DIAGNOSTIC DE LA LMMC: PHÉNOTYPAGE JOURNÉE GFHC-AFC_3 FÉVRIER Orianne Wagner-Ballon Hématologie Cellulaire Hôpitaux universitaires Henri Mondor

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1 DIAGNOSTIC DE LA LMMC: PHÉNOTYPAGE JOURNÉE GFHC-AFC_3 FÉVRIER 2016 Orianne Wagner-Ballon Hématologie Cellulaire Hôpitaux universitaires Henri Mondor

2 LES SOUS-POPULATIONS MONOCYTAIRES CIRCULANTES CHEZ LES SUJETS SAINS

3 LES 3 SOUS-POPULATIONS MONOCYTAIRES NOMENCLATURE COMMITEE OF THE INTERNATIONAL UNION OF IMMUNOLOGICAL SOCIETIES MO3 MONOCYTES NON CLASSIQUES CD14 faible CD ±4% 5 ±2% 85 ±6% MO2 MONOCYTES INTERMÉDIAIRES CD14 ++ CD16 + MO1 MONOCYTES CLASSIQUES CD14 ++ CD16 - ZIEGLER-HEITBROCK et al, Blood 2010 WONG et al, Blood 2011

4 CARACTÉRISATION PAR CMF À PARTIR DE PBMC Singulets SSC-A SSC-A Monocyte Monocyte sans DN MO3: 5.4% MO2: 5.2% CD45 CD24 CD16 DN CD16 MO1: 89.4% SSC-A SSC-A CD14 CD14 CD16 CD56 SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

5 VALIDATION DE LA STRATÉGIE D ANALYSE MORPHOLOGIE MONOCYTAIRE DES POPULATIONS MO1, MO2 & MO3 MO2 MO3 CD16 MO1 CD14 SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

6 VALIDATION DE LA STRATÉGIE D ANALYSE EXPRESSION DE GÈNES MONOCYTAIRES PAR LES POPULATIONS MO1, MO2 & MO3 CD14 CD64 CCR2 CD62L CD16 CX3CR1 CD115 MO1 MO2 MO3 MO1 MO2 MO3 MO1 MO2 MO3 MO1 MO2 MO3 MO1 MO2 MO3 MO1 MO2 MO3 MO1 MO2 MO3 SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

7 VALIDATION DE LA STRATÉGIE D ANALYSE HIÉRARCHISATION DES POPULATIONS PAR SPADE CD16 CD14 NK T cells CX3CR1 MO1 MO2 B cells CCR2 MO3 Residual Gran SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

8 LES SOUS-POPULATIONS MONOCYTAIRES CIRCULANTES DANS LA LMMC

9 SIGNATURE PHÉNOTYPIQUE DE LA LMMC ACCUMULATION DE MO1 DANS LA LMMC Autres hémopathies SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

10 COHORTE D APPRENTISSAGE (PBMC) *** 175 PATIENTS 26 Témoins < 65 ans: 86,1% 39 Témoins > 65 ans: 84,0% 24 Hémopathies non LMMC: 84,4% 33 Monocytoses réactionnelles: 79,1% 53 LMMC: 96,6% Contrôles C o Contrôles A g e dâgés -C o NNon o n -CLMMC M M L Monocytoses R e a c tiv e réactionnelles C M M L LMMC MO1(% monocytes totaux) SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

11 COHORTE D APPRENTISSAGE (PBMC) Contrôles C o Contrôles A g e dâgés -C o NNon o n -CLMMC M M L Monocytoses R e a c tiv e réactionnelles C M M L LMMC MO1(% monocytes totaux) 60 94% Spécificité: 95,1% Sensibilité: 90,6% SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

12 VALIDATION EN ROUTINE? TRANSPOSITION DU PROTOCOLE SUR SANG TOTAL CD64 CD24 CD56 CD14 CD2 CD16 CD45 FITC PE PC5.5 PC7 APC PB KOr 200 µl de sang total Harmonisation: cibles sur Versacomp Acquisition évènements dans gate MO1 % MO1 au sein des monocytes totaux SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

13 STRATÉGIE D EXCLUSION SUR SANG TOTAL BOOLÉENNE «MONO2»= CELLULES AND SINGULETS AND MONO AND (NOT CD56+) AND (NOT CD2+) AND (NOT CD24+) AND (NOT "PN CD16+") SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

14 STRATÉGIE D EXCLUSION SUR SANG TOTAL BOOLÉENNE «MONO Bis»= MONO2 AND (NOT DN) SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

15 COHORTE DE VALIDATION (SANG TOTAL) MO1(% monocytes totaux) 307 PATIENTS 68 Témoins > 65 ans: 85,1% 79 Hémopathies non LMMC: 81,9% 74 Monocytoses réactionnelles: 85,8% Contrôles âgés Non LMMC Monocytoses réactionnelles LMMC 86 LMMC: 96,4% SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

16 COHORTE DE VALIDATION (SANG TOTAL) MO1(% monocytes totaux) 94% Spécificité: 94,1% Sensibilité: 91,9% Contrôles âgés Non LMMC Monocytoses réactionnelles LMMC Résultat similaire sur la moelle Difficulté du fenêtrage +++ SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

17 ACCUMULATION DE MO1 DYSPLASIQUES DANS LMMC SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

18 SIGNATURE PHÉNOTYPIQUE SANGUINE DE LA LMMC Monocytose (G/L) Reactive CMML MO1(% monocytes totaux) Indépendante de la monocytose Indépendante des mutations/anomalies cytogénétiques Indépendante de la forme de LMMC (proliférative vs dysplasique) Indépendante du type de LMMC (Type 1 vs2) SELIMOGLU-BUET et al, Blood 2015

19 LES CAS TYPIQUES

20 LES CASTYPIQUES DE LMMC AVEC MO1 94%

21 LES CAS DE LMMC AVEC <94% DE MO1 Sensibilité de 91,9%

22 LES DIFFICULTÉS TECHNIQUES DU PHÉNOTYPAGE LMMC

23 LES DIFFICULTÉS TECHNIQUES PRÉ-ANALYTIQUES Acquisition d un nombre suffisant d évènements (50000 MO1 minimum) Technique à partir de 200 µl de sang total Attention aux grandes hyperleucocytoses avec myélémie (dilution: 10 G/L de leucocytes) CD Panels d anticorps d exclusion: non imposé (exclusion des NK et de la myélémie +++) Deux anticorps diagnostiques: CD14 et CD16

24 LES DIFFICULTÉS DU FENÊTRAGE D EXCLUSION Attention à la stratégie d exclusion large fenêtre «monocytes» sur CD45/SSC

25 LES DIFFICULTÉS DU FENÊTRAGE D EXCLUSION Attention à ne pas exclure les monocytes CD16+ ni les monocytes CD56+ Privilégier les histogrammes FL/SSC

26 LES DIFFICULTÉS DU FENÊTRAGE D EXCLUSION Exclure la myélémie Intérêt du CD24

27 LES DIFFICULTÉS DU FENÊTRAGE DES MO1 Difficulté de positionnement des fenêtres - distinction MO2/MO3: pas prise en compte dans calcul % - distinction MO1/MO2 +++: travailler en density plot

28 VERS UN NOUVEAU CRITÈRE DIAGNOSTIQUE Limites de la définition OMS : -diagnostic a posteriori -un seul critère positif: monocytose > 1 G/L persistante depuis au moins 3 mois - dysplasie non obligatoire - présentation hétérogène Nouveau critère diagnostique indépendant de la monocytose : % MO1 94%

29 PERTINENCE DU SEUIL DE LA MONOCYTOSE À 1 G/L? Monocytose (G/L) témoins (145 témoins <65 ans + 48 patients > 65 ans) 0,49 G/L

30 LES LMMC AVEC HEMATOFLOW (BECKMAN-COULTER) CD36 FITC/CD2-CRTH2 PE/CD19 Préparateur ECD/ CD16 PC5/ CD45 PC7 d échantillons CytoDiff CytoDiff Analyseur DxH Remisol FC500

31 LES LMMC AVEC HEMATOFLOW (BECKMAN-COULTER) TÉMOIN SAIN

32 LES LMMC AVEC HEMATOFLOW (BECKMAN-COULTER) LMMC

33 AUTRES CRITÈRES DIAGNOSTIQUES À PRENDRE EN COMPTE

34 LES ANALYSES CYTOGÉNÉTIQUES ET MOLÉCULAIRES Caryotype médullaire : anomalies cytogénétiques dans 20 à 30% des cas Biologie moléculaire: SALLMAN & PADRON, 2015

35 CONCLUSIONS

36 CYTOLOGIE: TAKE HOME MESSAGES Aspects cytologiques hétérogènes Rechercher des signes de dysplasie même minimes, y compris sur la lignée monocytaire Prudence en cas de tableau infectieux associé, porte d entrée fréquente de la maladie Quantification du compartiment blastes + promonocytessouvent délicate Le score mono-dysplasie sur automate XN permet d éliminer les monocytoses réactionnelles ne nécessitant pas de revue de lame

37 IMMUNOPHÉNOTYPAGE: TAKE HOME MESSAGES Accumulation 94% de MO1 dans le sang périphérique : signature phénotypique très spécifique de la LMMC Permet de distinguer LMMC des autres diagnostics différentiels dès l analyse du sang Importance du pré-analytique Importance du panel et de la stratégie d exclusion +++ Intérêt de la solution HEMATOFLOW pour le dépistage des LMMC Approche complémentaire de la cytologie

38 REMERCIEMENTS Hématologie Cellulaire Emmanuel BENAYOUN U1009 Dorothée BUET Margot MARABITO Nathalie DROIN Éric SOLARY Laboratoire d Hématologie Laboratoire d Hématologie Valérie BARDET Michaela FONTENAY Cliniciens GFM BREVET EUROPÉEN DÉPOSÉ Véronique SAADA