Lipoprotein (a) ELISA

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1 Fiche technique Lipoprotein (a) ELISA Test immuno-enzymatique pour le dosage quantitatif du Lipoprotein a [Lp(a)] dans le sérum humain, citrate et plasma EDTA. RE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1. BUT DU TEST Test immuno-enzymatique pour le dosage quantitatif du Lipoprotein a [Lp(a)] dans le sérum humain, citrate et plasma EDTA. 2. SOMMAIRE ET INTRODUCTION La lipoprotéine(a) [Lp(a)] est génétiquement déterminée et constitue un facteur de risque indépendant pour les athéroscléroses. On sait peut de chose sur la fonction physiologique et le métabolisme de Lp(a). La concentration du sérum de cette lipoprotéine peut varier entre 0 et 200 mg/dl. à des concentrations de plus de 30 mg/dl le risque de développement d'une athérosclérose est nettement accru, particulièrement en présence d'une augmentation synchrone du cholestérol LDL. La structure de Lp(a) est dérivée de la structure de la particule LDL. Lp(a) est une particule LDL, qui est lié à l'apolipoproteine (a) haute glycosylatée [apo(a)] par un ou plusieurs ponts disulphide. Des homologies dans les séquences d'apo(a) et dans le plasminogène indiquent une corrélation entre les processus thrombotiques et arthéroschlérotiques. La composition en protéine et en lipide de Lp(a) est caractérisée par une hétérogénéité inter aussi bien qu'intra individuelle. Plus de 30 isoformes ont été caractérisées jusqu'ici. On ne sait pas si cette hétérogénéité influence le risque relatif pour le développement de l'athérosclérose. Contrairement à d'autres lipoprotéines, les concentrations de Lp(a) ne peuvent pas être influencées par des mesures diététiques. Les médicaments abaissant les lipides, qui réduisent la concentration de LDL, n'ont aucun effet sur Lp(a). 3. PRINCIPE DU TEST Lp(a) est un dosage sandwich ELISA en une phase. Les puits du test des bandes de test ELISA sont revêtus d'anticorps anti-apo(a) spécifique polyclonaux. Dans une première phase d'incubation les échantillons dilués sont incubés avec le conjugué (incubation échantillon). Le conjugué est composé par un fragment Fab anti-apo(a) monovalent coupé avec du peroxydase (conjugué peroxydase anti-apo(a)). Durant la période d'incubation les particules Lp(a) sont liées à la phase solide et marqué simultanément par le conjugué. Les composants du sérum non spécifiques et le conjugué non lié sont éliminés par lavage. Dans une deuxième phase d'incubation (réaction substrat) la réaction enzyme s'effectue. La peroxydase fait partie du conjugué et oxyde le tétraméthylbenzidine du substrat (TMB) en une substance colorée en bleu. Pour arrêter la réaction on ajoute de l'acide sulfurique et la couleur devient jaune. L'intensité de la couleur est directement proportionnelle à la concentration Lp(a) dans l'échantillon. La densité optique est mesurée à une longueur d'onde de 450 nm au moyen d'un lecteur ELISA. La concentration Lp(a) dans l'échantillon est quantitativement déterminée à partir de la courbe de référence, qui est exécutée en même temps. 4. PRECAUTIONS D EMPLOI 1. Seulement prévu au diagnostic in-vitro et à l usage professionnel. 2. Lire les instructions complètement et avec attention avant de commencer le test. Utiliser la version valide de la fiche technique incluse dans le kit. S assurer que tout a été bien compris. 3. Dans le cas de dommages importants de l emballage du kit, veuillez contacter IBL ou votre fournisseur sous forme écrite, une semaine au plus tard après avoir reçu le kit. N utilisez pas les composants abîmés pour un test, mettez-les de côté et en sécurité pour les besoins éventuels liés à la plainte. 4. Suivez le numéro du lot et la date de péremption. Ne pas mélanger les réactifs de différents lots. Ne pas utiliser de réactifs périmés. 5. Suivre les bonnes pratiques de laboratoire et les directives de sécurité. Porter des blouses de laboratoire, gants en latex à usage unique et lunettes de protection si nécessaire. 6. Les réactifs de ce kit contiennent du matériel dangereux pouvant irriter les yeux et la peau. Consulter le MATERIEL FOURNI et les étiquettes pour les détails. Les Fiches de Données de Sécurité pour ce produit sont disponibles sur le site internet IBL ou sur demande particulière à IBL. 7. Les réactifs chimiques préparés ou utilisés doivent être traités comme matériel dangereux en accord avec les directives et règlements nationaux de sécurité pour tout matériel à risque. 8. Le personnel de nettoyage doit être formé par des professionnels en ce qui concerne les risques potentiels et la manipulation des produits. 9. Eviter tout contact avec la solution d arrêt. Elle peut provoquer des irritations et brûlures cutanées. Version / 6

3 10. Tous les réactifs de ce kit contenant des sérums ou plasma humains ont été testés et confirmés négatifs à anti-hiv I/II, HbsAg et anti-hcv. Tous les réactifs doivent être considérés comme potentiellement contaminants et utilisés en tant que tel. 5. STOCKAGE ET STABILITE Le kit est envoyé à température ambiante et doit être stocké entre 2 C et 8 C. À conserver à l abri de la chaleur ou de la lumière directe. Le stockage et la stabilité des échantillons et réactifs préparés sont indiqués dans les chapitres correspondants. Les barrettes de la microplaque, le Substrat TMB et le Tampon ouverts mais bien refermés (MTP dans un sachet) sont stables jusqu à 6 mois, stockées à 2-8 C. 6. COLLECTE ET STOCKAGE DES ECHANTILLONS Sérum, Plasma (EDTA, Citrate) Les échantillons doivent être frais. À -20 C ils peuvent être conservés pendant plusieurs mois. Les échantillons ne peuvent pas être congelés/décongelés à plusieurs reprises. Observer les précautions habituelles de prises de sang. Il est important de préserver l intégrité chimique d un échantillon sanguin, de sa collecte jusqu à son analyse. Ne pas utiliser d échantillons fortement hémolysés, ictériques ou lipémiques. Les échantillons d apparence turbide doivent être centrifugés avant analyse pour éliminer toute particule gênante. Noter que: L élévation de la concentration en Ca 2+ et des congélations/décongélations répétées peuvent se traduire par l agrégation de particules de LDL influençant de ce fait les valeurs de Lp(a). 7. MATERIEL FOURNI Quantité Symbole Composant 1 x 12 x 8 MTP 1 x 1.3 ml ENZCONJ LYO 1 x 5 x 0.2 ml CAL 1-5 LYO 1 x 2 x 0.2 ml CONTROL LL LYO CONTROL HL LYO 2 x 100 ml DILBUF CONC 2 x 15 ml TMB SUBS 1 x 15 ml TMB STOP Microplaque Prêt(e) à l emploi. Barrettes sécables. Recouvert de anticorps anti-apo(a) polyclonaux spécifiques purifiés par affinité provenant du mouton.. Conjugué Enzymatique lyophilisé/e Coloré en bleu. Contient: peroxidase anti-apo(a), polyclonaux, spécifiques, monovalents Fab-fragments du mouton. CAL 1-5 lyophilisé/e Contient: Sérum humain, stabilisateurs, conservateurs. Consulter les concentrations exactes sur les étiquettes ou sur le certificat CQ. Control LL+HL lyophilisé/e Contrôle Positif Sérum, LL, Low Level, HL, High Level. Contient: Sérum humain, stabilisateurs, conservateurs. Gammes acceptables sur les étiquettes des flacons ou sur le certificat CQ. Tampon Concentré (10x) Contient: détergents, stabilisateurs, 0.01 % (w/v) Thimerosal, 0.4 M Tris/HCl; ph 8.4. Solution Substrat TMB Prêt(e) à l emploi. Contient: TMB (Tetramethylbenzidine). Solution d Arrêt TMB Prêt(e) à l emploi. Contient: 0.5 M H 2SO 4. 2 x FOIL Feuille Adhésive 8. MATERIEL NECESSITE MAIS NON FOURNI 1. Pipettes (Multipette Eppendorf ou matériel similaire, CV < 3 %) Volumes: 5, 50, 100, 200, 1000 µl 2. Vortex 3. Tubes pour la dilution des échantillons 4. Micropipette à 8-canaux avec réservoirs pour réactifs 5. Bouteille pour lavage, système automatique ou semi-automatique pour le lavage de microplaque 6. Lecteur de microplaque capable de lire l absorbance à 450 nm (longueur d onde de référence nm) 7. Eau bidistillée ou désionisée 8. Papier absorbant, embouts de pipette et chronomètre Version / 6

4 9. NOTES POUR LA PROCEDURE 1. Toute manipulation impropre des échantillons ou modification de la procédure du test peut influencer les résultats. Les volumes indiqués pour pipeter, les temps d incubation, températures et étapes de prétraitement doivent être strictement suivis selon les instructions. N utiliser que des pipettes et appareils calibrés. 2. Une fois que le test a commencé, toutes les étapes doivent être suivies sans interruption. S assurer que les réactifs, matériels et appareils nécessaires soient prêts au moment approprié. Amener tous les réactifs et échantillons à température ambiante (18-25 C) et mélanger doucement en tournant chaque flacon de réactif liquide et d échantillon avant emploi. Mélanger les réactifs sans former de mousse. 3. Eviter toute contamination des réactifs, pipettes et puits/tubes. Utiliser des nouveaux embouts de pipette en plastique pour chaque réactif, étalon ou échantillon. Ne pas interchanger les bouchons. Toujours refermer les flacons non utilisés. Ne pas réutiliser les puits/tubes ou réactifs. 4. Il est recommandé de doser les échantillons en double pour pouvoir identifier d éventuelles erreurs de pipetage. 5. Utiliser un schéma de pipetage pour vérifier la répartition appropriée de la plaque. 6. Le temps d incubation affecte les résultats. Tous les puits doivent être manipulés dans le même ordre et au même intervalle de temps. Il est recommandé d utiliser une micropipette à 8-cannaux pour pipeter une même solution dans tous les puits. 7. Le lavage de la microplaque est important. Des puits mal lavés provoqueront des résultats erronés. Il est recommandé d utiliser une pipette multicanaux ou un système de lavage de microplaque automatique. Ne pas laisser sécher les puits entre les incubations. Ne pas gratter les puits coatés pendant le rinçage ou l aspiration. Rincer et ajouter les réactifs avec précaution. Lors du rinçage, vérifier que tous les puits soient régulièrement remplis avec le tampon de lavage, et qu aucun reste ne soit ensuite visible. 8. L humidité affecte les puits/tubes coatés. Ne pas ouvrir le sachet avant que celui-ci n ait atteint la température ambiante. Les puits/tubes inutilisés doivent être rangés immédiatement dans le sachet refermé avec le dessiccateur. 10. PREPARATIONS PREALABLES AU TEST Préparation des composants concentrés Diluer / dissoudre Composant avec Diluant Relation Remarques Stockage Stabilité 100 ml DILBUF CONC 900 ml eau bidist. 1:10 Mélanger profondement. 2-8 C 2 mois Préparation des composants lyophilisés Diluer / dissoudre 1 flacon Composant avec Diluant Remarques Stockage Stabilité CAL 1-5 Control LL Control HL 200 µl DILBUF 1 flacon ENZCONJ 1.30 ml DILBUF Laisser 15 minutes à température ambiante (18-25 C) et mélanger 10 sec sur un mélangeur d échantillons (éviter la formation de mousse). Après reconstitution les calibrateurs et les sérums de contrôle sont clairs ou légèrement troubles Dilution des Etalons, Contrôles et Echantillons CAL 1-5 Control LL Control HL doit être dilué avec Relation Remarques en général DILBUF 1: C 2 semaines -20 C 6 mois 2-8 C 1 semaine -20 C 6 mois par ex. 5 µl CAL + 10 ml DILBUF par ex. 5 µl Control + 10 ml DILBUF Sérum, Plasma en général DILBUF 1:2001 par ex. 5 µl + 10 ml DILBUF ENZCONJ en général DILBUF 1:11 par ex. 400 µl ENZCONJ + 4 ml DILBUF Stabilité: 60 min (18-25 C). Version / 6

5 11. PROCEDURE DU TEST 1. Pipeter 100 µl de Solution de Conjugué dans chaque puits qui le nécessite, puis pipeter en plus 100 µl des calibrateurs dilués, des contrôles dilués et des échantillons dans les puits respectifs de la plaque de microtitration (Les calibrateurs doivent être placés dans les bandes 1 et 2). 2. Couvrir la plaque avec une feuille adhésive. Incuber 120 min à TA (18-25 C). 3. Retirer la feuille adhésive. Jeter la solution d incubation. Laver la plaque 3 x avec 250 µl de Tampon dilué. Egoutter l excès de solution en frappant la plaque retournée sur du papier absorbant. 4. Utiliser une micropipette à 8 canaux si possible pour l ajout des Solutions Substrat et d Arrêt. Pipeter ces solutions à la même cadence. 5. Pipeter 200 µl de Solution Substrat TMB dans chaque puits. 6. Incuber 30 min à TA (18-25 C). 7. Arrêter la reaction substrat en ajoutant 50 µl de Solution d Arrêt TMB dans chaque puits. Mélanger rapidement le contenu en agitant la plaque. 8. Mesurer la densité optique avec un photomètre à 450 nm (longueur d onde de référence: nm) dans les 10 min suivant l ajout de la Solution d Arrêt. 12. CONTROLE QUALITE Les résultats du test ne sont valides que si le test a été réalisé en suivant les instructions. De plus, l utilisateur doit strictement se conformer aux règles BPL (bonnes pratiques de laboratoire) ou directives comparables. L utilisateur et/ou le laboratoire doivent disposer d un système validé pour établir un diagnostic conformément aux principes de BPL. Tous les étalons et contrôles du kit doivent être trouvés dans les gammes acceptables indiquées sur les étiquettes et dans le certificat de Contrôle Qualité (CQ). Si ces critères ne sont pas remplis, le test est non valide et il doit être répété. Chaque laboratoire devrait utiliser des échantillons connus comme contrôle supplémentaire. Il est recommandé de participer aux programmes de contrôle qualité appropriés. En cas de déviation des résultats, vérifier les origines éventuelles techniques: dates de péremption des réactifs (préparés), conditions de stockage, pipettes, appareils, conditions d incubation et méthodes de lavage. 13. CALCUL DES RESULTATS Les densités optiques (DO) des étalons (axe y, linéaire) sont reportées en fonction de leurs concentrations (axe x, logarithmique) soit sur papier graphique semi-logarithmique soit en utilisant une méthode automatisée. Une bonne analyse est obtenue avec les méthodes cubic spline, Logistics 4 Paramètres ou Logit-Log. Pour le calcul de la courbe étalon, appliquer chaque signal des étalons (une valeur apparemment fausse d un double dosage peut ne pas être prise en compte et peut être remplacée par une valeur plus plausible). La concentration des échantillons peut être lue à partir de la courbe étalon. La dilution initiale a été prise en compte pour pouvoir lire les résultats à partir du graphe. Les résultats des échantillons ayant été davantage dilués doivent être multipliés par le facteur de dilution appliqué. Les échantillons montrant une concentration supérieure à celle de l étalon le plus concentré doivent être dilués de la façon décrite dans les PREPARATIONS PREALABLES AU TEST et testés de nouveau. La conversion de plasma citrate en valeurs sériques se fait en multipliant les concentrations enregistrées par le facteur 1.1. Courbe Etalon Typique (Exemple. Ne pas utiliser pour vos calculs!) (OD) Lipoprotein (a) ELISA Étalon mg/dl DO Moyenne CAL CAL CAL CAL CAL (mg/dl) Version / 6

6 14. INTERPRETATION DES RESULTATS L'interprétation des valeurs obtenues est influencées par des facteurs génétiques (par ex. polymorphisme, différences spécifiques au genre et ethniques) et par la distribution de l'incidence asymétrique des valeurs Lp(a): par ex. la valeur médiane pour les caucasiens tourne autours de 10 mg/dl, pour les chinois de 7 mg/dl, et pour les soudanais autours de 40 mg/dl. Pour les caucasiens un risque de 15-20% de développer des symptômes arthérosclérotiques a été décrit pour des personnes ayant un niveau plasmatique de mg/dl. Les résultats des tests peuvent être interprétés d'après le tableau ci-dessous : Évaluation Lp(a) [mg/dl] Les résultats ne peuvent pas être l unique raison de conséquences thérapeutiques. Ils doivent être corrélés à d autres observations cliniques et tests diagnostiques. gamme normale < 25 Risque élevé / frontière Plage pathologique >35 Il est recommandé que chaque laboratoire établisse ses propres valeurs normales. 15. PERFORMANCE Spécificité Analytique (Réactivité Croisée) Des réactions croisées avec la plasminogène et LDL sont en dessous de la limite de détection. Les anticorps utilisés dans ce test identifient toutes les iso formes connues d'apo(a). Précision Gamme (mg/dl) CV Gamme (%) Intra-Essai Inter-Essai Linéarité Dilution Dosée (mg/dl) Linéarité (%) 1: : : : : : : : : : : : Sensibilité Analytique <5 mg/dl Comparaison de Méthode IBL-ELISA = x LEIA r = Standardisation: Il n'existe aucune méthode établie pour la détermination de Lp(a) et aucune norme établie. Correlation: Les valeurs obtenues avec le Lipoprotein (a) ELISA ont fait apparaître une très bonne corrélation avec les valeurs obtenues par les méthodes turbidimétiques (voir figure 2). 100 Regression Plot 90% Confidence Bands Batch 0115 values found (mg/dl) Expected values (mg/dl) Y = 4, ,052 * X; R^2 =,95 Figure 2: Courbe de corrélation ELISA/LEIA Version / 6

7 16. LITTERATURE DE REFERENCE DU PRODUIT 1. Berg, K.: A new serum type system in man - the Lp system; Acta Pathol. Microbiol. Scand. 59, (1963) 2. Dagen, M.M., Packard, C.J., Shepherd, J.: A comparison of commercial kits for the measurement of lipoprotein(a); Ann. Clin. Biochem. 28, (1991) 3. Dahlen, G.H.: Lipoprotein(a), Atherosclerosis and Thrombosis; Prog. Lipid. Res. 30/2+3, (1991) 4. Dahlen, G.H., Guyton, J.R., Attar, M., Farmer, J.A., Kautz, J.A., Gotto, A.M.: Association of levels of lipoprotein Lp(a), plasma lipids and other lipoproteins with coronary artery disease documented by angiography; Circulation 74, (1986) 5. Eaton, D.L., Fless, G.M., Kohr, W.J., McLean, J.W., Xu, Q-T., Miller, C.G., Lawn, R.M., Scanu, A.M.: Partial amino acid sequence of apolipoprotein(a) shows that it is homologous to plasminogen; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, (1987) 6. Edelberg, J.M., Pizzo, S.V.: Lipoprotein(a): The Link Between Impaired Fibrinolysis and Atherosclerosis; Fibrinolysis 3, (1991) 7. Kostner, G.M.: Immunochemische Bestimmung von Lipoprotein (a); Berichte der ÖGKC, Jg. 15, (1992) 8. Lawn, R.M.: Lipoprotein A und Herzinfarkt; Spektr. Wiss. 78 (08/1992) 9. Rhoads, G.G., Dahlen, G., Berg, K., Horton, N.E., Danneberg, A.L.: Lp(a) lipoprotein as a risk factor for myocardial infarction; JAMA 256, (1986) 10. Scanu, A.M.: Update on lipoprotein(a); Curr. Opin. Lipidol. 2, (1991) 11. Scanu, A.M.: Lipoprotein(a): A Genetic Risk Factor for Premature Coronary Heart Disease; JAMA 267/24, (1992) 12. Scanu, A.M. and Fless G.M.: Lipoprotein (a), heterogeneity and biological relevance; J. Clin. Invest. 85, (1990) 13. Steinmetz, A., Utermann, G.: Lipoprotein(a) als Risikofaktor für Arteriosklerose; Internist 33, (1992) 14. Utermann, G., Menzel, H.J., Kraft, H.G., Duba, H.C., Kemmler, H.G., Seitz, C.: Lp(a) glycoprotein phenotypes: inheritance and relation to Lp(a) concentrations in plasma; J. Clin. Invest. 80, (1987) 15. Utermann, G., Kraft, H.G., Menzel, H.J., Hopferweise, T., Seitz, C.: Genetics of the quantitative Lp(a) lipoprotein trait. I. Relation of Lp(a) glycoprotein phenotypes to Lp(a) lipoprotein concentrations in plasma; Hum. Genet. 78, (1988) Version / 6

8 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /