncol. 25, Finocchiaro, G. et al. (2007) EGFR, HER2, and Kras as predictive factors for cetuximab sensitivity in colorectal cancer. J Clin Oncol. 25, Di Fiore, F. et al. (2007) Clinical relevance of KRAS mutation detection in metastatic colorectal cancer treated by cetuximab plus chemotherapybr. J. Cancer 96, Khambata-Ford, S. et al. (2007) Expression of Epiregulin and Amphiregulin and K-ras mutation status predict disease control in metastatic colorectal cancer patients treated with cetuximab. J Clin Oncol. 25, Lièvre, A. et al. (2006) KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer. Cancer Res. 66, Lièvre, A. et al. (2008) KRAS mutations as an independent prognostic factor in patients with advanced colorectal cancer treated with cetuximab. J Clin Oncol. 26, Bokemeyer, C. et al., (2008) K-RAS status and efficacy of first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mcrc) with FOLFOX with or without cetuximab: The OPUS experience. J Clin Oncol. 26 (May 20 suppl; abstr 4000). 14. Van Cutsem, E. et al. (2008) K-RAS status and efficacy in the first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mcrc) treated with FOLFIRI with or without cetuximab: The CRYSTAL experience. J Clin Oncol. 26, (May 20 suppl; abstr 2). 15. Tejpar, S. et al. (2008) Relationship of efficacy with K-RAS status (wild type versus mutant) in patients with irinotecan-refractory metastatic colorectal cancer (mcrc), treated with irinotecan (q2w) and escalating doses of cetuximab (q1w): The EVEREST experience (preliminary data). J Clin Oncol. 26, (May 20 suppl; abstr 4001). 16. Karapetis, C. et al. (2008). KRAS mutation status is a predictive biomarker for cetuximab benefit in the treatment of advanced colorectal cancer. Results from NCIC CTG CO.17: A phase III trial of cetuximab versus best supportive care.10th World Congress on Gastrointestinal Cancer, June 25-28, Abstract o Amado, R.G. (2008) Wild-type KRAS is required for panitumumab efficacy in patients with metastatic colorectal cancer. J Clin Oncol. 26, De Roock, W. et al. (2007) KRAS wild-type state predicts survival and is associated to early radiological response in metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. Ann. Oncol. 19, Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

73 19. Thelwell, N. et al. (2000) Mode of action and application of Scorpion primers to mutation detection. Nucleic Acids Res. 28, Newton, C. R. et al. (1989) Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucleic Acids Res. 17, Whitcombe, D. et al. (1999) Detection of PCR products using self-probing amplicons and fluorescence. Nature Biotech 17, Catalog of Somatic Mutations in Cancer ( Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

74 Symboles Les symboles suivants peuvent apparaître sur l emballage et l étiquetage : <24> Contient suffisamment de réactifs pour 24 réactions À utiliser avant Numéro de référence Numéro de lot Numéro de matériel Composants Contient Rn Code article international (GTIN) R indique qu'il s agit d une révision des instructions d utilisation (manuel) et n indique le numéro de révision Limite de température Fabricant Consulter les instructions d utilisation Conserver à l abri des rayons du soleil Coordonnées Pour obtenir une assistance technique et plus d informations, prière de consulter notre Centre d assistance technique à l adresse ou d appeler l un des services techniques de QIAGEN ou l un des distributeurs locaux (voir quatrième de couverture ou le site 74 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

75 Annexe : Installation du logiciel therascreen KRAS Assay Package Le kit therascreen KRAS RGQ PCR est conçu pour une utilisation avec l instrument Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM avec un rotor à 72 puits. Le logiciel therascreen KRAS Assay Package est disponible séparément sur CD (QIAGEN, n réf ). Il comprend le modèle «therascreen KRAS QC Locked Template» et le modèle «therascreen KRAS Locked Template». Le CD comprend également des plans de plaques imprimables pouvant être utilisés pour enregistrer les expériences et les modèles d analyse définissant les protocoles de PCR pour la préparation des échantillons FFPE à l aide du kit QIAamp DSP DNA FFPE Tissue, l évaluation des échantillons d ADN à l aide du kit therascreen KRAS RGQ PCR et la détection des mutations KRAS à l aide du kit therascreen KRAS RGQ PCR. Remarque : le logiciel therascreen KRAS Assay Package ne fonctionne qu avec le logiciel Rotor-Gene Q version 2.3 ou supérieure. Vérifier que la bonne version du logiciel Rotor-Gene Q est installée avant de poursuivre l installation du logiciel therascreen KRAS Assay Package. Procédure 1. Commander le CD CE du logiciel therascreen KRAS RGQ Assay Package (QIAGEN, n réf ), disponible séparément chez QIAGEN. 2. Insérer le CD dans le lecteur de l ordinateur portable connecté à l instrument Rotor-Gene Q. 3. Démarrer l installation en double-cliquant sur le fichier therascreen_kras_assay_package_3.0.exe. Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

76 4. L assistant d installation s affiche. Cliquer sur «Next» (suivant) pour continuer (figure 21). Figure 21. Boîte de dialogue «Setup» (installation). 1 = «Next» (suivant). 5. Lire l accord de licence dans la boîte de dialogue «License Agreement» et accepter l accord en cochant la case «I accept the agreement». Cliquer sur «Next» (suivant) pour continuer (figure 22). Figure 22. Boîte de dialogue «License Agreeement» (Accord de licence). 1 = case «I accept the agreement» (j accepte l accord), 2 = bouton «Next» (suivant). 76 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

77 6. L installation par défaut démarre automatiquement et une boîte de dialogue «Setup» (installation) s affiche à la fin. Cliquer sur «Finish» (terminer) pour quitter l assistant d installation (figure 23). Figure 23. Fin de l installation. 1 = «Finish» (terminer). 7. Redémarrer l ordinateur. Les raccourcis des modèles «therascreen KRAS QC Locked Template» et «therascreen KRAS Locked Template» s affichent automatiquement sur le bureau. Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

78 Pour commander Produit Contenu N réf. therascreen KRAS RGQ PCR Kit (24) Pour 24 réactions : 1 test témoin, 7 tests de mutation, témoin positif, eau, Taq ADN polymérase therascreen KRAS Assay Package CD Package de protocole logiciel destiné à une utilisation avec le kit therascreen KRAS RGQ PCR et l instrument QIAGEN Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM avec un rotor à 72 puits Rotor-Gene Q et ses accessoires Rotor-Gene Q MDx 5plex HRM Platform Instrument de PCR en temps réel et analyseur de fusion haute résolution à 5 canaux (vert, jaune, orange, rouge, pourpre) plus canal HRM, ordinateur portable, logiciel, accessoires, garantie 1 an pièces et main-d œuvre, installation et formation non comprises Loading Block 72 x 0.1 ml Tubes Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (250) Strip Tubes and Caps, 0.1 ml (2500) Bloc en aluminium pour préparation de réaction manuelle avec pipette à canal unique dans des tubes de 72 x 0,1 ml 250 barrettes de 4 tubes et capuchons pour réactions 10 x 250 barrettes de 4 tubes et capuchons pour réactions Kit QIAamp DSP DNA FFPE Tissue pour la purification d ADN génomique des tissus inclus en paraffine QIAamp DSP DNA FFPE Tissue Kit (50) Pour 50 préparations d ADN : colonnes QIAamp MinElute, protéinase K, tampons et tubes de prélèvement (2 ml) Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

79 Cette page est intentionnellement laissée vierge Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/

80 Marques déposées : QIAGEN, QIAamp, QIAcube,MinElute, Rotor-Gene, Scorpions, therascreen (QIAGEN Group); FAM, HEX (Thermo Fisher Scientific Inc.). Ne doit pas être utilisé avec des échantillons de selles. Ne doit pas être utilisé avec des échantillons d urine. Ne doit pas être utilisé avec de l acide nucléique extracellulaire provenant d échantillons sanguins. Ne doit pas être utilisé avec des échantillons de moelle osseuse acellulaire. Ne doit pas être utilisé avec des échantillons de salive. L ACHAT DE CE PRODUIT CONFÈRE À L ACHETEUR DES DROITS SELON CERTAINS BREVETS ROCHE, POUR UNE UTILISATION RÉSERVÉE AUX SERVICES DE DIAGNOSTIC IN VITRO HUMAIN. AUCUN BREVET GÉNÉRAL OU AUCUNE LICENCE DE QUELQUE TYPE QUE CE SOIT, HORMIS LE DROIT SPÉCIFIQUE D UTILISATION CONFÉRÉ PAR CET ACHAT, N EST OCTROYÉ PAR LA PRÉSENTE. Accord de licence limitée En utilisant ce produit, l acheteur ou l utilisateur du kit therascreen KRAS RGQ PCR accepte les conditions suivantes : 1. Le kit therascreen KRAS RGQ PCR doit être utilisé conformément aux Instructions d utilisation du kit therascreen KRAS RGQ PCR (manuel) et uniquement avec les composants fournis à l intérieur du kit therascreen KRAS RGQ PCR. QIAGEN n accorde aucune licence de propriété intellectuelle pour utiliser ou intégrer les composants fournis dans ce kit avec tout autre composant non fourni dans ce kit therascreen KRAS RGQ PCR, à l exception des indications figurant dans les Instructions d utilisation du kit therascreen KRAS RGQ PCR (manuel) et dans d autres protocoles disponibles sur le site 2. En dehors des licences énoncées expressément, QIAGEN ne garantit aucunement que le kit therascreen KRAS RGQ PCR et/ou son ou ses utilisations ne violent pas les droits de tiers. 3. Ce kit therascreen KRAS RGQ PCR et ses composants sont octroyés sous licence pour une utilisation unique et ne peuvent pas être réutilisés, remis à neuf ou revendus. 4. QIAGEN rejette notamment toutes les autres licences, expresses ou tacites, autres que celles énoncées expressément. 5. L acheteur et l utilisateur du kit therascreen KRAS RGQ PCR consentent à ne pas prendre, ni autoriser quiconque à prendre, de quelconques mesures pouvant entraîner ou faciliter la réalisation d actes interdits par les termes précédents. QIAGEN est susceptible de faire appliquer les interdictions de cet Accord de licence limitée par tout tribunal et pourra recouvrer tous ses frais de recherche et de justice, y compris les frais d avocats, en cas d action en application du présent Accord de licence limitée ou de tous ses droits de propriété intellectuelle liés au kit therascreen KRAS RGQ PCR et/ou à ses composants. Pour consulter les mises à jour de la licence, voir QIAGEN, tous droits réservés. 80 Manuel du kit therascreen KRAS RGQ PCR 12/2016

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82 Canada FR /2016 Sample & Assay Technologies