Journée des doctorants de l Ifremer 14 et 15 Octobre 2009

Transcription

1 Journée des doctorants de l Ifremer 14 et 15 Octobre 2009 Estimation de l origine des contaminations fécales dans l environnement littoral : développement et validation d un marqueur Bacteroidales spécifique des contaminations fécales porcines par PCR en temps réel Sophie Mieszkin 1 *, Jean-Pierre Furet 2, Gérard Corthier 2, Dominique Hervio-Heath 1 et Michèle Gourmelon 1 1 Ifremer (Institut français de recherche pour l exploitation de la mer), centre de Brest, laboratoire de microbiologie EMP, France 2 INRA (Institut national de recherche agronomique), laboratoire UEPSD, Jouy en Josas, France Sophie.mieszkin@ifremer.fr

2 INTRODUCTION 3 sources principales l environnement : de pollutions fécales peuvent affecter Humaine, Porcine, Ruminant : bovine, ovine Classées en 2 groupes : - Pollutions directes : rejets de station d épuration - Pollutions diffuses : épandages, pâturages

3 INTRODUCTION Pollutions fécales d origine porcine sont difficiles à identifier car le plus souvent ce sont des pollutions diffuses Contaminations de l environnement par : Mauvaises pratiques d épandage Débordement accidentel des cuves à lisier L identification des pollutions fécales d origine porcine est importante afin d améliorer la qualité microbiologique des eaux et d apporter des mesures de gestion Actuellement les pollutions fécales sont mises en évidence de la présence de Escherichia coli (E. coli) Cependant E. coli ne discrimine pas l origine humaine ou animale des pollutions fécales

4 INTRODUCTION Besoin de nouvelles cibles pour discriminer les pollutions : Marqueurs chimiques : sterols, stanols, caféine Marqueurs microbiens: bactéries, virus Au laboratoire EMP/MIC : Cible sélectionnée : gènes codant l ARNr 16S des Bacteroidales Technique sélectionnée : PCR en temps réel (Real-Time PCR)

5 OBJECTIFS Développement d un marqueur Bacteroidales spécifique des porcs Etude de sa persistance en microcosmes d eau de rivière Application sur des eaux de l environnement

6 I METHODOLOGIE : développement du marqueur porc Collecte de fèces et d effluents d origine porcine et de fèces d origine humaine et animale Extraction d ADN et amplification par PCR des gènes codant l ARNr 16S des Bacteroidales Clonage et séquençage Fhc 26 Fh c 73 Fbc 24 F hc 21Fhc 4 R44 Fhc 6 3 Fhc 92 Fhc 5167 Fhc Fhc 80 Fh c 83 Fh c 48 Fhc8 Fhc Fhc56 Fh c 20 Fh c 97 Fhc76 Analyse phylogénétique Développement d amorces et sonde spécifiques des Bacteroidales issus du porcs >PigFeces36 AATGCAGCGGCTCAACCGTATGATG >PigFeces85 AGTGCAGCGGCTCAACCGTATGATG >HumanFeces75 AAGTGGGCGGAATTCGTGGTGTAGC >HumanFeces91 AAGTGGGCGGAATTCGTGGTGTAGC

7 II METHODOLOGIE : persistance en microcosmes Marqueur porc 4 C 20 C 4 C 20 C Aérobie Filtration de 50ml d eau de microcosme Dilution de lisier au 100 ème dans de l eau de rivière Microaérophilie Indicateurs classiques de contamination fécale Numération de E. coli et des entérocoques Extraction des ADN PCR temps réel en Entérocoques sur milieu BEA E. coli sur pétrifilm

8 III METHODOLOGIE : Application sur des eaux de l environnement Bassin versant (BV) de Daoulas et sites d échantillonnage 113 km 2 90 km de rivière Activité agricole intensive bovins porcs poulets zones conchylicoles 8 sites sélectionnés (n = 33) : - 3 sites pour leur proximité avec des élevages porcins - 4 sites pour leur proximité avec des élevages bovins - 1 site en aval du bassin versant au niveau de la ville de Daoulas

9 I RESULTATS : validation du marqueur porc Développement d un marqueur Bacteroidales porc : Pig-2-Bac par analyse phylogénétique Pourcentage d échantillons positifs (%) par PCR en temps réel Origine des échantillons Fèces porcine (n=25) Lisiers de porc (n=23) Marqueur Bacteroidales spécifique du porcs (Pig-2-Bac ) Concentrations (log 10 copies / g ou ml) 8,5 ± 06 6,9 ± 07 Selles humaine (n=24) 0 <4,5 Fèces bovine (n=10) 0 <4,5 Fèces ovine (n=10) 0 <4,5 Fèces équine (n=10) 0 <4,5 Marqueur sensible et spécifique

10 II RESULTATS : persistance de Pig-2-Bac en microcosmes Log10 copies / 100 ml Aérobie 4 C Aérobie 20 C Microaérophilie 4 C Microaérophilie 20 C Limite de Quantification 3 Conditions aérobie: Temps (jours) 20 C: diminution de 2,2 unités log en 16 jours avant d atteindre la limite de quantification / à 4 C: diminution de 1,1 unité log en 43 jours Conditions de microaérophilie: 4-20 C : concentrations restent stables au regard de la température Persistance influencée négativement par les conditions de saturation en oxygène et de température élevée

11 III RESULTATS : application sur des eaux de l environnement Pig-2-Bac : Quantifié dans 30,3 % des échantillons d eau (n = 33)» Dans 5 échantillons sur 10 collectés prés d élevages porcins» Dans 3 échantillons sur 8 collectés en aval du bassin versant Le marqueur n a pas été détecté dans les eaux de rivière collectées à proximité d élevages bovins Les concentrations obtenues dans les eaux de rivière variaient de 3,2 à 4,1 log 10 copies / 100ml Le marqueur porc a été détecté et quantifié sur des échantillons d eau de rivière faiblement contaminées, permettant de mettre en évidence la présence de contaminations fécales d origine porcine dans les eaux du bassin versant

12 CONCLUSION Pig-2-Bac est un marqueur sensible et spécifique pour la discrimination des contaminations fécales d origine porcine dans l environnement Quantifié dans des échantillons faiblement contaminés d eau de rivière L étude de sa persistance en microcosme a démontré qu il était important de prendre en compte les variations saisonnières de température et de saturation en O 2 dans les eaux afin d interpréter au mieux les résultats

13 PERSPECTIVES Améliorer la limite de détection de la méthode en ajoutant une étape de concentration des bactéries présentes dans les eaux Rechercher le marqueur dans les coquillages : Améliorer les techniques d extraction d ADN à partir du coquillage Estimer les rendements d extraction Comprendre la persistance de ce marqueur dans le coquillage Appliquer le marqueur à l échelle d un bassin versant pendant 3 années sur des eaux de rivière, des eaux littorales et des coquillages

14 Merci de votre attention!