TD Immuno S Pr : Nadia. Dakka

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1 TD Immuno S Pr : Nadia. Dakka 1

2 Anticorps monoclonaux Population homogène d anticorps issus d un «seul et unique» clone de cellules B Les anticorps monoclonaux sont des anticorps ne reconnaissant qu'un seul type d'épitope sur un antigène donné. Ils sont par définition tous identiques et produits par un seul clone de plasmocyte. Avantage Spécificité Affinité Production massive et constante 2

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5 Les Ac monoclonaux sont disponibles indéfiniment une fois les hybridomes immortalisés. La production des Ac monoclonaux nécessite moins d animaux par rapport à la production des Ac polyclonaux, Les Ac polyclonaux peuvent être obtenus beaucoup plus rapidement, à moindre coût et avec moins de compétences techniques que pour produire des Ac monoclonaux. Les Ac polyclonaux sont obtenus en 4 à 8 semaines, tandis que la production d Ac monoclonaux peut prendre 3 à 6 mois. 5

6 Principe de la production des anticorps monoclonaux Les partenaires de fusion cellules B extraites d organes lymphoïdes secondaires (rate, ganglions), des plasmocytes sécrétant des Ac. cellules myélomateuses de souris Méthode de fusion Chimique Physique Sélection, clonage in vitro d un hybridome producteur d Ac. Expansion multiplication de clones de l hybridome, soit in vitro, soit in vivo, afin d obtenir de grandes quantités d Ac. 6

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8 L'immunisation Les sources d'antigènes degré de pureté : élimination des contaminants L'immunisation de l'animal dose et forme de l antigène adjuvants voie et nombre d injection 8

9 Immunogène Antigène Quantité de l immunogène par injection et par animal. nprotéine protéine lyophilisée 2-50 µg en solution 2-50 µg Incluse dans un gel de polyacrylamide 1-10 µg Haptène Peptide 1-10 µg Nucléotide glucide Substance chimique naturelle ou synthétique 9

10 Les animaux, souris ou rats, utilisés à la fois pour l immunisation en vue de la préparation du clone d hybridome et pour la production d Ac monoclonaux (production in vivo), doivent être de même souche (syngéniques) pour des raisons d histocompatibilité. 10

11 César Milstein et Georges Köhler (1970) 11

12 + IMMUNISATION DE LA SOURIS AVEC L ANTIGÈNE ÉTUDIÉ OBTENTION DES LYMPHOCYTES SPECIFIQUES UTILISATION DE CELLULES MYELOMATEUSES OBTENTION DES CELLULES IMMORTELLES 12

13 Les cellules de myélome utilisées dans les hybridomes n ont pas l enzyme HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transférase). Elles ont perdu la capacité de produire des immunoglobulines (mutants Ig - ). Les cellules de myélome n apportent que leur propriété d immortalité aux cellules résultant de la fusion. 13

14 L autre partenaire de la fusion est une population de plasmocytes possédant l enzyme: HGPRT et sécrétant les Ig. Ces plasmocytes contribuent à la capacité des hybridomes à survivre dans le milieu de culture sélectif HAT (Hypoxanthine, Aminoptérine et Thymidine). 14

15 On fusionne les plasmocytes sécrétant des anticorps dirigés spécifiquement contre l'antigène choisi, avec des cellules de tumeur : myélomes (cellules immortelles). La fusion membranaire se fait grâce à l'addition de polyéthylène glycol (PEG) et permet ainsi d'obtenir des hybridomes. Les hybridomes ont la capacité de se multiplier plus rapidement que les plasmocytes productrices d'anticorps et de développer indéfiniment des anticorps spécifiques. 15

16 Méthodes de fusion Fusion chimique: Poly Ethylène Glycol (PEG) fusion des membranes cytoplasmiques rendement de fusion élevé DMSO renforce la viabilité cellulaire Fusion physique : Electrofusion Ouverture de pores dans la cellule par des pulses électriques technique onéreuse moins destructrice 16

17 + Par méthode chimique FUSION DES MEMBRANES CELLULAIRES AVEC DU PEG (poly éthylène glycol) SELECTION Par méthode physique FUSION DES MEMBRANES CELLULAIRES PAR ELECTROPORATION 17

18 Sélection, clonage Sélection sur milieu sélectif HAT Hypoxanthine Aminopterine Thymidine facteurs de croissance : IL 6 β mercaptoethanol sérum de veau fœtal fibroblastes sous atmosphère CO 2 seuls les hybridomes se développent 1 x 10 5 cellules/ml 18

19 Après fusion des hybridomes, les cellules sont réparties dans des plaques multipuits de telle sorte qu'il n'y ait qu'une cellule par puits. le mélange de toutes ces cellules (hybrides et cellules parentales) est placé sur un milieu de culture sélectif : HAT (Hypoxanthine, Aminoptérine et Thymidine). Les plasmocytes non fusionnés meurent rapidement et les cellules myélomateuses utilisées ayant un gène non fonctionnel pour une enzyme intervenant dans la synthèse des nucléotides (HGRPT) sont incapable de survivre dans un milieu HAT. 19

20 La sélection par le milieu HAT dépend du fait que les cellules de mammifères peuvent synthétiser les nucléotides par deux voies différentes : La voie de novo et la voie de récupération en incorporant directement les purines et les pyrimidines dans les nucléotides nécessaires à la synthèse de l ADN et de l ARN. Les enzymes qui catalysent la voie de récupération incluent HGPRT et TK. Une mutation de l un ou l autre de ces deux enzymes bloque la capacité de la cellule à utiliser la voie de récupération et entraîne sa mort dans le milieu HAT. 20

21 + Culture sur milieu HAT Hypoxanthine Aminoptérine Thymidine Cellule myélomateuse HGPRT- Lymphocyte B MORT CELLULAIRE Impossibilité de se diviser HYBRIDOME SELECTIONNE MORT CELLULAIRE disparition après quelques divisions 21

22 + Dès que la croissance est suffisante, il faut propager les cultures d'hybridomes productrices de l'anticorps désiré, les conserver et les cloner. Deux méthodes sont utilisées pour obtenir un clone à partir d'une cellule : Sur milieu gélosé Par dilution limite Une colonie = une cellule initiale Une ou zéro cellules par puit 22

23 Sélection d une seule cellule et mise en culture. Clonage dans l Agar, dans l Agarose on visualise directement les colonies cellulaires dans l agar, que l on remet en culture après dilution. Clonage par dilution limite la plus utilisée dans les laboratoires. Réalisée directement dans une plaque de microtitration peu onéreuse Longue. 23

24 Immuno précipitation Ouchterlony, Mancini Radio immunologie (RIA) radio isotope Immuno enzymologie (EIA) enzyme (ELISA) Compteur de cellules (Cell sorter) Western Blot 24

25 + TEST SUR LE SURNAGEANT DE CHAQUE PUIT DE LA PRESENCE DES ANTICORPS MONOCLONAUX PAR LA METHODE ELISA DU TYPE D ANTICORPS PRODUIT PAR DES METHODES D IMMUNOPRECIPITATION 25

26 2 techniques ELISA Compétition Sandwich : la plus utilisée pour ce propos 26

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28 ELISA sandwich Ac de capture 28

29 Au bout d'une dizaine de jours, on recherche dans chaque puits la présence d'anticorps dirigés contre l'antigène utilisé pour immuniser la souris. On peut alors multiplier les clones positifs (producteurs de l Ac d intérêt) soit en continuant de les cultiver in vitro, soit en utilisant l animal immunisé pour une production in vivo. 29

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31 Avantages Concentration élevée en Ac Mo Pas d intermédiaire industriels Inconvénients Utilisation de l animal Présence de protéines murines Contaminants Stress de la souris 31

32 + Amplification des hybridomes Production par cultures cellulaires OBTENTION DES ANTICORPS MONOCLONAUX Production dans les liquides d'ascites CONSERVATION DES HYBRIDOMES 32

33 Injection des hybridomes dans le péritoine de souris Développement d une tumeur : ascite Prélèvement des anticorps par ponction de liquide d ascite Rendement élevé 20 g/l C est la souris qui régule les conditions de culture! Purification du liquide d ascite nécessaire 33

34 Préparation de l échantillon Purification principale Chromatographie d affinité Affinité immunologiques spécifique du Fc. spécifique de l antigène. Ligand Analyte Impuretés 34

35 Fixation Elution 35

36 Elution par déplacement avec l antigène libre Elution par déplacement avec un analogue 36

37 Avantages Pas d utilisation d animal Production de grandes quantité d anticorps Pas de personnel d animalerie Pas de contaminant Inconvénients Nécessite l utilisation de sérum de veau fœtal Contamination par les hybridomes morts Ac de plus faible affinité Plus chère pour de petites production 37

38 Basé sur la technologie des fibres creuses. Diminution des coûts, du temps. Augmentation de la production 3 à 5 g/l, de la pureté Pas ou peu de contaminant (6 x moins) 38

39 Spécificité Reconnaissance d un seul motif épitopique Réactions croisées, non-spécifiques. Maintient de l activité après modification chimique L'affinité Élevée Constante et contrôlée Avantages de ce type de production Constante reproductible 39

40 Tout anticorps est caractérisé par deux propriétés : - capacité de lier spécifiquement un ou plusieurs ligands - participation à une ou plusieurs fonctions effectrices (activation du complément, stimulation de la phagocytose ) 40

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42 Premières applications thérapeutiques des Ac Mo en 1981 avec le muromonab utilisé dans le traitement des épisodes de rejet aigu en transplantation d'organes. Inconvénients des premiers anticorps monoclonaux produits par des hybridomes murins: - une demi-vie courte -immunogènes. Les progrès de la biologie moléculaire, au cours des années 1980, ont permis la production d'abord d'anticorps chimériques, puis d'anticorps humanisés et enfin d anticorps totalement humains. Depuis, le développement et l'utilisation clinique de ces anticorps monoclonaux ont connu un essor spectaculaire. 42

43 100% souris Ac monoclonal de souris Ac monoclonal chimérique 75% homme 25% souris 90 % homme 10% souris Ac monoclonal humanisé Ac monoclonal humain 43

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45 La chimérisation et l'humanisation permettent de varier les isotypes des anticorps donc de manipuler les fonctions potentielles de l'anticorps (par exemple, la fixation du complément). Un autre avantage: augmentation de la demi-vie de l'anticorps, qui passe de moins de 20 heures avec les anticorps murins à plusieurs jours, s'approchant des 21 jours des IgG humaines endogènes. Ceci permet une meilleure utilisation de ces Ac comme agents thérapeutiques. 45

46 ANTICORPS ENTIEREMENT HUMAINS: Des anticorps entièrement humains et biocompatibles sont cependant de plus en plus recherchés pour l'immunothérapie passive. Trois grands types de technologies ont été mis au point pour les obtenir: - Techniques d'hybridomes, - Phage display, - Souris transgénique. 46

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48 Les anticorps monoclonaux utilisés comme médicaments ont tous une nomenclature se terminant par «mab», acronyme de «monoclonal antibody» comme par exemple le rituximab. Ils sont utilisés dans les tests de grossesse, dans de nombreux domaines de la recherche en biologie et par de nombreuses techniques (cytométrie en flux, western blots.), dans les tests d'immuno-hématologie. Les anticorps monoclonaux, en monothérapie ou en association avec une chimiothérapie, ont pris place aujourd hui dans le traitement standard de nombreuses formes de cancers. 48

49 Herceptin (Anticorps humanisé) 49

50 Biotechnologie Recherche Diagnostic Thérapeutique Cytométrie en flux, Immunohistochimie Etude des lignées cellulaires Etude des marqueurs des cellules non lymphocytaire Etudes des cellules pathologiques Purification d antigènes Recherche d Ac ou d Ag Immunodétection (ELISA, RIA) Imagerie (immunoscintigraphie) 20 Ac monoclonaux utilisées en thérapeutique + 70 Ac monoclonaux en essais cliniques traitement immunosuppresseur (Maladies auto-immunes et inflammatoires, rejet de greffe) traitement anticancéreux (élimination des cellules cancéreuses) cardiologie (traitement anti-thrombotique) infectiologie (prophylaxie antivirale) allergologie (traitement asthme) 50

51 Beaucoup d espoirs soulevés dans le traitement de nombreuses pathologies lourdes, pour lesquelles les thérapeutiques conventionnelles ont montré leurs limites. (thérapeutiques ciblées) Toutefois le coût de ces produits est un facteur limitant leur utilisation, d autant plus que de nombreuses applications restent des traitements de longue durée. Enfin et en l'absence d'études de tolérance à long terme, le suivi et la prudence sont indispensables pour mieux évaluer les risques liés à leur utilisation. 51