FishSex. Museum National d Histoire Naturelle MNHN, CNRS Ecologie-Biodiversité, Evolution, Environnement, Paris, France

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1 FishSex Jean-François Baroiller 1, E. Pepey 1, S. Poonlaphdecha 1, C. Ozouf 2, O. Coriton 3, et Helena D Cotta 1, 1 CIRAD, Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour le Développement Aquaculture & Management of Aquatic Resources, Montpellier, France 2 Museum National d Histoire Naturelle MNHN, CNRS Ecologie-Biodiversité, Evolution, Environnement, Paris, France 3 INRA Amélioration des Plantes et Biotechnologies Végétales, Le Rheu, France

2 Grande diversité des mécanismes du déterminisme du sexe chez les Téléostéens Major Genetic Factors sex chromosomes XX/XY or ZZ/ZW Carp Rainbow trout Medaka J flounder Tilapia Sea bass Zebrafish Menidia Minor Genetic Factors Environmental Factors (Temperature, ph, density ) Baroiller, D Cotta & Saillant, 09

3 LE MODELE TILAPIA Une espèce majeure pour l aquaculture (2, t/an) Cichlidae Evolution/Spéciation Aquaculture Oreochromis niloticus Un modèle majeur pour l ordre des Perciformes 1 ère espèce d aquaculture à être séquencée CGC/NIH/Broad Inst. (WGS disponible fin 2009) Moronidae, Sparidae,..

4 Déterminisme du sexe chez les tilapias Analyses cytogénétiques classiques longest bivalent Bezault, Ozouf-Costaz, Rognon & Baroiller n = 44 Absence de chromosomes sexuels différenciés Analyses formelles suivi de sex-ratio de descendances d individus inversés (hormones), 2 groupes d espèces à système mono-factoriel avec des hétérogaméties opposées XX/XY O. niloticus O. mossambicus ZZ/ZW O. aureus O. hornorum Baroiller, J.F., et al., 1996; Bezault, E., et al., 2001

5 Analyse des complexes synaptonémaux chez O. niloticus E. Bezault, C. Ozouf-Costaz, A. D Hont, J.N. Volff, X. Rognon & J.F. Baroiller, 01 Bivalent Foresti et al., 1993 XY Appariement Complet Appariement incomplet Bivalent 1 Gde région terminale Non appariée XX YY XY Carrasco et al., 1999 Paire 1 = Chromosomes sexuels?

6 Une grande paire de chromosomes riche en hétérochromatine & séquences répétées FISH C-Banding Une région riche en hétérochromatine, séq. répétées (rétrotransp )

7 Déterminisme génétique du sexe chez les tilapias 2 groupes d espèces avec des déterminismes monofactoriels du sexe «de type» mammifères ou oiseaux ZZ/ZW O. aureus O. hornorum XX/XY O. niloticus O. mossambicus LG3 Déterminant majeur O. aureus Déterminant mineur O. niloticus LG1 Déterminant majeur O. niloticus Cnaani, Ozouf, Baroiller, D Cotta et al, 08

8 Evolution du Déterminisme du Sexe / Chromosomes sexuels chez les tilapias O. aureus LG3 Large région avec suppression de la recombinaison Différences sexe-spécifique dans le taux de recombinaison Taux plus faibles de recombinaison chez la femelle (ZW) Ces chromosomes ont commencé un processus de différenciation en chromosomes sexuels

9 Evolution du Déterminisme du Sexe / Chromosomes sexuels chez les tilapias pas de suppression des recombinaisons sur le XY O. niloticus pas de différences sex-spécifique ds taux de recombinaison LG1 LG1 LG1 Le système XY chez O. niloticus a évolué relativement récemment Cnaani, Ozouf, Baroiller, D Cotta et al, 08

10 Substitution d une ancienne paire de chromosomes sexuels par une nouvelle paire via le recrutement d un facteur mineur devenant progressivement le déterminant majeur du sexe O. aureus ZZ/ZW O. niloticus XX/XY Vieux chromosome sex Néo chromosome sex LG3 LG1 CYP19A1 clcn5 WT1b SEX DMO =Dmrt4 Cnaani, Ozouf, Baroiller, D Cotta et al, 08

11 Possible évolution du déterminisme du sexe/chromosomes sexuels chez les tilapias Ancêtre ZW LG3 ZZ ZW LG3 LG1 ZW + XY ZW + XY ZW + XY O. aureus LG3 Baroiller et al., 09 XX/XY ZZ/ZW LG3 O. niloticus LG1? XY LG1

12 FishSex: Fish for Genes on the Sex Chromosomes Evolution de 2 paires de chromosomes sexuels: émergence d un nouvelle paire et disparition d un ancien chromosome sexuel Identifier les gènes localisées sur LG1 (p. chrom.) et LG3 (g. chrom.) Chez XX XY et ZW ZZ en utilisant des génotypes ZZ, WW, XX, YY O. niloticus O. aureus Plusieurs stratégies de recherche: PrepISH; hybridation directe d ADNc, sélection directe des chromosomes, et avec les BACs.

13 MEDAKA: Déterminant sexuel dmy (=dmrt1by) Duplication de dmrt1 un gène très en aval de la cascade du déterminisme du sexe XY M Recrutement d un gène de la cascade du déterminisme sexuel et différenciation de ce protoy? Herpin & Schartl, 2009

14 FishSex: Recherche des gènes impliqués dans la cascade du déterminisme du sexe DMY/Dmrt1Y Hypothèse: comme chez les Mammifères, concentration de gènes liés à la fonction mâle sur le chromosome Y d O. niloticus (utilisation de mâles YY)? Recherche équivalente dans le chromosome W (utilisation de femelles WW gynogénétiques) chez O. aureus Utiliser une banque d ADNc normalisée de gonades d alevins femelles et mâles Marqueurs sexuels pour l aquaculture pour la production de populations male

15 1. cdna capture Chromosome microdissection Microdissection GIEMSA DOP-GENES Coloration Metaphase DOP-PCR PCR and cdna library screening XX-DOP YY-DOP ZZ-DOP bp T+ T- L-DOP1 10CH 20CH 1µl 3µl 1µl 3µl L-DOP S-DOP2 32 P DOP-probe 32 P Gonad cdna filter (18432 clones) FISH Analysis Gene analysis cdna Expression Genomic XX, YY, ZZ XY, WW Sequencing

16 DIRECT cdna SELECTION M13F Smart primer PCR of cdnas Smart M13R XY XX XX 36 C 27 C 27 C Gonad cdnas library 2. Prep-ISH (Hozier et al., 1994) Chromosome microdissection mediated cdna capture (Garcia et al., 1996; 2007) Pool cdnas Metaphase Hybridization of cdna onto metaphases 30 Chrom Chromosome microdissection Ligation & Transformation Sequencing

17 DIRECT Gonad cdna library SELECTION 3. Direct cdna selection using chromosomes M13F Smart primer Smart M13R PCR of cdnas DOP XX Metaphase Pool cdnas YY ZZ XX DOP YY DOP ZZ Biotin cdna M M Biotin Streptavidin Hybridization Enrichment LG3 cdnas Gene analysis cdna Expression Genomic XX, YY, ZZ XY, WW FISH Validation of amplification & chromos origin 3x Ligation & Transformation Sequencing

18 DIRECT Gonad cdna library SELECTION 4. Direct cdna selection using BACs (Lahn and Page, 1997) M13F Smart primer Smart M13R PCR of cdnas Biotin BACs from LG1 Biotin BACs from LG3 Pool cdnas YY ZZ XX M M Biotin Streptavidin Hybridization Enrichment LG3 cdnas Gene analysis cdna Expression Genomic XX, YY, ZZ XY, WW FISH Validation of amplification & chromos origin Ligation & Transformation Sequencing

19 Variation méthodologique de l approche 1 (DOP/WGA) Chromosome microdissection LG3 Whole Genomic Amplification (WGA) Microdissection Ctr+ Metaphase DOP-PCR PCR and cdna library screening Gonad cdna filter (18432 clones) BAC filter Gonad cdna filter (18432 clones) cdna filter Size: <10 kb Quantity: 1-10 ng ng bp bp CH 20CH 1µl 3µl 1µl 3µl L-DOP S-DOP2

20 Amplification de gènes présents sur LG3 (Gde paire) Validation des techniques utilisées DOP-PCR PCR Amplification directe sans kit bp 10CH 20CH 1µl 3µl 1µl 3µl Chrom./10 µl L-DOP2 S-DOP2 clcn5 3 PCRs trp1 Dmrt4 - + XX-DOP XX-DOP XX-GenDNA Dmrt4 Clcn5 100bp 200bp 100bp

21 3. Direct cdna selection using chromosomes Smart library primers Cyp19a (LG1) LG3 LG3 Pool cdnas UE 1st cdna-p XX-DOP YY-DOP ZZ-DOP 2nd cdna-p XX-DOP YY-DOP ZZ-DOP XX-DOP UE Pool cdnas UE 1st cdna-p XX-DOP YY-DOP ZZ-DOP 2nd cdna-p XX-DOP YY-DOP ZZ-DOP XX-DOP UE 2 kb 1 kb 600bp 200bp Enrichment Subtraction (Hybridations successives sur DOP-PCR-Biot) (Disparition progressive de gènes non présents )

22 De nombreux gènes ont été identifiés sur LG3 par les approches 1. (cdna capture) & 3 (direct cdna selection) (données non publiées, non communiquées ici) Pr chacun gène spécificité tissulaire (Expression) + entre génotypes + validation FISH

23 Validation de la localisation des gènes identifiés par FISH d ADNc Gènes inconnus XX-DOP on XX XX XX-DOP on YY YY XX-DOP on ZZ O-41E24 O-41E24 O-41E24

24 Grande Paire de Chromosomes : riche en rétrotransposons & séquences répétées (données non publiées, non communiquées ici) Etudier l évolution de la «richesse» en séq. répétées entre XX, YY, ZZ, WW

25 Localisation des gènes impliqués dans la cascade du déterminisme du sexe Sox14 Sox2 (les données relatives aux autres Sox étant non publiées, ne sont pas communiquées ici) BACs Sox ( Sry -related HMG box) famille des gènes : facteurs de transcription qui sont des régulateurs développementaux (déterminisme du sexe, différenciation cellulaire et développement du système nerveux central)

26 Densification carte: Grande paire de Chromosomes Sexuels (LG3) Carte densifiée entre autre avec les données de la carte RH (Projet Percimap) (données non publiées, non communiquées ici)

27 Densification: Petite paire de Chromosomes Sexuels (LG1) CYP19A1 Carte densifiée entre autre avec les données de la carte RH (Projet Percimap) WT1b (données non publiées, non communiquées ici) LG1

28 Tom Kocher, Univ. Maryland (Banques BAC) Angélique D Hont, Cirad-Bios DAP (FISH) Lucile Soler, Cirad-Persyst UPR20 (Bioinfo) MERCI!