SEROLOGIE NON INFECTIEUSE AAN Résultats questionnaire EASI Recommandations du comité d experts

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1 SERVICE PUBLIC FEDERAL, SANTE PUBLIQUE, SECURITE DE LA CHAINE ALIMENTAIRE ET ENVIRONNEMENT COMMISSION DE BIOLOGIE CLINIQUE SERVICE DES LABORATOIRES DE BIOLOGIE CLINIQUE COMITE DES EXPERTS RAPPORT GLOBAL EVALUATION EXTERNE DE LA QUALITE DES ANALYSES EN BIOLOGIE CLINIQUE SEROLOGIE NON INFECTIEUSE AAN Résultats questionnaire EASI Recommandations du comité d experts ENQUETE 2010/3 ISP-10/3/Sérologie non infectieuse/14 Service Biologie Clinique Rue J. Wytsman, Bruxelles Belgique

2 ISSN: COMITE DES EXPERTS tél. fax ISP Secrétariat : 02/ / Dr. Van Blerk : Coordinateur : 02/ : mvanblerk@wiv-isp.be Dr. Van Campenhout: Coordinateur : 02/ : cvancampenhout@wiv-isp.be Dr. BOSSUYT X. : 016/ / : xavier.bossuyt@uz.kuleuven.ac.be Dr. HUMBEL R. : 352/ / : rlhumbel@llip.lu Dr. MEWIS A. : 011/ / : alex.mewis@jessazh.be Dr. SERVAIS G. : 02/ / : genevieve.servais@chu-brugmann.be Dr. TOMASI J.P. : 02/ / : tomasi@mblg.ucl.ac.be Dr. VERCAMMEN M. : 02/ : Martine.vercammen@uzbrussel.be Tous les rapports sont également consultables sur notre site web: Institut Scientifique de Santé Publique Wetenschappelijk Instituut Volksgezondheid, Bruxelles Ce rapport ne peut pas être reproduit, publié ou distribué sans l accord de l ISP. Sérologie non infectieuse, rapport global 2010/3. Date d impression: 04/03/ /12

3 Echantillon Un échantillon (SN/6467) a été envoyé provenant d une plasmaphérèse thérapeutique chez une patiente atteinte d un syndrome de CREST. Nous remercions le Prof. Tomasi (Cliniques universitaires Saint Luc - Bruxelles) de nous avoir fourni cet échantillon. Participation Un laboratoire luxembourgeois et 128 laboratoires belges ont participé à cette enquête. Résultats des participants Immunofluorescence indirecte (IFI) sur cellules HEp-2(000) 126 laboratoires (97.7%) ont effectué la recherche des AAN par immunofluorescence indirecte. Le tableau suivant donne un aperçu de leurs résultats: Noyau (aspect) Cytoplasme Nombre Centromère Négatif ou non mentionné 105 Centromère + moucheté Négatif ou non mentionné 5 Centromère + membrane (nucléaire) (?) Négatif ou non mentionné 3 Centromère + mitose positif Négatif 2 Centromère + dots Négatif 1 Centromère + homogène Négatif 1 Centromère Membrane 1 Centromère Faiblement moucheté 1 Centromère Positif 1 Centromère ou moucheté diffus Négatif 1 Moucheté Négatif 1 Positif (pas de différentiation noyau/cytoplasme) 1 Négatif ou non mentionné Centromère 2 Trois laboratoires ont utilisé une technique ELISA ou FEIA pour la recherche des AAN. Tous ces laboratoires ont obtenu un résultat positif. Sérologie non infectieuse, rapport global 2010/3. Date d impression: 04/03/ /12

4 Cinq laboratoires ont interprété l image par immunofluorescence des AAN de façon incomplète ou incorrecte : L aspect anti-centromères n est pas reconnu (2, centromère ou moucheté diffus, moucheté) Noyau positif sans aucune description de l aspect (1) L aspect anti-centromères est reconnu mais interprété comme une fluorescence cytoplasmique (2) L image par immunofluorescence est donc correctement interprétée par 83.3% des participants et de façon acceptable par 96.0% des participants. Le tableau suivant reprend les aspects des anticorps obtenus avec les différentes cellules HEp-2(000): Fabricant N Noyau Cytoplasme N Cellules HEp-2 Alphadia 14 Centromère - ou non mentionné 11 Centromère + moucheté Non mentionné 1 Centromère + mitose positif Négatif 1 Centromère ou moucheté diffus Négatif 1 Diasorin ANA fluor 2 Centromère - ou non mentionné 2 Euroimmun 23 Centromère - ou non mentionné 19 Centromère + dots Négatif 1 Centromère + membrane nucl. Négatif 1 Centromère Positif 1 Centromère Faible moucheté 1 Inova 25 Centromère - ou non mentionné 22 Centromère + moucheté - ou non mentionné 2 Centromère + mitose positif Négatif 1 Kallestad 7 Centromère - ou non mentionné 7 Medica 1 Centromère Négatif 1 Menarini Zenit 2 Centromère + homogène Négatif 1 Centromère Membrane 1 Zeus 1 Centromère Négatif 1 Niet vermeld 3 Centromère Négatif 3 Cellules HEp-2000 Immuno Concepts 48 Centromère Négatif 40 Centromère + membrane (?) - ou non mentionné 2 Centromère + moucheté - ou non mentionné 2 Négatif ou non mentionné Centromère 2 Moucheté Négatif 1 Positif (pas de differentiation noyau/cytoplasme) 1 Sérologie non infectieuse, rapport global 2010/3. Date d impression: 04/03/ /12

5 123 laboratoires (97.6%) ont mentionné le titre des anticorps. Le tableau suivant montre les résultats des titres des anticorps pour les différentes cellules Hep-2(000) (aspect anti-centromères): Fabricant N Résultats Cellules HEp-2 Alphadia , 200, 320, 1280 (2), 1280 (4), 2560 (2), >3200, 5120 Diasorin ANA fluor 2 640, Euroimmun 21 >100, >200, 800, 1000, 1280 (2), >1280, 4000, >2560, >5000, 5120 (4), >5120 (3), 8000, (2), Inova (2), 1280 (3), >1280 (3), 2560 (7), 2560 (4), 5120 (5), Kallestad 7 160, 1000, 2560 (3), >2560 (2) Medica Menarini Zenit 2 >640, 1000 Zeus 1 >5000 Niet vermeld 3 >1280, 2560, 5120 Cellules HEp-2000 Immuno Concepts , >640, 1280 (11), >1280 (5), 2560 (14), >2560 (4), 3200, >5000, 5120 (3), (4), >10240, (2) Il est recommandé de titrer les anticorps au moins jusqu à 1/1280. Le graphique ci-dessous montre la distribution globale des titres des AAN (aspect anti-centromères): Pourcentage de laboratoires Titre Sérologie non infectieuse, rapport global 2010/3. Date d impression: 04/03/ /12

6 Les graphiques ci-dessous montrent la distribution des titres pour les cellules HEp-2(000) pour lesquelles il y a au moins 10 utilisateurs (aspect anti-centromères): Pourcentage de laboratoires Alphadia Titre Pourcentage de laboratoires Euroimmun Titre Pourcentage de laboratoires Immunoconcepts Titre Pourcentage de laboratoires Inova Titre Sérologie non infectieuse, rapport global 2010/3. Date d impression: 04/03/ /12

7 Recherche des anticorps anti-ndna/dsdna 42 laboratoires (32.6%) n ont pas effectué la recherche des anticorps anti-ndna/dsdna. 83 laboratoires (64.3%) ont effectué la recherche de ces anticorps; 9 laboratoires ont utilisé 2 techniques et 2 laboratoires 3 techniques. A l exception d un laboratoire (résultat : +/-), ils ont tous obtenu un résultat négatif. 4 laboratoires ont seulement mentionné la technique utilisée, mais sans aucun résultat. Recherche et identification des anticorps anti-ena/aan (pas d IFI) 119 laboratoires (92.2%) ont fait la recherche des anticorps anti-ena/aan avec une ou plusieurs méthodes. 62 d entre eux (52.1%) ont fait la recherche par un test de dépistage et plusieurs en combinaison avec un test d identification. Le tableau suivant donne un aperçu des résultats obtenus avec les tests de dépistage des anti-ena/aan: Fabricant N Résultats N Biorad 1 Positif 1 Chorus 1 Positif 1 Diasorin Liaison 6 Positif 6 Diasorin Etimax 2 Positif 2 Euroimmun 5 Positif 4 Négatif 1 Immuno Concepts 1 Négatif 1* Inova 12 Négatif 12* Phadia EliA 29 Positif 29 Phadia Varelisa 4 Positif 4 The Binding Site 1 Négatif 1* *La trousse utilisée ne permet pas la recherche des anticorps anti-cenp-b Sérologie non infectieuse, rapport global 2010/3. Date d impression: 04/03/ /12

8 Le tableau ci-dessous montre un aperçu des résultats obtenus avec les tests d identification des anti-ena/aan: Méthode N Fabricant N Résultat N ID 2 Immuno Concepts 2 Négatif 2 Dot/LIA 77 Alphadia 19 CENP-A/B 15 CENP-A/B + RNP 1 Négatif 3* BMD 11 CENP-B 11 Euroimmun 37 CENP-B 28 CENP-B +SSB 2 CENP-A en B 2 CENP-B + SSA + SSB 1 CENP-B+Rib.P-prot+/-+nucleos.+/- 1 Négatif 3* Innogenetics 8 CENP-B 7 CENP-B + histones+/- 1 Orgentec 2 CENP-B 1 CENP-B + SSA52 1 ELISA/EIA 29 BioRad 1 Négatif 1* Diasorin 1 CENP-B 1 Immuno Concepts 1 Négatif 1* Inova 2 CENP A/B 2 Phadia EliA 21 CENP-B 19 Négatif 2 1 Phadia Varelisa 3 CENP-B 1 CENP-B + RNP +/- 1 CENP-B + RNP + SSA 1 Immunodiffusion; *La trousse utilisée ne permet pas la recherche des anticorps anti-cenp-b; 1 Le laboratoire n a pas recherché les anticorps anti-cenp-b Les résultats négatifs obtenus par l immunodiffusion sont dus au fait que cette technique permet uniquement la recherche d anticorps dirigés contre des antigènes solubles (CENP-B: insoluble). Conclusion Trois laboratoires n ont pas effectué la recherche des AAN par immunofluorescence, mais ont seulement utilisé un test de dépistage des AAN. Ils ont tous obtenu un résultat positif. Un d entre eux a également identifié les anticorps anti-cenp-b. Un laboratoire a erronément décrit l aspect anti-centromères comme aspect moucheté et il n a pas non plus retrouvé les anticorps anti-centromères avec une autre technique (ELISA Immuno Concepts). Sérologie non infectieuse, rapport global 2010/3. Date d impression: 04/03/ /12

9 Tous les autres laboratoires ont retrouvé les anticorps anti-centromères par au moins une technique. La reconnaissance de l aspect anti-centromères par immunofluorescence indirecte sur des cellules HEp2(000) est cruciale dans le diagnostic des maladies autoimmunes. C est l aspect sur cellules HEp2(000), qui donne avec assez de sécurité l identité des anticorps présents, c'est-à-dire les anticorps anti-centromères. L application des autres techniques (exemple EIA) pour confirmer l aspect, peut donner plus d information. Le biologiste doit toutefois être informé des différents antigènes présents dans les systèmes utilisés que ce soit en dépistage ou en identification. Les résultats négatifs obtenus dans cette enquête (n=22) témoignent qu une partie de ces systèmes ne comportent pas les antigènes adéquats (CENP-A ou CENP-B) pour mettre en évidence la présence des anticorps anti-centromères. Les laboratoires utilisant ces systèmes doivent se rendre compte que la technique d immunofluorescence est la méthode de référence pour rechercher les AAN. Sérologie non infectieuse, rapport global 2010/3. Date d impression: 04/03/ /12

10 Résultats du questionnaire EASI et recommandations du comité d experts Questionnaire Afin d obtenir un aperçu de la politique adoptée par les différents laboratoires par rapport au diagnostic des AAN et des anticorps anti-dsdna et anti-ena en Belgique, chaque laboratoire belge réalisant les tests AAN a reçu en mars 2010 un questionnaire comportant 53 questions à choix multiple, rédigé par l équipe hollandaise EASI (European Autoimmunity Standardisation Initiative). Ce questionnaire, qui a également été distribué dans d autres pays européens, comportait les sujets suivants: organisation du laboratoire, tests AAN, détermination des anticorps anti-dsdna et anti-ena ainsi que les algorithmes de diagnostic. Participants Presque tous les laboratoires (127/130 (97.7%)) ont répondu à ce questionnaire. De l ensemble des participants, 61.7 % travaillent dans un laboratoire hospitalier, 30.5% dans un laboratoire privé et 7.8% dans un laboratoire d un hôpital universitaire. 18.9% des participants ont mentionné posséder une accréditation BELAC pour le laboratoire. Tests AAN A l exception de 3 laboratoires, tous les laboratoires utilisent l immunofluorescence indirecte (IFI) sur cellules HEp2 ou HEp-2000 pour la recherche des AAN. Dans 61.9% de ces laboratoires, les résultats AAN obtenus par IFI sont lus par au moins 2 personnes. Dans la moitié des cas, la lecture se fait par 1 technicien et 1 biologiste. La majorité des participants (66.4%) utilisent une dilution de départ de 1/80. Les autres laboratoires utilisent une dilution de départ de 1/40 (12.8%), 1/160 (12.8%), 1/100 (6.4%) ou 1/200 (1.6%). Titre des AAN Pratiquement tous les laboratoires (94.4%) déterminent le titre des AAN. Seul l un d entre eux ne transmet pas le titre au clinicien. Le tableau suivant donne un aperçu des dilutions finales utilisées par les laboratoires pour titrer les échantillons: Titre Nombre de laboratoires 1/ / Dernière dilution positive 19 1/ / / / / / / / Autre 8 Sérologie non infectieuse, rapport global 2010/3. Date d impression: 04/03/ /12

11 Aspect des AAN Un seul participant n évalue pas l aspect des AAN. Quatre laboratoires déterminent l aspect mais ne le transmettent pas toujours aux cliniciens. Les aspects les plus importants, qui sont distingués par presque tous les laboratoires, sont : homogène (100%), moucheté (100%), centromère (98.4%), nucléolaire (100%) et cytoplasmique (98.4%). De plus, certains laboratoires distinguent aussi d autres aspects (dots nucléaires, membrane nucléaire, matrice nucléaire, PCNA ). Détermination des anticorps anti-dsdna et anti-ena La plupart des laboratoires recherchent aussi les anticorps anti-dsdna (89,1%) et anti-ena (91.3%). Anti-dsDNA Pour la détection des anticorps anti-dsdna, environ la moitié des laboratoires utilisent l ELISA (31.3%) ou le FEIA (16.5%); 16.5% des laboratoires emploient l IFI sur Crithidia luciliae et 15,7% utilisent le dot.16.5% des laboratoires utilisent plus d une méthode. Moins de la moitié des laboratoires transmettent les résultats de la détermination des anticorps anti-dsdna de manière quantitative. Deux laboratoires n emploient pas la même méthode pour le diagnostic et le suivi. Anti-ENA Pour la détection des anticorps anti-ena, 69.4% des laboratoires utilisent un test de dépistage. Pour l identification des anticorps anti-ena, 51.8% des laboratoires utilisent une technique dot (41.1%) ou LIA (10.7%); 31.2% utilisent l ELISA (14.3%) ou le FEIA (17.9%) et 16.1% combinent 2 (13.4%) ou 3 (2.7%) méthodes. 19.3% des laboratoires répondent seule la présence des anticorps anti-ena positifs et non pas tous les anticorps anti-ena typés. La moitié des laboratoires (47.4%) utilisent un système diagnostic qui permet la distinction entre les anticorps anti-ss-a/ro60 et anti-ss-a/ro52. Parmi ces laboratoires, seulement la moitié répond les deux anticorps séparément. Neuf laboratoires (7.8%) emploient un système diagnostic qui permet la distinction entre les anticorps anti-smb et anti-smd. Un de ces laboratoires répond erronément les anti-smb comme des anticorps anti-sm. Urgence Dans moins de 9% des laboratoires, les anticorps AAN, anti-dsdna et anti-ena peuvent être déterminés en urgence. A une exception près, ces participants utilisent pour ce but leur méthode de routine. Algorithme de diagnostic Dans le cas où seulement la détermination des anticorps anti-dsdna ou anti-ena est demandée, 68.9% des laboratoires réalisent automatiquement la recherche des AAN. Environ 90% des participants ne réalisent pas la recherche des anticorps anti-dsdna ou anti-ena si les AAN ne sont pas retrouvés. Environ 80% des laboratoires ajoutent la détermination des anticorps anti-dsdna (78.6%) et anti-ena (80.8%) si les AAN sont retrouvés. 44.8% (pour anti-dsdna) et 35.6% Sérologie non infectieuse, rapport global 2010/3. Date d impression: 04/03/ /12

12 (pour anti-ena) de ces laboratoires ne le font qu en fonction de l aspect et/ou du titre d AAN retrouvé. Une politique visant à déterminer sur une période donnée le nombre maximal de demandes répétées (pour la détermination des AAN, anticorps anti-dsdna ou anti- ENA) est présente dans moins de 7% des laboratoires,. Dans 29.1% des laboratoires, les informations cliniques reprises sur le formulaire de demande ont un impact sur la gestion des tests. Dans 45.7% des laboratoires, un avis clinique accompagne le rapport d analyse. Recommandations du comité d experts 1. L IFI sur cellules HEp-2(000) reste la méthode de référence pour la détermination des AAN. Si on utilise un test basé sur un mélange d antigènes définis pour rechercher les AAN, les limitations de ce test doivent être connues par les cliniciens. 2. En cas de doute, la lecture des résultats AAN obtenus par IFI doit se faire par 2 personnes. 3. Le titrage des AAN est important mais un titrage >1/5000 n a pas de valeur clinique supplémentaire. 4. Un aspect cytoplasmique ou anti-centromères doit toujours être rapporté aux cliniciens. 5. Il est important de mentionner aux cliniciens la technique utilisée pour la détermination des anticorps anti-dsdna. 6. Il n est pas recommandé d utiliser une technique dot pour la détermination des anticorps anti-dsdna. La recherche de ces anticorps sur Crithidia luciliae s avère peu sensible et est difficile à interpréter. 7. Les résultats de la détermination des anticorps anti-dsdna doivent être répondus de manière quantitative. 8. Il est recommandé de typer les anticorps anti-ena pour les ENA les plus fréquents (SSA-A/Ro60, SS-B, Sm, RNP, CENP-B, Scl-70 et Jo-1). 9. Il est recommandé de mentionner les résultats de la détermination des anticorps anti-ena pour TOUS les ENA testés. Si une technique de dépistage est répondue en tant que négative, il faut spécifier quels ENA sont compris dans le test. 10. Si le système diagnostic permet de distinguer les anticorps anti-ss-a/ro60 et anti-ss-a/ro52, les deux résultats doivent être rapportés séparément. 11. La détermination des anticorps anti-sm doit être SmD spécifique. Seuls les anticorps anti-smd peuvent être répondus comme des anticorps anti-sm et non les anti-smb. 12. Si les AAN sont positifs, il est recommandé d ajouter une détermination des anticorps anti-ena ou de suggérer au clinicien de demander cette analyse. 13. En fonction de l aspect des AAN obtenu (au moins pour une image homogène avec mitoses positives ), il est recommandé de rajouter une détermination des anticorps anti-dsdna ou de suggérer au clinicien de demander cette analyse. Sérologie non infectieuse, rapport global 2010/3. Date d impression: 04/03/ /12