Réunion du printemps de la SFEIM / Toulouse Communications orales libres

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1 Réunion du printemps de la SFEIM / Toulouse 2013 Communications orales libres Mise au point de la mesure des activités MCAD et VLCAD dans les fibroblastes par spectrométrie de masse en tandem Dr. Damien Bouvier Travail dirigé par le Dr. Cécile Acquaviva-Bourdain Laboratoire des Maladies Héréditaires du Métabolisme et Dépistage Néonatal, Centre de Biologie Est, Hospices Civils de Lyon, Bron (Dr. Vianey-Saban)

2 Plan Introduction Rappels sur la MCAD et la VLCAD Diagnostic des déficits en MCAD et en VLCAD Objectifs et Matériels et Méthodes Résultats Mise au point de la mesure de l activité MCAD et VLCAD dans les fibroblastes Mesure des activités MCAD et VLCAD chez des patients Conclusion

3 Plan Introduction Rappels sur la MCAD et la VLCAD Diagnostic des déficits en MCAD et en VLCAD Objectifs et Matériels et Méthodes Résultats Mise au point de la mesure de l activité MCAD et VLCAD dans les fibroblastes Mesure des activités MCAD et VLCAD chez des patients Conclusion

4 Acide gras à chaîne longue Carnitine Membrane plasmique FAT OCTN2 FABP Cytoplasme AS CPT I LC- acyl-coa CAT CPT II LC- acyl- CoA + carnitine VLCAD MTP e - ETF-QO ETF Chaîne respiratoire Acétyl-CoA MC- acyl-coa Membrane plasmique MCAD SCAD crotonase e - NADH H + Glucose SCHAD SC thiolase Acétyl-CoA Cycle de Krebs Corps cétoniques Membrane mitochondriale interne Membrane mitochondriale externe

5 Acide gras à chaîne longue Membrane plasmique Cytoplasme CPT I CAT CPT II VLCAD C12 à C22 Membrane plasmique MCAD CH 3 -(CH 2 ) n -CH 2 -CH 2 -CO-CoA Acyl-CoA C4 à C14 CH 3 -(CH 2 ) n -CH=CH-CO-CoA 2-trans-énoyl-CoA Membrane mitochondriale interne Membrane mitochondriale externe

6 Déficit en VLCAD Clinique : - Forme néonatale sévère (cardiomyopathie et forte mortalité) - Forme infantile : hypoglycémies hypocétosiques - Forme adulte : atteintes musculaires C0 * Profil des acylcarnitines C14:1 C2 C16 * * * * * * C12 * C18:1 Chromatographie des acides organiques urinaires Acidurie dicarboxyliques C6, C8, C10, C12, C14 sans cétose

7 Prévalence : 1 / en France Déficit en MCAD Clinique : - Risque de mort subite - Hypoglycémies hypocétosiques - Atteintes hépatique et neurologique * C0 Profil des acylcarnitines C2 C8 Chromatographie des acides organiques urinaires - Acidurie dicarboxyliques C6 > C8 > C10 - Dérivés glycine : hexanoyl-, subéryl- C10:1 * * * * * * *

8 Plan Introduction Rappels sur la MCAD et la VLCAD Diagnostic des déficits en MCAD et en VLCAD Objectifs et Matériels et Méthodes Résultats Mise au point de la mesure de l activité MCAD et VLCAD dans les fibroblastes Mesure des activités MCAD et VLCAD chez des patients Conclusion

9 Feillet et collaborateurs, 2011

10 Méthode de référence de mesure de l activité enzymatique MCAD ou VLCAD MCAD ou VLCAD Acyl CoA Enoyl CoA FAD ETF H FADH2 ETF purifié Plus utilisée : - Coûteuse en temps - Inadéquate au GBEA

11 Plan Introduction Rappels sur la MCAD et la VLCAD Diagnostic des déficits en MCAD et en VLCAD Objectifs et Matériels et Méthodes Résultats Mise au point de la mesure de l activité MCAD et VLCAD dans les fibroblastes Mesure des activités MCAD et VLCAD chez des patients Conclusion

12 Substrat : octanoyl-coa (C8) ou palmitoyl-coa (C16) Homogénat de fibroblastes soniqués + ferrocenium hexa-fluorophosphate Objectifs - Mise au point de la technique - Test sur patients connus => Activité résiduelle par rapport à l enzyme témoin Incubation à 37 C Mesure des produits de la réaction enzymatique - Octenoyl-CoA (C8:1) - Hexadecenoyl-CoA (C16:1) Activité en nmol de produit formé / min / mg de prot

13 Plan Introduction Rappels sur la MCAD et la VLCAD Diagnostic des déficits en MCAD et en VLCAD Objectifs et Matériels et Méthodes Résultats Mise au point de la mesure de l activité MCAD et VLCAD dans les fibroblastes Mesure des activités MCAD et VLCAD chez des patients Conclusion

14 Mise au point / Optimisation des paramètres * Paramètres testés ~ Temps d incubation : 15 min ~ Concentration en protéines : 0,1 g/l ~ Concentration en substrat : 0,2 mmol/l ~ Concentration en ferrocenium hexa-fluorophosphate : 200 μm * Etude de la précision ~ Répétabilité (n = 10) : - Activité MCAD => CV = 4,3% - Activité VLCAD => CV = 10,8% ~ Reproductibilité (n = 4) : - Activité MCAD => CV = 19% - Activité VLCAD => CV = 31%

15 Plan Introduction Rappels sur la MCAD et la VLCAD Diagnostic des déficits en MCAD et en VLCAD Objectifs et Matériels et Méthodes Résultats Mise au point de la mesure de l activité MCAD et VLCAD dans les fibroblastes Mesure des activités MCAD et VLCAD chez des patients Conclusion

16 Activité MCAD (nmol/min/mg de protéine) Mesure des activités chez des patients MCAD * 0.4 * Témoin VLCAD MCAD n=12 n=10 n=6 * p < 0,05

17 C8 C8:1 C8OH Témoin Patient avec déficit en MCAD

18 Activité VLCAD (nmol/min/mg de protéine) Mesure des activités chez des patients VLCAD * 1.0 * Témoin VLCAD MCAD n=12 n=10 n=6 * p < 0,05

19 C16 C16:1 C16OH Témoin Patient avec déficit en VLCAD

20 Plan Introduction Rappels sur la MCAD et la VLCAD Diagnostic des déficits en MCAD et en VLCAD Objectifs et Matériels et Méthodes Résultats Mise au point de la mesure de l activité MCAD et VLCAD dans les fibroblastes Mesure des activités MCAD et VLCAD chez des patients Conclusion

21 Intérêt de la mesure enzymatique Déficits en MCAD et VLCAD => risque de mort subite et de séquelles neurologiques Diagnostic évoqué par le profil des acylcarnitines et CAO urinaires Confirmation par la biologie moléculaire Mais parfois, nécessité de la mesure le l activité enzymatique Technique de référence abandonnée Nouvelle technique utilisant la spectrométrie de masse en tandem Mise au point de la technique Temps d incubation retenu : 15 minutes Concentration en protéines : 0,1 g/l Concentration en substrat : 0,2 mmol/l Concentration en ferrocenium hexa-fluorophosphate : 200 μm Test dans fibroblastes de patients atteints de déficits en MCAD et/ou en VLCAD Diagnostic des hétérozygotes peu fiable Diagnostic de tous les malades Intérêt de la mesure d activité enzymatique dans trois cas

22 Patient décédé à J2 Suspicion de déficit en VLCAD sur CAOU (pas de prélèvement de sang pour profil d acylcarnitines) Biologie moléculaire : 2 mutations dans le gène ACADVL dont une non décrite (parents hétérozygotes pour une des 2 mutations) Mesure de l activité résiduelle VLCAD : 11% Diagnostic d un déficit en VLCAD

23 Patient présentant tableau modéré de déficit de la β-oxydation des acides gras Suspicion de déficit en MCAD sur CAOU et profil des acyl-carnitines Biologie moléculaire : 1 seule mutation dans le gène ACADM Mesure de l activité résiduelle MCAD : 8% Diagnostic d un déficit en MCAD

24 Patient avec hypotonie + hypoglycémie néonatale Suspicion de déficit en MCAD sur profil des acylcarnitines et CAOU Biologie moléculaire : 2 mutations décrites dans le gène ACADM retrouvées chez les parents dont p.arg206his Mesure de l activité résiduelle MCAD : 33% Diagnostic d un déficit modéré en MCAD

25 FIN Remerciements : - Christine Vianey-Saban - Cécile Acquaviva-Bourdain - Séverine Ruet - Michèle Trauchessec - Damien Bonsignore - Toute l équipe