Méthodes d exploration de la cellule (T.Montier)

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1 Méthodes d exploration de la cellule (T.Montier)

2 SOMMAIRE 1. Microscopie électronique 2. Isolement cellulaire 3. Exploration cellulaire

3 LA MICROSCOPIE Etude structure et ultrastructure cellulaire Deux types: - photonique (photons) : lumière blanche, épifluorescence etconfocal - électronique (électrons) : transmission ou balayage

4 Rappel : résolutions et ordres de grandeur Limite de résolution pouvoir du microscope MO : 0,2 µm ME : 2 nm pour coupes biologiques (0,2nm en conditions optimales) FACTEUR 100 ENTRE ME ET MO Ordres de grandeur (*) Atomes 0,2nm = 2 Å Virus 100nm Cellule eucaryote 10 à30nm Bactérie 1µm Mitochondrie 1µm

5 MICROSCOPIE ELECTRONIQUE Faisceau d ELECTRONS Si vitesse électrons, λ Objets très petits Préparation spéciale Images détaillées ou représentations 3D

6 1) Microscopie électronique à transmission MET Grossissement 1500 à x Résolution 2nm (20Å) / 0,2nm (2Å) Faisceau d électrons traverse (****) échantillon contrasté par dépôt métallique -> agrandissement par photoaimants -> image formée sur écran fluo ou sur film photo

7 Préparations des échantillons en MET 1. Prélèvement et fixation Glutaraldéhyde (P) / Tetroxyde osmium (L) 2. Inclusion Araldite (et non pas paraffine) 3. Coupe Ultra microtome 4. Coloration Agents de contraste = sels de métaux lourds (plomb et uranium) Autres applications : cytochimie (ex des sucres), immunologie (marquage à l or), autoradiographie

8 Méthode d ombrage et répliques Fine couche de métal lourd vaporisée (platine) = OMBRAGE Film de carbone pour consolider la réplique Matériel cellulaire dissous => REPLIQUE

9 2) Microscopie électronique à balayage MEB Grossissement : 20 à x Résolution : 10nm **** Technique privilégiée d observation des surfaces (reliefs et formes) **** Electrons réfléchis sur l objet puis détectés

10 Préparation des échantillons en MEB Dessiccation sans rétraction puis dépôt d or Fixation Glutaraldéhyde Déshydratation Acétone Métallisation Or, Platine

11 Section de flagelle en microscopie à TRANSMISSION Globules rouges en microscopie à BALAYAGE

12 MET PAR CRYOFRACTURE Congélation des cellules (-196 C) Séparation hémicouches membrane cellulaire Ombrage/réplique sur chaque hémicouche => Visualisation particules intramembranaires => Etude ultrastructure composants cellulaires (organites et macromolec)

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14 METHODES D ISOLEMENT DES CELLULES Isolement à partir des tissus Cultures cellulaires Clonage cellulaire

15 1) Isolement à partir d un tissu Etapes communes à toutes les méthodes: - dissociation mécanique des tissus - dissociation enzymatique => cellules isolées - identification Différentes méthodes d identification - basées sur des différences de propriétés physiques centrifugation sur gradient de densité, cytométrie en flux - basées sur la reconnaissance spécifique d Ac Ac spécifique couplé à un support, couplé à colorant fluo - Microdissection LASER

16 Méthodes basées sur propriétés physiques Centrifugation sur gradient de densité Séparation des cellules selon leur DENSITE plasma < leucocytes et plaquettes < Ficoll < granulocytes et hématies

17 Méthodes basées sur propriétés physiques Cytométrie en flux (FACS) Séparation des cellules selon leurs propriétés optiques (utilisation liquides vecteurs et faisceau LASER) Analyse individuelle, tri cellulaire, complexité interne Rapidité AVANTAGES Applicable aux C vivantes Haut débit (milliers/min) Plusieurs paramètres étudiés Marquages multiples C peuvent être remises en culture Applications: -Etude cycle cellulaire (quantification ADN) -Isolement de sous pop s -Quantification et répartitions des sous pop s

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19 Méthodes basées sur reconnaissance spécifique d Ac Ac spécifiques couplés à un support Ac reconnaît la C d intérêt et s y fixe Ac fixé sur support => C adhère indirectement support -> Regroupement des C d intérêt sur un support Ac spécifiques couplés à un colorant fluorescent Ac marqué reconnaît C d intérêt et la fixe -> Repérer les C d intérêt grâce à la fluorescence

20 Microdissection LASER Prélèvement de qq C dans une coupe de tissu Permet étude d un seul type cellulaire

21 2) Cultures cellulaires = Maintien in vitro de C vivantes pendant une durée variable Milieux de culture classiques (sb nutritives de base, suppléments pr divisions) OU Milieux chimiquement définis sans sérum Stérilité 37 C CO2 (5%) Incubateur Hotte

22 Définitions Culture primaire Cellules provenant directement du tissu Culture secondaire = repiquage Utilisation des C issues de la culture primaire pour reproduire d autres cultures

23 Comportement des C in vitro C expriment les ppiétés de leur tissu d origine (****) C normales : - contrôle prolifération Caire (taille, environnement, ADN) - nb limité de divisions (perte de nucléotide à chaque ) C cancéreuses - ø de contrôle de la prolifération - immortalité en culture (ø perte nucléotides) - in vivo tumeurs

24 Utilité de la culture cellulaire Obtenir des C en grand nombre Etudier influence milieu et interactions Caires Possibilité obtention colonie provenant d 1 seule C => COMPOSITION GENETIQUE HOMOGENE

25 3) Clonage cellulaire Réalisé à partir d une C primitive unique => UNIFORMITE GENETIQUE Production d Ac monoclonaux Clonage de mammifères

26 Production d Ac monoclonaux Intérêt médical : biologie, imagerie, thérapeutique Ac monoclonal = fusion de plasmocytome de souris et C sécrétrice d Ac (LB)

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28 Clonage de mammifères Intérêt : reproduction

29 EXPLORATION MOLECULAIRE Fractionnement subcaire -homogénéisation -centrifugation et ultracentrifugation Analyse Caire des Ac. Nucléiques -hybridation des ac. Nucléiques -technique d analyse de l ADN, des ARN et protéines

30 1) Fractionnement subcaire Homogénéisation = rupture de la MP (choc osmotique, ultrasons ou choc mécanique) Centrifugation Constituants de grande taille sédimentent en 1 er (noyau>mt/lysosome/peroxysome>re fragmenté>ribosomes/virus) Ultracentrifugation avec sédimentat à l equilibre Séparation «finale» des organites

31 Ultracentrifugation Lyse Caire (broyage, ultra-sons, choc osmotique) Dépôt du lysat sur gradient de sucrose Centrifugation à très haute vitesse Séparation des différentes structures selon densité

32 Notion de coefficient de sédimentation vitesse à laquelle le cstituant sédimente Traduite par loi de Stockes, et exprimée en Unité Svedberg (S) (unité non additive ****) Caractéristique de la taille et de la forme du constituant

33 2) Analyse Caire des acides nucléiques Hybridation des Ac. Nucléiques -Hybridation in situ -FISH Techniques d analyse Southern/Northern/Western Chromatographie Electrophorèse Séquençage des protéines